MANEJO Y USO – METODOS

DE CUANTIFICACION POR
HPLC
QF Ernesto Coz Velásquez
 HPLC
• Técnica de separación de muestras complejas en la cual intervienen 2 fases
• Bombeo de fase móvil a alta presión a través de una columna
• Primer cromatógrafo Waters (Años 70´s)
HPLC
COMPONENTES
• Componentes del HPLC:
• Reservorio de solventes
• Bomba
• Inyector
• Horno
• Detector
• Registrador
COMPONENTES
• Bomba:
• Alta y baja presión
• Desgasificador
• Binaria y cuaternaria
• Pistones o válvulas
• Mantiene velocidad de flujo constante
COMPONENTES
• Inyector:
• Manual o automático
• Loop
• Sistema de lavado
• Pre inyección
• Derivatización
• Rack
COMPONENTES
• Horno:
• Mantiene sistema constante
• Rango de temperatura
• Detector:
• UV
• DAD
• Fluorometría
• RID
COMPONENTES
• Registrador :
• Sistema informático
• Interpreta señal del detector
• CFR21 parte 11
• VSC
 HPLC
• El proceso de separación:
• Adsorción
• Distribución de masa (Exclusión)
• Intercambio iónico

• Fases
• Fase móvil
• Fase estacionaria
 FASE
ESTACIONARIA
• Sólido o gel (Columna o cartucho, pre columna)
• Por lo general esta empacada en tubo de metal o
plástico.
• Celulosa, silica modificada o polimérica.
• Presentan un determinado diámetro, tamaño de
partícula y porosidad
 FASE MOVIL
• Liquido Eluyente
• Mezcla de líquidos
• Isocráticos
• Gradiente
• Velocidad de flujo
• pH ± 0,2
• Sales ± 10%
 TIPOS HPLC
• De acuerdo con su función
• Preparativa
• Analítica

• De acuerdo con los componentes

• Fase Normal
• Fase Reversa
 FASE NORMAL
• Método más antiguo
• Fase estacionaria polar
• Ciano
• Amino

• Fase móvil no polar

• Hexano
• Mayor tiempo de equilibrio

• ¿Analito polar o apolar?

 FASE REVERSA
• Método más usado
• Fase estacionaria apolar
• Amino
• Cadenas hidrocarbonadas

• Fase móvil polar

• Tampones, soluciones acuosas
• Acetonitrilo / metanol

• Analitos hidrofóbicos
CROMATOGRAFIA
ANALITICA
• Análisis cuantitativo de laboratorio
• Impurezas
• Altas presiones
• HPLC
• Método más utilizado y de alta
sensibilidad
• Diversos tipos de estudio
 ANALISIS
CUANTITATIVO
• Determina concentración de componentes
• Comportamiento lineal
• Estándar interno
• Áreas
• Altura
• Estándar externo
• Solvente de extracción estable
ANALISIS PUREZA
• Cuantificable
• Compuesto relacionado / impureza
• Relación directa

• Normalización de área
• Muestra diluida
• Factor de corrección
• Semi cuantitativa
• LOD / LOQ
• Linealidad
• Descarte de picos
 VOLUMEN DE
COLUMNA
Diametro 4.6 mm
Longitud 250 mm

• Volumen de cilindro Radio 2.3 mm

4154.75628
𝑉 = π 𝑟2 ℎ Volumen Columna 4 mm3

• Calculo tiempo / flujo Volumen Columna

4.15475628
4 mL
• Fase móvil Numero de Volumenes 30

• Presión del sistema 124.642688

Volumen Total 5 mL
• Numero de volumenes
Flujo 1.2 mL/min
Tiempo 103.87 min
 VELOCIDAD DE
FLUJO
• Tipo de gradiente 𝐹1 = 𝐹2 × ⅆ𝑐22 × ⅆ𝑝1 Τ ⅆ𝑐12 × ⅆ𝑝2

𝐹1 = 𝐹2 × ⅆ𝑐22 × ⅆ𝑝1 Τ ⅆ𝑐12 × ⅆ𝑝2 × (𝐿1 / 𝐿2 )

• USP
• Relación L/dp (-25% a 50%)
• Platos teóricos Columna
Unidades
Columna
Unidades
Metodo Usada
• Aptitud de sistema
Longitud 250 mm 125 mm
Diametro 4.6 mm 4.6 mm
Particula 5 µm 5 µm
• Variables Flujo 1.2 mL/min 0.6 mL/min
• Diámetro interno
• Tamaño de partícula
• Longitud
 GRADIENTE
• USP
• Relación L/dp (-25% a 50%) 𝑡G1 = 𝑡G2 × 𝐹1 × 𝐹2 ⅆ𝑐22 × 𝐿2 Τ ⅆ𝑐12 × 𝐿1
• Tiempo de gradiente
Columna Columna
Unidades Unidades
• Variables Longitud
Metodo
250 mm
Usada
125 mm
• Diámetro interno Diametro 4.6 mm 4.6 mm
Flujo 1.2 mL/min 0.6 mL/min
• Longitud
Tiempo 5 min 1.8 min
• Flujo
GRADIENTE
 VOLUMEN DE
INYECCIÓN
• Tipo de gradiente
𝑉1 = 𝑉2 × ⅆ𝑐22 × 𝐿2 Τ ⅆ𝑐12 × 𝐿1

• USP
• Aptitud de sistema
Columna Columna
• Linealidad Metodo
Unidades
Usada
Unidades

• Validación / verificación Longitud 250 mm 125 mm

Diametro 4.6 mm 4.6 mm
V Inyecc 1.2 µL 0.6 µL
• Variables
• Diámetro interno
• Longitud