ANIMALES TRANSGENICOS

TERAPIA GENICA

Introduccin de DNA en ovocitos y embriones de an ibios

Utilizacin de ovocitos de Xenopus

Los ovocitos de !eno"us se orman en e# ovario a trav$s de un "roceso de maduracin #ento% a #o #ar&o de un "eriodo re#ativamente #ar&o 'unos ( meses)* Son c$#u#as de &ran tama+o ' de ,-. a /-0 mm de di1metro)% con un n2c#eo tambi$n &rande% 1ci#mente mani"u#ab#es y 3ue "ueden ser trans ormados muy e ica4mente mediante micro inyeccin* E# &ran tama+o de# ovocito y de su n2c#eo% "or un #ado% y #a me5ora de #os e3ui"os de micro inyeccin% "or otro% 6acen 3ue 6oy "ueda introducirse% sin nin&2n "rob#ema% tanto una "re"aracin de mRNA en e# cito"#asma de# ovocito% como un DNA'o cDNA) en su n2c#eo* Este contiene RNA7"o#imerasa en cantidad su iciente "ara transcribir #os &enes "resentes en #as mo#$cu#as de DNA inyectadas* La ca"acidad de #os ovocitos "ara traducir en su cito"#asma e# RNA micro inyectado 6a sido a"rovec6adas "ara desarro##ar un sistema de c#ona5e de e8"resin*

Inyeccin de mRNA y DNA en huevos fertilizados de Xenopus

mRNA sinteti4ado y modi icado in vitro 6a "odido ser micro inyectado en 6uevos de !eno"us en #o "rimeros estados de divisin 'una o dos c$#u#as)% e# mRNA se distribuye de manera mas o menos re&u#ar entre #as c$#u#as descendientes de #as inyectadas y es e8"resado durante e# desarro##o tem"rano* Esta estrate&ia 6a sido y esta siendo muy uti#i4ada "ara de inir e# e ecto 3ue "ueda tener #a 69"er e8"resin de &enes norma#es o #a e8"resin de &enes a#terados sobre e# desarro##o de# embrin* De manera "arecida% tambi$n se 6a micro inyectado DNA en 6uevos de !eno"us en #as ases mas tem"ranas de desarro##o* E# DNA e8&eno se mantiene durante e# desarro##o de# embrin y% a# menos "arte de e#% resu#ta re"#icado* Cuando e# DNA se inyecta en orma de "#1smido recombinante% este a"arece en un numero creciente de co"ias en #a ase de &1stru#a% "ara #ue&o descender* Parte de# DNA inyectado ##e&a a inte&rarse en e# &enoma y "odr9a ser transmitido a #a si&uiente &eneracin% aun3ue este "roceso no 6a sido muy investi&ado* La e8"resin de #os &enes c#onados inyectados en embriones de !eno"us de"ende en &ran medida% de# sistema "romotor:"otenciador "resente en #a construccin*

Sistema de insectos

Elementos P de Drosophila melanogaster

Los e#ementos P son e#ementos de DNA trans"onib#es 3ue en determinadas circunstancias% "resentan una &ran movi#idad en #9nea &ermina# de D* me#ano&aster* En #as c$#u#as som1ticas% e# e#emento P se transcribe% dando #u&ar a un RNA "recursor cuya maduracin su"one #a e#iminacin de #os tres intrones y #a unin de #os cuatro e8ones so#o se da en #a #9nea &ermina# y e# mRNA resu#tante es traducido "ara "roducir una "rote9na mas #ar&a% 3ue "resenta actividad de trans"osasa* Es un caso t9"ico de s"#icin& a#ternativo% a trav$s de# cua# se "roducen dos "rote9nas di erentes a "artir de un 2nico &en* Adem1s% e# e#emento P "resenta dos re"eticiones termina#es invertidas "er ectas% 3ue "robamente son e# sitio de reconocimiento "ara #a trans"osasa* De #as (, a ;, co"ias de# e#emento P 3ue est1n "resentes en individuos de #a estir"e P% tan so#o una tercera "arte esta ormada "or co"ias com"#etas% e# resto se trata de co"ias de ectivas% resu#tado "robab#emente de de#eciones internas* E# e#emento P o derivados de e# "ueden ser introducidos arti icia#mente en embriones de Droso"6i#a de manera 3ue se ##e&an a a#can4ar e ectos an1#o&os a #os #o&rados tras un cruce dis&$nico* Para e##o se "rocede a #a micro inyeccin de un ra&mento de DNA de Droso"6i#a 3ue conten&a un e#emento P en e# "o#o "osterior de un embrin de #a estir"e M en #a ase de b#astodermo sincitia#% ase en #a 3ue e# cito"#asma mu#tinuc#eado no se 6a re"artido aun "ara ormar c$#u#as individua#es* Si e# &en trans"osasa resu#ta e8"resado% e# e#emento "odr9a ser movi#i4ado desde #a mo#$cu#a recombinante inyectada 6asta a#&una #oca#i4acin cromosmica*

ectores del elemento P

<na "osib#e estrate&ia "ara uti#i4ar e# e#emento P como vector en Droso"6i#a "asa "or #oca#i4ar un sitio dentro de# e#emento en e# 3ue "ueda insertarse un DNA "asa5ero sin 3ue se vean a#teradas #as unciones de trans"osicin codi icadas en a3ue#* Otro camino a#ternativo se basa en a"rovec6ar #a ca"acidad de movi#i4acin en trans 3ue conservan #os e#ementos de ectivos con re"eticiones invertidas en #os e8tremos* <n e#emento P en e# 3ue &ran "arte de su secuencia interna 6a sido sustituida "or un DNA marcador% inca"a4 "or #o tanto de "roducir trans"osasa% c#onado todo e##o en un "#1smido bacteriano% ue micro inyectado en un embrin de Droso"6i#a derivado de un cruce dis&$nico P7M% en e# 3ue #a actividad de trans"osasa se es"era 3ue sea a#ta= e# &en marcador ue #oca#i4ado en #a "ro&enie de# individuo adu#to% #o 3ue su"one 3ue e# e#emento P recombinante 6ab9a sido e ectivamente movi#i4ado* Este ti"o de e8"erimento tiene #a desventa5a de 3ue tambi$n se "roducen mutaciones y aberraciones cromosoma#es recuentes* E# marcador mas uti#i4ado es e# denominado &en Rosy% 3ue codi ica #a en4ima 8antina7 des6idro&enasa% im"#icada en #a s9ntesis de un "i&mento res"onsab#e de #a co#oracin ro5a caracter9stica de #os o5os ro5os de #a mosca% #os mutantes 6omoci&ticos Rosy7 tiene o5os de co#or marrn* La e8"resin de# &en Rosy ##eva a #a a"aricin de o5os de co#or ro5o* E# &en Rosy es un marcador 3ue tiene #a venta5a de "roducir enoti"os c#aramente visib#es% "ero 3ue% sin embar&o% no son se#eccionab#es* Otros vectores derivados de# e#emento P 6an sido dotados de otros &enes marcadores se#eccionab#es*

