CRIOBIOLOGÍA

Estudio de los efectos de las bajas temperaturas sobre los sistemas biológicos. Se basa en fundamentos
de biología, física, química, matemática, biología molecular y bioquímica. Todas estas áreas son
aplicadas y tienen una interdisciplina con la bioingeniería, la biotecnología y la medicina.

Además, estudia los efectos de las bajas temperaturas sobre los sistemas celulares y los cambios en las
propiedades químicas, térmicas y eléctricas que pueden afectarlos, tanto a todo el sistema de
membranas plasmáticas, como a organelas y a las funciones celulares. Entonces, estudia cómo se
comportan física y biológicamente las células y tejidos a bajas temperaturas y qué interacción hay con el
medio ambiente.

Todas las células tienen entre 50 – 70% de agua, dependiendo el estadio de la vida, de la especie, del
género se va a modificar las cantidades y dentro de lo que es el cuerpo humano, se tiene distintos
porcentajes de acuerdo al tejido en cuestión. Por lo que, como se sabe, el agua es vital para que ocurra
la vida entonces si es vital, no es ilógico pensar que, si el agua se solidifica durante el proceso de
congelación, es decir, a bajas temperaturas si se solidifica pueda llegar a ser letal para los humanos.

Por lo tanto, estas bajas temperaturas que conllevan a una congelación del agua interna de las células
pueden provocar una ruptura celular, pero si se controlan las temperaturas y los procesos se pueden
detener transitoriamente ciertas funciones biológicas para almacenar, es decir, utilizar esas bajas
temperaturas para guardar tejidos, células, gametas, etc. por tiempo indefinido.

CLASIFICACIÓN DE BAJAS TEMPERATURAS

NORMOTERMIA: entre 35 – 38 °C dependiendo la especie, pero 37 °C es el promedio (temperatura

normal).

HIPOTERMIA: cerca de los 0 °C, donde empiezan a cesar muchas de las funciones biológicas y a
detenerse todas ellas, entonces el comportamiento celular es completamente diferente a lo que ocurre
en la normotermia.

CRIOCIRUGÍA: desde los -20 hasta los -60 o -80 °C dependiendo la bibliografía. Se produce crio injurias
(injurias por frio), es decir, rupturas. Por lo que, pasar la transición desde la hipotermia a los -80 °C
(parte de conservación) es lo más importante. Si se logra atravesar esta fase de bajas temperaturas sin
producir una ruptura celular, de organelas, de citoesqueleto y de cada una de las partes de las células se
va a poder preservarlas. Sin embargo, si en este proceso de transición se produce alguna ruptura, la
supervivencia celular va a ser muy baja. Muchas veces esta criocirugía o estas temperaturas bajas se
aplican para hacer cirugías en la medicina, es decir, también tiene un fin “bien”.

CRIOPRESERVACIÓN: desde los -80 a los -196 °C (temperatura del nitrógeno líquido).

Después de la Primera Guerra mundial, autores como Luyet – Gehenio en 1940 publicaron estudios
sobre cómo era la vida y la muerte a bajas temperaturas. Lo que se planteó es que la criopreservación se
trate de disminuir la temperatura de una muestra minimizando los daños ocasionados por la formación
de hielo intracelular o la cristalización porque estos cristales que se forman son los que van a romper o
dañar las células.

COMPOSICIÓN DE LA MEMBRANA CELULAR

Los fosfolípidos que son los componentes que mayor porcentaje representan en la bicapa de la
membrana plasmática, tienen una temperatura de transición o de fusión, es decir, que pasan del estado
líquido en el que están a un estado sólido, donde la membrana se vuelve impermeable al paso de
cualquier compuesto y, si se forma un cristal, ese sólido se va a romper entre los 10 – 16 °C.

Entonces, si se baja la temperatura desde los 37 °C hasta los -196 °C, ese proceso de solidificación de la
membrana va a ocurrir, por lo que, la idea es tratar de que ocurra de tal manera que, si se introduce
algo en el medio, antes o después de esos procesos, la estructura y el volumen celular se mantengan
porque si la célula se achica o se agranda porque si tiene un volumen mínimo (osmosis: célula
deshidratada) o máximo (osmosis: célula hinchada) va a hacer que la célula se rompa. Además, si la
membrana esta rígida, donde no puede entrar ni salir nada, y se le cambia el volumen se rompe.

Por lo tanto, que la membrana se rompa es muerte celular y lo que se busca es preservar el
espermatozoide, ovocito, etc.

FACTORES QUE AFECTAN A LA CRIOPRESERVACIÓN

Durante el primer paso o enfriamiento deja de funcionar normalmente la célula y el metabolismo
cambia, es decir, no hay más energía. ¿Qué implica esto? la célula entra en un proceso anaeróbico, si
hay anaerobiosis se produce ácido láctico, baja el pH (por acidosis), entonces también se produce un
desbalance de iones, empiezan a activarse algunas proteasas que degradan (por ej. el citoesqueleto), la
estructura de la célula deja de ser la misma (fosfolípidos dejan de ser líquidos → sólidos), se producen
radicales libres (superóxidos y peróxidos que van a producir un estrés oxidativo o degradación de
células) y también la desestabilización del citoesqueleto.

