Tecnologa Industrial

Qumica combinatoria: gestin de los productos de partida

J.I. BORRELL BILBAO
Dpto. de Qumica Orgnica. Instituto Qumico de Sarri. Universidad Ramn Llull (Barcelona)

1. INTRODUCCION
Las industrias farmacuticas y agroqumicas (insecticidas, herbicidas y fungicidas) presentan, pese a su aparente disparidad de objetivos, dos caractersticas comunes: - Necesidad continua de nuevas molculas que presenten actividad biolgica. - Mtodos de optimizacin de dicha actividad biolgica una vez conseguida una posible cabeza de serie. Por lo que respecta a la necesidad de nuevas molculas con actividad biolgica, ambos tipos de industrias han recurrido a las vas tradicionales para el descubrimiento de compuestos activos: 1. Evaluacin de colecciones de compuestos provenientes de sus propios archivos o de fuentes externas a la compaa (por ejemplo, universidades). 2. Bsqueda de compuestos activos de origen natural.
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3. Sntesis convencional uno cada vez (one-at-a-time) apoyada por los mtodos SAR (Relaciones Estructura-Actividad). 4. Bsqueda de compuestos activos provenientes de procesos fermentativos. 5. Diseo racional de compuestos activos cuando se conoce la estructura del receptor. El empleo combinado de todos estos mtodos ha permitido la obtencin de un elevado nmero de compuestos con actividad biolgica, aunque para ello pueda haber sido necesario obtener y probar un gran nmero de posibles candidatos. En este sentido, hay que recordar que se considera que la probabilidad de obtener un compuesto activo es de uno en 10.000 compuestos sintetizados. En muchas ocasiones, el ensayo biolgico de dichos candidatos ha constituido un importante cuello de botella en el proceso. El desarrollo en los ltimos aos

de mtodos de ensayo biolgico de alta eficacia (High Throughput Scr eening) ha revolucionado completamente la situacin pues, al ser capaces de realizar el test de un elevado nmero de compuestos en un tiempo corto, han hecho que la obtencin de candidatos para dicho tipo de ensayos sea el nuevo cuello de botella. Hay que recordar que la sntesis clsica de laboratorio permite que un qumico experimentado obtenga un mximo de 5-10 compuestos por mes. Esta circunstancia ha hecho que las empresas farmacuticas y agroqumicas se volcasen en la bsqueda de nuevos compuestos para el ensayo biolgico. En este sentido es revelador el elevado nmero de peticiones de muestras, provenientes de multinacionales de los campos farmacutico y agroqumico, recibidos por los grupos universitarios durante los ltimos aos. Todas estas circunstancias han fa67

vorecido la aplicacin de la qumica combinatoria como herramienta para el descubrimiento de nuevas molculas biolgicamente activas.

2. QUIMICA COMBINATORIA
El objetivo bsico de la Qumica Combinatoria [1] consiste en la produccin (biblioteca) de todas las posibles combinaciones (molculas) de un set base de componentes modulares (reactivos). Es decir, si para la obtencin de una determinada estructura qumica son necesarios n tipos de reactivos y de cada uno de ellos tenemos m 1 , m 2 , ..., m n reactivos comercialmente asequibles, sera en principio posible obtener (m1 x m2 x ... x mn) compuestos diferentes. As, por ejemplo, la sntesis de amidas a travs de la reaccin entre cloruros de cido y aminas podra rendir ms de 40.000 productos diferentes dado que pueden existir del orden de 200 cloruros de cido diferentes y otras tantas aminas primarias. R1COCI + NH2 - R2 R1CONHR2 Evidentemente, existen limitaciones al objetivo bsico de la qumica combinatoria, la obtencin de todas las posibles combinaciones, pues: - Es imposible obtener un nmero tan grande de compuestos mediante la forma de trabajo tradicional uno a la vez si se tiene en cuenta la capacidad sinttica de un qumico convencional (5-10 compuestos por mes).

