Informes de Prácticas

Métodos y Técnicas de Estudio

Bacteriológico I
ÍNDICE

COLORACIÓN GRAM ...................................................................................................1

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 2
II. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 3
a. Objetivos...................................................................................................................... 6
b. Materiales .................................................................................................................... 7
c. Procedimiento ........................................................................................................... 11
d. Resultado .................................................................................................................. 14
e. Método ....................................................................................................................... 15
III. CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 16
IV. CUESTIONARIO .......................................................................................................... 17
V. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 20
COLORACIÓN ZIEHL NEELSEN ........................................................................... 21
I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 22
II. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 23
a. Objetivos.................................................................................................................... 25
b. Materiales .................................................................................................................. 26
c. Procedimiento ........................................................................................................... 29
d. Resultado .................................................................................................................. 31
e. Método ....................................................................................................................... 32
III. CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 34
IV. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 35
MEDIOS DE CULTIVO GRAM + .............................................................................. 36
I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 37
II. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 38
a. Objetivos.................................................................................................................... 42
b. Materiales .................................................................................................................. 43
c. Procedimiento ........................................................................................................... 47
d. Resultado .................................................................................................................. 52
III. CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 53
IV. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 54
PRUEBA DE LA CATALASA Y COAGULASA................................................. 55
I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 56
II. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 57
 a. Objetivos.................................................................................................................... 62
b. Materiales .................................................................................................................. 63
c. Procedimiento ........................................................................................................... 65
d. Resultado .................................................................................................................. 67
e. Método ....................................................................................................................... 68
III. CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 69
IV. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 70
LECTURA DE PLACAS Y SIEMBRA EN LOS DIFERENCIALES ............ 71
I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 72
II. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 73
a. Objetivos.................................................................................................................... 79
b. Materiales .................................................................................................................. 80
c. Procedimiento ........................................................................................................... 83
d. Resultados ................................................................................................................ 87
III. CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 90
IV. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 91
PREPARACIÓN Y SIEMBRA DE MUELLER HILTON-LECTURA DEL
ANTIBIOGRAMA Y REPORTE................................................................................... 92
I. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 93
II. MARCO TEÓRICO ................................................................................................... 94
a. Objetivos.................................................................................................................... 96
b. Materiales .................................................................................................................. 97
c. Procedimiento ........................................................................................................... 99
d. Resultados .............................................................................................................. 101
III. CONCLUSIÓN ............................................................................................................ 102
IV. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 103
COLORACIÓN
GRAM

1
I. INTRODUCCIÓN

Para poder identificar más fácilmente a las bacterias, se utiliza una

tinción diferencial, llamada tinción Gram, en la que utiliza dos colorantes y
clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas
y bacterias Gram positivas. Es una de las tinciones más utilizadas
universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. Los
principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared
celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo.
Este trabajo tiene como fin identificar mediante la tinción las bacterias gram
positivas de las negativas, además del procedimiento a detalle con los materiales
adecuados y finalmente su uso.

2
II. MARCO TEÓRICO

PARED CELULAR BACTERIANA

Es una capa adicional que proporciona cierta resistencia por tener una estructura
semirrígida; además proporciona fuerza a la célula y puede contribuir a la
patogenicidad o enfermedad.
No todas las bacterias tienen pared celular, alrededor del 90% lo posee, estas
son de 2 tipos: Gram + y Gram -. Se diferencian mediante una tinción diferencial
conocida como la tinción Gram.
Estas bacterias tienen en sus paredes peptidoglicano (también llamado
mureína). Pero en ambas poseen ingredientes adicionales, lo que hace que la
pared celular sea una estructura compleja.

Peptidoglicano
Es un compuesto exclusivo de las bacterias, está formado por azúcares y
aminoácidos.

a) Pared Celular Gram +

El peptidoglicano forma casi el 90 % de la pared celular, formándose capa
tras capa alrededor de la membrana celular.
Un componente adicional es el ácido teicoico, que esta incrustado en las
capas de peptidoglucano; este genera carga neta de la célula, contribuye a
la rigidez celular, participan en la división celular y desempeñan un papel de
resistencia como a las altas temperaturas y concentraciones de sal; así como
de antibióticos.

3
Los ácidos teicoicos pueden unirse covalentemente o conectarse a la membrana
celular a través de un anclaje lipídico, en cuyo caso se le conoce como ácido
lipoteicoico.

b) Pared celular Gram –

Son más complejas que las bacterias Gram +, poseen entre un 5 a 10 % de
peptidoglicano.
Esta posee una membrana plasmática afuera de las capas de peptidoglicano,
conocida como membrana externa.
Presenta moléculas de lipopolisacáridos que se anclan a la membrana externa,
contribuye a la carga negativa neta para la célula, ayudar a estabilizar la
membrana externa y proporcionar protección contra ciertas sustancias químicas.
Además, juega un papel en la respuesta del hospedador a bacterias Gram -
patógenas.
Tienen porinas, las cuales transportan sustancias.
Las capas de peptidoglicano están unidad a la membrana externa mediante las
lipoproteínas.

4
TINCIÓN GRAM
En la década de 1880, en un hospital de Berlín
trabajó el médico danés Hans Christian Gram,
quien desarrolló la más importante tinción
bacteriológica. Él desarrolló una técnica de
tinción en la cual observaba bacterias en tejidos
de pulmones de pacientes que morían de
neumonía. El procedimiento que desarrolló,
ahora llamado tinción de Gram, demostró dos
categorías generales de bacterias que
causaban neumonía: algunas se teñían de
violeta y otras se teñían de rojo. Las bacterias
teñidas de azul fueron conocidas como Gram positivas, y las teñidas de rojo
como Gram negativas.
La tinción de Gram diferencia a las bacterias en dos grandes grupos.
Se llama bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul-violeta,
debido a su gruesa pared celular formada por varias capas de peptidoglicano. Al
introducir alcohol, se deshidratan, lo que provoca el cierre de los poros de las
paredes, así que el colorante no sale de la bacteria.
Y se denomina bacterias Gram negativas que pueden extraer el complejo cristal
violeta – yodo, debido a que la membrana externa es rica en lípidos, además de
que la capa de peptidoglicano es tan fina que no impide el paso del solvente, así
que el colorante sale de la célula. Después del tratamiento con alcohol, estas
bacterias reciben una tinción de contraste, la safranina, para diferenciarse de las
bacterias Gram positivas.

5
a. Objetivos

General:
 Diferenciar las bacterias Gram positivas (+) de las Gram negativas (-).
Específico:
 Realizar adecuadamente el procedimiento para mejorar el contraste en la
imagen vista al microscopio.