Muta &$nesis y marca5e "or trans"osn 'trans"oson ta&&in&)

<na a"#icacin im"ortante de# uso de e#ementos P en Droso"6i#a es #a "roduccin de mutantes "or trans"osicin* Se re3uieren dos estir"es de mosca> una es "ortadora de un e#emento P de ectivo 3ue ##eva uno o varios &enes marcadores= no "roduce trans"osasa "ero es movi#i4ab#e en trans% es e# e#emento mutador* La se&unda estir"e contiene un e#emento P ayudante de# ti"o de a#as cortadas% inca"a4 de trans"onerse% "ero "roductor de trans"osasa= es e# e#emento e arran3ue'5um"starter)* Para un e8"erimento de muta&enesis contro#ada% se uti#i4a una estir"e con un 2nico e#emento de arran3ue% 3ue se cru4a con otra estir"e "ortadora de# e#emento mutador* La trans"osicin tiene #u&ar% "ero en sucesivas &eneraciones e# e#emento mutador ##e&a a estabi#i4arse% cuando e# cromosoma 3ue ##eva #a 2nica co"ia de# e#emento de arran3ue se&re&a de# cromosoma en e# 3ue se #oca#i4a e# mutador* E# &en o &enes mutados "ueden ser entonces c#onados% ya 3ue se encuentran marcados o eti3uetados "or #a "resencia de #as secuencias de# e#emento P* La recu"eraciones de e#emento P y de #as secuencias &$nicas 3ue #e rodean "rocedentes de# &en inactivado se #o&ra muy 1ci#mente mediante #a t$cnica de rescate "or "#1smido "ara #o 3ue e# e#emento mutador ##eva incor"orado un ori&en de re"#icacin de un "#1smido E* co#i

ectores con trampa para potenciadores

Los e#ementos P tambi$n se usan "ara #oca#i4ar o ?atra"ar@ secuencias "otenciadoras ce#u#ares 'en6ancer tra""in&)*En "rinci"io% e# sistema se basa en e# uso de# &en #acA como &en testi&o% co#ocado tras un "romotor d$bi# e incor"orado a un e#emento P de ectivo% su trans"osicin a diversas #oca#i4aciones cromosmicas en distintas #9neas de Droso"6i#a co#ocara en a#&2n caso a #a construccin en #a 4ona de accin de un en6ancer% de manera 3ue e# "romotor d$bi# ser1 estimu#ado y #a actividad de #acA "odr1 ser detectada mediante tincin 6isto3u9mica* Para de inir e# "atrn de actuacin de# en6ancer en cuestin se "uede traba5ar con una estir"e de mosca 3ue ##eve un &en #acA reve#ara e# "atrn de e8"resin de Ga* Por otro #ado% una ve4 3ue se dis"one de #9neas de mosca con di erentes "otenciadores ?atra"ados@% cada una con un "atrn de e8"resin Ga#B distinto% con #o 3ue se "uede conse&uir su e8"resin de manera es"eci ica de ti"o ce#u#ar*

Sistemas de mam9 eros> anima#es trans&$nicos

Produccin de anima#es trans&$nicos A) Micro inyeccin de DNA Se sue#e esco&er e# "ron2c#eo mac6o% suministrado "or e# es"ermato4oide% "or ser e# de mayor tama+o* Tras #a micro inyeccin de# DNA% norma#mente en orma #inea#% #ibre de secuencias "rocariotas o vira#es y disue#to en un vo#umen microsc"ico% #os dos "ron2c#eos acaban undiendo "ara ormar e# n2c#eo di"#oide de ci&oto* Los ci&otos son cu#tivados in vitro 6asta #a ase de mru#a o b#astocitos y entonces son trans eridos a madres ado"tivas* Para identi icar #as cr9as trans&$nicas% se ana#i4a e# DNA e8tra9do de una "e3ue+a "ie4a de #a co#a mediante PCR* Los "ositivos son cru4ados "ara determinar si e# trans&en se encuentra en #a #9nea &ermina#* Estos ratones se vue#ven "adre undadores*

C) In eccin con retrovirus recombinantes* La in eccin "or retrovirus natura#es o recombinantes "uede ##evar a #a inte&racin de su DNA "rovira# en #a #9nea &ermina# y "or #o tanto a #a obtencin de anima#es trans&$nicos* Este sistema "resenta #a venta5a de su senci##e4 t$cnica% #os embriones son e8"uestos a# virus y trans eridos a madres ado"tivas* Pero sin embar&o% tiene a#&unas #imitaciones derivadas de #a construccin de# vector% de #a recuencia "roduccin de mosaicos debido a 3ue #a in eccin se da des"u$s de# comien4o de #a divisin ce#u#ar y de#as "osib#es inter erencias de #as secuencias LTR "rovira#es con #a e8"resin de #os &enes de# DNA e8tra+o*

 C) Sistema de c$#u#as embrionarias "#uri"otentes

Las c$#u#as ais#adas de #a masa interna de un embrin de ratn en ase de b#astocisto "ueden "ro#i erar en cu#tivo ce#u#ar in vitro% "ero se mantienen en estado "#uri"otentes% es decir retienen #a ca"acidad de di erenciar 6acia e# resto de #os ti"os ce#u#ares 'inc#uida #a #9nea &ermina#) cuando son reintroducidas en otro embrin en eta"a de b#astocito* Son c$#u#as embrionarias "#uri"otentes o c$#u#as* ES'embrionic stem ce##)* Se 6an desarro##ado "rocedimientos "ara su mani"u#acin in vitro y uti#i4acin como materia# embrionario "ara &enerar ratones trans&$nicos* E# sistema de #as c$#u#as ES tiene &randes venta5as% derivados de su ca"acidad "ara crecer in vitro conservando su estado "#uri"otente* <ti#i4ando construcciones adecuadas% "uede #o&rarse #a inte&racin de un trans&en 6omo#o&o a un &en end&eno en #a misma #oca#i4acin cromosmica 3ue este% bien "ara anu#ar su uncin nativa% bien "ara corre&ir una uncin de ectuosa* Incor"orando esta metodo#o&9a a #as c$#u#as ES% se consi&uen ratones trans&$nicos con una uncin a#terada* Esta es #a v9a de "roduccin de ratones DnocD7out% anima#es de &ran va#or "ara estudiar #as consecuencias de #a inactivacin de un &en concreto% investi&ar e# "oder tera"$utico de diversos a&entes o uti#i4ar como sistema mode#o de "ato#o&9as 6umanas con base mo#ecu#ar*

