CLONAJE DE DNA RECOMBINANTE.

ESQUEMA GENERAL

Panormico general de la tecnologa del clonaje de DNA

La tecnologa del clonaje de DNA constituye el ncleo central de la Ingeniera Gentica y va a ser presentada como parte integrante de esta ultima. La transferencia de una molcula de DNA al interior de una clula es la esencia del clonaje y establece un limite muy significativo: marca un cambio radical en la metodologa experimental(de in vitro a in vivo). Despus esta transferencia, el DNA aparece localizado en el interior de una clula, que puede ser del mismo tipo que aquella de donde se extrajo o no, y donde puede ser sensible a cualquiera de los muchos sistemas moleculares presentes. El objetivo fundamental del clonaje es que el DNA extrao se mantenga en el sistema celular receptor, lo cual implica que conserve su integridad, y que d lugar a copias que alcancen a todas las clulas del cultivo, de manera que posteriormente pueda recuperarse del cultivo una cantidad de DNA muy superior a la inicial (amplificacin) Un segundo objetivo de esta metodologa es la expresin de la informacin que contiene el DNA clonado. La clula hospedadora producir los productos codificados en el DNA extrao que pueden ser valiosos en si mismos o pueden ser la causa de comportamientos especiales de la clula receptora.

 El xito de los mtodos de clonaje depende bsicamente de las relaciones que se establezcan entre la clula receptora y la molcula construida in vitro y transferida a su interior, ya que marcan el desarrollo de los procesos posteriores, tanto del mantenimiento estable del recombinante en el cultivo, como de su posible expresin. Elementos principales del clonaje: - El DNA recombinante, que resulta de la unin in vitro del DNA pasajero y del DNA vector. - La clula hospedadora, que recibir al DNA recombinante para su mantenimiento, amplificacin y expresin. Elementos principales del clonaje. Etapas particulares dentro de la experimentacin general del clonaje: - La transferencia celular: proceso en el que un DNA manipulado in vitro es transferido al interior de las clulas hospedadoras, atravesando la estructura de su envuelta sin afectarla sustancialmente. - El anlisis de clones transformados: que permite distinguir, entre las clulas que resultan del intento de transformacin, aquellas que no hayan aceptado DNA exgeno, aquellas que hayan incorporado slo al DNA vector, aquellas que captaron molculas de DNA recombinante y, finalmente, aquella colonia que incorporo una secuencia particular de pasajero.

FIG 1 ESQUEMA DE UN EXPERIMENTO DE CLONAJE DE DNA RECOMBINANTE

EL DNA PASAJERO
Se le conoce como DNA pasajero, DNA extrao o forneo o, tambin, inserto, recordando su ubicacin en el interior de un recombinante. El DNA se extrae de su fuente biologa natural por mtodos ya estudiados. Una vez purificado y, en su caso, caracterizado y manipulado, se une al DNA vector para formar el DNA recombinante y ser clonado. Tras su clonaje y amplificado puede recuperarse del cultivo y separarse del vector para su estudio y anlisis. La amplia metodologa actual permite incorporar a este esquema cualquier tipo de DNA como pasajero del clonaje. As: Puede ser nico fragmento o una poblacin mixta de piezas diferentes de DNA. Puede ser un DNA bicatenario, un DNA de hebra simple o un RNA. Puede ser un DNA natural, extrado de una fuente biolgica cualquiera, o bien una molcula sinttica, obtenida artificialmente, tambin puede ser un cDNA sintetizado a partir de un mRNA.

El DNA VECTOR
Es el principal responsable del xito del experimento al depende de el tanto la supervivencia del recombinante en el cultivo transformado como la expresin del pasajero en sus clulas. Se trata de una molcula de DNA encargada de recibir (unirse) al DNA pasajero y acompaarle en su transferencia al interior celular. Los vectores son por ello construcciones complejas, molculas quimricas formadas a partir de la unin de regiones de muy diferentes procedencias, naturales o sintticas, y colocadas en un orden y un sentido especficos. Tipos de DNA Vector En muchos casos, un vector es especifico para un determinado tipo de clula. As, existen vectores para el clonaje: - En diferentes especies bacterianas, sobre todo en E. coli - En diversas levaduras. - En gran numero de plantas. - En distintos tipos de clulas o en embriones animales. - Existen vectores mixtos construidos para acten en mas de un tipo de clulas se conocen como vectores lanzadera.