- Aunque el problema sinttico no existiese, hay limitaciones intrnsecas en la produccin de una biblioteca grande de compuestos. As, la produccin, por ejemplo, de una biblioteca de pptidos de 60 aminocidos de longitud basada en los 20 aminocidos naturales tendra 20 60 = 1,15 x 10 78 componentes, no existiendo suficiente materia en el universo conocido para realizar su obtencin. En consecuencia, ha sido necesario actuar en dos frentes para conseguir implementar la qumica combinatoria como herramienta para la obtencin de nuevos compuestos con actividad biolgica: a) Desarrollo de mtodos de automatizacin de la sntesis (robotizacin) a travs de la paralelizacin de la sntesis (realizacin de varias reacciones al mismo tiempo) (Parallel Synthesis) [2]. b) Creacin de bibliotecas virtuales con todos los posibles compuestos que se podran obtener mediante qumica combinatoria que contengan una subestructura determinada (scaffold) y desarrollo de una sistemtica de seleccin de un subset de candidatos a obtener que sean representativos del conjunto de la biblioteca (cuyas propiedades calculadas mediante tcnicas QSAR cubran lo mejor posible el espacio de diversidad); es decir, se debe realizar el llamado anlisis de diversidad (Diversity Analysis) [3] (Fig.1). La integracin de la qumica combinatoria, la sntesis robotizada, los mtodos de anlisis de diver-

sidad, los mtodos de evaluacin de actividad de alta eficacia y las tcnicas de QSAR han permitido la creacin de una nueva metodologa (Fig.2) para el descubrimiento de nuevas molculas con posible actividad biolgica (o para la optimizacin de la actividad de un cabeza de serie) que se ha dado en llamar diseo combinatorio de compuestos biolgicamente activos (a veces llamado irracional por contraposicin al diseo racional basado en el conocimiento del receptor molecular). Ahora bien, este tipo de metodologa presenta un problema fundamental: la sntesis robotizada no se puede realizar usualmente en la forma habitual (fase lquida) debido a las dificultades de automatizacin de las operaciones bsicas de sntesis a escala laboratorio (filtracin, extraccin, etc.). Por ello se decidi aplicar la metodologa de la sntesis en fase slida (SPS), desarrollada para la sntesis de pptidos (Mtodo de Merrifield), a la sntesis de molculas orgnicas convencionales [4]. Dicha aplicacin necesit de: - Un material polimrico insoluble e interligado (bead) que sea inerte en las condiciones de sntesis habituales en qumica orgnica convencional. Las primeras resinas empleadas fueron polmeros de poliestireno parcialmente interligados, preparados por polimerizacin catalizada por luz o por catlisis radicalaria en mezclas acuosas/orgnicas. La primera forma de resina po-

Fig.1. El anlisis de diversidad en el diseo de una biblioteca combinatoria

Fig.3. Esquema general del diseo combinatoria de compuestos biolgicamente activos

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Fig.3. Acoplamiento entre la resina de Merrifield y un aminocido protegido

liestirnica empleada en sntesis de pptidos (resina de Merrifield, Fig. 3) presenta grupos clorometilo a los que se acoplan grupos aminocido por desplazamiento nucleoflico. Hoy en da, dado que la qumica combinatoria pretende tambin la sntesis de molculas no-peptdicas, se emplean diversos tipos de resinas entre las que cabe destacar la resina Tentagel S OH, que consiste en un 80% de polietilenglicol unido a un poliestireno interligado con el fin de aumentar la hidrfilia del polmero [5]. Las resinas y, en general, los soportes slidos empleados en SPS muestran una variedad de formas siendo la ms comn la esfrica. Por otro lado, tambin se han preparado una serie de extrusiones polietilnicas con salientes poliacrlicos llamados pins con formas diferentes que presentan una mxima superficie diseada para optimizar la capacidad del producto [6]. - Una forma de enlazar el sustrato a la fase slida permitiendo la escisin selectiva de algunos o todos los productos durante la sntesis para analizar el curso de la reaccin y para finalmente rendir el producto final de inters. El grupo espaciador es el que une la resina con el sustrato y es parte esencial en la sntesis en fase slida ya que este grupo dicta la forma de escisin del sustrato de la fase slida y la funcionalidad del grupo terminal del producto final. Cabe decir, que la liberacin de grupos cido carboxlico y de carboxamida ha sido ampliamente estudiada. Actualmente, la unin de cidos

carboxlicos en bibliotecas combinatorias se da a travs del uso de la resina Wang (Fig. 4) [7]. Los sustratos se unen al alcohol benclico espaciador mediante la formacin de un ster, estable en la mayora de condiciones, que se puede escindir en medio cido prtico fuerte (cido trifluoroactico, TFA). Otra ruta para la formacin de amidas primarias emplea la resina Rink [8] la cual requiere TFA para la escisin al igual que la Wang. - Una estrategia de proteccin qumica que permita una proteccin y desproteccin de los grupos reactivos en los monmeros. La utilizacin de la SPS ha permitido asimismo plantear la obtencin de los compuestos de una biblioteca como productos individuales (un compuesto por reactor) o como mezclas de compuestos (varios compuestos por reactor). La obtencin de mezclas se ha conseguido mediante la tcnica de combinacin y reparto (Combine and Split) (Fig. 5) [9-11]. Se toman tres porciones iguales de una resina o soporte slido, y