Cuando se llega a los –20 o –60 °C, en este proceso de crioinjuria se empiezan a formar cristales
intracelulares, se hace un núcleo de cristales que empiezan a crecer y esos cristales, desde el punto de
vista físico ellos ya pueden romper, pero también habrá más solutos porque ya no están diluidos en esa
agua por lo que la célula va a tratar de que ingrese agua y se va a expandir (cambia el volumen →
ruptura), se están concentrando los solutos, se produce una hiperosmolaridad que genera alteraciones
en el volumen celular y también desnaturalización de proteínas.

HIPÓTESIS DE LOS DOS FACTORES

Para poder lograr como optimizar los procesos de criopreservación, de almacenamiento, de tejidos,
gametas a bajas temperaturas, se planteó hace muchos años la hipótesis de los dos factores.

Por un lado, se sabe que se forma hielo intracelular durante el congelamiento rápido y por otro lado se
puede formar hielo extracelular durante el congelamiento lento, entonces ocurre lo opuesto que es el
efecto de la solución.

Cuando hay un elemento muy rápido, se forma hielo dentro de las células primero, entonces la célula se
puede romper por la formación de biomasa intracelular o aumenta su volumen. En el caso puesto en un
congelamiento lento, primero comienza a formarse hielo extracelular, entonces, el agua ahora va a
tender a salir de las células, se va a deshidratar y esa deshidratación es la que puede producir la muerte
celular.

A bajas tasas de enfriamiento se empieza a producir un achicamiento de la célula de deshidratación y en

el caso de la formación de hielo intracelular, la célula pierde completamente su forma, se rompen las
organelas. Pero hay una temperatura de congelamiento óptima donde estos dos procesos (efecto de la
solución y formación de hielo intracelular) se equilibran (óptima para cada tejido, para cada especie) y
donde estos dos procesos se minimizan de alguna manera y no es ni el máximo ni el máximo, es un valor
en el medio y que permite congelar las células, los tejidos a estas bajas temperaturas.
Uno de los primeros trabajos de Masur de 1972, donde ellos, por ejemplo, calcularon el porcentaje de
supervivencia y las tasas estas de congelación para cada uno o para diferentes tipos de células, para
células de ovario, para el polen, para los glóbulos rojos, para embriones de ratón. Por lo tanto, las
condiciones óptimas son específicas del tipo celular.

AGENTES CRIOPROTECTORES (ACP O CPA)

Sustancias hidrosolubles, de baja toxicidad que disminuyen el punto eutéctico de una solución.

Un punto eutéctico es la temperatura óptima, mínima, donde hay una mezcla equimolecular de estos
dos compuestos a la cual los dos están de forma homogénea y se solidifica, es decir, es el punto de
fusión de una mezcla homogénea de dos solventes. Esto se lo utiliza para saber que, si se agrega un
compuesto que sea hidrosoluble, que tenga baja toxicidad, disminuye el punto eutéctico de la solución,
eso es un agente de crioprotector, que es hidrosoluble, genera descenso crioscópico y no es tóxico en
bajas concentraciones.

Un agente crioprotector según Karow (1969) es “cualquier aditivo que nosotros coloquemos en una
célula antes de congelarlo y aumente la tasa de supervivencia post descongelación que sea mayor a lo
obtenido en su en su ausencia, eso es definido como un agente crioprotector”.

En el año 1949, Polsh publica sobre la supervivencia de espermatozoides después del proceso de
vitrificación y deshidratación a bajas temperaturas. ¿Qué es lo que utiliza él para poder lograr ese
proceso de vitrificación y de criopreservación? La molécula de glicerol que se caracteriza por:

- Alta solubilidad en agua, incluso a bajas temperaturas (cumple con la regla de hidrosolubilidad)
 - Baja toxicidad
- Forma interacciones tipo puente hidrógeno con el agua (compite con el agua por esos puentes
hidrógeno, por lo que entre molécula de hidrógeno e hidrógeno se puede poner un glicerol en el
medio)
- Permeable a través de la membrana plasmática
Entonces, utilizaron este agente crioprotector para poder lograr y aumentar las tasas de supervivencia
de los espermatozoides a bajas temperaturas. Donde hay dos tipos de ACP:

 PENETRANTES O INTRACELULARES: de bajo PM y permeables al embrión. Ej. glicerol, DMSO

(dimetilsulfóxido), etilenglicol, propilenglicol.
 NO PENETRANTES O EXTRACELULARES: alto PM (azúcares y proteínas) y son impermeables al
embrión. Ej., sucrosa, seroalbúmina bovina, ácido hialurónico, PVP (polivinilpirrolidona), HES
(hidrosietilo de almidón), dextranos, PROH (1,2 propanadiol), glucoproteínas de peces del antártico
(congelan a -2,5 °C).
Quién los describió todo fue eh Lovelock en el año 1953.

BENEFICIO DE CRIOPROTECTORES

- Dilución de electrolitos
- Aumento de la viscosidad
- Descenso crioscópico (generado por la densidad y la viscosidad)
- Disminución de la formación de hielo intracelular (entre moléculas de agua y agua no se van a
formar necesariamente puente de hidrógeno, sino que va a haber una molécula de glicerol, de
etilenglicol, de cualquiera de estos agentes crioprotectores en el medio)
DESVENTAJAS DE LOS CRIOPROTECTORES

- Toxicidad a altas concentraciones

- Estrés osmótico por la incorporación de solutos
- Cambios en la permeabilidad, en el caso de proteínas o azúcares, porque pueden incorporarse a la
membrana.
Además, autores demostraron que cuando se agrega un agente crioprotector lo que ocurre es que
empieza a ingresar el agente en la célula y a salir el agua y eso produce primariamente una disminución
del volumen celular. Cuando se sigue agregando concentraciones del agente crioprotector, llega un
momento que se equilibra porque el
agente ingresó (si es penetrante) y se
estabiliza el volumen celular.