6
b. Materiales

Microscopio

Caldos de cultivo
E. Coli y Staphylococcus
aureus

Tubos de ensayo

7
Láminas portaobjeto

Pipeta

Mechero

Asa de siembra

8
Laminillas cubreobjetos

 Colorantes: Cristal
violeta, safranina
 Mordiente: Lugol
 Decolorante:
Alcohol acetona
 Agua destilada

Puente de tinción

9
 EPP´S

Aceite de inmersión

Suero fisiológico

10
c. Procedimiento

1er Paso Con un asa de siembra esterilizado, cogemos una colonia de

Escherichia coli para realizar el frotis en una lámina porta objetos.

A B

Repetir el procedimiento con el tubo (Staphylococus aureus)

2do Paso Fijar el frotis sobre un mechero de 2 a 3 veces.

11
 3er Paso En una bandeja de tinción colocaremos el frotis. Agregamos cristal
violeta y dejar reposar por 1 a 2 min. Después lavarlo con agua destilada.

A B C

4to Paso Agregar el lugol y dejar reposar por 1 a 2 min. Después lavar con agua
destilada.

A B

12
5to Paso Agregar alcohol acetona y dejar reposar por medio minuto. Después
lavar el exceso con agua destilada.

A B

6to Paso Agregar safranina y dejar reposar por 1 a 2 min. Después lavar el exceso
con agua destilada. Después secar suavemente con un papel toalla y ver al
microscopio en 100x.

A B

13
d. Resultado

Escherichia coli Staphylococus aureus

Observando en el microscopio a 100x

Observando en el microscopio a 100x se
la muestra estaba contaminada no se
encontró bacilos teñidos de color rosado
logró observar los cocos gram
ya que son bacterias gram negativas.
positivos.

14
 e. Método

TINCIÓN GRAM

Bacteria Bacteria
G+ G+
1´min Bacteria
Lugol G+
Cristal
Bacteria Safranina
violeta

Bacteria Bacteria
G- G-
2´min
Alcohol-
acetona
Bacteria
G-

15
III.CONCLUSIÓN

Con la finalidad de mejorar la sensibilidad y especificidad de las pruebas

realizadas en el laboratorio, es importante el uso de las epp´s para el personal
del laboratorio, así como también la revisión periódica de los microscopios.
Esta tinción nos ayuda a diferenciar los gram positivos y negativos, es una de las
técnicas más usadas, mostrando así a los bacilos positivos de color fucsia.
La tinción resultará eficiente cuando se cumpla el orden y el tiempo adecuado,
así también con el correcto lavado al finalizarse. Se observará la diferencia
cuando lo llevemos al microscopio.
Finalmente, con los puntos ya mencionados en este informe , los resultados de
esta tinción no fueron correctos y/o deseados, ya que la muestra estuvo
contaminada.

16
IV. CUESTIONARIO

Define los siguientes términos.

1. Colorante: Los colorantes son sustancias que tienen la capacidad de

teñir células, estructuras o tejidos; y de acuerdo con su origen, permiten
hacer visibles los objetos microscópicos y transparentes y así conocer
más de su estructura interna o externa.
2. Mordente: Intensifican la tinción para aumentar la afinidad de la célula
por el colorante.
3. Tinción diferencial: El colorante utilizado se manifiesta diferenciando
entre células bacterianas o entre partes de una misma célula. Estas
técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción.
4. Tinción simple: Consiste en la aplicación de un solo colorante a la
muestra, esta debe ser posterior a la fijación de esta, permitiendo su
visualización.
5. Peptidoglucano: Es un polímero que consta de azúcares y
aminoácidos que forma una capa, formando la pared celular.
6. Ácido teicoico: Los ácidos teicoicos son polímeros de un polialcohol
unidos mediante enlaces fosfodiéster.
7. Espacio periplásmico: Es una solución densa, con alta concentración
de macromoléculas, y que participa en la regulación de la osmolaridad
celular frente a la tonicidad del medio exterior.
8. Membrana celular: Estructura fina que envuelve a la célula y separa
el contenido de esta misma de su entorno.
9. Lipopolisacárido: Es el mayor componente de la membrana externa
de las bacterias Gram negativas.

17
Haz un diagrama de flujo sobre el proceso de la tinción de
Gram, indicando la función de cada sustancia empleada.

18
Haz un dibujo de las paredes celulares de una bacteria
Gram positiva y una Gramnegativa señalando las
principales estructuras en ellas.

19
V. BIBLIOGRAFÍA

1. Christian. El Peptidoglicano | Bacterias [Internet]. Microbiología. 2020.

Available from:
https://microbiologia.net/bacterias/peptidoglicano/#Diferencias-entre-
GRAM-positivas-y-GRAM-negativas

2. Bacterias - Paredes Celulares [Internet]. LibreTexts Español. 2022.

Available from:
https://espanol.libretexts.org/Biologia/Microbiolog%C3%ADa/Libro%3A_
Microbiolog%C3%ADa_(Bruslind)/04%3A_Bacterias_-
_Paredes_Celulares

3. Rodríguez P, Arenas R, Gea M. Hans Christian Gram y su tinción Hans

Christian Gram and His Staining [Internet]. 2018. Available from:
https://www.medigraphic.com/pdfs/cosmetica/dcm-2018/dcm182n.pdf

20
COLORACIÓN
ZIEHL
NEELSEN

21
 I. INTRODUCCIÓN

En este informe detallaremos la tinción de Ziehl-Neelsen, utilizando esta técnica

es posible identificar al bacilo de la tuberculosis en la muestra del enfermo como
un bastoncito rojo fucsia sobre una coloración de fondo que facilita su
visualización.
Esta propiedad no es específica del bacilo de la tuberculosis, sino que la tienen
todos los bacilos del género Mycobacterium, aún las micobacterias ambientales
y otros pocos microorganismos.

La coloración de Ziehl-Neelsen es la técnica apropiada para ser utilizada en

todos los laboratorios y es recomendada para enfermedades respiratorias por la
certeza en sus resultados.

Así también precisaremos el paso a paso de esta tinción con los materiales
adecuados para visualizar dichas bacterias en el microscopio.

22
 II. MARCO TEÓRICO

TUBERCULOSIS
Enfermedad infecciosa generalmente crónica Y potencialmente seria causada
por las especies del género Mycobacterium, M. tuberculosis. Que afecta
principalmente los pulmones, se transmite el enfermo a través de pequeñas
gotitas diseminadas en el aire al toser o estornudar estas lo inhala la persona
sana y basta con que una persona inhale unos pocos de estos bacilos para
quedar infectada o también a través de la ingestión de leche de vaca
contaminada, respectivamente.

PATOGÉNESIS
La tuberculosis puede afectar a cualquier órgano, pero dado que la vía de ingreso
más frecuente es la inhalatoria, la presentación más habitual de la enfermedad
es la pulmonar. Los pasos involucrados en la patogénesis de la tuberculosis se
presentan de manera muy simplificada.

Patogénesis de la tuberculosis. Se describe la evolución de los casos extremos

cuando la bacteria ingresa por primera vez a un huésped inmunocompetente o
inmunodeficiente.

