ELECTROFORESIS Cul de los siguientes enunciados es verdadero?

La velocidad que adquiere una partcula que porta una determinada q es proporcional al E aplicado.

La me de una protena es directamente proporcional a la Mr e inversamente proporcional a la q.

La FEO es proporcional al E aplicado en el sistema. En un fraccionamiento electrofortico de protenas de suero humano, el poder resolutivo del agar resulta mayor que el de una membrana de acetato de celulosa gelificado. La FEO es siempre indeseable en el desarrollo de las distintas tcnicas electroforticas.

El desarrollo de calor es siempre indeseable en electroforesis.

La movilidad de una partcula en electroforesis es directamente proporcional a la fuerza inica del medio.

Rango de separacin de fragmentos de DNA en geles de agarosa o poliacrilamida

Agarosa % 0,3 0,6 0,7 1,2 2,0 Acrilamida % 3,5 5 12 15 20 Intervalo de tamaos (bp) 5.000 - 60.000 1.000 - 20.000 800 - 10.000 400 - 6.000 100 - 2.000 Intervalo de tamaos (bp) 1000 - 2000 80 - 500 40 - 200 25 - 150 6 - 100

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

ESTRUCTURA DE LA MATRIZ DEL GEL DE POLIACRILAMIDA

Copolimerizacin de los monmeros de acrilamida y N,N- metilenbisacrilamida

PAGE. POLIMERIZACION
Reaccin de catlisis por radicales libres: Iniciador: persulfato de amonio
Catalizador o propagador de la reaccin: TEMED (N,N, N, Ntetrametilendiamina (acelera la formacin de radicales libres del iniciador)

S2O82- + e- SO42- + SO4- (R) R + M RM RM + M RMM , etc

Iniciador: riboflavina + UV (reaccin fotoqumica)

generacin de R TEMED no es imprescindible pero favorece la reaccin

PAGE. POLIMERIZACION
MONMEROS NEUROTXICOS!!

Inhibicin de la polimerizacin: oxgeno (bloqueo de R iniciados por persulfato), pH cido retarda la polimerizacin (presencia de cido acrlico por hidrlisis) Luz y oxgeno: requeridos cuando se usa riboflavina Ajuste de la velocidad de polimerizacin (tiempo): cantidades ptimas de persulfato y TEMED Temperatura: ptima 25-30C (a < 10C: gel inhomogneo, a 50C: polmeros cortos)

PAGE: POROSIDAD DEL GEL T%yC%

T = (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/v) C = Bisacrilamida / (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/p) T y C influyen sobre el grado de reticulacin (tamao de poro), resistencia mecnica, fragilidad y elasticidad del gel

T < 4%: geles casi fluidos (agregar agarosa 0,5%) T > 25% C > 10%: geles opacos y quebradizos
T (C 1%) 3-5% 7 - 10 % 15 - 20 % Poro 70 nm 10 nm 5 nm kDa > 150 40-100 < 10

Consideraciones prcticas
Polimerizacin de los monmeros activada por la luz TEMED: sensible a la accin de la luz Evitar presencia de cido acrlico (hidrlisis de acrilamida) Conservar las soluciones en botellas oscuras a resguardo de la luz Agregar a la solucin stock resina de intercambio aninico (Amberlite IRA-400, Dowex1 2) Preparar soluciones frescas. Conservar el persulfato slido en desecador y las soluciones a -20C

Persulfato de amonio: hidratacin del slido e inestabilidad de las soluciones

Efecto de la carga elctrica y el tamao molecular

ELECTROFORESIS

GELES DE POLIACRILAMIDA
VENTAJAS Tamiz molecular: tamao de poro variable Qumicamente inerte frente a molculas biolgicas Transparente, facilidad para ser densitometrado Estable en amplio intervalo de pH, fuerza inica y temperatura Resistente a agentes desnaturalizante Fuerza electroendosmtica reducida Mecnicamente estable Fcil de almacenar Amplia versatilidad para la deteccin de compuestos analizados

DESVENTAJAS Toxicidad de los monmeros El material no puede ser recuperado

PAGE
CILINDRO (ROD) - PAGE VERTICAL
Tamao variable. Siembra nica. Dificultad para estandarizar. PAGE preparativa. Facilidad para PAGE en sistema multifsico de buffers. Equipo especial.