Cuando se lo quiere remover después del

proceso de descongelamiento, en general,
en cualquier metodología que se utilice va
a ir saliendo el agente crioprotector y va a
ir ingresando el agua y en ese ingreso del
agua va a haber un aumento en el volumen
celular, no tan cercano al volumen crítico,
luego se va a estabilizar y va a llegar a su
volumen. Si se logra esto o se encuentra
una forma en la que los cambios de
temperatura no sean tan bruscos entonces se puede mejorar la viabilidad celular.
CRIOPRESERVACIÓN DE GAMETAS Y EMBRIONES EN LA PRODUCCIÓN ANIMAL

Hay tres o cuatro técnicas, depende de los autores, para criopreservar, para almacenar todos estos
tejidos y gametas.

Uno de ellos es la CONGELACIÓN CONVENCIONAL de estructuras biológicas (células somáticas,

gametas o embriones) que permite su almacenamiento a una temperatura a la cual los procesos
metabólicos son detenidos. Es decir, se produce un descenso controlado de la temperatura para el
almacenamiento a bajas temperaturas. Por lo tanto, este tipo de técnica permite el almacenamiento
mediante un descenso paulatino de la temperatura y, además, todos los procesos metabólicos son
detenidos.

Se parte de la temperatura de 37 °C (normal) pero al momento del almacenado de muestra

(independientemente de cual sea) se lo hace a una temperatura de equilibrio de 4,5 o 6 °C en heladeras,
transportadores de embriones, transportadores de ovocitos y durante el traslado del lugar de donde
fueron obtenidos, si no es en un laboratorio donde se está realizando hasta llegar a donde se van a ir a
criopreservar, están en esta temperatura de equilibrio que suele estar entre los 6, 7 y 8 °C, porque no
llegan a los 4 °C.

Ocurre un descenso de la temperatura cuando los ponemos en máquinas congeladoras que nos
permiten hacer este proceso de congelación convencional y lo que ocurre normalmente es que baja
bastante rápido la temperatura, se solidifica la muestra y en esta solidificación se produce liberación de
calor, porque pasa del líquido al sólido y esto es lo que se denomina liberación de calor latente.
Entonces cuando libera ese calor, la muestra que se vuelve a calentar y llega a los 0 °C y después vuelve
a recuperar la el descenso de la temperatura.

Estos cambios de temperatura descender hasta los -6, -7 °C volver a subir a 0 °C y que se repita
cíclicamente, tampoco le hace bien a la célula, por lo tanto, hay que minimizarlo. Se observó que si se
hace un seeding (genera la cristalización de la solución de manera controlada) podemos disminuir esta
liberación de calor latente, por lo tanto, el descenso de la temperatura cambia (comparación entre
curva verde y roja).

¿Cómo se logra inducir el seeding? Partiendo de una muestra a baja temperatura (6, 7 °C) si se utiliza
algún elemento metálico que esté a muy baja temperatura (en general estos elementos metálicos se le
sumergen en vapor de nitrógeno líquido), lo que se puede hacer es a la muestra que tenemos ya está
frío, la tocamos con la varilla y lo que se hace con la varilla de metal es inducir a la formación de muchos
cristales chiquititos y que los mismos después crezcan. Entonces, de a poco se va formando un cristal, es
decir, un único cristal lentamente va creciendo hasta que se hace y se congela toda la muestra, se
inducen y forman muchos núcleos, la nucleación de muchos cristales, que después cada uno de ellos va
a crecer. Este proceso genera una menor liberación de calor latente y hace que sea más efectivo la tasa
de enfriamiento.

Mejor explicado: Una vez que la muestra ha sido enfriada a una temperatura ligeramente por debajo del
punto de congelación (aproximadamente entre -6 y -8 °C), se utiliza un objeto metálico (por ejemplo,
una varilla) previamente enfriado con vapor de nitrógeno líquido para tocar el exterior del tubo o
pajuela que contiene la muestra. Este contacto induce la formación controlada de pequeños cristales de
hielo extracelular, un proceso conocido como nucleación. Estos cristales actúan como núcleos que luego
crecen gradualmente a medida que continúa el enfriamiento. Esta nucleación controlada evita que la
formación de hielo ocurra de manera espontánea y desorganizada a temperaturas más bajas, lo que
podría ser perjudicial. Además, al formar cristales de manera progresiva, se reduce la liberación brusca
de calor latente, lo que permite mantener una tasa de enfriamiento más estable y eficaz.

CONGELACIÓN DE SEMEN
El semen en la pajuela está en una concentración más elevada de lo que se quiere almacenar en la
pajuela de 0,25 o de 0,50 mL, por lo tanto, se las tiene que diluir para que alcanzar la concentración
adecuada para su uso posterior. La dilución se hace con diluyentes.

Posteriormente se refrigera a unos 5 grados. Esto se puede hacer en máquinas congeladoras, luego se
utilizan vapores de nitrógeno líquido que están en -70, -90, -100 y finalmente se lo sumerge a -196 °C.