Clasificacin de vectores en funcin de la fuente principal. Derivados de plsmidos, bacterias o de levaduras. Derivados de bacterifagos o de virus eucariotas. Vectores de origen mixto derivados de mas de un tipo de fuente. Vectores integrativos, cuya forma de actuar se basa en la integracin del recombinante en el cromosomas de la clula receptora.

Vectores segn su capacidad de actuacin sobre el pasajero que transportan: - Vectores de clonaje, cuya nica misin es mantener establemente al recombinante en el interior de la clula hospedadora. - Vectores de expresin, que aportan las seales necesarias para la transcripcin y/o la traduccin de la secuencia del inserto Condiciones de un vector: Debe contener un origen de replicacin (regin ori) que sea activo en la clula hospedadora, capaz de dirigir la accin de la maquinaria replicativa celular sobre el recombinante y provocar su replicacin, de manera que sus copias se repartan entre las clulas descendientes de aquella y se consiga as la amplificacin de DNA clonado.

- En el caso de que el numero de copias del recombinante en la clula no sea muy alto es muy conveniente que el vector disponga de regiones que facilitan un buen reparto entre clulas hijas. - Debe presentar una o, mejor, varios sitios nicos de restriccin, de manera que su incubacin con la endonucleasa correspondiente de lugar a uno (si el vector es circular) o dos (si es lineal) fragmentos que puedan ser ligados al pasajero en un orden adecuado y con el mayor rendimiento posible (con subproductos mnimos). - Si el sistema de transferencia y/o propagacin no es muy eficiente, se requiere que contengan un marcador fenotpico de seleccin que permita anular el crecimiento de las clulas que no lo contienen. - El rendimiento de varios sistemas de DNA es inversamente proporcional al tamao de la molcula, por lo que es muy ventajoso que el vector tenga un tamao pequeo; eso favorece la entrada del recombinante a la clula y, al mismo tiempo, deja disponible un espacioso mayor para el pasajero. - Funciones adicionales - Marcadores de seleccin alternativos que permitan e uso de distintas vas e incluso la deteccin de recombinante. - Seales diversas de expresin que dirijan y controlen la lectura del inserto por parte de la maquinaria transcripcional celular. - Sitios mltiples de clonaje o polylinker.

EL DNA RECOMBINANTE
El DNA recombinante es la molcula que resulta de la unin del DNA vector y el DNA pasajero. Su amplificacin, anlisis y expresin pasa por su transferencia al interior de una clula hospedadora. La sntesis del DNA recombinante se basa en la unin in vitro del DNA vector y el DNA pasajero mediante la accin de la DNA-ligasa.

LA CELULA HOSPEDADORA
Ha de recibir al DNA recombinante y colaborar a su replicacin. Clulas usadas como hospedador : E. coli, la especie hospedadora mas utilizada y en la que se desarrolla la mayor parte del trabajo sistemtico de clonaje. Otras bacterias , tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Las levaduras, especialmente Saccharomyces cerevisiae. Las plantas superiores, objetivo de muy variados trabajos de transgnesis. Lneas celulares de tejidos animales, capaces de crecimiento in vitro. Embriones animales, fuente para la obtencin de individuos transgnicos.

CARACTERSTICAS DE UN HOSPEDADOR
El primer factor a considerar en una estirpe bacteriana hospedadoras es que carezca de un sistema de restriccin activo, es decir que sea r-, de otra manera, el DNA extrao transferido a su interior seria rpidamente degradado. Otro sistema celular importante, es el que da lugar a la recombinacin entre secuencias, la recombinacin es en muchos casos, la base de la integracin del recombinante en el cromosoma del organismo receptor, lo que es una forma de mantenerlo estable es esa clula y en sus descendientes.