PLACA (SLAB) - PAGE HORIZONTAL Espesor variable. Siembra mltiple y en distintas zonas del gel. Equipo comn para otros sistemas electroforticos. PLACA (SLAB) - PAGE VERTICAL Espesor variable. Siembra mltiple. Sentido nico de electroforesis. Facilidad para PAGE en sistema multifsico de buffers. Equipo especial. Ventaja en estandarizacin del proceso.

PAGE
SISTEMA HOMOGENEO DE GEL Y pH SISTEMA DE GEL DISCONTINUO Caso especial: gel con gradiente de poro SISTEMA MULTIFSICO DE BUFFERS (concentracin de la muestra) CONDICIONES NATIVAS CONDICIONES DESNATURALIZANTES
(ruptura de agregados, disociacin en subunidades, solubilizacin). Posible alteracin de actividad biolgica, enzimtica, inmunolgica. Urea 6-8 M (agregada a muestra y gel): ruptura de puentes de H Detergentes no inicos (Tritn X-100, Tween 20) o glicerol (70%) 2-mercaptoetanol o DTT (reduccin de -S-S-): agregados a la muestra. No agregar al gel: inhibicin de polimerizacin. Detergentes (aninico SDS, catinicos BCTA o CPC)

DETERMINACIN DE TAMAOS MOLECULARES.

I.-DIAGRAMA DE FERGUSON
log m log Rf

log m = log m0 - KRT log Rf = log Y0 - KRT

protenas estndar en 5 geles con diferentes T%

1) PAGE de protena X y 7

2) Para cada protena: grfico de log Rf vs. %T 3) Para cada protena, clculo de KR (pendiente de la curva)

%T

Mr

4) Grfico de Mr (estndar) vs. KR

5) Mr de protena X por interpolacin del KR

KR

PAGE - GRADIENTE DE PORO

II.-PAGE EN GRADIENTE DE PORO

Gradiente adecuado a los componentes de la muestra: 4-16, 4-24, 4-30 Sistema multifsico de buffers Inclusin de marcadores de tamao molecular (caractersticas similares a las de las protenas en estudio) Curva de calibracin: tamao molecular vs. D recorrida o T alcanzada
D1/2 B A log PM

DETERMINACIN DE TAMAOS MOLECULARES.

log Mr

log T

DETERMINACIN DE TAMAOS MOLECULARES. III.- SDS-PAGE

Combinacin de la protenas con SDS para enmascarar las cargas (tratamiento de la muestra)

Agregado de SDS a la muestra y al buffer de los compartimientos electrdicos

Eleccin del T% del gel de separacin de acuerdo con el tamao de los compuestos a analizar Inclusin de marcadores de tamao molecular (caractersticas similares a las de las protenas en estudio)

Electroforesis
Curva de calibracin: tamao molecular vs. distancia recorrida

SDS- PAGE: curva de calibracin y determinacin de tamaos moleculares

SDS-PAGE
EFECTO DE AGENTES DESNATURALIZANTES

GELES DE POLIACRILAMIDA
APLICACIONES DETERMINACIN DE TAMAOS MOLECULARES

ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD MOLECULAR (VARIANTES GENTICAS)

INTERACCIONES (AGREGACIN, DISOCIACIN) INTERACCIONES (LIGANDO-RECEPTOR) IDENTIFICACIN (REACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO) ESTRUCTURA (PROTENAS OLIGOMRICAS, PUENTES DISULFUROS)

MODIFICACIONES POTTRDUCCIONALES (GLICOSILACIN, FOSFORILACIN)

ISOENZIMAS

Rango de separacin de fragmentos de DNA en geles de agarosa o poliacrilamida

Agarosa % 0,3 0,6 0,7 1,2 2,0 Acrilamida % 3,5 5 12 15 20 Intervalo de tamaos (bp) 5.000 - 60.000 1.000 - 20.000 800 - 10.000 400 - 6.000 100 - 2.000 Intervalo de tamaos (bp) 1000 - 2000 80 - 500 40 - 200 25 - 150 6 - 100