Benemérita Universidad

Autónoma de Puebla
Complejo Regional Mixteca,
campus Izúcar de Matamoros
Facultad de biotecnología

Implementación de un sistema de inmersión

temporal de tipo BIT para la micropropagación
de pitahaya (Hylocereus Spp)

Protocolo de tesis para la materia de proyecto

de investigación I

Presentado por:
Alumno: Eliseo Benicio Lopez

Asesor:
Dr. José Roberto Zúñiga Silva

1
Contenido
Introducción:....................................................................................................................................4
Planteamiento del problema............................................................................................................5
Objetivo General..............................................................................................................................7
Objetivos específicos....................................................................................................................7
Hipótesis............................................................................................................................................7
Justificación......................................................................................................................................7
Marco teórico...................................................................................................................................8
Antecedentes.................................................................................................................................8
Pitahaya........................................................................................................................................9
Clasificación Taxonómica............................................................................................................9
Pitahayas en México...................................................................................................................10
Bajo que precipitación y altitud crecen....................................................................................11
Morfología..................................................................................................................................11
Tallos...........................................................................................................................................12
Flores...........................................................................................................................................12
Frutos..........................................................................................................................................13
Métodos de propagación............................................................................................................13
Bencilaminopurina.....................................................................................................................14
Situación actual de la pitahaya..................................................................................................15
Metodología....................................................................................................................................16
Lugar del estudio........................................................................................................................16
Materiales...................................................................................................................................16
Equipos....................................................................................................................................17
Obtención del material vegetal..................................................................................................17
Prueba de germinación de semillas...........................................................................................18
Formulación de medios de cultivo.............................................................................................19
Proceso de desinfección y siembra............................................................................................19
Desinfección de campana.........................................................................................................19
Desinfección de semillas y siembra..........................................................................................20
Desinfección de material vegetal y selección...........................................................................20
Inmersión temporal de los explantes.........................................................................................21

2
 Sistema de tipo BIT:...............................................................................................................21
Sistema de tipo Smith:...........................................................................................................22
Resultados.......................................................................................................................................22
Germinación de semillas..........................................................................................................26
Discusión de resultados..............................................................................................................27
Conclusión parcial..........................................................................................................................28
Perspectivas..................................................................................................................................29
Bibliografía consultada..................................................................................................................30
Anexo de formulas..........................................................................................................................33
Anexo de imágenes.........................................................................................................................34
Cronograma de actividades...........................................................................................................37

3
Introducción:
En México las cactáceas son de gran importancia ya que estas suelen estar en ambientes
hostiles como suelos semiáridos, áridos, entre otros ambientes donde no podrían crecer
otras especies vegetales. “En el continente americano existen un aproximado de 2000
especímenes, en el cual México destaca por tener 913 de estas especies, además que el 80%
son especies endémicas del país” (1). Además de ser una importante fuente de recursos
desde tiempos ancestrales siempre han estado presentes desde las primeras civilizaciones
hasta la actualidad, puesto que estas además de servir como fuente de recursos también son
una fuente alimento pues pueden aprovecharse de múltiples formas los tallos, raíces, flores,
frutos además de servir como forraje (2), no obstante las cactáceas que han pasado a tener
valor comercial son tanto aquellas que funcionan como especies de ornato, así como
aquellas que se utilizan para la producción de alimentos en el sector agrícola, en donde
podemos encontrar a las pitahayas que también son conocidas como pitayas orejonas que
pertenecen al género Hylocereus undatus esta especie la podemos encontrar distribuida en
Veracruz, Tabasco, Campeche, Quintana Roo y Chiapas, además de ser cultivada
ampliamente en la zona central y en el sur del país (2).

Las pitahayas son pertenecientes a la familia de las cactáceas que se encuentran en México,
donde han adquirido un valor comercial, principalmente por su fruto que se considera
exótico, en la parte de la Mixteca Poblana se suelen encontrar las especies: en la región de
Izúcar de Matamoros las actividades de agricultura son una actividad básica donde se
cultivan áreas menores a 2 hectáreas (has) estos suelen ser cultivos de temporal, donde los
principales cultivos que destacan son: maíz, frijol, calabaza, ejote, palma, limón, hierba
buena, salva real, manzanilla, orégano, ajo, tomate, cebolla, pitaya, pitahaya, cacahuate,
caña de azúcar entre otros (3). La forma agrícola que se emplea para el cultivo de pitahaya
en la región de Izúcar de Matamoros es mediante esquejes, debido a que es uno de los
métodos que ayuda a la producción rápida ya que estos se toman de una planta adulta que
está en producción (4). No obstante, este método tiene la desventaja de los tejidos vegetales
envejecen más rápidamente, por lo que para su producción en gran escala se aplicó el
cultivo in vitro ya que esta es una técnica que permite la generación de plántulas de
pitahaya a partir de fragmentos de la planta denominados explantes donde puede tomarse el

4
tejido de apical, basal, central y axilar, permitiendo que este sea un tejido que no tenga el
problema de envejecimiento como la forma tradicional mediante esquejes(5), esto permitió
que se hicieran estudios con diferentes especies de pitahaya Hylocereus spp y Selenicereus
spp. El cultivo in vitro requiere diferentes promotores de crecimiento en los que destaca el
Bencilaminopurina (BAP) perteneciente a las citocininas, adicionado a el medio
Moorashige and Skoog (MS) (6,5) han demostrado el efectivo crecimiento de la pitahaya.
Pero a pesar de su efectividad el cultivo tradicional in vitro tiene sus limitaciones a la
generación de plántulas de pitahaya y tomaría mucho tener una gran cantidad de plántulas
para usarse con fines agrícolas. Para los campos de Izúcar de Matamoros es necesario
aplicar un cultivo que pueda generar plántulas de forma masiva, de ahí la necesidad de la
aplicación de un sistema de inmersión temporal (SIT) que permite la generación de
plántulas mediante la aplicación de un medio de cultivo semisólido o líquido, es necesario
que sean este tipo de medios que pueden permitir que sea semiautomatizado este sistema,
en este sistema existen diferentes tipos de SIT como son: RITA®, TWIN FLASK, Plant
Form, SETIS™, entre otros (7). El presente escrito se empleará un SIT de tipo BIT
denominado como vasos gemelos para poder micropropagar el generó, además de un
sistema homologo al sistema RITA® para evaluar cual tiene mejores resultados en la
generación de nuevas plántulas.

