Microscopía y métodos de

estudio celular

Sesión 4
 Breve historia
Zacharias Janssen (finales siglo XVI) se le
considera inventor del primer
microscopio compuesto (dos lentes).

Robert Hooke (siglo XVII)

genera y utiliza el microscopio
compuesto para observar
corcho.

Anton van Leeuwenhoek (siglo XVII) fabricó

un sencillo microscopio, con los que pudo
observar algunas células como protozoos y
glóbulos rojos.
Un poco más de historia
La microscopia depende de:
❖ Técnica de preparación de la muestra
❖ Poder de resolución y rendimiento del
microscopio

Tipos de preparaciones microscópicas:

❖ Preparación temporal (montaje en
portaobjeto, gota de agua y cubreobjeto)
❖ Preparación permanente (Fijación,
Deshidratación, Inclusión, Seccionar con
micrótomo, Tinción selectiva)
Existen dos tipos de microscopio:
❖ Microscopio óptico
❖ Microscopio electrónico
Microscopio simple o lupa: consta de una lente convexa
doble con una distancia focal corta
Microscopio óptico: está basado en lentes ópticos. Utiliza luz
visible para generar una imagen aumentada del objeto (haz de luz).
Las células observadas bajo este microscopio pueden estar vivas o
fijadas y teñidas.
Microscopio óptico compuesto:
-El límite de resolución alcanza los 200 nm (0,2 µm), 500 veces más
que el ojo.
-Consta de dos sistemas ópticos o lentes: objetivo (imagen real) y
ocular (imagen virtual de la imagen real).
-No es suficientemente poderoso para observar pequeños detalles de
la estructura celular (resolución: capacidad del microscopio para
distinguir objetos separados por pequeñas distancias).

Aumento total de un microscopio = aumento ocular x aumento objetivo

Microscopio ≠ Microscopio
óptico electrónico

Fuente de luz En base a

flujos de
electrones
 Tipos de Microscopios Electrónicos

✓ de transmisión (en español MET)

(Transmission Electron Microscope, TEM)

✓ de barrido (en español MEB)

(Scanning Electron Microscope, SEM)
El Microscopio Electrónico de Transmisión
(MET)
• Tiene un límite de resolución de
cerca de 2 nm.
• Mira células muertas, después de
haber sido fijadas y teñidas con
iones de metales pesados.
• Los electrones son dispersados
cuando pasan a través de una fina
sección de la muestra. Luego,
detectados y proyectados hacia una
imagen sobre una pantalla
fluorescente.
Microscopía electrónica de transmisión (TEM):
-Permite conocer la ultraestructura de las células y su matriz extracelular.
-Utiliza un haz de electrones en vez de haz de luz.
-Los electrones son desviados por un campo electromagnético y aquellos que
atraviesan la muestra son los utilizados.
-Nuevas formas de fijación, inclusión, corte y tinción.

Utiliza un haz de electrones acelerados por un

alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina
una sección muy fina de la muestra, sean
tejidos, células u otro material.
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)

• Tiene un limite de 2nm.

• Permite mirar células
muertas, fijadas y teñidas
con iones de metales
pesados.
• Los electrones son
reflectados sobre la
superficie de la muestra.
Microscopía electrónica de barrido:
-Obtiene imágenes tridimensionales de los materiales de estudio.
-Se emplea un haz de electrones que actúa sobre la superficie del material, la cual
emite un fino haz de electrones secundario que rebotará en un fotomultiplicador, el
cual genera la imagen en una pantalla de televisión.
-Se usan los electrones emitidos o dispersados por la superficie de la muestra y no
los absorbidos como en el TEM.

Se utiliza para el estudio de la

morfología y topografía de los
elementos. Las lentes magnéticas
utilizan un haz muy fino de
electrones para penetrar superficies
y se produce una imagen ampliada
de la superficie observada en la
pantalla de un monitor.
 Espermatozoides bovinos

Células sanguíneas

polen
Comparación entre microscopios
Resumen

➢ Actualmente disponemos de muchas técnicas de microscopía que permiten la

observación de células.

➢ Las células fijadas y teñidas se pueden estudiar al microscopio óptico

convencional, mientras que para localizar moléculas específicas en las células se
pueden utilizar anticuerpos marcados y estudiar su localización mediante el
microscopio de fluorescencia.

➢ Todos los tipos de microscopía son mas fáciles utilizando técnicas electrónicas de
procesamiento de imágenes, las cuales amplifican la sensibilidad e incrementan
la resolución.

➢ Para determinar la estructura detallada de membranas y organelos celulares se

requiere mayor resolución, que se puede alcanzar con el microscopio electrónico
de transmisión.

➢ Se pueden obtener imágenes tridimensionales de las superficies de células y

tejidos mediante microscopio electrónico de barrido.
CULTIVO CELULAR
 Cultivo celular y tejidos
➢Método que permite cultivar células o tejidos en un medio
nutritivo, con temperatura y pH adecuado, en donde pueden
desarrollar funciones metabólicas que realizaban cuando formaban
parte de los tejidos.
➢Se realizan estudios sobre distintos procesos tales como: división,
crecimiento, diferenciación celular, entre otros.

