TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN SINTESIS O DUPLICACIN DEL ADN

1.- Molcula de la vida.

El ADN es la molcula de la herencia en todos los organismos vivos (procariontes y eucariontes). Sin embargo, en el caso de los virus, el material gentico puede ser ADN o ARN. Todos los ADN estn formados por dos muy largas cadenas helicoidales de bases nitrogenadas, que son: A : adenina G : guanina T : timina C : citosina
Purinas

Pirimidinas

Estas bases se encuentran enrolladas a lo largo de un eje comn. Las dos hebras de la doble hlice estn dispuestas en direcciones opuestas, es decir, mientras una tiene direccin 5 3 la otra tiene direccin 3 5. Ejemplo de una molcula de ADN: 5 ACTCGGAATGC 3 3 TGAGCCTTACG 5

Las dos cadenas permanecen juntas por enlaces de hidrgeno entre los pares de bases: - Adenina siempre se aparea con Timina (unidas por dos enlaces de hidrgeno) - Guanina est siempre apareada con Citosina (unidas por tres enlaces de hidrgeno). De esto se desprende que una de las hebras de la molcula de ADN es la complementaria de la otra.

Toda la informacin gentica o de la herencia es codificada por una secuencia precisa de bases a lo largo de la hebra de ADN.

La mayora de las molculas de ADN tienen circulares.

la caracterstica de ser

Adems el eje de la doble hlice de un ADN circular puede girar en s mismo, formndose una superhlice. Esta estructura recibe el nombre de ADN sobreenrrollado, que es una forma ms compacta que una molcula relajada (sin giro sobre su propio eje).

ADN relajado

ADN sobrenrollado

Durante el proceso de duplicacin de la molcula de ADN, lo primero que debe ocurrir es el desenrollamiento del ADN sobrenrollado y luego las dos hebras del ADN son separadas para que se pueda sintetizar una nueva molcula de ADN. Cada hebra padre acta como patrn para la formacin de la nueva hebra complementaria.

1.2 Requerimientos para la duplicacin del ADN.

En todos los organismos los requerimientos generales para la sntesis de ADN son los mismos: - una hebra de ADN como molde, en otras palabras una seccin de ADN que ser copiado.

- la enzima encargada polimerasa.

de

copiar

el

ADN,

llamada

ADN

El proceso de sntesis puede ser resumido como sigue: Mg+2 d (NMP)n + d NTP ADN polimerasa d (NMP)n+1 + PPi

donde d NTP es el deoxirribonuclesido trifosfato y d (NMP)n se refiere a un polmero de n deoxirribonucleotidos. El pirofosfato (PPi) generado por la reaccin anterior es hidrolizado a fosfato inorgnico conduciendo la reaccin hacia la derecha ( PPi 2Pi) .

1.3 Enzimas que participan en la duplicacin.

En procariontes.La duplicacin es un proceso complejo en la que participan muchas protenas. En bacterias, como E.coli, existen 3 polimerasas (Tabla I) y una ADN ligasa.

- ADN polimerasa I. Es una de las enzimas que es capaz de catalizar la sntesis de ADN. Posee una sola cadena polipetdica de 109 kDa. Contiene un tomo de zinc como cofactor. Esta enzima sintetiza en la direccin 5-->3 ( ver fig. 2).

Todas las ADN polimerasas poseen una actividad exonucleasa; esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple, removiendo deoxirribonucleotidos terminales desde el extremo 3 (actividad exonucleasa 3 5) o desde el extremo 5 (actividad exonucleasa 5 3).

- ADN polimerasa II Esta enzima sintetiza ADN en forma similar a la ADN polimerasa I, pero no tiene actividad exonucleasa 5 3.

-ADN polimerasa III La enzima esta compuesta por lo menos por 10 subunidades. Todas las subunidades son requeridas para que la enzima exprese su actividad total. Esta enzima es la responsable de la sntesis de ADN en E.coli.

Tabla I.

ADN polimerasas de E. coli. Mr (kDa) Molculas por clula Base sintetizada por segundo Direccin a) polimer. b) exonucl.

Polimerasa

109

400

16-20

a) 5 3 b) 3 5 y 5 3

II

120

17-100

2-5

a) 5 3 b) 3 5

III

180

10

250-1000

a) 5 3 b) 3 5 y 5 3

1.4 Origen de duplicacin.

La sntesis del cromosoma de E.coli siempre comienza en el mismo punto, llamado sitio ori C, una regin de 245 pares de bases.

oriC

Enzimas que participan en la sntesis de ADN en Eucariontes.