Planteamiento del problema

Según datos registrados por SAGARPA, la región de Izúcar de Matamoros tiene todas las
condiciones climatológicas para poder producir pitahaya debido a que Puebla es el tercer
productor de pitahaya del país debajo de Yucatán y Quintana Roo (8). En una zonificación
realizada en el 2013 expone que el potencial genético condiciones climáticas del Estado
permitirán la adaptabilidad de la pitahaya (9), pero aún no han tenido un cultivo
significante aunado a esto para la obtención del material vegetal será a partir de esquejes o
estacas también denominados como clones los cuales después de ciertos ciclos de
propagación vegetativa tienen un decaimiento en su fase productiva que es el resultado del
envejecimiento de los tejidos. Además de la cantidad de espacio y traslados del vegetal,
este estará en riesgos de poder ser susceptible a patógenos además que no todos los tallos
tienen una garantía de que llegaran a la fase productiva (5).

5
Producir la pitahaya (Hylocereus spp) por medio de semillas. No es una forma tan viable,
ya que para poder generar nuevas plántulas a partir de esta técnica se requiere de semilleros
y viveros en los que se deben tener múltiples cuidados, además que para llegar a la etapa
productiva pueden tardar de 4 a 6 años, además que las plántulas obtenidas pueden tener
una mayor variabilidad génica, no sería igual a una especie debido a la unión de los
gametos de las plantas parentales generando otra nueva planta (4-6).

El motivo para aplicar la técnica de micropropagación pitahaya (Hylocereus ssp) en un SIT

es encontrar las concentraciones de bencilaminopurina (BAP) para la generación de
plántulas de forma masiva que mantengan las propiedades de la planta madre, además de
probar mediante que técnica de SIT se puede obtener mejores resultados, permitiendo tener
plantas de alta calidad fitosanitaria para poder así ser aplicables en el campo de la región.

6
Objetivo General
 Implementar un protocolo de micropropagación de pitahaya (Hylocereus Spp) a
partir de explantes mediante un sistema de inmersión temporal de tipo BIT

Objetivos específicos
 Evaluar el efecto de diferentes concentraciones de Bencilaminopurina sobre el
crecimiento y desarrollo de las plántulas de pitahaya
 Evaluar el crecimiento de las plántulas a partir de los diferentes tejidos vegetales
como basal, apical, y axilar.
 Comparar el crecimiento de plántulas en sistemas de inmersión temporal de tipo
BIT y Smith
 Evaluar los efectos de BAP en plántulas generadas a partir de germinación de
semillas

Hipótesis
Los sistemas semi automatizados para la micropropagación in vitro harán plantas con
mayor adaptabilidad y aclimatación, además de una mayor producción que la forma
tradicional, sin mencionar que el sistema de tipo BIT puede tener mayor producción de
plántulas en concentraciones de bencilaminopurina (BAP) en el medio de cultivo con
plantas más asépticas que en el sistema Smith.

Justificación
La pitahaya es una de las frutas exóticas que se pueden producir en el área de la Mixteca
Poblana, específicamente en la región Izúcar de Matamoros. Donde aún es un cultivo
secundario, pero debió a su importancia agro-biotecnológica es susceptible para el proceso
de micropropagación. Mediante un sistema de inmersión temporal se podrá generar
plántulas libres de patógenos que pueden ser certificables. Debido a que en la forma
tradicional mediante esquejes estos son vulnerables hongos, depredadores y condiciones
adversas climáticas, no obstante, la falta de un protocolo con estás técnicas biotecnológicas
en dicha región hace que en la actualidad no pueda trabajarse sencillamente, además de
requerir conocimientos sobre el tema ya que las plantas de cultivo in vitro tienen mucho
más potencial que la forma tradicional de cultivo de la pitahaya en el campo local, el

7
presente trabajo se enfocara en elaborar un protocolo para la micropropagación de pitahaya
a través de un sistema de inmersión temporal, de igual manera se va comparar el
rendimiento en el crecimiento de las plántulas mediante los sistemas de tipo BIT y Smith.

Marco teórico
Antecedentes
La familia cactácea siempre ha sido uno de los más complejos a la hora de trabajar in vitro
ya que no siempre las concentraciones de los promotores de crecimiento son las adecuadas
o en ocasiones se aplica más de lo que se necesita, en trabajos in vitro en la especie
Hylocereus Guatemalensis donde se utilizó como medio control MS y se dieron 4
tratamientos con Bencilaminopurina (BAP) como promotor de crecimiento de H.
Guatemalensis en concentraciones de BAP que fueron 0.25 mg/L, 0.5 mg/L, 0.75 mg/L y 1
mg/L, los cuatro tratamientos adicionados con medio MS en el cual se obtuvo un mejor
resultado en el tratamiento con la aplicación de 0.5 mg/L dando un crecimiento de
cladodios a partir de los explantes, donde se evaluó el crecimiento del cladodio y el número
de areolas(5). Mientras que en el trabajo realizado en Managua Nicaragua con un estudio
de medios de cultivo con explantes divididos en tres tipos de tejido basal, apical y central,
en el que la formulación de sus medios de cultivo fueron mediante Bencilaminopurina
(BAP) y concentraciones de Sacarosa en el cual tuvieron mayor número de brotes en los
segmentos apicales y centrales con la utilización en el medio de BAP y bajas
concentraciones de sacarosa además que el volumen del frasco también influyo en la
generación de brotes, además de utilizar las sales del medio MS en las fases adecuadas
ayuda con la enraización de los brotes (4). En trabajos realizado en caña de azúcar por (P.
Digonzelli, L. Díaz y S. Carrizo de Bellone) nos dicen que los vitro patógenos para su
proliferación influyen condiciones climáticas, el tipo de propagación, el tipo de cultivo y la
gravedad de las concentraciones, en este estudio se aplicó plant preservative mixture
denominado PPM este es un preservante de amplio espectro, en el que podemos encontrar
las acciones biocida y biostatica, esto permitirá controlar la contaminación microbiana en el
cultivo de tejidos, en el cual se obtuvieron resultados del tratamiento 3 al 6 en donde
impidió el crecimiento de las pseudomonas que fueron inoculadas en el medio de cultivo,
por lo que las concentraciones superiores de 0.25 ml/L no son capaces de controlar la
contaminación en medios de cultivo (10).