Todo esto se puede hacer en una rampa y después almacenar directamente en los termos de nitrógeno
líquido y cuando se lo quiere sacar, las descongelamos a las pajuelas en baños térmicos a 37 °C por 10 –
30 segundos (valor que depende del volumen de la pajuela, entre otros).

FACTORES QUE INFLUYEN

Diversos factores afectan el desempeño biológico de los gametos post – descongelamiento:

 Calidad original
 Cantidad de espermatozoides respecto del volumen del eyaculado (concentración)
 Protocolo de congelamiento y descongelamiento
 Diluyente
CALIDAD ORIGINAL: se debería evaluar el %motilidad, la morfología y la concentración. A nivel de
comercialización se pueden o se utilizan generalmente otro tipo de microscopios y un software para
evaluar estos parámetros.

El volumen del eyaculado va a variar de acuerdo a la especie (a las a las glándulas que tenga y el tamaño
de las glándulas). Además, las motilidades también son diferentes de acuerdo a la especie.

GRADIENTES DE DENSIDAD CON PERCOL: los espermatozoides móviles después de todo el proceso, se
van a encontrar abajo del tubo, es decir, después de las centrifugaciones van a estar en el en el fondo y
todo lo demás se descarta.
SWIM–UP: los espermatozoides móviles después de su incubación van a estar arriba del tubo.

Por lo tanto, la selección va a depender de con qué fase trabajar es si se hizo un swim – up o una
centrifugación por gradientes.

¿CÓMO ESTÁ COMPUESTA LA MEMBRANA LIPÍDICA DE LOS ESPERMATOZOIDES?

La relación entre la cantidad de colesteroles y los fosfolípidos que hay en la membrana indica la
sensibilidad a que los mismos sean criopreservados. El colesterol va a generar una estructura
completamente diferente, mucho más rígida que es lo que es un fosfolípido transmembrana.

Para el caso de conejos, gallos, pavos, ser humano la relación colesterol/fosfolípido es alta y esto hace
que sean poco sensibles a la criopreservacion. Mientras que ovinos, porcinos, equinos y bovinos tienen
una baja relación colesterol/fosfolípidos y, por lo tanto, son muy sensibles a la criopreservacion. En
conclusión, la composición lipídica de los espermatozoides de diversas especies se modifica luego de la
congelación.

La composición los fosfolípidos en general se pueden degradar o pueden sufrir ciertas alteraciones
durante el proceso de congelación, el colesterol también, entonces, la concentración inicial previo a la
congelación después va a ser modificada durante el proceso de congelación y descongelamiento.

Actualmente hay muchos avances con respecto a los termos para congelar y preservar la muestra, pero
hace algunos años lo que se hacía era una congelación manual que consiste en enfriar las muestras de
forma controlada y progresiva sin el uso de equipos automatizados. El proceso inicia cargando las
muestras con crioprotectores y dejándolas equilibrar a temperatura ambiente. Luego, se colocan en un
baño de alcohol isopropílico o un soporte térmico, donde se desciende la temperatura gradualmente,
típicamente a razón de 0.3 a 1 °C por minuto. Al llegar a unos -6 a -8 °C, se realiza el seeding, que
consiste en inducir la nucleación del hielo tocando el recipiente con una varilla metálica enfriada en
nitrógeno líquido. Después, se continúa el enfriamiento hasta alcanzar temperaturas de entre -70 °C y -
80 °C, momento en el cual las muestras se transfieren a nitrógeno líquido (-196 °C) para su
almacenamiento a largo plazo. Está estandarizado los centímetros que se van alejando del nitrógeno
líquido y son las distintas temperaturas para poder llegar a hacer estas rampas de descenso crioscópico.
EXTENDERS O DILUYENTES

Son soluciones acuosas que se utilizan para mezclar gametas, embriones o tejido a congelar, con el
objetivo de proteger las células durante la congelación y descongelación, y así mantener su viabilidad y
funcionalidad.

CARACTERÍSTICAS

 Proteger contra los efectos nocivos del enfriamiento rápido

 Proporcionar nutrientes como una fuente de energía
 Proporcionar un medio amortiguador (buffer) para prevenir los cambios dañinos de pH por la
formación de ácido láctico
 Mantener la presión osmótica apropiada y el balance electrolítico
 Incrementar el volumen del semen de modo que este pueda emplearse en múltiples inseminaciones
(diluye y nos permite manejar la concentración de los espermatozoides)
 Inhibir la proliferación bacteriana (tienen antibióticos)
 Proteger a las células espermáticas durante la congelación
Pueden ser a base de yema de huevo (tradicionales) o libres de yema de huevo o sintéticos (a base de
proteínas vegetales, liposomas, etc.). Los medios tradicionales han dado muy buen rendimiento, pero
tienen la cuestión de la contaminación bacteriana y también de que aportan un perfil proteico mucho
más grande y mucho más colesterol (en algunos casos es beneficioso). Por otro lado, los libres de yema
de huevo tienen la ventaja de que se conoce exactamente todo lo que tiene y no depende de estación
del año.

Entonces, todas esas cosas condicionan de alguna manera el almacenamiento y la criopreservación de la

muestra.