Por otro lado, existen cinco polimerasas en eucariontes son conocidas como alfa , beta , gamma , delta y psilon. Todos ellas tienen mecanismos de accin similares a las enzimas en procariontes (E.coli). - Las ADN polimerasas alfa y delta son las encargadas de la duplicacin del ADN cromosomal. - La ADN polimerasa beta consistente de una sola cadena polipeptdica es la responsable de la reparacin del ADN. - La ADN polimerasa gamma se encuentra en mitocondrias y es responsable de la duplicacin del ADN mitocondrial. - La ADN polimerasa psilon, enzima recientemente descubierta y su actividad es similar a la polimerasa delta.

1.5 Proceso General de Sntesis de ADN (Fig. 2).

Las hebras de ADN son antiparalelas y la cadena del ADN que va en direccin 3 5 es copiada directamente por la enzima ADN polimerasa III. La hebra hija sintetizada (5 3) es llamada HEBRA PRINCIPAL o ADELANTADA. La otra hebra del ADN padre que tiene la direccin opuesta, 5 3, no puede ser copiada directamente, debido que no es sustrato para la

enzima y solamente puede ser sintetizada hasta que una parte del ADN se ha desdoblado. La hebra hija resultante se llama HEBRA RETRASADA y es sintetizada en forma discontinua. Esta sntesis discontinua resulta de la formacin de cortas secciones de ADN de aproximadamente 1000 a 2000 nucletidos que reciben el nombre de FRAGMENTOS DE OKASAKI. Estas secciones son unidas por la accin de la enzima ADN ligasa produciendo una hebra de ADN continua, que algunas veces se conoce como ADN+.

ADN girasa (reduce los giros)

Proteinas SSB (cubren ADN de una hebra)

Helicasas (desdobla ADN)

Primosoma (hace el primer)

Primer

Holopolimerasa III (agrega dNTPs)

Topoisomerasa (relaja tensin)

Hebra Adelantada

Hebra
Retrasada
Pol I

El primer es removido y llenado el espacio

Ligasa

Figura 2. Proceso de sntesis de ADN.

1.6 Previo a la sntesis.

Previo al proceso de sntesis del ADN propiamente tal, el ADN padre de doble hebra debe desenrollarse, para lo cual se requiere la accin de la protena REP o HELICASA que necesita energa proveniente del ATP. Adems en este proceso de desenrollamiento participa la enzima ADN girasa, que acta dando giros negativos al ADN padre cuando este se encuentra sobre enrollado.

1.7 Etapa inicial de la sntesis.

Para comenzar la sntesis de ADN se requiere la presencia de doble hebra como patrn-cebador. La segunda hebra corresponde a una hebra de ARN, llamada PRIMER o PARTIDOR y es sintetizada por una enzima llamada PRIMASA. La forma activa de esta enzima requiere una serie de protenas. Entre estas protenas se encuentra la PROTEINA N o dnaB, que selecciona el sitio en que la primasa actuar. El complejo formado entre la primasa y las protenas auxiliares recibe el nombre de PRIMOSOMA.

1.8 Regla para la Sntesis.

La regla principal para la actividad de la ADN polimerasa es que cataliza la formacin de un enlace fosfodiester solamente si la base entrante es complementaria al nucletido de la hebra padre. En otras palabras las ADN polimerasas son enzimas dirigidas por la hebra patrn o padre.

Como mencionamos anteriormente las ADN polimerasas I. II y III poseen la actividad exonucleasa que permite aumentar la fidelidad de la duplicacin o replicacin del ADN, removiendo los nucletidos que fueron puestos erradamente.

1.9 Proceso de Sntesis en procariontes

Una vez desenrollado la doble hebra de ADN, la enzima primasa coloca el ARN partidor y de ah comienza la sntesis de la hebra hija por la accin de la enzima ADN polimerasa III. Recordemos que esta enzima es la responsable de la duplicacin, mientras que la ADN polimerasa I acta como enzima auxiliar sacando la hebra de ARN partidor y luego sintetizando el trozo faltante, adems ella tambin participa en la reparacin del ADN.

Durante el proceso de duplicacin del ADN circular (E.coli) se produce una estructura caracterstica, formada por dos horquillas (o frentes) de duplicacin. Direccin de
la replicacin

La velocidad de sntesis en E.coli , es de 800 bases por segundo.