23
TINCION ZIEHL- NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen en una
técnica de coloración para identificar
microorganismos alcohol-ácido
resistentes (BAAR). El nombre de este
procedimiento de microbiología hace
referencia a sus autores: el bacteriólogo
Franz Ziehl y el patólogo Friedrich
Neelsen. Esta técnica es un tipo de
coloración diferencial, lo que implica el
uso de distintos colorantes con la finalidad de crear contraste entre las
estructuras que se desean observar, diferenciar y posteriormente identificar son
coloreadas de rojo por la Fucsina y retienen el color a pesar de la acción del
ácido y del alcohol. La tinción de Ziehl-Neelsen identifica ciertos tipos de
microorganismos. Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por
ejemplo, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (por ejemplo, Nocardia sp.) y
algunos parásitos unicelulares (por ejemplo, Cryptosporidium parvum).

FUNDAMENTO
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el
calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos
grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro
lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante
lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la
decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza
azul de metileno como tinción de contraste.
Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido
micólico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante
1rio (fuscina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Una vez que se
forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y
del alcohol pueden deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma
"resistente".

24
 a. Objetivos

General:

 Determinar la presencia de bacterias ácido alcohol resistentes (BAAR).

Específico:
 Utilizar las técnicas adecuadas para realizar la coloración Ziehl-Neelsen
 Conocer el procedimiento para la observación microscópica.

25
b. Materiales

Microscopio

Gancho de madera

Frasco estéril con

muestra de esputo

ESPUTO

26
Láminas portaobjeto

Mechero

Asa de siembra

27
 Colorante:
Fucsina
 Decolorante:
Alcohol acido
 Colorante de
contraste: azul de
metileno
 Agua destilada

Puente de tinción

Aceite de inmersión

EPP´S

28
 c. Procedimiento

1er Paso Realizar un frotis con la muestra de esputo en una lámina portaobjetos
y fijarlo con el mechero.

2do Paso Añadir la fucsina al frotis sobre una bandeja de coloración y dejar actuar
durante 1 minuto.
Con ayuda de una pinza, pasaremos el frotis sobre un mechero, hasta observar
la emisión de 3 vapores (3 a 5 min). Luego lavar el excedente con agua destilada.

A B

29
3er Paso Añadir el alcohol ácido y dejar actuar por medio minuto y retirar el
excedente con agua destilada.

A B

4to Paso Añadir el colorante de contraste azul de metileno dejando actuar por 1
min y después retirar el excedente con agua destilada. Posteriormente secar
suavemente con un papel toalla y observar al microscopio en 100x.

A B

30
d. Resultado

Observando al microscopio a 100 x no se encontraron bacilos ácidos

alcohol resistentes (BAAR).

31
e. Método

Coloración Ziehl-Neelsen
1. Hacer un frotis de la muestra de esputo.

2. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al

portaobjetos.

Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y

un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la
tinción.

3. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción

con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos
orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba.

4. Dejar el frotis sobre el puente de tinción.

5. Aplicar fucsina-fenicada.

Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5

minutos. Mantenga el calor durante este período.

6. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).

Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre
y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el
colorante.

7. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente

fría hasta que toda la tinción libre quede lavada, de manera que el
extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

8. Decolorar con alcohol-ácido.

Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol

ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Si no se
decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos
TBC puede permanecer teñido.

32
9. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de
agua. Si los portaobjetos aún están rosas, aplique una cantidad
adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

10. Aplicar azul de metileno (1 minuto).

11. Enjuagar con agua

12. Coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

13. Finalmente coloque una gota de aceite de inmersión y haga la

observación al microscopio con 10 x 100.

33
 III.CONCLUSIÓN

En esta práctica se realizó la tinción de Ziehl Neelsen, la cual nos permite

diferenciar e identificar a las bacterias ácido alcohol resistente (BAAR) mediante
el uso del calor, colorantes y un decolorante ácido.
Siguiendo el proceso correcto para realizar la coloración; además de trabajar con
las medidas necesarias de bioseguridad y de esterilidad. Para lo cual se observó
mediante el microscopio que las bacterias adquirieron una coloración azulina,
indicando que no son BAAR.

34
IV. BIBLIOGRAFÍA

1. Graterol R OA, Barreto E ME, Ramos NA, Fernández F S, Da Mata J OJ,

Angulo JA. Diseño del Kit de Tinción Ziehl Neelsen del Instituto Nacional
de Higiene “Rafael Rangel”. Revista del Instituto Nacional de Higiene
Rafael Rangel [Internet]. 2016 [citado el 23 de marzo de 2023];47(1-2):18–
26. Disponible en:
https://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0798-
04772016000100003

2. Detección del género Mycobacterium con tinción diferencial de Ziehl-

Neelsen. [Internet]. RSI - Revista Sanitaria de Investigación. 2021[citado
el 23 de marzo de 2023]. Disponible en:
https://revistasanitariadeinvestigacion.com/deteccion-del-genero-
mycobacterium-con-tincion-diferencial-de-ziehl-neelsen/

3. Tinción_de_Ziehl_Neelsen [Internet]. Quimica.es.[citado el 23 de marzo

de 2023 Disponible en:
https://www.quimica.es/enciclopedia/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl_Neelsen.
html

35
MEDIOS DE
CULTIVO
GRAM +

36
 I. INTRODUCCIÓN

Para el crecimiento de bacterias es necesario cultivarlas en un medio rico en

nutrientes u otras sustancias y así proporcionar los medios necesarios para
lograr su óptimo crecimiento.
En el presente informe se realizará la preparación de dos medios de cultivo; el
agar sangre que contiene un 5% de sangre, que al ser un medio diferencial nos
permite observar la hemólisis producida por algunas bacterias y el agar manitol
salado es un medio selectivo y diferencial, ya que fue creado para el aislamiento
de cocos Gram positivos, especialmente Staphylococcus aureus; además nos
permite diferenciar a las bacterias que fermentan el manitol de las que no lo
fermentan.
Se realizó el cultivo de Escherichia Coli en los dos medios preparados, que serán
incubados el tiempo necesario para su crecimiento.

37
 II. MARCO TEÓRICO

MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo microbiológico deben proporcionar condiciones de
crecimiento óptimas para todos los microorganismos o para tipos específicos de
microorganismos. La composición precisa de un medio depende de la especie
que vaya a cultivarse y del objetivo de la aplicación. El pH del medio debe
ajustarse en función de los microorganismos. Los medios de cultivo
microbiológico se clasifican en función de diversos parámetros, como los
componentes químicos, su característica física y su función.

AGAR SANGRE
Es un medio de cultivo sólido enriquecido, utilizado para la recuperación y
crecimiento de una gran variedad de microorganismos provenientes de muestras
clínicas o para subcultivos.
Este medio de cultivo se compone
básicamente de un agar base enriquecido y
5% de sangre ovina. La base de agar puede
variar de acuerdo con las necesidades, pero
principalmente estará compuesto por
peptonas, aminoácidos, vitaminas, extracto de
carne, cloruro de sodio, agar, entre otros. En
cuanto a la sangre, en ocasiones se usa
sangre humana.