Estudios demuestran que, haciendo la comparativa entre semen criopreservado con diluyente a base de
yema de huevo en contraste con un diluyente sintético (colesterol + ciclodextrina + triglicerol) que no
había diferencia significativa en la tasa o cantidad de blastocitos eclosionados entre las dos técnicas.
Entonces, dependiendo del precio y la proliferación bacteriana con la que se quiera trabajar, se elije un
diluyente o el otro. (diapositiva 35)

Aunque, no toda la bibliografía sugiere lo mismo, otro trabajo evaluó el efecto de la yema de huevo, la
lecitina de soja y el liposoma como criopreservantes en bovino para leche. Trabajaron con 5 animales y
diluyeron las muestras en los distintos tipos de diluyentes. Observaron que había una diferencia en la
motilidad total, en la movilidad progresiva y después hicieron un estudio de citometría de flujo, con los
que concluyeron que el que tenía los liposomas, mejoraba la integridad de la membrana del acrosoma,
genera una menor alteración del orden de la membrana, similares valores de producción de especies
reactivas del oxígeno y una correlación positiva entre espermatozoides viables y el orden de la
membrana. Concluían que, evaluando solo el espermatozoide (sin ver como influye in vitro), es mejor
trabajar con diluyente a base de liposoma. (diapositiva 37)

ANTIOXIDANTES
Es una sustancia que protege a las células del daño causado por los radicales libres, lo que hacen es
neutralizan radicales libres, donando un electrón sin volverse inestables ellos mismos.

- No Enzimáticos: glutatión reducido (GSH), ácido ascórbico, uratos, vitamina E, carotenoides, Zn, Se.
- Enzimáticos: GPX (glutatión peroxidasa), GR (glutatión reductasa), SOD (superóxido dismutasa).
Vitamina E: participa en la ruptura de enlaces covalentes que forman las especies reactivas del oxígeno
entre las cadenas laterales de ácidos grasos de los lípidos de membrana, es decir, impide la formación
de los hidrólipoperóxido que son los productos de oxidación lipídica primaria.

GSH: neutralizar a las especies reactivas del oxígeno, mantiene a los antioxidantes exógenos (vitamina C
y E) en sus formas activa.

SOD: convierte el superóxido (O₂·⁻) en peróxido de hidrógeno (H₂O₂). CAT (catalasa) y GSH-Px (glutatión
peroxidasa): convierten el H₂O₂ en agua (H₂O) y oxígeno (O₂). Estas enzimas requieren selenio orgánico,
esencial para su función, especialmente en el caso de GSH-Px.

Si el H₂O₂ no se elimina a tiempo, puede reaccionar con hierro (Fe²⁺ o Fe³⁺) y formar:

- Radical hidroxilo (OH·) → Muy dañino, puede romper ADN, lípidos y proteínas.
- También se pueden formar radicales peroxilo (ROO·), otro tipo de ROS que daña lípidos de
membrana.
Vitaminas E, C, A, polifenoles, y otros antioxidantes exógenos interrumpen estas reacciones en cadena.
Actúan neutralizando los radicales libres (como ROO·), protegiendo las células del daño.

Otro trabajo muestra que en el cuerpo y en la cabeza de los espermatozoides constantemente hay
procesos de oxidación y que pueden afectar la reacción acrosómica, pueden afectar la fragmentación
del ADN, la captación de Ca, la producción de ATP que pueden generar problemas a nivel de las
mitocondrias (son las que le dan la movilidad al espermatozoide), pueden producir daños en el flagelo, a
nivel macro y a nivel de movimiento.

Entonces, todo lo que se pueda aportar como agentes antioxidantes para evitar las especies reactivas
del oxígeno son beneficiosos en lo que es la calidad espermática.

Además, otro estudio propone incorporar nanopartículas de zinc que recubrirían todo el cuerpo y la
cabeza de los espermatozoides, se podría obtener una estabilización al nivel de la membrana (porque se
insertarían entre las cabezas de los fosfolípidos), impedir la oxidación y de ese modo tener una mayor
tasa de supervivencia con descongelamiento. (diapositiva 42)

RELACIÓN COLESTEROL/FOSFOLÍPIDOS
Estudio propuso aumentan el contenido de colesterol previo a la congelación, aumentando la viabilidad
y la movilidad postdescongelación. Utilizaron ciclodextrina (oligosacárido que puede captar colesteroles
en general) y pusieron colesterol y desmosterol (análogo del colesterol) en semen en fresco, congelaron
y luego de congelación vieron que el contenido de esteroles en los espermatozoides y la tolerancia
osmótica y la movilidad total era mayor en estos con respecto al control que no tenía la ciclodextrina ni
el desmosterol. (diapositiva 43)

MEMBRANAS
En el tracto reproductivo, si se utiliza estradiol, benzoato de estradiol por la contaminación propia del
agua, se puede formar especies reactivas del oxígeno, evitar la formación de glucosa y un desorden en el
metabolismo.

El estrés térmico, el uso de imidazoles que se utiliza mucho como limpieza durante el proceso de cuando
están haciendo las inseminaciones, también puede generar un aumento en el ROS y genera la apoptosis
o incluso, si hay un proceso de isquemia, en los testículos generar una ferroptosis por acumulación de
hierro (no es a nivel mitocondrial). (diap. 44)

DEGRADACIÓN
Se puede tener degradación durante todo el proceso de previo de congelamiento y descongelamiento a
nivel de fragmentación del ADN, en histonas (fragmentación), generación de los micro ARN, en la
mitocondria y también cambios en la membrana a nivel de concentración de los de los esteroles y
fosfolípidos (cambio en la fluidez y en la integridad propia de la membrana).