D)

Trans erencia de n2c#eos

E# estado "#uri"otente de un n2c#eo "uede com"robarse trans iriendo a un 6uevo anuc#eado y observando si es ca"a4 de diri&ir e# desarro##o de una "ro&enie viab#e esto se 6a intentado a "artir de n2c#eos de c$#u#as embrionarias% eta#es y adu#tas% Con n2c#eos de c$#u#as embrionarias se sue#e conse&uir e# desarro##o a termino de# embrin% aun3ue #a e iciencia es ba5a* Recientemente se 6a conse&uido #a "roduccin de ove5as c#nicas a "artir de n2c#eos de c$#u#as di"#oides di erenciadas* E# "rimer caso conocido se rea#i4o mediante #a trans erencia d# n2c#eo de una c$#u#a de &#1ndu#a mamaria de una ove5a de E a+os% a un ovu#o de ove5a sin erti#i4ar y a# 3ue se #e 6ab9a e#iminado e# n2c#eo* A "artir de esta c$#u#a reconstruida se obtuvieron 0F embriones mu#tice#u#ares 3ue ueron im"#antados en /( madres ado"tivas* /B. d9as des"u$s naci Do##y cuyo an1#isis demostr 3ue "ose9a e# DNA de# n2c#eo trans erido y 3ue% inc#uso% #ue&o mostro ser $rti#> este e8"erimento% 3ue des"ert enorme e8"ectacin en c9rcu#os "ara cient9 icos% demostr #a "#uri"otencia de# n2c#eo de una c$#u#a di erenciada* Aun as9% #a &enera#i4acin de esta t$cnica de trans erencia nuc#ear "ara #a "roduccin de anima#es trans&$nicos debe reso#ver e# "rob#ema de# mantenimiento de# estado "#uri"otente a #o #ar&o de un cu#tivo ce#u#ar continuado*

E8"resin de DNA en ratones trans&$nicos

La es"eci icidad de te5ido en #a e8"resin de un &en se basa en #a "artici"acin de di erentes e#ementos re&u#adores #oca#i4ados en re&iones mas o menos e8tensas y situadas mas o menos "r8imas a e#* La construccin de ratones trans&$nicos "ortadores de usiones entre un &en testi&o y re&iones re&u#adoras "ermite ana#i4ar #a e8"resin de# "rimero en #os di erentes te5idos de# anima# y de inir as9 #as secuencias de# contro#* <na ve4 de inidas estas% "ueden usarse "ara diri&ir #a e8"resin de un trans&en a un te5ido o ti"o ce#u#ar es"eci ico* Esta "osibi#idad de e8"resin diri&ida se 6a uti#i4ado "ara a denominada ab#acin ce#u#ar% #a estrate&ia consiste en usionar a #a re&in de contro# de un &en cuya e8"resin es es"eci ica de te5ido% una secuencia codi icadora de a#&una uerte to8ina ca"a4 de "roducir #a muerte ce#u#ar* En #os embriones trans&$nicos 3ue "ortan esta construccin% #a e8"resin de #a to8ina se va a "roducir en un determinado momento de# "roceso de di erenciacin ce#u#ar y% 2nicamente% en a3ue# ti"o ce#u#ar en e# 3ue #as se+a#es de contro# se activan* E# resu#tado ser1 #a muerte de esas c$#u#as% y e# e ecto de su ausencia en e# subsi&uiente desarro##o de# anima# "uede ser se&uido y estudiado* E8"#otando esa idea% se 6an desarro##ado m$todos "ara #a e8"resin contro#ada de ciertos &enes en anima#es trans&$nicos* Los resu#tados mas es"ectacu#ares se 6an #o&rado co#ocando ciertos &enes ba5o e# contro# de "romotores re#ativamente senci##os y 1ci#mente inducib#es*

APLICACIONES DE LOS RATONES TRANSGENICOS A LA CIENCIA CASICA

Estudio del desarrollo

La uti#i4acin de ratones trans&$nicos o rece una v9a a#ternada basada en e# uso de trans&enes testi&o% 3ue "ueden ser detectados 2nicamente cuando son e8"resados ba5o e# contro# de a#&2n &en end&eno activo* <n trans&en de este ti"o uti#i4a e# &en #acA de E* co#i como testi&o% co#ocado inmediatamente detr1s 'doGnstream) de #a se+a# 3ue de ine e# #imite "osterior de un intrn% si % tras #a inyeccin en ci&otos unice#u#ares% e# trans&en se inte&ra dentro de# intrn de un &en y en #a orientacin y marco de #ectura adecuados% #a e8"resin de# &en end&eno% re&u#ada "or sus "ro"ias se+a#es% ##evara a #a usin de #os e8ones "recios de# &en con #acA* Esto "roducir1 una "rote9na de usin con actividad de b7&a#actosidasa% 1ci#mente detectab#e sobre !7&a#% "ero cuya uncin ori&ina# "uede estar severamente a ectada* E# ais#amiento de #9nea de ratones mutantes tras #a micro inyeccin de embriones con esta construccin ira se&uido de# an1#isis de# "atrn de e8"resin de# &en testi&o= #a a"aricin de actividad de b7&a#actosidasa en determinados momentos de# desarro##o o es"ec9 icamente en ciertos te5idos indicara #a insercin de# trans&en en &enes re#acionados con e# "roceso de di erenciacin* La construccin act2a como un mut1&eno de insercin% de manera 3ue #os anima#es "ueden "resentar enoti"os muy interesantes% "ero adem1s e# ais#amiento de# &en a#terado es senci##o a# estar marcado "or #as secuencias de #a construccin insertada en e#*