8
3

Pitahaya
La palabra pitahaya proviene de las Antillas mayores que significa “fruta escamosa” esta
palabra tiene diversos cambios debido a las fonéticas, lugares donde se produce y consume,
en Japón es conocida como “Fruit Dragon” o “fruta dragón” y en Israel es conocida como
“fruta roja del Edén” (11). La pitahaya son plantas trepadoras que han sido aprovechadas
milenariamente por diversas culturas americanas pero solo hace un par de décadas
constituyen un cultivo nuevo (12), pertenece al orden de las Cariophyllales y
pertenecientes a la familia de las cactaceae debido a que comparten con otras familias la
presencia de betalaínas, existen 16 especies conocidas a nivel mundial de que tienen
potencial de cultivo y obtención de frutos, hortaliza fresca o forraje, las cuales son
pertenecientes a las especies Hylocereus undatus, Hylocereus polyrhizus, Hylocereus
Costarisencis, Hylocereus triangularis y Hylocereus purpusi son conocidas como pitahaya
roja, estas especies son encontradas en principalmente en Centro América e Israel, pero no
solo existe la pitahaya roja, especies como Selenicereus spp y Hylocereus megalanthus que
tienen el nombre de pitahaya amarilla(13). Las condiciones pueden variar según la nación
donde sean producidas, ya que la planta tiende a tener gran polimorfismo en su ADN, por
lo que esto genera diversos tipos que lo más probable es que correspondan a la misma
especie, una de las características de estas plantas es que pueden reproducirse de dos
formas tanto sexual como asexual, pero dependerá de las condiciones ambientales del lugar
debido a que estas especies en forma silvestre podemos encontrarlas en lugares boscosos
(14).

Clasificación Taxonómica
Reino: Plantae

División: Magnioliophita

Clase: Magnoliopsida

Orden: Caryophyllale

Familia: Cactaceae-cactacea

Tribu: Hylocereeae

9
Género: Hylocereus

Pitahayas en México
En México podemos encontrar tres especies que son producidas (Hylocereus undatus,
Hylocereus purpusii y Hylocereus ocamponis) estas se encuentran distribuidas en los
estados de Quintana Roo, Yucatán, Tabasco, Veracruz, Guerrero, Querétaro, Estado de
México, Puebla, Oaxaca, Michoacán, Jalisco, San Luis Potosí, Colima y Sinaloa (13). En la
actualidad México se está quedando sin recursos acuíferos lo que lleva a buscar alternativas
agrícolas que no utilicen gran cantidad de dicho recurso por ello en lugares como en el valle
de Culiacán Sinaloa se ha empleado un estudio de la fenología de la planta frente a este tipo
de condiciones se ve como una forma de dar reconversión a los cultivos tradicionales
además de su gran valor económico y ornamental, dicho estudio se realizó durante tres años
y se obtuvo un mayor rendimiento en los aspectos fenológicos cada año demostrando la
viabilidad de dicho cultivo en la región del país (15). En el Estado de Puebla desde los
años noventa en valle de Tehuacán aumento la producción del género de pitahaya en este
valle se han identificado dos especies que son Hylocereus undatus y Hylocereus ocamponis
esto ya que el país del sol naciente Japón hicieron un trato con los productores por al menos
10 toneladas de este fruto, el valle de Tehuacán presenta un problema con una gran
salinidad en sus suelos además de ser una región con un clima árido no obstante la pitahaya
al ser una planta bastante versátil puede crecer en este tipo de ambientes hostiles, además
que el manejo agrícola en esta zona es mediante esquejes que es la forma predomínate en
distancias de 2x2 y 3x3 m de separación entre plantas, comúnmente se realiza al inicio de
la temporada de lluvias y asegurar que los tutores tengan una vida mínima de 30 años como
la capacidad de soportar a la planta cuando entre en su fase de producción ya que la
pitahaya llega a pesar 100 Kg. Dicho lo anterior en el valle de Tehuacán hay un mal manejo
agronómico de la pitahaya ya que hay una carencia de divulgación sobre cómo manejar esta
planta pues no hay ni una sola cuantificación de daños por plagas o hongos. Además de ser
una importante fuente de ingresos para las personas que habitan en dicho valle (16).

10
 Figura 1.- Ciclo de vida de la Pitahaya
(Hylocereus undatus) imagen tomada
de: Nadiia Havryliuk. [no date] from:
https://es.dreamstime.com/ciclo-de-
vida-una-planta-del-pitahaya-en-un-
fondo-blanco-ejemplo-hermoso-
image150419013

Bajo que precipitación y altitud crecen

A nivel mundial se menciona que el crecimiento de la pitahaya es comúnmente en climas
secos junto a las bajas disponibilidades de agua, donde existe una precipitación anual entre
600 a 1500 mm, sin embargo en América Central podemos encontrar precipitaciones entre
los 1500 y 3000 mm, sin embargo las precipitaciones en exceso causan la pudrición en las
plantas, mientras que la altitud donde se han registrado son 0 y 2000 m.s.n.m pero también
se han registrado especies a 2500 m.s.n.m aunque no obstante los mejores rendimientos se
encuentran entre los 700 y 1900 m.s.n.m (17).