CONSECUENCIAS SOBRE EL CONGELAMIENTO/DESCONGELAMIENTO DEL SEMEN

LIOFILIZACIÓN: se congela la muestra en el solvente y mediante presión y a bajas temperaturas se
produce la sublimación
del líquido. Entonces,
los espermatozoides
quedarían en polvo y
durante este proceso se
pierde la cola de los
espermatozoides y
solamente nos
quedamos con la
cabeza. Por lo tanto,
sirve para una inyección
citoplasmática
directamente.

VITRIFICACIÓN DEL SEMEN: técnica de criopreservación ultrarrápida en la que el esperma se solidifica

en un estado vítreo (como vidrio).
 VENTAJAS

- Conserva la función mitocondrial y el ADN intacto

- No se produce la criocapacitación
- Conservación y almacenamiento de muestras

DESVENTAJAS

- Almacenamiento (tener en termos de nitrógeno líquido constantemente)

- Riesgo de contaminación
La congelación lenta en dos etapas es lo que más se utiliza

CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES Y OVOCITOS

El éxito de la criopreservacion depende de:

- La especie con la que se esté trabajando porque esto define la cantidad de colesteroles, los
fosfolípidos que hay en la membrana.
- El crioprotector, ya sea por disponibilidad o por buscar una opción menos citotóxica.
- El estado de desarrollo y origen del embrión o, inclusive, del grado del ovocito.
- El método de criopreservacion.
Para lograr el principio más importante de la criobiología: reducir el daño causado por la formación de
hielo intracelular y evitar el efecto de la solución.

CONGELACIÓN CONVENCIONAL

Procedimiento mediante el cual los embriones y ovocitos, vehiculizados en una solución de

criopreservacion son enfriados lentamente y finalmente congelados utilizando maquinas congeladoras
programables.

Hay distintas rampas de descenso térmico que depende de las especies y los distintos protocolos, otros
convencionales que están seteados en los programas donde el concepto es similar:

1. Selección de embriones
2. Exposición de embriones a las soluciones de congelación
3. Enfriamiento inicial (-7 °C)
4. Inducción de la cristalización o “seeding”
5. Descenso térmico lento y controlado
6. Descenso térmico rápido
Explicación: se baja hasta aprox. -7 °C, se induce el seeding, (la formación de cristales) y posteriormente
hay una rampa de descenso hasta llegar a la T de congelación.

→ Proceso dependiente de:

 Maquinas congeladoras
 Nitrógeno líquido
 Conocimiento del operador
 Seguridad al trabajar con nitrógeno líquido

1.SELECCIÓN DE EMBRIONES
Tener en cuenta el estado de desarrollo (si trabajamos con mórula, con blastocito, blastocito expandido,
etc.) porque cada uno de ellos va a generar diferentes resultados debido a que están en un proceso de
evolución completamente distinto.

En cuanto a la calidad, se tiene que saber qué es lo que se ha generado. Si bien se quiere criopreservar
aquellos de máxima calidad, pero si no se los tiene porque capaz no se han producido, en muchos casos,
hay que criopreservarlos y evaluar los resultados que se tengan. De igual manera, el objetivo es
preservar aquellos de buena calidad.

LLENADO DE PAJUELA
Se necesita:

Siempre se deben tener las burbujas de aire para evitar que durante el proceso de congelación que hay
un aumento del tamaño la pajuela no se desarme o no salga el tapón (compresión).

El medio puede ser PBS, sucrosa y algún alcohol. Etilen glicol es uno de los primeros crioprotectores que
se empezó a utilizar para embriones después del glicerol. Otros autores también, para que el cambio no
sea tan brusco de PBS y etilen glicol (cuando se corta el extremo termosellado, el embrión va cayendo
lentamente) lo que hacen es agregarle sacarosa para aportarle energía de alguna manera y apenas
llegue a las placas donde se va a seguir trabajando.

El crioprotector no necesariamente se coloca en los otros medios, se puede poner un diluyente, un

buffer fosfato, azúcares (sacarosa también es un crioprotector porque es un azúcar no penetrante de
alto PM puede actuar de esta manera porque desciende el punto crioscópico, no así el PBS).

Es importante que el medio tenga el crioprotector siempre y cuando las burbujas estén bien hechas (si
se golpea la pajuela pueden desaparecer).

El llenado de la pajuela puede ser de acuerdo a este esquema, pueden tener muchas más burbujas de
aire o pueden tener únicamente dos, es decir, puede ir variando.

Posteriormente se sigue con el protocolo estipulado, es decir, enfriamiento inicial, inducción del
seeding, descenso térmico lento y controlado.

TRANSFERENCIA DIRECTA
Los embriones producidos se pueden utilizar para hacer una transferencia directa que consiste en
descongelarlos a 37 °C aprox. 30s (depende que agente criopreservante se use), con los dispositivos
correspondientes, se le transfiere el embrión a la hembra receptora y posteriormente, pasado un
tiempo, se diagnostica preñez.