1.10 Otras protenas del proceso de sntesis.

A continuacin describiremos otras protenas que participan en el proceso de duplicacin del ADN:

- HELICASA: son enzimas requeridas para desdoblar y abrir la molcula de ADN padre debido que esto no ocurre espontneamente. Las helicasas requieren ATP como cofactor. Dos diferentes helicasas han sido descritas, una de ellas se mueve en direccin 3 5 del ADN padre y recibe el nombre de REP o HELICASA II o COPOL III ( subunidad beta de la ADN polimerasa III) y las otras se mueve en direccin 5 3, llamadas HELICASA I y III.

- PROTEINAS QUE SE UNEN A HEBRA SIMPLE (SSB): Las hebras simples de ADN generadas por las helicasas son mantenidas separadas por la unin de las protenas SSB a la hebra de ADN. (ver figura 3 y Tabla II)

- ADN LIGASA es una enzima que cataliza la formacin de enlaces fosfodiester entre polinucletidos preformados. La ADN ligasa esta involucrada en la sntesis de ADN discontinua, uniendo los fragmentos de OKASAKI una vez que se ha reemplazado el partidor de RNA. Ellas tambin estn involucradas en los mecanismos de reparacin del ADN daado. Existe un solo tipo de ADN ligasa en procariontes y dos en eucariontes; ambas funcionan en el ncleo.

Tabla II. Principales protenas de la duplicacin de E.coli.

Protenas Protena N o dnaB Primasa Helicasas Protenas SSB ADN girasa ADN polimerasa III ADN polimerasa I ADN topoisomerasa I ADN topoisomerasa II ADN ligasa Funciones Capacita a la primasa para comenzar la duplicacin Sintetiza el ARN partidor. Desdobla la doble hlice. Estabiliza regiones de hebra simple. Introduce giros a la superhlice. Sintetiza el ADN. Saca la hebra partidora y completa los espacios. Corta una hebra de ADN. Corta ambas hebras de ADN. Une los extremos de los polinucleotidos preformados.

10

1.11 Duplicacin del ADN en Eucariontes.

El mecanismo de sntesis del ADN en eucariontes es probablemente similar al proceso en procariontes. La velocidad de las polimerasas en eucariontes es mucho menor que en procariontes. Para compensar esto, las clulas eucarioticas contienen ms de 20.000 molculas de enzimas. Adems, las clulas eucarioticas tienen un gran nmero de horquillas de duplicacin y fragmentos de Okasaki mas pequeos de 40 - 300 bases. De esta forma la velocidad de duplicacin del ADN es mayor en eucariontes. La ADN polimerasa delta es la encargada de sintetizar la hebra principal o adelantada y la polimerasa alfa la hebra retrasada. El ADN en eucariontes esta unido con histonas, por lo tanto la duplicacin involucra dos pasos extras; - Primero el ADN se debe disociar de las histonas para comenzar la duplicacin. - La sntesis de histonas tiene lugar al mismo tiempo que la sntesis de ADN y las histonas se deben unir al nuevo ADN. Algunos virus poseen otra forma de sintetizar ADN, debido que tienen una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA capaz de usar como hebra molde la molcula de ARN.

11

5 3

3
3

Procariontes

3 5 Hebra adelantada

3 5 Hebra retrasada

Figura 3. Esquema que muestra el loop que se forma en la hebra retrasada para que la ADN polimerasa III tenga la misma posibilidad de actuar en ambas hebras.

5' Primasa Pol 3' 5' Helicasa PCNA Pol

Figura 4. Sntesis de ADN en eucariontes.

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TRANSCRIPCIN DE ADN SINTESIS DE ARN

El flujo de la informacin gentica en las clulas normalmente es: ADN ARN Protena

La sntesis de ARN usando un ADN patrn es llamada transcripcin, mientras que la sntesis de protena a partir de un ARN patrn es llamado traduccin.

2.1 Clases de ARN.

Existen tres clases de ARN: - ARN mensajero (mARN) - ARN de transferencia (tARN) - ARN ribosomal (rARN) En general, todos estos ARN son de hebra simple, pero el ARN de transferencia y ARN ribosomal contienen extensas regiones de doble hlice (la cadena de nucletidos se dobla formando una horquilla o loop). Los ARN ms pequeos son los tARNs, que contienen alrededor de 75 nucletidos, mientras que el ms grande esta entre los mARN, que pueden tener ms de 5.000 nucletidos.

2.2 Enzima de la sntesis

Todos los ARN celulares son sintetizados por la ARN polimerasa de acuerdo a las instrucciones dadas por un ADN-patrn (o molde),

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empleando ribonuclesido-5-trifosfatos como sustrato. La direccin de la sntesis de ARN es 53, similar a la sntesis de ADN. La actividad de la ARN polimerasa es diferente a la actividad de la ADN polimerasa porque no necesita una secuencia partidora o primer y no posee una actividad nucleasa. Otra diferencia es que el ADN patrn es totalmente conservado despus de la sntesis de ARN.