El ratn como sistema modelo de enfermedades humanas

E# &enoma de# ratn contiene #ar&os se&mentos de DNA muy conservadas res"ecto de# &enoma 6umano% #o 3ue 6a 6ec6o 3ue se #e vea como un buen sistema mode#o "ara re"roducir y estudiar diversas en ermedades 6umanas con base &en$tica*

LA TRANSGENESIS EN LA MEHORA ANIMAL

!e"ora de la produccin animal

Las "rimeros e8"erimentos se 6an ##evado a cabo en cone5os% ove5as% cabras% cerdos y vacas y uti#i4ando #a 6ormona de crecimientos como trans&en* <n ob5etivo c#aro de #a trans&$nesis es #a "osibi#idad de a#terar #a com"osicin de a#imentos "roducidos "or anima#es* Por e5em"#o #a cantidad de 3ueso "roducido de #a #ec6e es "ro"orciona# a un contenido en D7caseina= #a sobre e8"resin de esta "rote9na en #a #ec6e de vacas trans&$nicas no "arece ina#can4ab#e otro caso es #a "roduccin de #ec6e #ibre de #actasa= esto "ermitir9a e# consumo de #ec6e "or "ersonas 3ue no to#eran #a #actosa* Se 6a desarro##ado un "rotoco#o "articu#ar "ara #a obtencin de vacas trans&$nicas 3ue ya 6a demostrado su viabi#idad aun3ue con ba5a e iciencia% "ero e# "ro&reso es muy #ento debido a# #ar&o "#a4o 3ue se consume en #a obtencin dePrevencin una ternera a "artir de ovu#o erti#i4ado* de enfermedades Los resu#tados mas o"timistas se 6an #o&rado en #a #9nea de #a introduccin de ras&os de "roteccin rente a in ecciones* Estas son un &rave "rob#ema ya 3ue se e8tienden muy r1"idamente dada #a &ran "ro8imidad de #os anima#es en &ran5as* Se 6an conse&uido estir"es de "o##o resistentes a# virus de #a #eucosis de ave% mediante #a in eccin de vu#os erti#i4ados con retrovirus recombinantes "ortadores de# &en 3ue codi ica un a &#ico"rote9na de #a cubierta de# virus* Esta "rote9na "robab#emente se una a #os rece"tores ce#u#ares de# virus% b#o3ueando as9 su entrada a #a c$#u#a* E8"erimentos en esta #9nea 6a ##evado a conse&uir vacas trans&$nicas 3ue e8"resan b7inter ern% estimu#ador de #a de ensas contra ata3ues vira#es% o anima#es 3ue "roducen anticuer"os es"ec9 icos contra un determinado "at&eno'inmuni4acin in vivo)

LOS ANIMALES TRANSGENICOS COMO CIORREACTORES PARA LA PROD<CCION DE PROTEINAS I OTROS COMP<ESTOS DE INTERES

Produccin de proteinas e#ogenas en la leche

E# traba5o con ratones condu5o a ciertos trans&$nicos ca"aces de 6i"er7 e8"resar "rote9nas e8tra+as y secretar#as en #ec6e% mediante e# aco"#amiento de# &en de inter$s con "romotores im"#icados en #a e8"resin de "rote9nas #1cteas% ta#es como #a case9na o #a b7#acto7 &#obu#ina* De esta manera% se 6an "roducido di erentes "rote9nas de inter$s como e# activador de "#asmino&enos tisu#ar 6umano% #a inter#eu3uina70 o #a uro3uinasa* <n caso muy si&nicativo 6a sido #a construccin de ratones trans&$nicos "roductores de# re&u#ador transmembrana# de #a ibrosis 3uistica'CJTR) en su #ec6e% de #a 3ue se recu"ero asociado a &#bu#os de &rasa= e# cDNA de CJTR ue c#onado tras #a re&in re&u#adora de# &en de #a b7caseina% una de #as "roteinas 3ue se asocian a membranas* Pero% aun3ue #as "rote9nas se encuentra bastante concentradas en #a #ec6e y "resentan una actividad bio#&ica muy ace"tab#es% evidentemete e# raton no es un buen sistema "roductivo*

A ortunadamente% se 6a #o&rado &randes "ro&resos en #a "roduccin de "rote9nas con va#or armac$utico a "artir de #a #ec6e de anima#es de &ran5a trans&$nicos* A"arte de su a#ta "roductividad vo#um$trica% #a re&u#acin "ara #a comercia#i4acin de estos "roductos a "artir de estos anima#es esta muc6o mas avan4ado* As9% se 6an se&uido #9neas trans&$nicas de ove5a 3ue "roducen 6asta (; & de a/7antitri"sina 6umana% "rote9na uti#i4ada en tera"ia de reem"#a4amiento en casos de en isema% "or #itro de #ec6e* La ove5a es ca"a4 de "roducir de 0;, a L;, # de #ec6es "or "eriodo de #actancia% #o 3ue su"one un "otencia# "roductivo muy considerab#e* La cabra es otro anima# tambi$n e8"#otado "ara #a "roduccin de "rote9nas 6umanas en su #ec6e* Las "rote9nas se reco&en &#icosi#adas y con una actividad bio#&ica com"arab#e a #a obtenida de uentes 6umanas* Su "resencia en #a #ec6e no tiene e ectos ne&ativos ni Produccin de prote$nas e#genas en la sangre en #a madre ni en su "ro&enie* Por otra "arte% se 6an conse&uido cerdos trans&$nicos 3ue e8"resan 6emo&#obina 6umana en su san&re% construyendo un trans&en con #os &enes de #a a/7&#obina y #a de #a bK 7&#obina 6umana ba5o contro# de se+a#es re&u#adoras de credo* La 6emo&#obina 6umana "roducida "or e# cerdo trans&$nico tiene "ro"iedades an1#o&as a #a nativa% "uede se"arase con aci#idad de #a "orcina mediante cromato&ra 9a y "odr9a tener un &ran va#or "ara #a "re"aracin de san&re sint$tica* <n anima# &rande "uede "ro"orcionar varios #itros de san&re a# a+o sin detrimento "ara su sa#ud% #o 3ue se traduce en ;,, o 6asta /,,, & de 6emo&#obina 6umana "ura*