Morfología
La pitahaya es una planta perenne que debido la forma de los tallos no es capaz de
sostenerse por sí misma, no obstante, es una planta que usa los denominados tutores para
poder sostenerse, estos tutores son piedras, troncos o árboles y muros. Las pitahayas son
plantas hemiepifitas, por ello pueden sostenerse en los tutores. Las plantas que son epifitas
son aquellas que su raíz no llega a tocar el suelo, algo que en la pitahaya no sucede ya que
el tallo principal está en el suelo (11).

11
Tallos
Los tallos son suculentos, verdes de forma triangular, la epidermis mejor conocida como la
superficie exterior es gruesa, esto le da la capacidad de poder desarrollarse en zonas donde
hay poca precipitación. Presenta un cierre de estomas, hay una presencia de mucilago
(sustancia vegetal viscosa) además de poseer otras sustancias que evitan la perdida de agua
en las temporadas de sequias (18).

Figura 2.- Tallo de Hylocereus undatus.

Sadambio at hu.wikipedia [CC BY-SA
2.5
(https://creativecommons.org/licenses/b
y-sa/2.5)]

Los tallos también tienden a ser llamados coloquialmente como vainas, que son aquellas
que se pueden emplear para la reproducción asexual, estos tallos pueden ramificarse, lo
cual puede generar segmentos de hasta dos metros. Los tallos también tienen aristas las
cuales se conocen como costillas, también está la presencia de espinas que están agrupadas
en pequeñas almohadillas que son conocidos como areolas de donde también se generan los
nuevos brotes (13).

Flores
Las flores tienen la capacidad de ser hermafroditas y actinomorfas además se encuentran
insertadas en los tallos, las características de las flores: son grandes tienen forma tubular
como una trompeta, estas pueden ser de tres colores distintos como blanco, amarillo o
rosado (13,14). Las flores suelen emerger de los tallos que tienen mayor exposición a la luz
solar, estas tienden a aparecer en las primeras lluvias de Mayo o Junio. Estas flores son
muy vistosas para los polinizadores, al ser flores nocturnas unos de sus principales
polinizadores son los murciélagos con las pitahayas rojas (,13,14,15).

12
 Figura 3.- flor de pitahaya
(Hylocereus undatus)
imagen toda de: Saenz
Lopez Soledad [no date]
tomada de:
https://www.pinterest.co
m.mx/pin/530298924846
334349/

Frutos
Son bayas de forma ovoide, redondeada o alargada, de 10 a 12 cm de diámetro, posee
escamas foliáceas y exocarpo amarrillo, rojo o magenta. El endocarpo puede ser de color
blanco, amarillo o magenta, con semillas diminutas de color negro (19).

Figura 4.- fruto de pitahaya

(Hylocereus undatus)
consultada de ocu.org [21 de
octubre 2020] de:
https://www.ocu.org/alimenta
cion/alimentos/noticias/pitaha
ya-fruta-del-dragon

Métodos de propagación.
Como se ha mencionado anteriormente existen múltiples formas de la propagación de esta
cactácea, ya que tienen dos formas de propagarse tanto de manera sexual como de forma
asexual, la pitahaya es de esas plantas que tienen esas opciones para reproducirse a
diferencia de algunas que solo pueden ser por medio de semillas. Las formas de propagarse
de la pitahaya son:

Semillas: es conveniente la propagación por semilla debido a la obtención de material con

diferente información genética, ya que este puede presentar diferentes características
aprovechables. Sin embargo, no siempre es utilizada esta propagación ya que para llegar a
su etapa productiva deben pasar varios años, la germinación de las semillas en tierra de tipo

13
arenosa sucede entre 4 a 5 días. Estas plántulas requieren mayores cuidados pues al mes
deben pasar por un trasplante hasta que sean disponibles para el campo o para el proceso de

Esqueje: los tallos son cortados en forma de V, estos se dejan cicatrizar aproximadamente
una semana para poder sembrarlos en suelo, esto para que tenga una mayor vida además la
enraización se realiza más rápido. Este proceso puede realizarse con los brotes nuevos, pero
estos suelen sufrir mayor ataque de insectos y patógenos, este método tiene la ventaja de ser
la forma sencilla y económica, los tallos seleccionados deben medir aproximadamente entre
20 y 50 cm, estos deben ser sanos tampoco deben estar dañados por insectos, pero también
existen tres tipos de forma de propagar los esquejes que son:

 Siembra directa en suelo al lado de su soporte.

 Los tallos se siembran en tierra de vivero para su enraizamiento y posterior
transplante.
 Insertar los tallos en tierra embolsada para enraizamiento y posterior transplante.

Injerto: esta es la unión de dos o más piezas del tejido de diferentes plantas, que en el futuro
serán una sola planta, que tiene ciertas ventajas.

 Ayuda al crecimiento más rápido y menos tiempo para que la planta pueda producir.
 Acelera la floración y para obtención de ejemplares más llamativos.
 Ayuda a que puedan vivir directamente en suelo.
 Fortalecimiento de aquellas que tienen un sistema raquítico en las raíces.

In vitro: las especies Hylocereus y Selenicereus la organogénesis y la proliferación de

células están controladas en función de los reguladores de crecimiento, estos han sido
probados en los medios de cultivo, donde destacan las auxinas y citocininas, esto con el fin
de conservar el germoplasma además de incrementar la diversidad génica de la pitahaya
(20).

Bencilaminopurina
Es una citoquinina que deriva de la adenina, su función principal el promover el
crecimiento, elongación y división de las células, este también tiene la capacidad de

14
promover la germinación, es un regulador del crecimiento de raíces y es capaz de inhibir el
proceso de envejecimiento (21).

Las citoquininas son capaces de iniciar el proceso de crecimiento en las yemas laterales, en
numerosas especies induce la división celular, también incrementa la clorofila ya que
sucede una diferenciación de los cloroplastos, tiene un aumento en la actividad
fotosintética, tiene participación en la perdida de dominancia apical además de retrasar la
senescencia (envejecimiento celular). Las citoquininas tienen la particularidad de estar
envueltas en el control de la biogénesis y la función de los cloroplastos (22).