La secuencia de ADN transcrito por la ARN polimerasa en ARN es llamado UNIDAD DE TRANSCRIPCIN y el producto de la sntesis (ARN) es el TRANSCRIPTO PRIMARIO.

La ARN polimerasa de E. coli (procariontes) esta formada por subunidades 2 y un peso molecular cercano al medio milln de dalton (450 kDa). El corazn de la enzima consiste de 2 (enzima ncleo). La sub-unidad sigma ( ) aumenta la velocidad y especificidad de la transcripcin, debido que ayuda a la ARN polimerasa a reconocer la seal de inicio en el ADN-patrn. La sub-unidad sigma estara reconociendo una regin particular del ADN, que se encuentra a 35 bases antes del sitio de inicio de la transcripcin. Esta regin del ADN recibe el nombre de regin PROMOTORA y adems de esta regin, en E. coli existe otra regin promotora a 10 bases antes del inicio de la transcripcin y est regin del ADN esta relacionada con el lugar donde se une la enzima ncleo.

2.3 Regin Promotora (E.coli)

-35 -10 +1 (ADN) ------- TTGACA ------- TATAAT --------------------------Inicio de la transcripcin

14

El signo negativo indica que las bases se encuentran antes del sitio de inicio de la transcripcin

2.4 Proceso de sntesis

La unin de la ARN polimerasa a estas regiones promotoras permiten un desenrollamiento local de 17 pares de bases de la molcula de ADN patrn (llamada burbuja de transcripcin). La sntesis de ARN siempre comienzan con GTP ATP, es decir, con una base purina. La subunidad sigma se disocia desde la holoenzima cuando se han trascrito 12 bases. Esta subunidad una vez suelta puede unirse a otra enzima ncleo, permitiendo el inicio de una nueva sntesis. ARN polimerasa
+ 1 punto de inicio -35 3 ADN 5 -10 5 3

Enzima ncleo (a) Subunidad Sigma

+1 punto de inicio -35 -10

ppp

5'

3'

15

(b)

ARN en crecimiento

5' p p p ppp NTP

-35

-10

(c)

Subunidad sigma disociada

Figura 5. Inicio y elongacin de la cadena de ARN (transcripcin). (a) Unin de la holoenzima a la regin promotora (complejo cerrado) (b) Separacin de la doble hebra (complejo abierto) (c) Elongacin en direccin 5' 3' , a los 12 nucletidos transcritos la subunidad sigma se disocia.

Las regiones promotoras afectan la frecuencia de inicio de la transcripcin. Lo anterior es reflejado en los siguientes ejemplos: en cada clula de E. coli contiene solamente 12 molculas de represor lac y su gen es transcrito una vez cada 30 minutos. Por otro lado, el gen de ARN ribosomal es transcrito una vez por segundo aproximadamente.

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2.5 Terminacin de la Transcripcin.

La terminacin de la transcripcin es tan controlado como su iniciacin. El ADN-patrn contiene seales de detencin para la transcripcin. Existen dos mecanismos de terminacin en E. coli: uno es dependiente de una protena auxiliar llamada factor rho y otro independiente de este factor. Terminacin independiente del factor rho. Esto es distinguido por la presencia de una secuencia rica GC en el ADN seguido por cinco o seis adeninas. EL ARN transcriptos lgicamente tambin posee esta regin rica en GC, regin que es capaz de formar un loop o estructura de horquilla como resultado de interaccin entre bases complementarias. Adems seguido de esta regin rica en GC, en el extremo 3 del ARN aparece una secuencia rica en uracilo. Se ha observado que la unin Uracilo con Adenina de la hebra de ADN molde es menos estable y as el ARN es capaz de disociarse ( ver fig. 6 ). Por consiguiente el duplex ADN-ARN se suelta y se libera el ARN sintetizado. C U C U G -- C A -- U C -- G C -- G C -- G C -- G C -- G C -- G G 3' 5' U - A - A - U - C - C - C - A - C - A - G - OH C

---

A-U-U-U-U

Figura 6. Estructura secundaria del ARN sintetizado (seal de termino).

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Terminacin dependiente del factor rho. Tambin requiere la presencia de la estructura de horquilla (regin rica en GC). Sin embargo, la secuencia rica en U est ausente. El factor rho, es una protena compuesta por seis sub-unidades idnticas de 46 KDa y tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energa liberada es capaz de mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se esta sintetizando en direccin de la burbuja de transcripcin. Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el hbrido ADN-ARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al citoplasma (ver fig. 7).