Produccin de prote$nas e#genas en el huevo de ave

La me5ora de# contenido nutritivo de &a##ina% de #a "ro"ia carne de "o##o o e# aumento de #a resistencia a in ecciones en #as aves son ob5etivos 3ue tambi$n se "ersi&uen a trav$s de #a trans&$nesis% #a e8"resin de un trans&en en #as c$#u#as de# oviducto de #a &a##ina% 3ue norma#mente se&re&an &randes cantidades de ovoa#b2mina% "odr9a ##evar a #a acumu#acin de una "rote9na e8&ena en e# interior de# 6uevo* Con #a vista "uesta en todo esto% se est1n desarro##ando "rocedimientos "articu#ares "ara #a "roduccin de "o##os trans&$nicos La micro inyeccin de DNA en 6uevos erti#i4ados de aves no es un "rocedimiento senci##o a causa de caracter9sticas es"eci icas de su mecanismo de re"roduccin y desarro##o embrionario* As9 durante #a erti#i4acin% son varios #os es"ermato4oides 3ue "ueden entrar en e# ovu#o% #o 3ue 6ace im"osib#e identi icar e# "ron2c#eo 3ue acabara usion1ndose con e# emenino* Adem1s #a entrada en e# cito"#asma no basta "ara #a inte&racin de# DNA e8tra+o en e# &enoma nuc#ea* I "or otro #ado% tras #a erti#i4acin% e# 6uevo de ave se va recubriendo con &ran ra"ide4 con una resistente membrana% una ca"a de a#bumina y #as membranas de #a cascara= todo e##o 6ace muy di 9ci# me5orar #a e icacia de #a micro inyeccin en este materia#* Aun as9 se 6a conse&uido inyectar un trans&en en e# disco &ermina#% #a re&in de #a yema en 3ue se #oca#i4an #os "ron2c#eos% antes de #a ormacin de #a cascara% #o&r1ndose una #9nea de "o##os trans&$nicos*

Produccin de rganos para trasplantes

E# "otencia# de #a a"#icacin de #os anima#es trans&$nicos a #as ciencias medicas se e8tiende a #a "roduccin de r&anos anima#es con ries&o reducido de rec6a4o tras un tras"#ante '8enotrans"#antes)= #a estrate&ia se basa en #a e8"resin de trans&enes codi icadores de "rote9nas 6umanas in6ibidores de# com"#emento* En e8"erimentos "re#iminares% #os r&anos de un cerdo trans&$nico 6an "roducido una res"uesta in #amatoria reducida y tard9a en "rimates rece"tores

Nuevas Tera"ias contra en ermedades 6umanas> Tera"ia &$nica

E# desarro##o de a&entes y "rocedimientos tera"$uticos "ara 6umanos% debe su"erar un aserie de ases de estudio y com"robacin antes de su ace"tacin de initiva* Estas ases se concretan en> Pruebas "rec#9nicas Jase /> "ruebas sobre un numero reducido de "acientes Jase 0> "ruebas sobre un numero su"erior de "acientes "ara va#orar su uti#idad* Jase (> sobre una muestra &rande de su5etos% "ara e# an1#isis com"#eto de #a se&uridad y e icacia de# "roducto o "rocedimiento y "ara com"#etar #a in ormacin obtenida a #as ases anteriores*

En "rinci"io #a tera"ia &$nica estar9a 5usti icada cuando se usa "ara corre&ir una mutacin &en$tica 3ue% de no 6acer#a% causar9a una en ermedad &rave* I a# contrario #os ries&os no com"ensar9an #os bene icios si uese uti#i4ada "ara "rovocar #a a"aricin de un determinado car1cter% ina#idad cuya im"ortancia seria ob5eto de una eva#uacin con #ictiva y 3ue muy "robab#emente ##evar9a a un aumento de #as desi&ua#dades ya e8istentes en #os sistemas de sa#ud "arcia# o tota#mente "rivados*

%erapia g&nica en animales Ciertos de ectos &en$ticos 6an sido corre&idos en ratones "ortadores de #os mismos mediante trans&$nesis con co"ias correctas de #os &enes res"onsab#es de #a "ato#o&9a* En #os casos en 3ue #a base mo#ecu#ar de #a en ermedad es una mutacin recesiva% #a introduccin de una 2nica co"ia de# &en norma# deber9a ser su iciente "ara #a recu"eracin de# enoti"o norma#* <n as"ecto t$cnico a considerar en #a e8"erimentacin de tera"ia &$nica inc#uye un con5unto de caracter9sticas de# or&anismo 3ue va a ser tratado% ta#es como su tama+o% su "eriodo de re"roduccin% su r$&imen de a#imentacin o su sistema de mantenimiento*

%erapia g&nica de c&lulas g&nicas en humanos

La #imitacin de #a tera"ia &$nica 6umana a# traba5o de con c$#u#as som1ticas de5a de #ado #a "osibi#idad de uti#i4ar #os m$todos desarro##ados sobre embriones in ectados o micro inyectados* La a"ro8imacin e8"erimenta# mas viab#e consiste en #a uti#i4acin de un cu#tivo ce#u#ar de un a#inea a"ro"iada% sobre e# 3ue se rea#i4a #a insercin de DNA con e# &en no de ectuoso% con #a idea de #a "osterior reim"#antacin de #as c$#u#as as9 mani"u#adas en e# te5ido u r&ano adecuado= esta estrate&ia es conocida como tera"ia e8 vivo* E8iste adem1s #a a#ternativa de introducir directamente en e# or&anismo e# a&ente o mo#$cu#a e# a&ente o mo#$cu#a tera"$utica% #o 3ue se denomina tera"ia in vivo* Los "untos c#ave en donde se centran #os mayores es uer4os "ara e# desarro##o de esta metodo#o&9a son> #a me5ora de #a e icacia de #os sistemas de trans erencia a# te5ido diana% e# aumento de #os nive#es de e8"resin a #ar&o "#a4o de# &en tera"$utico y #a e#iminacin de# rec6a4o inmuno#&ico de# or&anismo rece"tor contra #a c$#u#a trans ectada*