El medio agar sangre puede ser preparado en

el laboratorio o puede comprarse ya listo, a
empresas que se dedican a ello. La
preparación de este medio es muy delicada,
cualquier descuido en su elaboración dará como resultado un lote contaminado.

FUNDAMENTO
El agar sangre es un medio enriquecido, diferencial y no selectivo.

 Es un medio enriquecido porque lleva como aditivo principal 5-10% de

sangre sobre una base de agar. Ambos compuestos contienen muchos
nutrientes que permiten que en él puedan crecer la mayoría de las
bacterias cultivables.
 Ese crecimiento ocurre sin restricción, por eso es no selectivo. Sin
embargo, si se le adicionan compuestos que impidan el crecimiento de
algunos microorganismos y favorezca el de otros, se vuelve selectivo. Por
ejemplo, si se añaden ciertos tipos de antibióticos o antifúngicos.

38
  Es diferencial, ya que permite distinguir 3 tipos de bacterias: los beta-
hemolíticos, alfa-hemolíticos y gamma-hemolíticos.
 Los beta-hemolíticos son aquellos que tienen la capacidad de lisar o
romper completamente los glóbulos rojos, formando un halo claro
alrededor de las colonias, por tanto, producen hemólisis ß o ß-hemólisis,
y los microorganismos son llamados ß-hemolíticos. Ejemplos de bacterias
ß-hemolíticas son Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae.
 Los alfa-hemolíticos son los que realizan una hemólisis parcial, donde la
hemoglobina es oxidada a metahemoglobina, generándose una
coloración verdosa alrededor de las colonias. Este fenómeno se conoce
como hemólisis α o α-hemólisis, y a las bacterias se les clasifica como α-
hemolíticos. Ejemplo de bacterias α-hemolíticos son Streptococcus
pneumoniae y Streptococcus del grupo viridans.
 Las bacterias gamma-hemolíticas o no hemolíticas crecen sobre el agar
sin generar cambios en el mismo, efecto conocido como γ-hemólisis, y los
microorganismos son γ-hemolíticos. Ejemplo de bacterias γ-hemolíticas:
algunas cepas de Streptococcus del grupo D (Streptococcus bovis y
Enterococcus faecalis).

USOS

 Este medio de cultivo es uno de los más comúnmente utilizados en el

laboratorio de microbiología. Entre los microorganismos capaces de
crecer en este medio se tienen: bacterias aerobias estrictas, facultativas,
microaerófilas, anaerobias, grampositivas o gramnegativas, bacterias de
crecimiento rápido o crecimiento lento.
 También crecen algunas bacterias exigentes o fastidiosas desde el punto
de vista nutricional, así como hongos y levaduras. Es útil para realizar
subcultivos o reactivar cepas que metabólicamente estén muy débiles.

AGAR MANITOL SALADO

Es un medio altamente selectivo para el

aislamiento primario de estafilococos
patógenos, cuya composición incluye el
alcohol polihidroxílico (manitol). Este
sustrato permite la identificación de
estafilococos coagulasa-positivos
pertenecientes fundamentalmente a la
especie Staphylococcus aureus, por su
capacidad de fermentar el manitol,
característica que ha sido considerada
como un índice de patogenicidad.

39
FUNDAMENTO
El agar manitol es selectivo gracias a la alta concentración de sal que posee. La
salinidad actúa como sustancia inhibitoria y evita el crecimiento de bacterias
Gram negativas.

También es diferencial debido a la presencia del carbohidrato manitol y al

indicador de pH rojo de fenol. A partir de este, las bacterias capaces de fermentar
el manitol producen ácidos, acidificando el medio, tornándose las colonias y el
medio de color amarillo.

Por otra parte, las colonias que no fermentan el manitol crecen en el medio
tomando los nutrientes que les proporciona los extractos y peptonas de carne y
la tripteína. De allí las bacterias extraen el carbono, el nitrógeno, las vitaminas y
los minerales necesarios para su crecimiento.

Las colonias en este caso pueden ser rosadas débiles o fuertes, y el medio se
queda del mismo color o cambia a fucsia.

USOS
 Por su alta selectividad, este medio es ideal para sembrar muestras con
flora mixta en la que se quiere buscar la presencia de Staphylococus
aureus, como principal patógeno de este género.
 En este sentido, uno de sus usos más frecuentes es en el análisis
microbiológico de muestras de exudados faríngeos y secreción nasal,
especialmente para detectar portadores asintomáticos de S. aureus.
 Algunos países han implementado este análisis como requisito obligatorio
para personas que desean trabajar como expendedores de alimentos.
 Este control previene que se contraten personas portadoras de S. aureus,
evitándose así que haya intoxicaciones alimentarias masivas, debido al
consumo de alimentos contaminados con la enterotoxina estafilocócica.
 También puede incluirse en la siembra de infecciones de heridas,
hemocultivos, LCR, lavado bronco alveolar, entre otras.

40
41
 a. Objetivos

General:
 La siembra del Staphylococus Aureus en agar sangre y manitol salado.
Específico:
 Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar un
buen resultado.
 Identificar y describir correctamente las características y diferencias de
cada agar.
 Identificar e interpretar los resultados de los agares empleados.

42
 b. Materiales

Placas Petri

Frascos para autoclave

Asa de siembra

43
Probeta de 1000ml

Mechero

Vaso precipitado

44
 Agar Base

Agar Manitol Salado

Agua destilada

45
Pinzas

Bagueta

EPP´S

46
 c. Procedimiento

Procedimiento del Agar Manitol Salado

1er Paso Preparar el agar Manitol Salado en 100 mL de agua destilada.

A B C

2do Paso Calentar la disolución hasta el punto de ebullición, agitando con una
bagueta para asegurar la completa disolución.

A B

47
3er Paso Llevar el frasco a la autoclave durante 45 min a 120 °C.

A
B

Aflojar la tapa del frasco antes de meter a

la autoclave

4to Paso Después del tiempo indicado, verter la disolución del agar Manitol
Salado junto a un mechero a una placa petri previamente esterilizada.

48
5to Paso Con el asa de siembra esterilizada, cogemos una colonia de
Staphylococus aureus para realizar el cultivo.

A B

Para el cultivo es importante solo tener la tapa levantada y tener un

mechero al lado para que no se contamine.

Procedimiento del Agar Sangre

1er Paso Se prepara el agar base en 100 mL de agua destilada.

49
 2do Paso Calentar la disolución hasta el punto de ebullición, agitando con la
bagueta para asegurar la completa disolución.

3er Paso Llevar el frasco a la autoclave durante 45 min a 120 °C.

Aflojar la tapa del frasco antes de meter a

la autoclave

50
 4toPaso Añadir 5 mil de muestra sanguina de un tubo lila a la disolución del agar
base ya esterilizado (Agregar cuando el agar este frio). Homogenizar la sangre
y el agar base para así formar el agar sangre.