se hacen reaccionar individualmente con tres reactivos. Se eliminan los excesos y se recombinan las porciones de resina, se mezclan y se vuelven a dividir en tres porciones. La reaccin con otro set de tres agentes reactivos rinde un set completo de mezclas de posibles dmeros. Este proceso se puede ir repitiendo las veces que sea necesario. El hallazgo de actividad en una de las mezclas requiere el reconocimiento de los compuestos y, para ello, se plantean dos alternativas: 1. Deconvolucin recursiva: este mtodo se utiliza en muchos casos en bibliotecas de oligonucletidos para conocer cual es la secuencia de aminocidos activa. La deconvolucin recursiva consiste en resintetizar los compuestos cada vez un paso anterior y determinar la actividad, lo que lleva a conocer finalmente la estructura del compuesto [12]. Existen tcnicas para reservar una parte de los polmeros en cada paso de forma que no sea necesaria la sntesis de nuevo de cada paso. 2. Codificacin binaria: se utiliza un sistema de etiquetaje (tagging) previo para identificar estructuralmente la molcula en cualquier momento de la reaccin. Sobre esta estrategia de identificacin se han hallado diversas publicaciones que emplean diferentes mtodos de etiquetaje y por tanto diferentes sistemas de codificacin (encoding) y de decodificacin

Fig.5. Mtodo de combinain y reparto

Fig.4. Resina Wang

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Fig.6. Mtodo de codificacin binaria

grupo de investigacin, y presenta las siguientes facetas: 3.1. Bsqueda de los productos de partida que contienen una subestructura determinada Existe una multitud de compaas que fabrican y venden compuestos orgnicos comunes y todas ellas tienen extensos catlogos de productos de partida e intermedios sintticos interesantes en sntesis orgnica. Entre dichas compaas cabe destacar Sigma, Aldrich, Fluka, Riedel-de-Han, Merck, Lancaster, Maybridge y Acros. Ahora bien, la bsqueda manual en dichos catlogos de posibles productos de partida, por ejemplo steres , -insaturados, para la preparacin de una biblioteca combinatoria resulta ser una tarea tan tediosa como intil. Afortunadamente, hoy en da los catlogos de dichas compaas se hallan disponibles en CD-ROM o son accesibles mediante Internet. As, Sigma-Aldrich dispone de una pgina Web (http://www.sigma-aldrich.com) donde permite acceder a los catlogos de Sigma, Aldrich, Fluka y Riedel-de-Han. Similarmente existen pginas Web de Merck (http://www.merck.de/ english/index.htm), Lancaster (http://www.lancaster.co.uk), Maybridge (http://www.maybridge.co.uk) y Acros (http://www. fisher1.com/catalogs/index.htm). La pgina Web de Sigma-Aldrich es especialmente interesante dado que permite realizar bsquedas estructurales gracias a un plug-in que se puede incorporar a Netscape. Adems Sigma-Aldrich distribuye su catlogo completo en CD-ROM (Sigma-Aldrich Chemical Directory). En dicho CD-ROM se puede realizar el mismo tipo de bsquedas que la versin en Internet pero adems, caso de hallar una familia de compuestos que cumple con la subestructura buscada, permite exportarla a un archivo con formato SDFile (Standard Molecular Data File) lo que permite su posterior importacin desde ISIS/Base (MDL Information Systems Inc., http.//www. mdli.com), desde Accord (Synopsys Scientific Systems, http.// www.synopsys.co.uk) o desde otros paquetes informticos desarrollados especialmente para qumica combinatoria tal como el Project Library de MDL InformaINDUSTRIA FARMACEUTICA - ENERO/FEBRERO 1999