Situación actual de la pitahaya

 Betalaínas: en la actualidad las betalaínas son utilizadas en la industria de los
alimentos como un antioxidante, debido a que las betalaínas es el pigmento
principal en la pitahaya, la industria alimentaria busca darles un buen enfoque
para la evitación de la peroxidación de los lípidos. La oxidación de los lípidos
es de las causas principales del deterioro de los alimentos (23). Dicho esto,
las betalaínas son un poderoso colorante que compiten con los colorantes
sintéticos, pero excluyendo los potenciales tóxicos de los colorantes sintéticos
(24).
 Campo de salud: la pitahaya tiene un gran potencial debido a sus beneficios
nutricionales tiene grandes beneficios, debió a que tiene una acción de
prebióticos estos son muy importantes a la hora de hablar de alimentos
funcionales, ya que son oligosacáridos y fibras dietéticas que son
carbohidratos no degradables que funcionan como fuente de alimento a lo
microorganismos bacterianos que residen en el sistema intestinal, esto tiene
como un beneficio un fortalecimiento al sistema inmune, ya que de esta
forma regulan el crecimiento de las bacterias patógenas (14).
 Valor nutritivo:

Calorías 36
Agua 89.4g

15
 Proteínas 0.5 g
Lípidos 0.1 g
Hidratos de carbono 9.2 g
Fibra 0.3 g
Cenizas 0.5 g
Calcio 6.0 mg
Fosforo 19.0 mg
Hierro 0.4 mg
Tabla 1.
Tiamina 0.01 mg Porcentaje
Riboflavina 0.03 mg nutrimental
de los frutos
Niacina 0.2 mg de pitahaya
Ácido ascórbico (vitamina C) 25.0 mg

Dicho esto, la pitahaya en la actualidad conforma parte de muchos productos y

puede ser aplicada tanto en la industria de alimentos como en el área de la salud,
además de que se pueden preparar bastantes productos aparte de este fruto como
concentrados de pitahaya y gomitas entre otros (25).

Metodología
Lugar del estudio
El presente trabajo se realizó en la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, en el
campus Izúcar de Matamoros perteneciente al Complejo Regional Mixteca con dirección
carretera Atlixco-Izúcar de Matamoros 141, San Martin Alchichica, C.P. 74570, en el
laboratorio de cultivo de tejidos vegetal de dicho campus en el estado de Puebla México.

Materiales
Material vegetal y Material de desinfección Materiales de cristalería
reactivos
Explantes de Hylocereus Hipoclorito de sodio Vasos de precipitado
Medio MS agua destilada Matraz Erlenmeyer

16
 Bencilaminopurina Alcohol etílico 96 Agitador magnético
Acido indolacético (AIA) Agua estéril Papel aluminio
Agar bacteriológico Nitrato de plata (microdyn) Algodón
PPM Peróxido de dihidrógeno Cinta adhesiva
Semillas Captan Marcadores
Giberelinas (GAS) Antibenzil Caja magenta
Carbón activado Pinzas de 12 cm
Ácido naftalenacético Bisturí
(ANA)
Hidróxido de sodio Pipeta y micropipeta
(NaOH)
Vasos gemelos y
homólogos de frascos
RITA®
Vidrios de reloj
Gasas

Tabla 2. Materiales para utilizar a lo largo del experimento en el que podemos

encontrar reactivos, material de cristalería, equipos y material vegetal.

Equipos
 Campana de flujo laminar
 Autoclave de gas o eléctrica
 Balanza analítica
 Potenciómetro
 Mechero de alcohol
 Sistema de inmersión temporal BIT y Smith

17
Obtención del material vegetal
Las vainas o esquejes de pitahaya (Hylocereus undatus) fueron obtenidas de la región
mixteca en el estado de Puebla, en el municipio numero 87 correspondiente a Jolalpan con
código postal: 74716, de la comunidad de Teutla con mismo código postal.

Las semillas fueron obtenidas de una fruta de pitahaya comprada en el mercado de picos en
la ciudad de Izúcar de Matamoros (municipio 217) perteneciente a la mixteca Poblana con
código postal 74400.

Diagrama de flujo 1: proceso para la obtención de explantes de pitahaya para el sistema

de inmersión temporal.

18
Prueba de germinación de semillas
Las semillas se extrajeron directamente de la fruta con mucho cuidado las cuales fueron
puestas en un papel filtro con agua en un frasco y posteriormente pasadas a un cuarto de
oscuridad para ver la viabilidad de las semillas y su capacidad de germinación.

Formulación de medios de cultivo

Para el siguiente proyecto se realizaron dos tipos de formulaciones de medios de cultivo
para dos tipos de propagación, para la germinación de semillas y para generación de
explantes mediante el material vegetal ya que ambos requieren diferentes tipos de
hormonas y otros elementos para el posible desarrollo de plántulas.

Para la elaboración de medio de cultivo de semilla se elaboraron 500 ml de medio de

cultivo en el cual se agregaron 2.2g de medio MS (Moorashige & Skoog), se agregaron 7.5
g de agar bacteriológico, esto para dar la capacidad de gelificación, el medio también fue
enriquecido con las hormonas necesarias, las cuales fueron el ácido indolacético (AIA),
ácido naftalenacético y giberelinas estas en una concentración de 250 µl, agua de coco al
10%, estos fueron agregados después de que el medio ya haya obtenido el hervor, después
se realizó el vaciado de medio de cultivo a las caja magenta para pasar a esterilizar en el
autoclave en un ciclo de 15 minutos a 121°C con 1 psi de presión.