ARN polimerasa

Factor rho

ADP + Pi

5'

ATP + H2O

Figura 7. Terminacin dependiente de rho La transcripcin puede ser bloqueada por inhibidores especficos, llamados comnmente antibiticos. Por ejemplo, el antibitico rifampicina inhibe la iniciacin de la sntesis de ARN, mientras que la actinomicina D bloquea la elongacin del ARN.

2.6 Transcripcin en eucariotes

La maquinaria transcripcional de eucariontes es lejos ms complejo que en procariontes. Una importante consideracin es que en eucariontes superiores solamente una pequea proporcin del genoma es expresada a ARN (cerca de 10% como mximo). Una considerable proporcin del genoma de eucariontes existe permanentemente como cromatina (ADN

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cromosomal) altamente condensada y es transcripcionalmente inerte. Adicionalmente, hay protenas accesorias especficas llamadas FACTORES DE TRANSCRIPCIN y son requeridos para una transcripcin eficiente de todos los genes de eucariontes.

Diferente al factor bacterial sigma (), los factores de transcripcin no se unen a la polimerasa directamente. Ellos forman complejos con la cromatina (ADN cromosomal) antes del inicio de la transcripcin y acta como un regulador positivo de la transcripcin.

2.7 Enzimas de la trancripcin en eucariontes. El ncleo de eucariontes contiene tres tipos de ARN polimerasas: - ARN polimerasa I (localizada en el nuclolo) transcribe los genes de ARN ribosomal. El transcrito primario producido corresponde a un prerARN que posteriormente sufre algunas modificaciones para transformarse en una rARN maduro. -ARN polimerasa II (se encuentra en el nucleoplasma) transcribe los genes que codifican para protena y el transcrito primario corresponde a un ARN nuclear heterogneo (hnARN), que son los precursores del ARN mensajeros citoplasmtico. -ARN polimerasa III (nucleoplasmtica) transcribe el rARN 5S (ARN ribosomico) y los tARNs (ARN de transferencia).

La reaccin catalizada por todas las polimerasas en eucariontes es bioqumicamente la misma que la reaccin de las enzimas de E. coli (procariontes).

Todas las polimerasas eucarionticas son grandes molculas con masas que exceden los 500 kDa. Ellas contienen dos sub-unidades con masas superiores a 100 kDa, cada una de las cuales es una polimerasa especfica y adems poseen 12 sub-unidades menores,

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algunas de las cuales son comunes a los tres tipos de polimerasas. La precisa funcin de cada sub-unidad es an desconocida.

2.8 Regin promotora para la actividad de ARN polimerasa I

Para el caso particular de la ARN polimerasa I que sintetiza el ARN ribosomal. En el gen (ADN) para el rARN presenta una regin promotora de 150 pares de bases, ubicada en la posicin -142 y +6. Sin embargo, existen copias imperfectas del largo total del promotor en posiciones -1200 y -2300 pares desde el sitio de inicio de la transcripcin y entre estas regiones hay mltiples copias de 60 81 pares de bases de la regin promotora ( ver Fig. 8). Las copias 60/81 estimulan la transcripcin del verdadero promotor y puede estar involucrado en la unin de un factor presente en cantidades limitadas. Las copias totales de los promotores pero imperfectos son capaces de iniciar la sntesis de ARN, pero este efecto termina antes de alcanzar la verdadera regin promotora.
Punto de inicio

gen 28S rARN

Promotor espaciador

repeticiones de 60/81 bp

Promotor del gen

Gen 18S rARN

-4000

-2000

+1

Figura 8. Regin promotora del gen de rARN, con una regin promotora verdadera ( ) y con copias imperfectas de ella ( . ).

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2.9 Regin promotora para la ARN polimerasa II.

Los genes transcritos por la polimarasa II producen los ARN mensajeros. Estos incluyen los genes que codifican a las protenas que son expresadas constitutivamente (que siempre son expresadas) en todos los tejidos y aquellos genes que solamente son expresados en un tejido particular de un organismo multicelular o que esta regulado por la presencia o ausencia de un sustrato particular, hormona o estmulo ambiental. Los promotores para la ARN polimerasa II estn localizados en el lado 5 del sitio de inicio de la transcripcin.

-80 -25 inicio --CAAT----------GGGCCCGGG------GGGCCGGG---------TATA-------

Estas secuencias tienen la funcin de unir los factores de transcripcin especficos en vez de dirigir los puntos de contacto con la ARN polimerasa II, como ocurre en procariontes. Varios promotores que estn relativamente cercanos al punto de inicio de la transcripcin, son necesarios pero normalmente insuficientes para que se realice una eficiente expresin de los genes por la enzima ARN polimerasa II.