TRANSFERENCIA DE DNA A LA CELULA HOSPEDADORA

La transferencia de una molcula de DNA al interior de una clula, proceso conocido genricamente como transformacin (en bacteria) o transfeccin (en eucariotas), se consigue por diferentes procedimientos. El procedimiento resulta mas o menos complicados dependiendo de la estructura de esta envoltura. La eleccin del procedimiento mas adecuado depende fundamentalmente de la naturaleza de la clula receptora, as como de la del recombinante que se transfiere.

MTODOS TRANSFERENCIA DE DNA A LA CLULA HOSPEDADORA

La transformacin por choque trmico, que consiste en la captura de DNA por clulas previamente tratadas con metales ( Ca2+, Rb+, Co2, etc.), con el fin de alterar su envuelta (clulas competentes), la elevacin momentnea de la temperatura del cultivo parece ser la causa de que la clula permita el paso de la molcula de DNA a su interior. La clula recibe el nombre de clula transformada. La infeccin por fagos o virus, la estrategia implica colocar al DNA recombinante en el interior de una partcula viral infectiva, para que el propio sistema natural se encargue de llevar a cabo su transferencia al interior de la clula infectada. La electroporacin, basada en la utilizacin de descargas elctricas para alterar la estructura de la envuelta celular y permitir el paso del DNA exgeno. La micro inyeccin utiliza un equipo sofisticado de micro manipulacin para seleccionar, fijar e inyectar una clula o un grupo de ellas u transferir a su interior una pequea cantidad de DNA. El bombardeo con micro proyectiles (biolstica) se basa en el uso de proyectiles esfricos hechos de un metal pesado a cuya superficie se ha unido el DNA, que se requiere transferir, A travs de un mecanismo especial (can), estas partculas se lanzan a gran velocidad sobre las clulas receptoras.

ANALISIS DE CLONES
Tras la etapa de transferencia de DNA, procede analizar el resultado de ese proceso a fin de aislar el clon o clones que se persiguen. Este anlisis se aborda en diferentes niveles: La seleccin de aquellos clones que han aceptado DNA exgeno (transformantes). La deteccin de clones con DNA recombinante. La identificacin de un clon particular a partir de una biblioteca de clones. Seleccin de Transformantes Los procedimientos de transformacin o transferencia de DNA son de una eficacia muy variable. En muchos casos, el rendimiento es tan bajo que la mayora de las clulas sometidas al proceso no llegan a captar ninguna molcula de DNA; las clulas transformadas son minora y resulta imposible localizarlas y aislarlas del resto. Este grave problema se ha resuelto empleando arcadores genticos que permitan una seleccin fenotpica de las clulas transformadas.

Deteccin de Recombinantes
La identificacin y seleccin de clulas transformadas se consigue utilizando un marcador incorporado a la molcula del DNA vector. Una forma de identificar recombinantes se basa en la inactivacin de un marcador por la insercin del pasajero. Este sistema, conocido como una seleccin positiva, no esta generalizada y solo es ofrecido por algunas parejas vector-hospedador.

Identificacin de clones(screening de bibliotecas)

Cuando el DNA que se pretende clonar es una mezcla de fragmentos que se liga a una nica especie de DNA vector, el recombinante que resulta es mixto. Entre la poblacin de clulas transformadas se distribuyen los distintos recombinantes y, por lo tanto, los distintos pasajeros, este cultivo de clulas constituye lo que se conoce como banco de secuencias, banco de genes, biblioteca o genoteca. La identificacin de un determinado clon de esa biblioteca conduce al aislamiento de su pasajero, a partir de la poblacin mixta original. La identificacin de la secuencia mediante hibridacin del DNA celular de los diferentes clones con una sonda especifica marcada. La seleccin del clon aprovechando que el pasajero codifica una actividad seleccionable. La complementacin de alguna mutacin del hospedador por el gen pasajero del recombinante. La identificacin inmunolgica del producto proteico codificado por el DNA pasajero.