(decoding). El mtodo de codificacin binaria (Fig. 6) introducido por Still et al. abre nuevas perspectivas en la qumica combinatoria ya que en l la decodificacin es una asignacin formal del cdigo binario para cada etiqueta individual y su mezcla [13]. Se necesitan X etiquetas para codificar 2x - 1 compuestos, y por lo tanto en un paso N se podra codificar una biblioteca de (2x - 1)N compuestos con slo XN tipos de etiquetas. Las molculas cdigo se unen al polmero de diversas formas pero slo se necesita emplear una pequea proporcin (<1% del total del polmero) para su identificacin. Esta se realiza, tras la escisin, mediante anlisis por cromatografa de gases en columna capilar con un detector de captura electrnica (ECGC). Este conjunto de tcnicas ha comenzado a ser utilizado de forma habitual por las grandes multinacionales de los sectores farmacutico y agroqumico, habiendo favorecido la aparicin en USA de multitud de pequeas empresas
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dedicadas a la aplicacin de la qumica combinatoria en la sntesis de molculas biolgicamente activas (CombiChem, ArQule, Alanex, Ontogen, etc.) surgidas usualmente del ambiente universitario. Tambin es de destacar el gran nmero de conferencias y simposios que se realizan en todo el mundo sobre estos temas y la aparicin de empresas dedicadas a la comercializacin de robots de sntesis.

3. GESTION DE LOS PRODUCTOS DE PARTIDA EN QUIMICA COMBINATORIA

Un aspecto poco comentado en la abundante literatura generada en relacin con la qumica combinatoria, ms de 3.400 artculos desde 1991 [14], es la problemtica que supone la gestin de los productos de partida necesarios para la obtencin de una biblioteca combinatoria. Dicha problemtica se detecta con facilidad al iniciarse en esta rea, como es el caso de nuestro

tion Systems Inc. Esta posibilidad es especialmente interesante cuando se trabaja en el mbito de la qumica combinatoria dado que el formato SDFile trata la estructura de los compuestos de manera qumica permitiendo bsquedas subestructurales, filtrado de tablas de estructuras en funcin de un requisito concreto (por ejemplo presencia de un sustituyente aromtico), clculo de masa molecular, etc. Con todo, la base de datos ms completa sobre productos qumicos y suministradores es el Available Chemicals Directory (ACD) (MDL Information Systems Inc., http.//www.mdli.com) que contiene alrededor de 240.000 compuestos y 600.000 productos comercializados por ms de 300 distribuidores en todo el mundo. El catlogo contiene tanto productos disponibles en escala laboratorio como en escala industrial (bulky) y, adems de hallarse disponible en CD-ROM, es accesible a travs de INTERNET gracias a la iniciativa ChemWeb (http://chemweb.com). Finalmente, la bsqueda de posibles productos de partida en el fichero del grupo que desarrolla la biblioteca combinatoria (productos propios o reactivos usados en proyectos previos) puede ser una labor ardua si no se ha empleado para su construccin una base de datos estructural (por ejemplo la ISIS/Base) que permita bsquedas subestructurales. 3.2. Adquisicin de un nmero elevado de compuestos qumicos incluso de suministradores diferentes La adquisicin de un nmero elevado de reactivos diferentes, incluso centenares, necesaria para la preparacin de una biblioteca combinatoria es, en si mismo, un reto importante tanto para el equipo que desarrolla dicha biblioteca como para el departamento de compras que tiene que tramitar la compra. En efecto, preparar la propuesta de pedido de un centenar de reactivos, de forma manual o informtica, es una labor que consume una cantidad de tiempo elevada. Esta situacin se complica si los productos proceden de varios suministradores diferentes. Adems hay que tener en cuenta los plaINDUSTRIA FARMACEUTICA - ENERO/FEBRERO 1999

zos de entrega de aquellos productos que no se hallen en stock del suministrador, das o a veces semanas, lo que introduce un retraso en el inicio de la produccin de la biblioteca. Esta problemtica se puede soslayar en parte si el sistema informtico de compra de la empresa acepta el formato SDFile en que se halla contenido el resultado de la bsqueda realizada en los catlogos de productos de partida. Este hecho permite realizar el pedido de forma ms eficiente al ser posible el trasvase del nombre del producto, referencia, tamao de envase y precio directamente de la bsqueda a la propuesta de pedido. 3.3. Cantidades mnimas demasiado grandes en que se venden muchos productos de partida Otro aspecto importante cuando se desarrollan bibliotecas combinatorias, en particular en fase slida, es el de las cantidades mnimas de productos de partida que se pueden adquirir. Una ojeada a los catlogos de los diversos fabricantes revela que, en la mayora de los casos, los envases son demasiado grandes (desde 10 g hasta 1 Kg) para las necesidades de la qumica combinatoria (usualmente las sntesis en fase slida se realizan a escala de 50