Ej. si se utiliza etilen glicol es laborioso porque hay que preparar la solución, sacar la pajuela,
descongelarla, poner el medio en el que está la pajuela en el otro medio para que el alcohol salga de la
célula, el agua entre a la célula, se hidrate de manera correcta y recién transferirlo. Es decir, se hacen
pasajes en diluciones de PBS de menores concentraciones de tal manera que se le pueda ir sacando de a
poco el agente crioprotector. Entonces, todo ese proceso se lleva a su tiempo y de allí se buscaron otras
moléculas de crioprotectores para evitar todo eso.

Hay muchos artículos que evalúan los procedimientos de criopreservación de los embriones y de los
agentes crioprotectores que se pueden utilizar, de acuerdo no solo a las tasas de clivaje (velocidad y el
patrón con que un cigoto se divide en múltiples células durante la primera etapa del desarrollo
embrionario) que haya o a la cantidad de blastocitos, sino que como se está hablando de embriones, se
reporta directamente el porcentaje de preñez y al porcentaje de nacidos vivos.

Trabajo de Dochi (2019): lo que se evaluaba es si la T de descenso desde donde se colocó en nitrógeno
líquido era de -25 o -35°C y se utilizaba un agente crioprotector (glicerol + PBS o glicerol + PBS +
sucrosa). En un caso se hace la dilución antes de hacer la transferencia y en el que tiene sucrosa se
puede hacer la transferencia sin hacer la dilución. Entonces, en este articulo evalúan la cantidad de
embriones que se han descongelado y el %de preñez que se obtuvo.

→ Se puede observar en la tabla como de acuerdo a la T inicial de trabajo y los agente

crioprotectores que se utilizan varían los resultados. Esto indicia que no hay una “receta única” por lo
que se pueden probar combinaciones de temperaturas y agentes hasta encontrar la que mejores
resultados se obtenga en su laboratorio. (diapositiva 63)

En este mismo ensayo se evaluó otros crioprotectores como etilen glicol, etilen glicol + sucrosa y glicerol
+ sucrosa (mismas T de prueba). Se reportó para los dos T de trabajo y el estadio en el que se
encontraba el embrión que posteriormente se iba a implantar. Siendo esto otro ejemplo de como puede
variar la eficiencia y tasa de supervivencia no solo dependiendo de la T inicial, el agente crioprotector
(tipo y molaridad) sino también el estadio en el que se encuentre el embrión. (diapositiva 64 y 65)

Cosas a tener en cuenta el número de individuos que conforman la muestra poblacional, de tal manera
que no es lo mismo obtener un porcentaje alto porque se utilizaron pocos animales de muestra a tener
un porcentaje bajo, pero con un n > 20.

EMBRIONES PRODUCIDOS Y PRESERVADOS EN LOS ÚLTIMOS AÑOS

Mayor cantidad de embriones producidos in vitro, también hay producción in vivo, pero influyen otros
parámetros como el mercado (oferta y demanda). Esto no significa que una tecnología sea mejor que
otra o que la pueda llegar a reemplazar, sino que ambas son buenas, tienen sus deficiencias y sus
ventajas, pero la producción de embriones in vitro fue aumentando con el paso de los años por
cuestiones de mercado. (diapositiva 67)

Lo mismo ocurre con la transferencia de embriones, hay mayor transferencia de los producidos in vitro
que los producidos in vivo. (diapositiva 68)

Resumen: la congelación lenta difiere en las temperaturas a la cual se llega al seeding de acuerdo a si se
trabaja con ovocitos o embriones.

VITRIFICACIÓN

La vitrificación es la solidificación de un líquido formando una estructura amorfa (no cristalina) conocida
como vidrio. Es un proceso tan rápido a altas tasas de congelamiento que no produce la crioinjuria ni la
muerte celular.

Inclusive, visualmente se puede ver las diferencias entre lo que es algo congelado y algo que está
vitrificado, que ha alcanzado muy rápidamente este descenso de temperatura. Se lo identifica por la
coloración y el estado que tiene.

“El principio de que la solidificación de un líquido en vidrio requiere menos reordenación molecular que
la transformación de ese líquido en cristal sugiere que la vitrificación podría no dañar el protoplasma en
condiciones en las que la cristalización lo mata” – Luyet 1939

En el año 1984, Fahy et al., propone la vitrificación como un método de criopreservación, pero en ese
momento no fue tan conocido a pesar de que se hicieron muchos estudios y después se recuperó su
información porque no se sabía cómo alcanzar velocidad o tasas de congelación tan alta de casi los 10
millones de °C por minuto.

Después se vio que había algunas formas de disminuir estas tasas de velocidad de enfriamiento para
poder utilizar el proceso de vitrificación, es decir, de conseguir esa estructura amorfa, metaestable que
no es ni sólido ni líquido.

La solidificación de un líquido en un sólido cristalino consta de 2 etapas:

1. Nucleación del cristal

2. Crecimiento cristalino
Se busca mucha nucleación y poco crecimiento cristalino para que no haya ruptura de la célula por lo
que la velocidad es muy importante. Trabajando a bajas temperaturas se puede evitar que se formen
muchos núcleos y también que crezcan.

La velocidad de ambos procesos es dependiente de la temperatura. Si la velocidad de enfriamiento es lo

suficientemente rápida, ambos procesos pueden minimizarse. Por lo que, el estado vitro es entonces un
estado metaestable no termodinámico, sino cinético (no es solamente que produzca el congelamiento,
sino que hay una cuestión de cinética para la formación de los núcleos y su crecimiento constante).