A B C

5to Paso Verter la disolución del agar sangre junto a un mechero a una placa
petri previamente esterilizada. Con ayuda del asa de siembra esterilizada,
cogemos una colonia de Staphylococus aureus para realizar el cultivo.

Para el cultivo es importante solo tener la tapa levantada y tener un

mechero al lado para que no se contamine.

51
 d. Resultado

Agar sangre Agar manitol salado

Presenta una beta hemolisis Staphylococus aureus positivo y este

causada por las bacterias de presenta la fermentación del manitol,
Staphylococus aureus en colonias amarillas y resistentes a las
crecimiento y colonias dorado pardo. sales del medio.

52
 III.CONCLUSIÓN

Es importante conocer las medidas de seguridad y los pasos para preparar los
medios de cultivo, ya que debido a esto podemos generar colonias bacterianas
y obtener los resultados deseados.
Es necesario el cuidado de los medios de cultivo, tener el conocimiento y seguir
el procedimiento adecuado para evitar accidentes y la propagación de bacterias
presentes en este medio.
De igual manera la esterilización es uno de los puntos que se debe resaltar, ya
que, si no tenemos un buen uso, los medios de cultivo no tendrían el crecimiento
que deseamos obtener y con ello nos llevaría también a tener materiales
contaminados que afectaría nuestra práctica.
Finalmente, con estos puntos mencionados, el resultado fue el ideal, es por ello
la importancia de cumplir con cada paso correctamente en el procedimiento.

53
IV. BIBLIOGRAFÍA

1. Sangre A. Valtek.cl. [citado el 9 de abril de 2023]. Disponible en:

https://www.valtek.cl/wp-content/uploads/2020/02/Agar-Sangre-Soya-
Tripticasa-Versi%C3%B3n-3-Valtek.pdf

2. Manitol -Sal A. Valtek.cl. [citado el 9 de abril de 2023]. Disponible en:

https://www.valtek.cl/wp-content/uploads/2020/02/Agar-Manitol-Sal-Placas-
Valtek-Version-3.pdf

3. Microbiología clínica [citado el 9 de abril de 2023]. Disponible en:

https://www.sintesis.com/data/indices/9788490773185.pdf

54
 PRUEBA DE
LA
CATALASA Y
COAGULASA

55
 I. INTRODUCCIÓN

En el presente informe se detallará la prueba de catalasa que consiste en la

identificación de numerosos microorganismos. La efervescencia (burbujeo) es
consecuencia de la acción de una enzima llamada catalasa que, al entrar en
contacto con el peróxido de hidrógeno, convierte este compuesto en agua y
oxígeno. Usando el método empleado para ello que es la lámina porta objetos
con los reactivos correspondientes, de esta manera obtendremos los resultados
correspondientes para esta prueba si es negativo o positivo en Escherichia Coli.

Además de ello se tendrá conocimiento de la prueba de coagulasa, los reactivos

empleados, materiales necesarios, procedimientos y las precauciones para ello.

56
 II. MARCO TEÓRICO

CATALASA
La prueba de la catalasa es una metodología usada en los laboratorios de
bacteriología para poner en evidencia la presencia de la enzima catalasa en
aquellas bacterias que la poseen. Junto a la coloración de Gram son las
principales pruebas que se le deben realizar a los microorganismos recién
aislados. Estas pruebas orientan al microbiólogo sobre los pasos a seguir para
la identificación definitiva del microorganismo en cuestión.
Por lo general las bacterias que contienen citocromo poseen la enzima catalasa,
es decir, que las bacterias aerobias y anaerobias facultativas deberían poseerla.
Sin embargo, existen excepciones, como por ejemplo los Streptococcus, que a
pesar de ser microorganismos anaerobios facultativos no poseen la enzima
catalasa.
Es por ello que la prueba de la catalasa se usa principalmente para distinguir a
las familias Staphylococaceae y Micrococaceae (ambas catalasas positivas) de
la familia Streptococaceae (catalasa negativa).

Así mismo, el género Bacillus (catalasa positiva) se distingue del género

Clostridium (catalasa negativa), entre otros.

La catalasa es una enzima clasificada como una hidroperoxidasa, esto quiere

decir que utilizan como sustrato al peróxido de hidrógeno (H2O2).

También se le considera una oxidorreductasa, ya que en la reacción donde

participa hay un elemento que sirve como donante de electrones (sustancia
reductora) y otro como receptor de electrones (sustancia oxidante).

La catalasa es una proteína que contiene un grupo prostérico con cuatro átomos
de hierro trivalentes (Fe+++), por tanto, es una homoproteína. El ión férrico se
mantiene oxidado durante la reacción.

Se puede decir que la catalasa es una enzima desintoxicante, pues su función

es eliminar sustancias que se producen durante el metabolismo bacteriano que
son tóxicas para las bacterias. Entre estas sustancias se encuentra el peróxido
de hidrógeno.

El peróxido de hidrógeno se forma de la descomposición de los azúcares por la

vía aeróbica. Este proceso ocurre de la siguiente manera:

El ión superóxido (O2–) (radical libre) se forma como producto final de la

asimilación de la glucosa por la vía aerobia. Este es tóxico y es eliminado por la
enzima superóxido dismutasa que lo transforma en oxígeno gaseoso y peróxido
de hidrógeno.

57
El peróxido de hidrógeno también es tóxico para las bacterias y debe ser
eliminado. La enzima catalasa desdobla el peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno.

La catalasa puede actuar sobre otros sustratos diferentes al peróxido de

hidrógeno, como alcoholes, aldehídos, ácidos, aminas aromáticas y fenoles. Sin
embargo, el peróxido de hidrógeno puede ser utilizado también por la catalasa
para oxidar otros compuestos tóxicos como el alcohol metílico y etílico.

Así mismo, la catalasa está presente en las células fagocíticas, protegiéndola de

la acción tóxica del peróxido de hidrógeno.

Interpretación

 Reacción positiva: desprendimiento de gas, que se evidencia con la

formación de burbujas (burbujeo fuerte).
 Reacción negativa: no hay formación de burbujas.