a 100 mg de resina lo que implica el empleo de cantidades milimolares de los restantes reactivos). Sera pues deseable que las compaas que comercializan dichos productos de partida ofreciesen envases de menor tamao (1 a 5 g) o incluso colecciones de reactivos usuales en qumica combinatoria (por ejemplo cloruros de cido, aminas primarias, etc.) seleccionados segn criterios de diversidad molecular. Este parece ser el objetivo de los Combikits ofrecidos por Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) donde es posible buscar los productos deseados tanto en el Available Chemicals Directory de MDL como en el Sigma-Aldrich Corporate Directory, escoger los productos necesarios, la cantidad y el tipo de envase en que se quiere recibirlos. Similarmente Maybridge ofrece en su catlogo en CDROM de octubre de 1998 un archivo (mcc_com.db) en formato ISIS/Base conteniendo 770 monmeros (cloruros de cido, cloruros de sulfonilo, derivados halogenados, aminas, etc.) para qumica combinatoria en cantidades de 0,5 a 5 g. 3.4. Coste de los productos de partida Una consecuencia inevitable de dichas cantidades mnimas en

Fig.7. Biblioteca de cien 1,4-dihidropiridinas construidas por el mtodo de combinacin y reparto

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que se comercializan la mayora de los productos de partida es el elevado coste que supone el desarrollo de una biblioteca combinatoria de tamao grande. Un buen ejemplo lo tenemos en la sntesis de una biblioteca de cien 1,4-dihidropiridinas descrita por Patel et al. [15] (Fig. 7) mediante el mtodo de combinacin y reparto empleando diez -cetoste-

res y diez aldehidos aromticos. Si los compuestos necesarios para la construccin de dicha biblioteca se buscan en los catlogos de Fluka, Aldrich y Fluorchem Inc., se encuentran los envases y precios recogidos en las figuras 8 y 9. Dichas tablas han sido construidas mediante el programa Accord para Excel comentado anteriormente.

Fig. 8. Envases y precios de los diez -cetosteres necesarios para la construccin de la biblioteca de 1,4-dihidropiridinas

Como se puede observar la mayora de los envases son mucho ms grandes que las cantidades necesarias de cada producto para construir la biblioteca. Una consecuencia inmediata de este hecho es que el precio global de dichos reactivos se eleva casi a 100.000 pta., cantidad 20 veces mayor que las 5.000 pta. que aproximadamente valdran si se pudiesen comprar dichos productos en cantidades de 1 g. Una extrapolacin sencilla indicara que una biblioteca de 100.000 productos, como las que a veces aparecen en publicaciones o conferencias sobre qumica combinatoria, podra costar entre 1 y 100 millones de pta. caso de tener que adquirir todos los productos de partida. Parece evidente, pues, que hay que reclamar de las empresas suministradoras de productos de partida una nueva escala de envasado, del orden de 1 a 5 g, para aquellos grupos que han apostado decididamente por la qumica combinatoria como herramienta para el desarrollo de nuevos productos con actividad biolgica potencial. 3.5. Almacenamiento de las estructuras y caractersticas de los productos de partida en una base de datos Finalmente, un ltimo aspecto a considerar en relacin con los productos de partida necesarios para el desarrollo de bibliotecas combinatorias es la necesidad de almacenar sus estructuras y caractersticas principales (nombre, masa molecular, frmula emprica, datos fsicos, etc.) junto con su localizacin en el archivo del grupo. Este fin se consigue nuevamente con el empleo de una base de datos estructural, tal como la ya comentada ISIS/Base, o con uno de los programas especficamente diseados para el archivo de compuestos en un laboratorio, tales como el Chemical Inventory System (CISPro) de ChemSW (http: //www.chemsw. com) o el Electronic Laboratory Notebook (Expereact) de ChemExper (http://www.chemexper.be). Este ltimo combina la capacidad de archivo de productos de partida en una base de datos estructural con un diario de laboratorio electrnico.
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Fig. 9. Envases y precios de los diez aldehidos aromticos necesarios para la construccin de la biblioteca de 1,4-dihidropiridinas

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4. CONCLUSION
El innegable inters de la qumica combinatoria como metodologa para el descubrimiento de nuevos compuestos con posible actividad biolgica ha generado toda una serie de nuevas necesidades a los grupos de investigacin que se aventuran en ella. Uno de los aspectos a considerar es el de la gestin de los productos de partida necesarios para el desarrollo de bibliotecas combinatorias. En este sentido, el presente artculo pretende sensibilizar sobre la problemtica que conlleva la bsqueda, adquisicin y archivo de grandes cantidades de productos de partida y las herramientas disponibles en la actualidad para facilitar dichas operaciones.

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