La elaboración del medio de cultivo para tejidos vegetales como yemas axilares y tejido
central, se elaboraron 500 ml de medio de cultivo el cual se agregaron 2.2 g de medio MS
(Moorashige & Skoog) se agregó al medio 7.5 g de agar bacteriológico como agente
gelificante, 0.5g de carbón activado con el fin de evitar la oxidación de los tejidos, se
agregaron 500 µl de PPM, se agregaron las hormonas acido indolacético (AIA), ácido
neftalenacético (ANA), giberelinas y Bencilamino purina (BAP) en concentración de 250
µl (consultar formula 1), pero para preparar la hormona BAP se tuvo que disolver en una
concentración de hidróxido de sodio (NaOH) al 1 N ya que el BAP no se disuelve en agua,
posteriormente se hizo un ajuste de pH al medio de cultivo a 5.8 con una solución base, una
vez realizado este proceso se vació en cajas magenta y se esterilizo a 121°C por 15 minutos
a 1 psi de presión.

19
Proceso de desinfección y siembra
Desinfección de campana
Para la correcta desinfección de la campana de flujo laminar se realizó su limpieza por
medio de alcohol al 70% se aplicó en todos los extremos de la campana mientras estaba el
ventilador, después se realizó un proceso por radiación UV durante 5 minutos,
posteriormente se hizo una segunda limpieza con alcohol al 70% esto para tener un
ambiente de inocuidad para la siembra posterior de las semillas de pitahaya.

Para la desinfección de campana de flujo laminar para trabajar con tejidos vegetales de
pitahaya se utilizó alcohol al 96% para limpiar todos los extremos de la campana, una vez
realizado este proceso se realizó un proceso por radiación UV durante 5 minutos para una
completa desinfección, posteriormente se limpió nuevamente con alcohol al 96%,

Por último, se realizó una desinfección para siembra de semillas, donde primero se realizó
una limpieza con antibenzil para eliminar esporas de hongo, después una limpieza con
alcohol al 96%, una vez realizado este proceso se aplicó radiación UV durante 10 minutos
para asegurar el ambiente de asepsia e inocuidad, por último, se hizo una limpieza con
alcohol.

Desinfección de semillas y siembra

Para la desinfección de semillas de pitahaya se utilizó 1 g de captan en 100 ml de agua,
donde las semillas se sumergieron en un difusor durante 10 minutos, posteriormente se pasa
a alcohol al 70% durante 5 minutos para eliminar las trazas de captan, de forma continua se
pasa a hipoclorito al 30% durante 10 minutos, una vez terminado el tiempo pasa a
sumergirse en agua oxigenada al 30% v/v con dos gotas de microdyn durante 5 minutos,
después se pasa por tres enjuagues con agua estéril con 5 minutos de duración cada
enjugue, de esta manera nos aseguramos de eliminar posibles factores contaminante unidos
a las semillas, estas fueron sembradas en la caja magenta con 5 por caja, de forma
distribuida por toda la caja, posteriormente se dejaron en oscuridad para su germinación.

Desinfección de material vegetal y selección

Para la desinfección de explantes tomados del material vegetal para su posterior siembra en
medio de cultivo, se aplicó captan en dos tratamientos diferentes 0.1g/100 ml y 0.15 g/100
ml esto durante 10 minutos, posteriormente se hizo un lavado con alcohol al 96% durante 5

20
minutos, este se utilizó hipoclorito al 3% esto para evitar los daños a los tejidos vegetales
durante 10 minutos, posteriormente se hizo un lavado con microdyn durante 5 minutos, una
vez terminado todo este proceso de desinfección se aplicaron tres enjuagues con agua
estéril con una duración de 5 minutos cada enjuague, para la selección de explantes se tomó
el tejido central, en este proceso fue necesario la eliminación de la cobertura de la pitahaya
dejando solo la parte interior, se tomaron yemas axilares en las que se utilizó un corte de
manera triangular de un tamaño considerable 2 cm aprox. Estos se sembraron en los medios
de cultivo con carbón activado y BAP, en el cual se depositó solo un fragmento por caja
magenta, una vez realizado el proceso de siembra se llevaron a luz para la generación de
explantes.

Inmersión temporal de los explantes

En el presente trabajo se modificará el medio de cultivo MS con 5 concentraciones
diferentes de Bencialaminopurina, que van a estar en el rango de concentraciones de 0.5
mg/L a 1.5 mg/L, más la muestra que se utilizara como control que solo será el medio MS,
estos se agregaran a los frascos de vidrio esterilizados de que serán puestos bajo el
fundamento en los sistemas Smith y BIT para saber en cual sistema habrá mayor número de
plántulas al finalizar el proceso que durara 90 días se regularan las fases de oxigenación
cuando los cultivos se vean con excesos de humedad para evitar la vitrificación los medios
de cultivo se cambiaran cada 20 días. Al medio también se le agregará Plant Preservative
Mixture, debido a que la pitahaya tiende a estar rodeada en la parte de la epidermis con
hongos debido a que esta planta es muy susceptible a contaminarse en los medios de cultivo
ya que estos son ricos en azucares.

Sistema de tipo BIT:

está formado por dos contenedores gemelos que están conectados entre sí por medio de una
manguera hecha a base de silicona, uno de los frascos almacena los explantes mientras el
otro tiene el medio de cultivo, este contenedor está conectado a otra manguera en la que se
inyecta aire a presión, esto permite que el medio de cultivo liquido sea transferido al
contenedor de los explantes, por la manguera que los interconecta. La presión que ejerce el
aire de forma continua permite la aireación además de agitar los explantes en el tiempo
programado de inmersión, al finalizar el tiempo programado, se inyecta presión de aire en
el contenedor de los explantes que permite regresar el medio de cultivo al contenedor de

21
origen. Dicho sistema requiere un temporizador, bomba de presión y filtros de aire que
permitirán la esterilidad dentro del frasco, una de las ventajas de este sistema es la
posibilidad de inyectar una ventilación adicional denominada como ventilación forzada,
que permite regular la humedad y reducir la o evitar la vitrificación (26).

Otras ventajas

 Simplicidad en manejo y menor costo en comparación de RITA®.

 Posibilidad de remplazar el medio de cultivo o renovarlo sin causar estrés a los
explantes ni arriesgar la asepsia.
 Los contenedores tienen la versatilidad de poder adaptarse a las necesidades y
recursos disponibles (27).