58
COAGULASA
La identificación de los Staphylococcus se basa en la morfología de las colonias,
las características en cultivo y bioquímicas y el examen microscópico. Sin
embargo, la detección de la coagulasa es el criterio más usado para la
diferenciación entre las especies.
La capacidad de Staphylococcus para producir coagulasa, una enzima capaz de
coagular el plasma fue comunicada por primera vez por Loeb en 19032. Desde
entonces, muchos investigadores han intentado correlacionar la producción de
coagulasa con la patogenia de los Staphylococci.
Chapman, Berens, Nilson y Curcio, en un estudio de la producción de coagulasa
y hemolisina por los Staphylococcus, demostraron que las cepas que producían
coagulasa habitualmente eran patógenas, independientemente de sus
propiedades hemolíticas o cromógenas.
La experiencia más reciente ha demostrado que la capacidad de un
Staphylococcus para producir coagulasa no puede utilizarse como indicador
constante fiable de su patogenia.
PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
El Staphylococcus aureus produce dos tipos de coagulasa, libre y unida. La
coagulasa libre es una enzima extracelular producida cuando se cutiva el
organismo en caldo.
La coagulasa unida, conocida también como factor de aglutinación, permanece
fijada a la pared celular del organismo. La prueba en tubo consiste en la adición
de 2-4 colonias del aislado a un tubo que contiene plasma de coagulasa
rehidratado e incubación a 37 °C durante hasta cuatro horas.
La formación de un coágulo indica la producción de coagulasa. La prueba en
tubo es el método más usado debido a su mayor exactitud y gracias a su
capacidad para detectar tanto la coagulasa unida como la libre. La prueba en
portaobjetos se realiza haciendo una suspensión pesada del aislado de prueba
en una gota de solución salina en un portaobjetos de vidrio limpio y después
añadiendo una gota de plasma.
Luego se mezcla suavemente con un asa y se examina en busca de
aglutinación. Esta prueba es menos precisa que la prueba en tubo y requiere que
todas las pruebas negativas se confirmen mediante la prueba en tubo. Esta
prueba solo detecta la coagulasa unida.

REACTIVOS
El plasma coagulasa es plasma liofilizado de conejo al que se añade EDTA como
anticoagulante. Las bacterias no utilizan el EDTA, por lo que no producirá
reacciones falsas positivas de la coagulasa por las bacterias que utilizan citrato5.
El plasma de coagulasa de conejo se suministra en diversos tamaños: Código
del producto Tamaño Volumen para N. º aproximado de reconstitución pruebas

59
en tubo PL.850-3 10 viales/caja 3 ml/vial 6 x 10 PL.850-5 10 viales/caja 5 ml /vial
10 x 10 PL.850-10 Vial individual 10 ml/vial 20 PL.850-20 Vial individual 20 ml/vial
40 PL.850-30 Vial individual 30 ml/vial 60.

RECONSTITUCIÓN
Reconstituya el plasma de coagulasa de conejo añadiendo agua estéril
destilada o desionizada al vial en el volumen indicado en la etiqueta del producto.
Gire el vial con suavidad hasta que el producto se haya disuelto por completo. Si
el producto no se disuelve por completo o si contiene fibras o coágulos de fibrina,
no utilice el producto.

MATERIALES NECESARIOS, PERO NO SUMINISTRADOS

Agua estéril destilada o desionizada Asas de inoculación Tubos de ensayo de
12 mm x 75 mm Pipetas estériles de 1 ml Baño maría (37°C) Portaobjetos de
vidrio Cepas de control positivas y negativas (véase Control de Calidad).

PRECAUCIONES
1. El plasma de coagulasa de conejo está pensado exclusivamente para uso
diagnóstico in vitro.
2. No utilizar el reactivo después de la fecha de caducidad mostrada en la
etiqueta del producto.
3. Deben adoptarse precauciones universales al manipular, procesar y desechar
todas las muestras clínicas y reactivos.
4. El reactivo contiene material de origen animal y debe manejarse como
potencial portador y transmisor de enfermedades.
5. Para obtener resultados válidos deben seguirse los procedimientos,
condiciones de conservación, precauciones y limitaciones especificadas en
estas instrucciones de uso.

ESTABILIDAD Y CONSERVACIÓN
1. Conservar los viales sin abrir ni reconstituir a 2-8 °C.
2. Conservar los viales reconstituidos de plasma a 2-8 °C o la alícuota en
volúmenes de 0,5 ml, congelar rápidamente y conservar a -20 °C. No
descongelar y volver a congelar.
3. Los viales sin abrir ni reconstituir permanecerán estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta del producto si se conservan según lo indicado.
4. El plasma reconstituido permanecerá estable durante cinco días si se
conserva a 2-8 °C o durante hasta 30 días cuando se formen alícuotas y se
conserve a -20 °C, sin superar la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta.

60
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. Determinar que el aislado de prueba sea puro y tiene las siguientes
características de Staphylococus Aureus:
 Morfología apropiada en el medio de aislamiento.
 Cocos Gram positivos
 Catalasa positiva.
2. Usar 2-4 colonias (un asa completa) del organismo de prueba.

61
 a. Objetivos

General:
 Comprobar la presencia de la enzima catalasa.
Específico:

 Observar la reacción del peróxido de hidrogeno con desprendimiento de

burbujas que nos indicará un resultado positivo.

62
b. Materiales

MECHERO

PEROXIDO DE HIDRÓGENO

PORTAOBJETOS

CULTIVO

63
 MICROPIPETA

PUNTA PARA MICROPIPETAS

EPP´S

64
 c. Procedimiento

1er Paso: En una lámina portaobjetos limpia, agregamos 2 gotas de peróxido de

hidrógeno con la ayuda de una micropipeta.

A B

2do Paso: Esterilizamos el asa de siembra en el mechero para después

recolectar una pequeña colonia de la cepa.

A B

Siempre trabajar con el mechero al lado, para así trabajar en un área

estéril cuando realicemos la recolección de la colonia

65
3er Paso: Colocamos la colonia recolectada sobre el peróxido de hidrógeno y
revolvemos bien hasta que se disuelva. Finalmente observamos si ocurre alguna
reacción.

A B

Se debe tapar inmediatamente la placa Petri una vez terminada la

recolección de la colonia.

66
 d. Resultado

Lo ideal sería que la colonia de Escherichia coli reaccionará al peróxido de

hidrógeno(H2O2) produciendo agua y oxigeno gaseoso que es liberado mediante
la formación de burbujas. Para lo cual la Escherichia coli seria catalasa +.

Debido a que el peróxido de hidrógeno pudo haber estado vencido; por ello no
hubo formación de burbujas.

67
 e. Método

Método del portaobjetos

Es una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente.
Procedimiento
En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada al 30% y
se pone en contacto con ella una colonia de los microorganismos a estudiar. La
muestra se recoge con el asa de siembra y se toma preferentemente el centro
de una colonia pura de 18-24 horas.
Revelado
Observar la formación inmediata de una efervescencia rápida con
desprendimiento de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en
un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la
colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
Precauciones
Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe
tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya
que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso
resultado positivo.

Método del tubo de ensayo

Agregar 1 ml de Peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3% directamente a un cultivo
de agar densamente inoculado.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

68
 III.CONCLUSIÓN

En esta práctica se llevó a cabo con el fin de comprender la prueba de catalasa,

siguiendo el procediendo paso a paso con la precaución y cuidado evitando
posibles accidentes.
Concluyendo que el resultado ideal y que esperamos tendría que ser positiva,
que la colonia Escherichia Coli reaccionará al peróxido de hidrogeno. Sin
embargo, debido a que el reactivo estuvo vencido, nos dio un resultado negativo,
observando así ninguna reacción de efervescencia sobre la colonia de bacterias
colocada en la lámina portaobjetos.