Objetivos:
-Mantener células, tejidos u órganos in vitro.
-Preservar y mantener propiedades
fisiológicas, metabólicas y genéticas.
Atributos de las células que permiten el cultivo celular

Capacidad genética que tiene todas las

Totipotencialidad células de dividirse, diferenciarse y dar lugar
a un individuo idéntico al que le dio origen.

Capacidad de las células para modificar su

Plasticidad Celular metabolismo, fisiología y en última
instancia, su estructura, para adaptarse a
las condiciones del medio.
Áreas de investigación dependientes de técnicas de cultivo celular:

• Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas,

producción de vacunas antivirales.

• Investigación del Cáncer

• Ingeniería de proteínas: producción de proteínas en líneas celulares: interferón,

insulina, hormona de crecimiento.

• Aplicaciones diagnósticas: análisis cromosómico de células crecidas a partir de

muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad.

• Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para transplante.

• Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción "in vitro" de

clones de plantas de interés comercial.
Técnicas para estudio celular

Responder preguntas que atañen a la función de los

orgánulos celulares, ya que microscopía no es capaz de
definir a nivel de componente celular.
 Separación subcelular
Consiste en la homogenización o destrucción de las uniones
celulares, a través de diferentes procedimientos mecánicos o
químicos, lo que permite romper membranas plasmáticas y separar
las fracciones subcelulares según masa, superficie y peso específico.

Etapas:
1- Homogenización
2- Filtración
3- Purificación (centrifugación)
 Sonicación (exposición a
sonidos de alta frecuencia)

Rotura de membrana plasmática bajo condiciones que no destruyan los componentes

internos de la célula. Se rompe membrana plasmática y retículo endoplasmático en pequeños
fragmentos. Núcleo, lisosomas, peroxisomas, mitocondrias y cloroplastos quedan intactos.
 Separación de sustancias de diferente
Centrifugación densidad y tamaño mediante
movimiento giratorio

Se utiliza para acelerar la sedimentación en una

suspensión.

Consiste en separar la mezcla utilizando una centrífuga,

la cual tiene un movimiento de rotación constante y
rápido, logrando que las partículas del sólido de mayor
densidad, se vayan al fondo.
Centrifugación
La fuerza centrífuga está determinada
Unidades Rpm.
por el diámetro del rotor y la
velocidad de rotación.
Centrifugación
Centrifugación fraccionada o diferencial
Separación en base a: tamaño y densidad

Se utilizan distintas velocidades de centrifugación.

Se obtienen preparaciones de orgánulos
enriquecidas, pero no puras

Utilidad: separación de organelos celulares

Centrifugación en gradiente

Separación en base a
gradiente de densidad

Se obtiene mayor nivel de

purificación. Los orgánulos se
separan mediante sedimentación
en función al gradiente de una
sustancia densa (ej. sacarosa)
 Centrifugación de equilibrio

-Se separan componentes en función de su

migración en gradiente de densidad,
independiente de su tamaño y forma.

-La muestra se centrifuga en un gradiente de alta

concentración de sacarosa.

-En lugar de separarse de acuerdo a su velocidad

de sedimentación, la muestra se centrifuga hasta
que las partículas alcancen equilibrio (su densidad
es igual a la de la solución de sacarosa)
 Electroforesis
Permite separar moléculas según la movilidad de éstas en un campo
eléctrico. Depende de la carga, tamaño y masa de las moléculas a
separar.

Fundamentos:
-Moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, éstas
experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta.
Después de cierto tiempo, las moléculas cargadas positivamente se desplazaran
hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se
desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).

-Alta sensibilidad, resolución y versatilidad.

-Método de separación de: ácidos nucleicos y proteínas.

-Permite determinar: peso molecular de una proteína, punto isoeléctrico, número

de cadenas polipeptídicas de una proteína.
Electrodo con carga negativa

Electrodo con carga positiva

Soportes más usados en electroforesis:
-Papel filtro
-Acetato de celulosa
-Almidón
-Poliacrilamida
-Agarosa
Equipo necesario para electroforesis:
-Fuente de poder
-Cubeta vertical u horizontal.
-Dos electrodos
Electroforesis en gel de agarosa
-Polisacárido usado en distintas concentraciones (0,5- 2%)
-Geles fáciles de preparar.
-No tóxico.
-Amplio rango de separación.
-Usado típicamente para ADN.
-Baja resolución.
20 T2 40 T2 20 T3 40 T3
Electroforesis en gel de poliacrilamida
-Polimerización de dos componentes: acrilamida y bisacrilamida.
-Variación de la concentración hace variar el tamaño del poro (mayor
concentración de poliacrilamida, menor tamaño de poro).
-Fácil de preparar pero trabajoso.
-Tóxico.
-Alta resolución.
Depende: pH, fuerza iónica, gradiente de potencial, tiempo de
corrida, concentración acrilamida/bisacrilamida)
La proteínas pueden separarse gracias a sus propiedades:
-Tamaño
-Forma
-Carga
-Hidrofobicidad
-Afinidad por otras moléculas
Electroforesis en SDS-PAGE