Adems existen otros tipos de secuencias en el ADN molde llamadas ENHANCER que no tienen actividad promotora por si mismas, pero que pueden estimular la transcripcin y pueden actuar sobre considerables distancias de varios kilobases del sitio de inicio de la transcripcin. Una caracterstica de los enhancer es que realizan su accin independiente de la orientacin que ellos tengan (Fig. 9)

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-8,000
Enhancer Promotor Sitio de inicio

+1

Figura 9. Esquema de la posicin del Enhancer con respecto al promotor.

El transcrito primario de la ARN polimerasa II, son conocidas colectivamente como ARNs nucleares heterogneos. Ellas pueden llegar a ser grandes molculas (sobre 10 kilobases) debido que contiene an los intrones (secuencia que no son traducidas a protena) en la secuencia de ARN, pero ellas no estarn presente en el ARN maduro.

2.10 SINTESIS DE ARN MENSAJEROS

La sntesis de un mARN en eucariontes (ver fig. 10): - (1) Comienza la transcripcin de un ADN cuando una ARN polimerasa se encuentra a 20 o 30 nucletidos despus de la secuencia TATA. - (2) Cuando el transcrito ( ARN) ha alcanzado 30 nucletidos de largo, en su extremo 5 es colocado una guanosina unido a un grupo trifosfato que adems es metilado. - (3) La ARN polimerasa se nueve a lo largo del ADN transcribiendo tanto exones como intrones. Hasta que se transcribe la secuencia AAUAAA, despus de cerca de 20 nuclotidos de esta secuencia, el transcrito es cortado; la reaccin probablemente involucra una pequea ribonucleoprotena nuclear (snRNP) que contiene una molcula de ARN ( U1 ARN) rico en uracilo. - (4) Una enzima adiciona una secuencia de 150 a 200 adeninas en el extremo 3 de la hebra de ARN naciente.

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- (5) El transcrito es procesado y son cortados los intrones, probablemente con la ayuda de otras snRNPs; y nuevamente U1 ARN se une a una secuencia complementaria (que incluye GU) en el comienzo del intron, tambin en este proceso participan otras 6 molculas de ARN (denominadas U2,U3,...U7) - (6) Los intrones son doblados y cortados - (7) Los exones son unidos para formar finalmente el ARN mensajero maduro

La mayora de los genes en eucariontes superiores son discontnuos. Las secuencias que se codificaran en estos genes (exones) son separadas por secuencias que no son traducidas (intrones), que son removidos en la conversin del transcripto primario a mARN maduro.

(1)
TAT A

ARN Polimerasa II

ADN

(2)
TATA

+CH3 G -P-P-P

Transcrito primario Enzima

23

(3)

CH3 G -P-P-P snRNP

AAUA AA

U1 ARN

Enzima Poli (A)

(4)

CH3

! G
AAAA...

AAUAAA

P-P-P

(5)

snRNP U1 ARN CH3

GU

GU

24

G
AAAA...

P-P-P

(6)

GU

! G - P-P-P

GU

CH3

AAAA...

CH3

! G - P-P-P

GU

(7)

GU

AAAA...

Figura 10. Transcripcin de un mARN en Eucariontes (las explicaciones se encuentran en el texto).

ARN Polimerasa III

Los genes transcritos por la ARN polimerasa III ( rARN 5S, tARN y varios ARNs nucleares y citoplasmticos pequeos) usualmente contiene menos de 300 nuclotidos. Genes de rARN 5S no contienen intrones mientras que muchos genes de tARN poseen pequeos intrones.

25

2.11 Regin Promotora para la accin ARN polimerasa III.

El control de transcripcin mejor estudiada es del gen rARN 5S, que inesperadamente tiene una secuencia promotora dentro de su secuencia transcrita. Se ha determinado que la regin interna promotora esta entre las posiciones + 50 y + 84, que mostr ser esencial para la transcripcin de los genes rARN 5S (fig. 11). En la regulacin de las sntesis de rARN 5S existen factores llamados : TFIIIA, TFIIIC, que son requeridos para una transcripcin eficiente.

Gen 5S rARN
Regin Promotora

5'

3'

5S rARN
-80 -40 0 +40 +80 +100

Figura 11. Localizacin de la regin promotora del gen 5S rARN de X. laevis.