Entonces, a velocidades de enfriamiento lo suficientemente rápidas se evita la formación de hielo y sus

efectos nocivos asociados.
 Zhaoy Fu, 2017

Vemos como sube la tasa de supervivencia de las células cuando se utiliza la vitrificación.

La idea inicialmente fue desestimada ya que para la vitrificación de volúmenes útiles de agua se
requieren velocidades de enfriamiento de 106 °C/min. Sin embargo, después de un tiempo se observó
que:

- VISCOSIDAD: ciertos agentes crioprotectores empleados a altas concentraciones permiten obtener

muestras vitrificadas a velocidades de enfriamiento razonables.
- VOLUMEN DE MUESTRA: al disminuir el volumen de muestra se logran velocidades más altas de
enfriamiento disminuyendo la concentración de CPA necesarias para obtener el estado vitreo.
Entonces, la vitrificación depende de la tasa de enfriamiento, de la viscosidad y es inversamente
proporcional al volumen.

VENTAJAS

 Rapidez en el procesamiento individual de las muestras

 Muy bajo costo de equipamiento
 Previene los daños asociados a la formación de cristales de hielo
DESVENTAJAS

 Embriotoxicidad y citotoxicidad por la alta concentración de crioprotectores

 Resultados variables
 Requiere entrenamiento especifico en el laboratorio

CRIOPRESERVACIÓN
Congelación lenta Vitrificación
 -Baja concentración de -Alta concentración de crioprotectores
crioprotectores -Altas tasas de enfriamiento
-Tasa de enfriamiento baja y -Previene de la formación de cristales de
controlada hielo

Usos más comunes: Usos más comunes

→ Espermatozoides → Ovocitos < espermatozoides
→ Embriones producidos in vivo → Embriones producidos in vivo e in vitro
(más in vitro por los susceptibles que son
debido a todo el procesamiento por el que
pasan)

DISPOSITIVOS
Criopreservacion lenta: máquinas congeladoras (portátiles o de mesada).

Vitrificación: se utilizan dispositivos que pueden:

- TUBULARES: cerrados o semiabiertos de forma cilíndrica o capilar y tienen baja área superficial de
contacto con el nitrógeno líquido. Ejemplos: pajuelas, hemipajuelas (mitad del volumen de una
pajuela), pajuelas abiertas (el diseño “abierto” puede modificar su rendimiento térmico).
- SUPERFICIE: planos, curvos o con soporte tipo asa, diseñados para permitir una rápida transferencia
térmica y vitrificación ultra rápida. Alta relación superficie/volumen lo que permite una congelación
mucho más rápida. Ejemplos: Cryotop, Cryiloop, OPS (Open Pulled Straw) que son comerciales.
Lo que se hace es poner sobre una superficie lisa (en vez de que sea una pajuela donde tiene que
ingresar) la célula o el embrión que se quiera criopreservar y someterlo a eso al proceso de
congelamiento.
Descripción video: en primer lugar, para hacer el proceso de vitrificación hay una solución de equilibrio
donde se va a poner el embrión que venía siendo producido in vitro, se lo va a sumergir se lo deja unos
minutos para que pueda acondicionarse posteriormente a las distintas soluciones crecientes de
vitrificación (por esta exposición en primera medida se deshidratan). Lo sumerge primero en los vapores
de nitrógeno líquido y luego le pone en el nitrógeno líquido.
→Una vez hecha la vitrificación ¿cómo se lo va a descongelar? Se lo saca (utilizando unas pinzas), se lo
coloca en una solución para temperar y se hacen pasajes con soluciones decrecientes del crioprotector.
La célula vuelve a su tamaño original.

SISTEMAS BASADOS EN SOPORTES FÍSICOS

Tasas de congelamiento lo más convencional es entre 10 a 20 mil °C/min. Actualmente también se hace
mucho hincapié en las tasas de supervivencia y a que temperatura se descongela (tasa de
descongelamiento).

CARACTERÍSTICAS DE LA VITRIFICACIÓN
 Mayor tasa de supervivencia que en sistemas de enfriamiento controlado
 Posibilidad de empleo en criopreservacion de tejidos
 Inconveniente: se emplean concentraciones de ACP potencialmente toxicas, por lo que los tiempos
de exposición deben estar muy controlados (que sean lo más rápido posible para que estén menor
tiempo expuesto)
 Sistemas comerciales/costo = alto
 Alta transferencia térmica/manipulación en nitrógeno líquido
 Personal entrenado

¿CÓMO SEGUIR?

DESCONGELAMIENTO

Hay un trabajo del 2015 que no avanzó mucho pero que proponían un utilizar un calentamiento laser de
alta potencia directamente para poder tener rápidamente el cambio de los -196°C hasta los 37 °C y
alcanzar esta tasa de descongelamiento de 10 millones °C/min.

MEJORAR LA CALIDAD INTRÍNSECA DEL OVOCITO Y EL EMBRIÓN PRODUCIDO in vitro

Mejoramiento modular y la importancia de los colesteroles, de los fosfolípidos en la membrana de los

ovocitos (similar a lo que se comentó para espermatozoides).

En un resumen presentado en la Sociedad Argentina de Biología (2017) los autores reportaron que, con
el agregado de moléculas de ciclodextrina, colesterol y desmosterol en la membrana de los ovocitos,
después del proceso de vitrificación, esto mejoraba su tasa de supervivencia celular.