Esta estrate&ia im"#ica>

Tera"ia G$nica e8 vivo

Ais#ar c$#u#as de# individuo a ectado* Mani"u#ar &en$ticamente estas c$#u#as "ara corre&ir

e# de ecto &en$tico 3ue contienen*

Se#eccionar y crecer #as c$#u#as &en$ticamente

correctas*
Trans eridas a# "aciente de# 3ue reco&ieron*

La in eccin de c$#u#as in vitro con viriones retrovira#es recombinantes es un "rocedimiento muy e ica4 "ara su incor"oracin a #as estrate&ias de tera"ia e8 vivo* Las c$#u#as rece"toras "ueden se directamente in ectadas "or #os viriones recombinantes o% a#ternativamente% co7 cu#tivadas con #as c$#u#as em"a3uetadoras 3ue est1n "roduciendo #os viriones* Tras #a se#eccin de #as c$#u#as transducidas 6a de con irmarse 3ue e# &en trans erido se e8"resa en e##as% 3ue no est1n "roduciendo nin&2n retrovirus activo y 3ue #a insercin de# vector retrovira# no 6a a ectado a nin&una de sus unciones ce#u#ares norma#es* Tras estas com"robaciones% #as c$#u#as transducidas se cu#tivan y am"#i ican% se reco&en y se introducen en e# "aciente7donador*

'&lula vector Estas c$#u#as son #a c#ave "ara com"#etar e# "roceso de trans erir e# &en correcto a# cuer"o de# "aciente y deben reunir ciertas condiciones% 1ci#es de obtener y cu#tivar% resistentes a #a mec1nica de mani"u#acin y susce"tib#es de in eccin "or vectores retrovira#es% 1ci#es de reim"#antar en e# or&anismo a ectado y su"ervivencia en $# durante e# resto se su vida o a# menos durante varios meses

'&lulas de la medula sea Las c$#u#as "recursora "#uri"otentes dan ori&en a todas #as c$#u#as de #as series 6emato"oy$ticas= su in eccin conduce a un suministro continuo de c$#u#as con e# &en tera"$utico* Por otro #ado% 6oy se tiene una &ran e8"eriencia en e# traba5o con este ti"o de c$#u#as "ara e# tratamiento de en ermedades 6emato"oy$ticas* Como dato ne&ativo se "uede citar #a di icu#tad con #a 3ue en a#&unos casos se consi&uen nive#es a#tos de e8"resin de# &en e8&eno en e##as% 3ui41 "or #a ausencia de #as se+a#es adecuadas* La "re"aracin de esta c$#u#as a "artir de medu#a 6umana es rea#mente di 9ci#% "or #o 3ue se 6a e#aborado un a v9a a#ternativa a "artir de #in ocitos T auto #o&os% modi icados e8 vivo con un vector retrovira#* Puesto 3ue estas tienen una vida #imitada% e# tratamiento e8i&e in usiones re"etidas* Este caso es es"ecia#mente si&ni icativo% ya 3ue 6a sido e# "rimer e8"erimento de tera"ia &$nica 3ua 6a a#can4ado #a ase de "ruebas c#9nicas*

)tros tipos de c&lulas vectores Otro ti"o ce#u#ar en e# 3ue se est1n consi&uiendo avances son #os ibrob#astos de #a "ie#* Se trata de c$#u#as de 1ci# mane5o% de in eccin e iciente "or vectores retrovira#es y ca"aces de e8"resar a#tos nive#es de# &en "asa5ero% inc#uso cuando e# "roducto o es una "rote9na "ro"ia de ese ti"o ce#u#ar* La mayor desventa5a radica en #a di icu#tad de reim"#antar #as c$#u#as mani"u#adas en e# or&anismo rece"tor de manera 3ue "ervivan e# tiem"o necesario y de orma 3ue #a "rote9na "roducida "or e##as "ueda a#can4ar e# te5ido cut1neas% i&ua#mente se 6an intentado im"#antes subcut1neas de c$#u#as mani"u#adas embebidas en una matri4 tridimensiona# de co#1&eno* E# 69&ado esta siendo considerado como te5ido b#anco "ara e8"erimentos de tera"ia &$nica* Se conocen muc6as en ermedades metab#icas 6ereditarias 3ue a ectan a este r&ano y e# tras"#ante de 69&ado es uno de #os medio uti#i4ados "ara #a #uc6a contra e##os*

(istemas vectores no inmunog&nicos

La tera"ia &$nica e8 vivo de"ende de c$#u#as modi icadas y tras"#antadas "ara #a "roduccin de "rote9nas tera"$uticas* E# rec6a4o inmuno#&ico de estas c$#u#as se evita con e# uso de c$#u#as "rocedentes de# "aciente% 3ue se convierte en su5eto donante y rece"tor* Por eso se est1n desarro##ando sistemas de "roteccin contra e# ata3ue de anticuer"os a c$#u#as no an1#o&as> 8eno&enicas o a#o&enicas* Las c$#u#as esco&idas entre otras "or su buen crecimiento en cu#tivo% son transducidas con e# &en tera"$utico y% #ue&o enca"su#adas en una membrana "o#im$rica% arti icia# y semi"ermeab#e% 3ue "ermite e# "aso 6acia uera de #a "rote9na tera"$utica% y e# "aso 6acia adentro de nutrientes% "ero 3ue im"ide a# sistema inmuno#&ico de# "aciente reconocer y res"onder a #as c$#u#as im"#antadas* E# materia# inmu&enico de #a membrana esta construida con derivados de a#&inato% "o#ieter o acri#onitri#o*

Tera"ia &$nica in vivo

Esta tera"ia se basa en #a #iberacin directa de# &en tera"$utico en #as c$#u#as de un te5ido "articu#ar de# "aciente% bien "or inyeccin directa o bien "or "rocesos mediados "or recetores* Los vectores retrovira#es re3uieren 3ue #a c$#u#a diana se este dividiendo "ara "oder in ectar#a% sin embra&o% en muc6os de #os te5idos ob5etivo de# tratamiento% #as c$#u#as se encuentran en estado 3uiescente% no "ro#i erativo* De esta manera% se 6an contem"#ado di erentes estrate&ias "ara #a #iberacin de# &en or1neo basadas en e# uso de vectores vira#es y no vira#es* La variedad dis"onib#e de este ti"o de vectores re #e5a #a diversidad y #oca#i4acin de #os te5idos "otencia#es ob5etivos de# e8"erimento* <n sistema e ica4 "ara #a trans erencia de# &en or1neo deber9a mostrar> a) una e iciencia a#ta en #a ca"tura de# &en "or #as c$#u#as diana= b) un a#to rendimiento en e# trans"orte de# &en a# interior de# n2c#eo ce#u#ar% con una de&radacin m9nima= c) una e8"resin mantenida y su iciente de# &en tera"$utico "ara a#iviar e# cuadro de #a en ermedad*