2.12 Modificaciones Post Transcripcionales

Muchos ARNs son modificados qumicamente (Ej. metilados) y escindidos o cortados despus de la transcripcin. Los mARNs son modificados por acoplamiento de una larga cadena de poli-A a su extremo 3. Los rARNs se generan a partir de una larga cadena precursora que finalmente es escindida para rendir los ARNs maduros.

26

CDIGO GENTICO
La secuencia de bases de un gen es colineal con la secuencia aminoacdica de su producto polipeptdico. El cdigo gentico es la relacin entre la secuencia de bases en el ADN (o su ARN transcrito) y la secuencia de aminocidos en una protena. Los aminocidos son codificados por un grupo de tres bases (llamadas codones) comenzando de un punto determinado (ver fig. 12).

Se pueden definir cuatro caractersticas generales del cdigo gentico: 1) El cdigo no requiere de puntuacin ni seal alguna para indicar el final de un triplete y el comienzo del siguiente, es decir el cdigo gentico no tiene comas. nicamente requiere de una molcula de mARN que este ubicada correctamente para su lectura (53) adems de contar con el codn de inicio, AUG (en procariontes codifica la incorporacin de N-formilmetionina y en eucariontes metionina). 2) 61 de 64 codones especifican algn aminocido en particular. De esta forma, para la mayora de los aminocidos hay ms de un triplete (o codn). En otras palabras, el cdigo es DEGENERADO. Codones que especifican el mismo aminocido son llamados sinnimos. La mayora de los sinnimos difieren solamente en la ltima base del triplete. Esto presenta una ventaja, debido a que la mayora de las mutaciones conducen a la formacin de tripletes sinnimos no provocando un cambio en la secuencia peptdica. 3) La tercera base de los tripletes es menos especifica que las dos primeras. La degeneracin implica solamente la tercera base en la mayora de los casos (excepto para Arginina, Leucina y Serina). 4) 3 de los 64 tripletes no codifican para aminocido alguno y estos son UAG, UAA y UGA llamados originalmente codones sin sentido que constituyen las seales de termino de la sntesis de la cadena polipeptdica.

27

SEGUNDA LETRA U UUU UUC U PRIMERA LETRA UUA UUG CUU CUC C CUA Leu CUG Leu UCA Leu UCG Ser Leu CCU Leu Pro CCC Pro Leu CCA CCG Pro Ile ACU Ile ACC Ser UAA UAG CAU CAC CAA CAG Pro Gln Stop UGA Stop UGG His CGU His CGC Gln CGA CGG Stop Trp Arg Arg Arg Arg Phe UCU Phe UCC C Ser UAU Ser UAC A Tyr UGU Tyr UGC G Cys Cys

AUU AUC A AUA AUG Met

Ile ACA Thr ACG AAA Lys Thr AAG Lys GUU Val GCU GAU Asp GUC Val Ala GAC Asp GCC GUA Val Ala GAA Glu GUG Val GAG GCA Glu Ala GCG Ala Figura 12. Cdigo gentico.

Thr AAU Thr Asn AAC Asn

AGU AGC AGA AGG Arg GGU GGC GGA GGG

Ser Ser Arg

Gly Gly Gly Gly

28

TRADUCCIN O SNTESIS DE PROTENAS

La sntesis de protenas tienen lugar en la superficie de los ribosomas. Dicha sntesis requiere que los aminocidos sean activados en el citoplasma por la accin de aminoacil- tARN-sintetasas, que catalizan la formacin de steres de aminocidos de tARN homlogos (unin de un aminocido con su tRNA respectivo) y en forma conjunta en el proceso de activacin se hidroliza ATP produciendo AMP y pirofosfato. Las aminoacil-tARN-sintetasas son altamente especficas tanto para el aminocido como para su correspondiente tARN.

Aminoacido + ATP Aminoacil- AMP + tARN

aminoacil AMP + PPi aminoacil-tARN + AMP

Aminoacido + ATP + tARN

aminoacil tARN + AMP + PPi

El aminocido se une al extremo 3 del tARN que posee la secuencia CCA, mientras que el anticodn esta a 80 de distancia en el otro extremo (ver fig. 13).

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3 A C 5 C

Sitio de unin al aminocido

Loop DHU

Loop TC

anticodn Figura 13. Estructura de hoja de trbol caracterstica de un tARN

El ARN mensajero reconoce el anticodn de un tARN en vez de reconocer el aminocido. Un codn en mARN se aparea con el anticodn en el tARN. Algunos tARNs reconocen ms de un codn porque la tercera base que se aparea de un codn es menos especifica que las otras dos ( ver cdigo gentico).