Sistema de tipo Smith:

El sistema de inmersión temporal de tipo Smith es un homólogo del sistema de inmersión
temporal RITA® el cual funciona debido a un software integrado que regula el tiempo y
frecuencia de inmersión, permite que el medio este en contacto con todas las partes del
explante. El fundamento del sistema es la inyección de aire que hace que el medio de
cultivo pueda subir hacia el apartado donde se encuentran los explantes, una vez que el
medio de cultivo a empapado los explantes este desciende por medio de la gravedad. Su
modo de funcionamiento es el siguiente, los explantes son puestos sobre el disco, en la fase
de sumergimiento una presión de aire estéril sube el medio de cultivo, el aire oxigenara el
medio, además es se renueva totalmente, una vez realizado este paso la bomba que da la
presión de aire se apaga y el aire desciende por la acción de la gravedad (28).

El proceso de luz que recibirán los explantes durante el proceso de SIT serán de 16 horas de
luz y 8 horas de oscuridad debido a que no son semillas la fase de oscuridad no es aplicable
ya que no habrá germinación, las vitro plantas se revisaran cada 5 días debido a que son los
días laborales del laboratorio para verificar si no hay contaminaciones en el medio de
cultivo o si es necesario dar aireación, durante los 90 días que dure el experimento.

Resultados
Los presentes resultados obtenidos después de aplicar las técnicas de metodología no
fueron los esperados con el intento de obtención de explantes desde el material vegetal,

22
debido a que este tipo de material vegetal es demasiado viable a tener hongos en la parte
exterior, sin embargo al aplicar los procesos de desinfección no fueron suficientes, debido a
que la presencia de este agente externo o interno estuvo presente en los dos tratamientos
que se aplicaron para la desinfección del material vegetal, no obstante también los tejidos
centrales no tendieron a un proceso de oxidación como de vitrificación, en medio de cultivo
con carbón activado y sin carbón activado, por lo que los explantes de material vegetal no
pudieron ser obtenidos.

Las semillas pudieron germinar exitosamente en un medio de cultivo de ácido

indolacéticoco (AIA), ácido naftalacetico (ANA), giberelinas y agua de coco, aunque fue
de forma lenta al final se obtuvieron plántulas en un estado de asepsia y libre de agentes
contaminantes externos.

Foto del explante
Tipo de tejido del explante ¿Es viable la utilización?
Tejido basal central, en No, debido a que el tejido
medio ms con hormonas tendio a un proceso de
ANA, AIA, Gas en una oxidación.
concentración de 250µl.

Tejido central, en medio No, debido a que el

ms con hormonas ANA, fragmento vegetal tendió a
AIA, Gas en una un proceso de oxidación.
concentración de 250µl.

23
Tejido apical, en medio ms No, este explante parecía
con hormonas ANA, AIA, que haría el proceso de
Gas en una concentración generación de callos, pero
de 250µl. al final se vitrifico y se
terminó por oxidar.

Tejido central, medio MS No, ya que a pesar de tener

Con carbón activado, ppm, un antifúngico en el medio
hormonas ANA, AIA, Gas de cultivo creció un hongo
y BAP en una de carácter endófito.
concentración de 250 µl.

Tejido central, medio MS No, a pesar de no presentar

Con carbón activado, ppm, contaminación el tejido
hormonas ANA, AIA, Gas vegetal se vitrifico después
y BAP en una de 5 días.
concentración de 250 µl.

24
Tejido yema axilar, medio No, ya que hubo
MS con carbón activado, proliferación de hongos
ppm, hormonas ANA, que estaban dentro del
AIA, Gas y BAP en una tejido vegetal.
concentración de 250 µl.

Tejido cladodio apical, No, el cladodio no creció

medio MS con carbón más, si no que comenzó a
activado, ppm, hormonas oxidarse y posteriormente a
ANA, AIA, Gas y BAP en un proceso de vitrificación.
una concentración de 250
µl.

Tejido central, medio MS

Con carbón activado, ppm,
hormonas ANA, AIA, Gas
y BAP en una
concentración de 250 µl.

25
 Tejido central medio MS Si, hasta el momento
Con carbón activado, ppm, realizado este escrito el
hormonas ANA, AIA, Gas tejido vegetal muestra una
y BAP en una forma de crecimiento
concentración de 300 µl correcta en medio
semisólido.

Tejido central Tejido Si, hasta el momento

central medio MS realizado este escrito el
Con carbón activado, ppm, tejido vegetal muestra una
hormonas ANA, AIA, Gas forma de crecimiento
y BAP en una correcta en medio
concentración de 300 µl semisólido.

Tejido central Tejido Si, hasta el momento

central medio MS realizado este escrito el
Con carbón activado, ppm, tejido vegetal muestra una
hormonas ANA, AIA, Gas forma de crecimiento
y BAP en una correcta en medio
concentración de 300 µl semisólido.

Tejido central Tejido Si, hasta el momento

central medio MS realizado este escrito el
Con carbón activado, ppm, tejido vegetal muestra una
hormonas ANA, AIA, Gas forma de crecimiento
y BAP en una correcta en medio
concentración de 300 µl semisólido.

Tabla 3. Imágenes del material vegetal para explante, además de tipo de tejido que es, el
medio en el que aplico y si son viables para un sistema de inmersión temporal.