69
IV. BIBLIOGRAFÍA

1. Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias [Internet].

Disponible en:
https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/pruebas
_bioquimicas_de_identificacion_de_bacterias.pdf

70
 LECTURA DE
PLACAS Y
SIEMBRA EN
LOS
DIFERENCIALES

71
 I. INTRODUCCIÓN

En esta práctica de laboratorio realizamos el cultivo en medios selectivos, se usó

el agar Mac Conkey y EMB para realizar el sembrado y posteriormente para
cultivarlos en los medios diferenciales. Realizamos el procedimiento del agar TSI
(hierro tres azucares), siguiendo el proceso indicado por el docente para evitar
posibles contaminaciones; posteriormente se realizó el cultivo de la bacteria que
será incubado en el tiempo necesario para su crecimiento adecuado y finalmente
observar los resultados.
Se observará también los resultados en el agar Citrato de Simmons, LIA y SIM
que son mencionados en el presente informe.

72
 II. MARCO TEÓRICO

AGAR MACCONKEY
El Agar MacConkey es un medio de cultivo
selectivo que se utiliza para el aislamiento de
bacilos Gram negativos de fácil desarrollo Y
Enterobacteriaceae, los cuales, a partir de
muestras clínicas, agua y alimentos permiten la
diferenciación sobre la base de la fermentación
de la lactosa.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta estos elementos se encargan de inhibir el
crecimiento de bacterias grampositivas y algunos bacilos gramnegativos
exigentes. A su vez, favorece el desarrollo de los bacilos gramnegativos que no
son afectados por estas sustancias. El agar es el agente solidificante. Por
fermentación de la lactosa, los microorganismos que poseen la capacidad para
fermentar la lactosa desarrollarán colonias rosadas fuertes. Esto produce un
viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y
la precipitación de las sales biliares. Algunas bacterias pueden fermentar la
lactosa lenta o débilmente, desarrollando colonias color rosado pálido, y siguen
siendo lactosa positiva.

Las que no fermentan la lactosa utilizan las peptonas como fuente de energía,
produciendo amoníaco, alcalinizando el medio. Por ello las colonias que se
originan son incoloras o transparentes.

USOS

 El agar MacConkey se incluye en todos los sets de medios de cultivos

dispuestos para la siembra de las muestras clínicas recibidas en el
laboratorio. También es útil en microbiología de alimentos y microbiología
ambiental.
 La variedad de bacilos gramnegativos que crecen en este medio expresa
características fenotípicas que ayudan a un diagnóstico presuntivo de la
especie en cuestión. Por ejemplo, el tamaño, color, consistencia y olor de
las colonias son algunas de las características que pueden orientar.
 En este medio, las especies de Escherichia coli, Klebsiella
sp y Enterobacter sp producen colonias rosadas fuertes, rodeadas de una
zona de bilis precipitada.
 En tanto que las bacterias como Citrobacter sp, Providencia sp, Serratia
sp y Hafnia sp pueden aparecer sin color después de 24 horas, o rosa
pálido en 24-48 horas.

73
AGAR EMB
Es un medio ligeramente selectivo y de diferenciación
para el aislamiento y la diferenciación de bacilos gram
negativos entéricos (Enterobacteriaceae y diversos
otros bacilos gram negativos) a partir de muestras
clínicas.

FUNDAMENTO
El medio de cultivo combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de
Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. Es nutritivo por la
presencia de peptona que favorece el desarrollo microbiano. La diferenciación
entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son
incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno;
éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de bacterias Gram
positivas. El agar es el agente solidificante. Muchas cepas de Escherichia coli y
Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que
utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras
que las que no lo hacen son incoloras. También, pueden crecer especies de
Candida y se observan como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en
profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus
spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras
que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas se observan como colonias
de color azul lavanda; esto puede ocurrir, aunque las cepas no sean capaces de
acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de
metileno a sus membranas. En este medio se obtiene, además, un buen
desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

USO
 Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos,
a partir de muestras clínicas, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.
 Las bacterias gramnegativas fermentadoras de lactosa acidifican el medio
y, en condiciones ácidas, los tintes producen un complejo de color púrpura
intenso que generalmente se asocia con un brillo metálico verde. Este
brillo verde metálico es un indicador de la vigorosa capacidad de
fermentación de lactosa y/o sacarosa típica de los coliformes fecales.
 Una cantidad menor de producción de ácido, que es el resultado de una
fermentación lenta (por organismos de lactosa de fermentación lenta), da
como resultado una coloración marrón-rosada del crecimiento.
 Los no fermentadores de lactosa, como Shigella y Salmonella, forman
colonias transparentes, incoloras o ámbar que se distinguen fácilmente de
los coliformes.
74
Crecimiento de colonias

75
MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES
Son medios de cultivos que nos permiten
distinguir entre varios géneros y especies de
microorganismos, estos también son empleados
para detectar reacciones bioquímicas, con
carácter diferencial de grupos, géneros, o
especies microbianas mediante el viraje de color
del indicador presente en el medio, demostrando
algunas de sus características.
En respuesta a los componentes del medio, las
colonias bacterianas pueden cambiar de color o
alterar la apariencia del medio mediante la producción de enzimas
extracelulares.
Estos medios son el TSI, Citrato de Simmons, SIM, LIA y más.
Agar TSI (Triple Sugar Iron)
Medio empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la
fermentación de los hidratos de carbono glucosa, lactosa y sacarosa y a la
producción de ácido sulfhídrico, se busca determinar la capacidad de la bacteria
para degradar los azucares, formación de gas y sulfuros de hidrógeno.
La fermentación aeróbica se produce en la parte de arriba del tubo y la
anaeróbica en el fondo del tubo. La presencia de gas se debe al CO2 producto
de la fermentación. La degradación de la lactosa ocurre en la parte superior, la
de la sacarosa en la parte intermedia y de la glucosa en la parte profunda
produciéndose un viraje de rojo a amarillo. El tiosulfato es reducido a sulfuro de
hidrógenos quien reacciona con el citrato férrico amoniacal para dar formación a
sulfuro de hierro que es de color negro.
Características
 Color: rojo ladrillo.
 Inhibidores: no tiene.
 Indicador: rojo fenol.
SUSTRATOS PRINCIPALES: Lactosa, sacarosa y
glucosa
SUSTRATOS SECUNDARIOS: Tiosulfato sódico,
peptona, citrato férrico amoniacal y extractos.
SIEMBRA: Punción profunda con asa y luego estrías
en la parte de arriba.