ectores retrovirales

Me5oras adiciona#es de #os nuevos vectores retrovira#es inc#uyen aumento en #a "roduccin de viriones% incremento de #a e icacia en #a transduccin o creacin de variantes ca"aces de in ectar 3uiescentes* <na de #as me5oras mas si&ni icativas 6a sido #a "roduccin de sistemas es"ec9 icos de# ti"o ce#u#ar 3ue va a ser in ectado% "ara e##o% e# &enomas recombinante retrovira# es em"a3uetado con #a "rote9na de cubierta de otro virus% cuya es"eci icidad de in eccin determina e# es"ectro de c$#u#as sensib#es a #a transduccin* Estos virus denominados "seudoti"os% "ueden conse&uirse "or cotrans eccion de una #9nea ce#u#ar 3ue "roduce #os "roductos de #os &enes &a& y "o# con un vector retrovira# recombinante y con otro 3ue e8"resa e# &en env de otro virus* D esta manera% e# es"ectro de in eccin "uede diri&irse 6acia un ti"o ce#u#ar "articu#ar y de"endiendo de# &en env uti#i4ado% e# ran&o de c$#u#as rece"toras "uede ser mas o menos am"#iado* I mas aun% #a modi icacin de# &en env "uede inc#uir un e#emento de DNA 3ue codi i3ue una secuencia de amino1cidos es"eci ica "ara #a union de# "roducto resu#tante con un rece"tor ce#u#ar% #o 3ue da #u&ar a un retrovirus con una ca"acidad de in eccin es"eci ica y diri&ida*

)tros vectores virales

Entre #os "rimeros en desarro##arse se encuentran #os derivados de adenovirus* Estos virus in ectan un am"#io ran&o de c$#u#as 6umanas y "resentan caracter9sticas adecuadas "ara su em"#eo como vectores* Las estrate&ias mas e icaces se basan en un sistema m2#ti"#e 3ue inc#uye una #9nea ce#u#ar em"a3uetadora% 3ue contiene e# &en 3ue codi ica #a "rote9na de #a c1"side% y dos ra&mentos de DNA% uno "ortador de# &en e8&eno y de #as se+a#es de em"a3uetamiento% y otro con e# resto de #os &enes vira#es esencia#es "ara #a "ro"a&acin* So#o em"a3uetan co"ias de# DNA "ortador de# &en tera"$utico #o 3ue reduce muc6o #a "osibi#idad de una in eccin descontro#ada y de un rec6a4o inmuno#&ico de #as c$#u#as transducidas% en #a 3ue no a"arecer1n "rote9nas vira#es* E# virus sim"#e de# 6er"es 'MSN) se esta uti#i4ando "ara e# desarro##o de vectores tratando de a"rovec6ar #a es"eci icidad 3ue mani iesta en #a in eccin 6acia c$#u#as de# sistema nervioso* Pruebas "rec#9nicas con anima#es de e8"erimentacin 6an mostrado #a ca"acidad de #os vectores derivados de# MSN% "ara #iberar &enes a c$#u#as de# cerebro y de# sistema nervioso "eri $rico* Oue adem1s son e8"resados y mantenidos durante "eriodos #ar&os*

(istemas no virales de li*eracin de genes

E# mas sim"#e es #a inyeccin directa de construcciones "uras de DNA a #as c$#u#as de# te5ido b#anco* Este m$todo re3uiere &randes cantidades de DNA y so#o es viab#e con te5idos accesib#es* <na variante basada en #a i5acin de# DNA a macro"art9cu#as de oro 3ue son dis"aradas contra #as c$#u#as demostr en ratones* La e8"resin de# &en e8&eno durante unos ;, d9as y #a #iberacin de su "roducto "roteico a# torrente circu#atorio% #o 3ue en teor9a% deber9a aci#itar su acceso a te5idos &randes y no muy accesib#es "or otros medios* Sin embar&o% #a mayor9a de #as "rote9nas e8tra+as son de&radadas en #a san&re* E# sistema tiene #a #imitacin de #a recuencia de trans eccin 3ue a#can4an no es su iciente "ara conse&uir un e ecto tera"$utico y #a duracin de #a e8"resin de# &en e8&eno es demasiado breve "ara "ro"orcionar un tratamiento e ectivo*

%erapia con genes suicidas Es un ti"o de aborda5e tera"$utico diri&ido contra #as c$#u#as de un tumor% esta estrate&ia se basa en una combinacin de# &en de #a timidina73uinasa'tD) de# virus sim"#e de# 6er"es 'MSN) y e# &ancic#ovir 'GCN)= #as c$#u#as tumora#es son trans ectadas o transducidas in vitro con e# &en MSNtD co#ocado ba5o e# contro# de un "romotor activo y% unos d9as des"u$s% e# "aciente es inyectado con GCN* LA "rote9na MSNtD convierte a# GCN en su derivado mono os ori#ado* Este "roducto in6ibe a #as DNA7"o#imerasa% b#o3ues #a s9ntesis de DNA y "rovoca #a muerte ce#u#ar* E# &en MSNtD es un &en suicida y e# GCN es un e5em"#o de "ro medicamento% #a orma inactiva de un a&ente tera"$utico 3ue es activada bio#&icamente tras su administracin como "arte de un tratamiento*

ACIDOS N<CLEICOS COMO AGENTES TERAPE<TICOS

E# "rinci"io de este aborda5e es 3ue una estructura "o#inuc#eot9dica mono catenaria "uede 6ibridar con un &en es"eci ico o con su mRNA y disminuir% res"ectivamente % su transcri"cin o su traduccin* Tambi$n "odr9a unirse a otros e#ementos "artici"antes en e# "roceso de e8"resin * Otra a#ternativa "asa "or #a construccin de ribo4imas diri&idas contra un mRNA "articu#ar% con e# in de disminuir sus nive#es*
Mo#ecu#a antisentido <n RNA anti sentido% con secuencia com"#ementaria a #a de un mRNA% se une a este e im"ide su #ectura "or e# ribosoma* La "osibi#idad de uti#i4ar o#i&onuc#etidos sint$ticos "ara "rovocar ese b#o3ueo de# mRNA se basa en distintos actores> a) 3ue se asocien "or 6ibridacin a sitios accesib#es y unciona#mente im"ortantes de# mRNA= b) 3ue sean resistentes a #a de&radacin "or nuc#easas ce#u#ares= y c) 3ue "ermitan su e ica4 #iberacin a #as c$#u#as diana* Mo#$cu#as de entre /; y 0, nuc#etidos son ca"aces de 6ibridar con un RNA con su iciente es"eci icidad* Las dianas "otencia#es sobre e# mRNA "ueden determinarse eva#uando e# e ecto 3ue un con5unto de di erentes mo#$cu#as anti sentido "rovoca sobre #a s9ntesis de #a "rote9na "rob#ema en c$#u#as en cu#tivo*