3.1 Los Ribosomas.

La sntesis de protena tiene lugar en los ribosomas, que estn formados por una subunidad mayor y una menor, cada una de las cuales estn compuestas de dos tercios de ARNs y un tercio de protenas. En E. coli, por ejemplo, el ribosoma 70 S ( 2.500 kdal) est formado por una sub-unidad de 30 S y una de 50 S. En cambio en eucariontes el ribosoma es de 80 S, formado por uno de 40 S y uno de 60 S.

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- El coeficiente de sedimentacin de macromolculas biolgicas son expresadas en unidades Svedberg (abreviada como S). 1 S = 10-13 seg.

Hay tres fases en la sntesis de protena: inicio, elongacin y termino.

CADENA NASCIENTE

40 S

INICIO ELONGACION
40 S 60 S 60S

INICIO

STOP

5' 3'

TERMINO

40 S 60 S

Figura 14. Ciclo de la sntesis de protena.

3.2 Inicio.
En procariontes el ARN mensajero, la formilmetionina- tARN y la subunidad ribosomal 30 S, forman el complejo iniciacin de la sntesis (en cambio para eucariontes este complejo est formado por mARN, metionina-tARN y la sub-unidad 40 S, ver fig. 14). La seal de inicio en el mARN es AUG y esta precedida por una secuencia rica en purina que puede aparearse con el rARN 16 S de la

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sub-unidad 30 S del ribosoma. La subunidad mayor ribosomal de 50 S se une a este complejo para formar un complejo de iniciacin de 70 S, (ver fig. 15) que esta listo para la siguiente fase (elongacin). En el proceso de iniciacin estn participando una serie de factores protecos que son descritos en la Tabla IV.

mARN

fMet.tARNMet 30S IF-1 IF-3 IF-1 IF-3 IF-2 GTP

IF-2GTPfMet-tARN

Met

GDP +Pi IF1 IF2

50 S

30 S

Complejo de inicio 70 S

Figura 15. Fase de inicio de la sntesis de protena en baterias (procariontes). 30S y 50 S son la subunidad menor y mayor del ribosoma respectivamente. IF, son factores proteicos de inicio.

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3.3 Elongacin.
El ciclo de elongacin consiste en (ver fig. 16) : 1) La unin de aminoacil-tARN (reconocimiento del codn). 2) Formacin del enlace peptdico. 3) Transposicin. Tambin durante la elongacin se requiere la presencia de factores proteicos que son descritos en la Tabla V.

La direccin de lectura del mARN es de 5 3y el crecimiento de la cadena polipeptidica es hecho desde el extremo amino al extremo carboxilo.

Sitio E

f- Met Sitio A

Ingreso del aminoaciltARN al sitio A

f-Met

Arg

Sitio P GTP GDP + Pi

AUG- CGA- GCU------------3 AUG.CGA -

----------------

Inicio de un nuevo ciclo

Formacin del enlace peptdico catalizado por la peptidil transferasa Sitio A vaci

f- Met | Arg |

f- Met | Arg |

Translocacin

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-AUG-CGA-GCU-----CGA-GCU

GDP + Pi

GTP

----------------- AUG-

Figura 16. Fase de elongacin de la cadena peptdica: unin del aminoacil-tARN, formacin del enlace peptdico y translocacin.

3.4 Termino.
La sntesis de protena es terminada por factores de liberacin, que reconocen los codones de terminacin UAA, UGA y UAG provocando la hidrlisis entre el polipeptido y el tARN (Tabla VI).

La energa requerida tanto en la formacin del complejo de iniciacin son 70 S como en la unin del aminoacil- tARN al ribosoma, y en la transposicin son obtenidos de la hidrlisis del GTP ( ver Tabla VII ).

Varios pasos en la sntesis de protena son especficamente inhibida por toxinas y antibiticos. Por ejemplo, puromicina inhibe la sntesis de la cadena peptdica por su interaccin con el peptidil - tARN en la ribosoma, formando peptidil- puromicina que libera el complejo ribosomal ( ver Tabla VIII). Por otro lado, los polirribosomas, tambin denominados polisomas, consisten en molculas de mARN a las que estn adheridos muchos ribosomas, cada uno de los cuales, leen el mARN independientemente y construyen una cadena polipeptdica. En las clulas eucariticas, la

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sntesis proteca puede tener lugares en ribosomas libres, o bin, en los ribosomas unidos al retculo endoplasmtico.

Tambin existe sntesis proteca en las mitocondrias y en los cloroplastos, los cuales poseen mARNs, tARNs especficos, aminoaciltARN-sintetasas y ribosomas.