26
Germinación de semillas
Las semillas extraídas desde un fruto de pitahaya tuvieron un porcentaje de germinación del
100% además que las semillas no presentaron hongos por lo que en el siguiente grafico
veremos como fueron germinando progresivamente las semillas.

porcentaje de germinación de semillas de

pitahaya Gráfico 1. Porcentaje de
120% germinación de semillas frescas
de pitahaya en diferentes tipos
100%
de medios de germinación.
80%

60%

40%

20%

0%
dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8 dia 9 dia dia dia dia dia
10 11 12 13 14

% germinación agua
% germinación medio de cultivo + agua coco
% germinación medio de cultivo sin agua de coco

grafico de generación de explantes

8
6
4 Gráfico 2. Numero de explantes
2
0
viables por diferentes medios de
cultivo diseñados

viable contaminado vitrificado

Discusión de resultados
Debido a que para poder comenzar el sistema de inmersión temporal es necesario contar
con los explantes que son los que se micropropagaran en los sistemas BIT y Smith en
medio semisólido, retraso los tiempos previstos para obtener los resultados en tiempo y
forma, ya que en la generación de los explantes hubo múltiples tratamientos que dieron
diversos resultados, en la tabla 3 como podemos observar que en los medios sin carbón
activado y sin ppm el material vegetal se contamino y también se oxido debido a se tuvo

27
por lo que hizo falta el carbón activado para evitar ese proceso de oxidación y falta de ppm
para evitar la colonización de hongos en el medio de cultivo, en el segundo tratamiento ya
con estos dos nuevos aditamentos además de también ya contar con Benciaminopurina
(BAP) en una concentración de 250 µl no obstante el resultado fue similar en la tabla 3
podemos visualizar como el tejido vegetal central tendió a oxidarse a pesar de que contaba
con carbón activado esto debido a que el medio de cultivo estaba solido o pudo afectar el
cloro a los tejidos en el protocolo de desinfección, además que los hongos volvieron a
presentarse demostrando que los conidios de los hongos que están en las vainas que se
utilizaron para la obtención de explante son de carácter endófito, es decir se encuentran
dentro del tejido vegetal lo cual dificulta más su eliminación dejando solo como la opción
eliminar la parte de cobertura de las vainas para eliminar de esa forma eficiente los conidios
de los hongos, en el tercer tratamiento se hizo un medio semisólido el cual tuvo la
concentración de mayor de hormonas y ppm para intentar obtener los explantes en la tabla
3 podemos observar como de los 10 explantes 4 son viables lo cual en la grafica 2 podemos
ver como tenemos en el tratamiento 3 la mitad de vitrificado y la mitad en estado viable
para poder generar los explantes necesarios para el sistema de inmersión temporal, lo cual
al parecer tiene mejor resultado en un medio semisólido que en medio solido por lo tanto se
podría repetir el mismo experimento.
Mientras que en el grafico 1 indica bajo que tratamiento se germinan de manera más
eficiente las semillas de pitahaya para la generación de plántulas que posteriormente serán
aplicadas al sistema de inmersión temporal, una vez que tengan un tamaño aceptable, ya
que es la segunda opción viable para poder hacer el sistema de inmersión temporal, además
que está desde el inició en un ambiente estéril libre de patógenos, volviendo la opción más
viable para trabajar esta especie de cactácea.

Conclusión parcial
Según los datos anteriores obtenidos en la fase experimental hacen notoria la presencia de
un hongo endófito en los tejidos vegetales de la pitahaya, por lo que es necesario replantear
los protocolos de desinfección y selección del material vegetal para poder obtener los
explantes para poder aplicar el sistema de inmersión temporal debido a que las
contaminaciones por el material vegetal dificultan la obtención de explantes además de la
modificación en el diseño de medio de cultivos ya que estos pueden ayudar para disminuir
los problemas de contaminación.

Los cladodios de la pitahaya también no son viables a la aplicación de medio de cultivo MS

ya que al iniciar apenas su desarrollo a una vaina adulta estos tienden a vitrificarse, además
que a pesar de aplicar BAP a 0.5mg/l no hubo resultados tan viables posiblemente ya que el
medio de cultivo se encontraba en un estado solidó, también se considera que al ser de

28
origen silvestre sea necesaria aumentar más esta concentración para poder adaptarla a los
sistemas in vitro

Conforme está el proyecto aun no se han conseguido los objetivos de la comparación de

crecimiento en el sistema de inmersión temporal de tipo BIT y Smith debido a que los
explantes no pudieron obtenerse en tiempo y forma por lo que se recurrió a la germinación
de semillas de pitahaya para poder realizar este rubro del trabajo, por lo que es necesario
mayor tiempo para obtener los resultados necesarios y se cumplan los objetivos e hipótesis
del presente trabajo.

Perspectivas
El presente trabajo aun puede tener diferentes enfoques en uno de ellos será la aplicación de
plántulas obtenidas a través de la germinación de semillas con diferentes concentraciones
de BAP por lo que debido a los percances que se dieron durante el trabajo experimental este
enfoque es el que asemeja más a la propuesta inicial para este trabajo, no obstante, también
se puede mantener este enfoque sin realizar la comparación de los sistemas de inmersión,
además que esta seria una forma mas eficiente para sustituir los semilleros tradicionales
para la germinación de plántulas de pitahaya a través de semillas.

29
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32
Anexo de formulas
1. Fórmula para la solución de BAP en Hidróxido de sodio al 1N/1M
n moles n moles 1
M= =1 M = =n moles= =0.25
volumen (L) volumen 0.25l

40 g 10 g
1 mol NaOH → 0.25 mol NaOH →
mol mol

se disolvió 1.0 g de BAP en 100 ml de agua en la que se agregó gota a gota

NaOH al 1M hasta que el BAP se homogenizara en la solución.
2. Formulación para el volumen de agua oxigenada
C 1 C 2=V 1 V 2

C 1=10 volumenes

V 1=x

C 2=3 volumenes

V 2=100 ml

( C 2 )( V 2)
V 1=
C1

( 3 ) ( 100 ml )
V 1= =30 ml de H 2 O2
10

33
Anexo de imágenes

Figura 5. Desinfección de
tejido central de
pitahaya.

34
 Figura 6. Corte de las vainas de
pitahaya para su posterior
desinfección

35
36
Cronograma de actividades
actividades mese Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre
s
Entrega de
protocolo de tesis
Selección de
explantes
Desinfección de
explantes
Preparación de
medios de cultivo
Aplicación de los
explante al medio
de cultivo
Fase de inmersión

Renovación del
medio de cultivo
Conteo de las
plántulas
Elaboración del
informe de
resultados
Entrega de informe
de resultados.

37