EXPRESION DE GENES CLONADOS

El clonaje de expresin es una modalidad cualitativamente distinta de esta tecnologa, que persigue la expresin del DNA pasajero en la clula hospedadora. Esto requiere la participacin de seales especificas que promuevan el proceso, que son incorporados al DNA vector dando lugar a los denominados vectores de expresin. Estas seales han de ser reconocidas por la maquinaria de expresin de la clula hospedadora lo que plantea la necesidad de utilizar seales especificas para esa clula. La expresin de una secuencia extraa en la clula hospedadora puede ser inconveniente, nociva e, incluso, letal para esta ultima. La expresin de secuencias clonadas en una clula receptora puede afectar a la actividad de esta ultima y convertida bien en una cepa productora de metabolitos de inters, bien en una estirpe con capacidades nuevas y aplicacin en diferentes campos; como en la eliminacin de compuestos txicos de medio (biodegradacin)

LOGROS Y APLICACIONES GENERALES DE LA TECNOLOGIA DEL CLONAJE DE DNA

El clonaje de DNA se ha impuesto como tecnologa esencial e insustituible para el desarrollo de la ciencia bsica y aplicada. El aislamiento de un fragmento puro de DNA a partir del clonaje de una pasajero misto(biblioteca). Este logro es sin duda el mas importante, gracia a l se pueden aislar, estudiar y utilizar secuencias puras de DNA; todo el resto de los xitos conseguidos y delas aplicaciones desarrolladas deriva de este primer resultado. La amplificacin de secuencias puras clonadas. Esta abre la va a su anlisis estructural, sin limitacin de cantidad de material, y a su produccin a gran escala. Adems, el clon recombinante se puede conseguir con garantas durante mucho tiempo, lo que asegura la disponibilidad de esa secuencia en cualquier momento. La expresin de secuencia en sistemas celulares. Este logro es quiz el mas trascendente; el fragmento clonado ya no es solo el objetivo del trabajo, sino tambin el medio para la obtencin de productos o la manifestacin de actividades codificadas.

Un caso real: El nacimiento de la Ingeniera Gentica

Si la comunidad cientfica tuviera que decidir cuando naci oficialmente la Ingeniera Gentica, casi todos estaran de acuerdo en que ese nacimiento se produjo a finales de 1973 cuando Stanley Cohen y su grupo del Departamento de Medicina de la Universidad de Stanford en colaboracin con Robert Helling de la Universidad de California publicaron sus trabajos sobre la construccin in vitro de plsmidos biolgicamente funcionales. Para realizar el trabajo, Cohen y su grupo solo disponan de una pareja de endonucleasas de restriccin, EcoRI y EcoRII, que ellos mismos haban purificado, y de la DNA ligasa de Escherichia coli que les haban regalado unos buenos amigos. Su conclusin fue que se podan construir nuevos plsmidos mediante la unin in vitro de fragmentos de DNA generados por digestin de distintos plsmidos con endonucleasas de restriccin. Estos plsmidos recombinantes se podan introducir en clulas E. coli por transformacin y mostraban unas propiedades que eran la suma de las que posean los fragmentos que se haban unido. Tambin demostraron que se podan obtener plsmidos funcionales mas pequeos mediante digestin con endonucleasas y unin de algunos de los fragmentos resultantes.

Mas sobre el tema La Electroporacin

Tambin denominada electro transformacin o transformacin por electro permeabilizacin. Aunque esta tecnologa se aplico inicialmente a clulas eucariotas, con el tiempo y gracias a sus aplicaciones para la transformacin de organismos procariotas ha demostrado ser una herramienta trascendental. Fue a principios de los aos sesenta cuando se empez a saber que en las clulas sometidas a un campo elctrico se producen muchos cambios fsicos y bioqumicos que alteran entre otras propiedades el potencial de la membrana celular y producen desorganizaciones y roturas transitorias que hacen que la clula sea permeable a distintas macromolculas. La formacin de poros fue postulada como una explicacin del fenmeno y de ah deriva el nombre de la tcnica. Los parmetros fsicos mas importantes que afectan a la eficiencia de la entrada de DNA en la clula electroporada son el voltaje aplicado y la constantes de tiempo del pulso. Tpicamente el campo aplicado oscila entre 6-12 kV/cm, pero cada bacteria necesita un voltaje optimo. El porcentaje de clulas que sobreviven despus del pulso elctrico decrece a medida que el voltaje aumenta.