)ligonucletidos +ue se unen a prote$nas

Estas mo#$cu#as son ca"aces de interaccionar con otras% modi icando su actividad* Por e5em"#o% con actores de transcri"cin o traduccin% a#terando su uncin en #a e8"resin de un &en% con "rote9nas 3ue norma#mente no se asocian a mo#$cu#as de 1cidos nuc#eicos% "ero 3ue% cuando se unen a un o#i&onuc#etido sint$tico% reducen o "ierden su actividad* <n o#i&onuc#etido de este ti"o recibe e# nombre de a"t1mero* Ri*ozimas Las ribo4imas son mo#$cu#as de RNA natura#es 3ue "resentan actividad cata#9tica* Presentan dos dominios en su estructura> uno de unin a# sustrato RNA a trav$s de bases com"#ementarias y otro cata#9tico% 3ue rom"e a# RNA sustrato "or un sitio es"eci ico* E# dominio de unin a# sustrato de un ri4obima "uede ser modi icado "ara diri&ir su actuacin sobre una secuencia "articu#ar de RNA*

O#i&onuc#etidos como 6erramientas "ara #a correccin de errores &en$ticos

Es un "rocedimiento basado en un o#i&onuc#etido 3uim$rico* RNA7DNA' i&) com"uesto "or una cadena mista 3ue incor"ora NMPs y dNMPs con #as "osiciones 0- de #os restos de ribosa meto8i#adas* Esta 6ebra orma una estructura en dob#e 6$#ice intracatenaria con re&iones en 6or3ui##a en #os e8tremos* La or&ani4acin de #os nuc#etidos en #a cadena 3uim$rica es im"ortante> 6ay die4 ribonuc#etidos en cada uno de #os costados de #a re&in centra#% ormada a su ve4 "or cinco deso8rribonuc#eotidos% en cuyo centro se #oca#i4a e# "ar de base a sustituir* Toda #a secuencia de este se&mento de# o#i&onuc#etido es id$ntica a #a de# DNA diana% sa#vo e# "ar de bases centra#*

<N CASO REAL* ? LA LECME TRANSGENICA@

La uti#i4acin de un anima# trans&$nico "ara #a obtencin de una "rote9na de inter$s comercia# ya no es tan corriente*% uno de #os "rimeros e5em"#os ue #a "roduccin de# actor I! anti 6emo 9#ico 6umano en #a #ec6e de un a ove5a trans&$nica* E# actor I!';E,,, Da) es e# 4im&eno de una serin7"roteasa esencia# en #a cascada de #a coa&u#acin * Las de iciencias en e# actor I! est1n #i&adas a# se8o y "roducen #a 6emo i#ia C 3ue ocurre en una "ro"orcin de /:(,,, mu5eres* Para "oder diri&ir #a secrecin de# actor I! a #a #ec6e es necesario 3ue e# &en se e8"rese en #a &#1ndu#a mamaria y esto so#o es "osib#e si se uti#i4a un "romotor de un &en es"eci ico de &#1ndu#a mamaria* E# &en e#e&ido ue e# de #a b7#acto&#obu#ina Cuatro ove5as trans&$nicas% 0 mac6os y 0 6embras% ueron obtenidas des"u$s de #a inyeccin de esta construccin en "ron2c#eo de varios ovocitos* Las 0 6embras ueron cru4adas% a# a+o si&uiente "arieron sendos corderos cada uno 6eredo e# trans&en usionado y #a #ec6e ue ana#i4ada "ara determinar #a "resencia de actor I!% com"rob1ndose 3ue #a #ec6e conten9a 0;n&:m# de actor I! 6umano y 3ue adem1s era bio#&icamente activo%* Aun3ue e# nive# de e8"resin era ba5o y no se ##e&o a com"robar adecuadamente si en #a #ec6e se "roduc9a e# actor I! como 4im&eno o en su orma activada% estos e8"erimentos demostraron 3ue #os anima#es trans&$nicos de &ran5a "od9an transmitir e# &en a otras &eneracin y uncionar como biorreactores*

MAS SOCRE EL TEMA> ?LA ONEHA DOLLI@

Do##y era #a "rimera ove5a c#onada a "artir de una c$#u#a adu#ta* E# &ru"o de Pi#mut y Cam"be## 6ab9a sido ca"a4 de desarro##ar una ove5a des"u$s de trans erir e# n2c#eo de una c$#u#a de #a &#1ndu#a mamaria a un ovocito anuc#eado*esencia#mente este e8"erimento consiste en "re"arar una "ob#acin de n2c#eos di"#oides donadores mediante su "arada en #a a G, e estado de 3uiescencia* E# ovocito es entonces enuc#eado mediante #a as"iracin con una "i"eta micro ca"i#ar y activado mediante un "u#so e#$ctrico de corriente continua'/-0; DN*cm7/ durante .,us)tras su cu#tivo durante B7E 6 en medio TC/FF conteniendo /,Q de JCS% e# ovocito anuc#eado se usiona con #a c$#u#a 3uiescente mediante un "u#so e#$ctrico de corriente a#terna '(N durante ;s) se&uido de ( "u#sos de corriente continua '/-0; DN*cm7/ durante .,ms)* Las c$#u#as usionadas ueron cu#tivadas "rimero durante /6 en medio TC/FF conteniendo /,Q de JCS y citoc6a#asina C% y #ue&o en e# mismo medio sin citoc6a#asina C 6asta e# momento de su im"#antacin tem"ora# en una ove5a rece"tora sincroni4ada "ara su desarro##o a termino% E# $8ito de este e8"erimento radica varios as"ectos= e# uso de ovocitos en #u&ar de ci&otos "ro"orciona un cito"#asma as adecuado% e# n2c#eo donante en ase G, "arce mas com"atib#e con #a situacin cito"#asm1tica% adem1s #a "osibi#idad #os &enes antes de c#onar#a*