76
Agar (LIA) Lisina hierro agar
En este medio se permite evidenciar la descarboxilación del aminoácido lisina en
la diamina cadaverina, como también la desaminación de la lisina en un alfa
cetoácido. Estas 2 reacciones se ponen de manifiesto por el viraje del indicador
púrpura de bromocresol.
La formación de H₂S se pone de manifiesto por la presencia del tiosulfato sódico,
que dará formación al sulfato férrico. También puede verificarse la formación de
gas a partir de la degradación de la glucosa.
Características
 Color: lila.
 Inhibidores: no tiene.
 Indicador: purpura bromocresol.
SUSTRATOS PRINCIPALES: lisina y glucosa
SUSTRATOS SECUNDARIOS: tiosulfato
sódico, peptona, extracto de levaduras.
SIEMBRA: Punción profunda con asa y luego
estrías en la parte de arriba.

CITRATO DE SIMMONS
Este medio nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de utilizar el
citrato como fuente exclusiva de carbono.
La degradación del citrato conlleva a la alcalinización del medio y el viraje del
indicador azul de bromotimol de verde a azul prusia.
Características:
COLOR: Verde.
INHIBIDORES: No tiene.
INDICADOR: Azul de bromocresol.
SUSTRATO PRINCIPAL: Citrato de sodio.
SUSTRATO SECUNDARIOS: Fosfato
dipotásico, cloruro de sodio, sulfato de
magnesio y fosfato monoamónico.
SIEMBRA: Por estrías.

77
MEDIO SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes para el
desarrollo microbiano. El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas
peptonas y particularmente de la tripteína y puede ser metabolizado por algunas
bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas
llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo
de Ehrlich (Indol Reactivo REF B1550361) o de Kovac´s, para originar un
compuesto de color rojo. A partir del tiosulfato de sodio los microorganismos
pueden generar ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro presente
formándose un compuesto de color negro. El agar es el agente solidificante y a
esta concentración le otorga al medio la propiedad de ser semisólido, condición
necesaria para detectar movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del
medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de siembra del
microorganismo en estudio.
Características:
COLOR: Crema.

INDICADOR: No tiene.
INHIBIDOR: No tiene.
SUSTRATO PRINCIPAL: Peptona.
SUSTRATO SECUNDARIO: Tiosulfato
sódico, hierro y amonio.
SIEMBRA: por punción.

78
 a. Objetivos

General:
Preparar un medio de cultivo con todos los componentes necesarios para
permitir el desarrollo exitoso del organismo que desea ser aislado.
Específicos:

 Conocer los diferentes medios de cultivo.

 Comprobar el crecimiento de los diferentes microorganismos.
 Identificar y reconocer los microorganismos que crecen en estos medios
diferenciales.

79
b. Materiales

Mechero

Agar TSI

Frasco de cultivo

Muestra de orina

80
Asa de siembra

Tubos de ensayo

Agua destilada

Bagueta

81
Placas Petri

Pinzas

EPP´S

82
 c. Procedimiento
PREPARACIÓN AGAR TSI
1er Paso Prepararemos 1.3 gr de agar TSI con 20 ml de agua destilada y
removeremos con ayuda de la bagueta hasta que el agar se haya disuelto
por completo.

A B C

2do Paso Calentamos la disolución hasta el punto de ebullición, agitando con

la ayuda de la bagueta.

A B

83
3er Paso Llevaremos el frasco (medio abierto) a la autoclave durante 45min a
121°C.

4to Paso Verter la disolución de agar TSI en los tubos (previamente

esterilizados), junto a un mechero. Colocamos los tubos de manera inclinada
para formar un bisel con base.

A
B

84
 CULTIVO EN MEDIOS SELECTIVO
1er Paso: Esterilizamos el asa de siembra en el mechero hasta que se torne
rojo, dejamos enfriar y lo sumergimos en la muestra de orina.

2do Paso: Realizamos la siembra por agotamiento con 3 estrías en las placas
Petri que contienen los agares (MacConkey y EMB).

Para el cultivo es importante solo tener la tapa

levantada y tener un mechero al lado para que no
se contamine.

3er Paso: Envolvemos las placas Petri en papel craft y llevamos a incubar a 37°C
por 24 horas.

85
 CULTIVO EN MEDIOS DIFERENCIALES
1er Paso: Esterilizamos el asa de siembra(punta) en el mechero hasta que se
torne rojo, dejamos enfriar y cogemos algunas cepas.

A B

Realizar este paso para cada

siembra en los distintos agares.

Flamear la boca de los tubos

para evitar la contaminación.

2do Paso:
 En el agar TSI y LIA incaremos los agares y después realizaremos una
estria en la superficie.
 En el agar CITRATO realizaremos una estria en la superficie.
 En el agar SIM incaremos el agar de manera vertical (lo mas recto
posible).
A
B

Trabajar al lado de un
mechero siempre, pasar la
boca de los tubos en el
mechero para así evitar su
contaminación.

3er Paso: Llevar a incubar los tubos a 37°C por 24 horas.

86
 d. Resultado

1. Al realizar la siembra de la muestra de orina en los agares selectivos

(MACCONKEY, EMB), se observó lo siguiente:
AGAR MACCONKEY

No hubo crecimiento de la
bacteria, debido a un error al
momento de realizar la
siembra.

AGAR EMB

Hubo crecimiento escaso de

colonias, por ende, se
considera negativo.

87
 2. A las cepas obtenida en el agar EMB, se las sembrara en el agar TSI, LIA,
CITRATO Y SIM. Incubar a 37°C por 24 horas.

TSI (Triple azúcar hierro)

Se observó que tanto en la base como en el

bisel se acidificó el medio dando un color
medio amarillento, lo que indica que la
bacteria fermenta los 3 azúcares (glucosa,
lactosa, sacarosa). No se observó un color
amarillo más intenso debido a un tiempo de
incubación mayor a 24 horas.

LIA (Agar lisina hierro)

Se observó que en la base y en el bisel se

manifiesto un color medio lila, lo cual indica
que la bacteria presenta lisina
descarboxilasa. No se observó un color lila
más intenso debido a un tiempo de
incubación mayor a 24 horas.

88
SIM (Sulfuro- Indol-Motilidad)

 No se observó una precipitación

de color negro, lo que indica que
la bacteria no produce sulfuro de
hidrógeno.
 La bacteria no se propago por
todo el medio, lo que indica que
no presenta motilidad.
 No se llegó a añadir el reactivo de
KOVAC’S para observar la
formación del indol.

CITRATO DE SIMMONS

No se observó el cambio de color

esperado, debido a un error al
momento de realizar la siembra.

89
 III. CONCLUSIÓN

La evaluación de medios de cultivo resultó ser el procedimiento más importante

para esta práctica, ya que el desarrollo de los procedimientos en el área depende
de la buena calidad de un medio. Sin embargo, el fallo o error al cultivar el
microrganismo en el medio viable se tendría falsos positivos o posibles negativos
en cada una de las pruebas realizadas en estos. El control y manejo de tiempo
es importante en todos los laboratorios, ya que el medio puede cambiar de color
al pasar más tiempo de lo requerido resultando así que esto pueden afectar a un
medio y no lograr un resultado confiable al finalizar.
Dentro de los logros realizados en este informe, se obtuvo experiencia en el
manejo y preparación en medios diferenciales de cultivo. Además de tomar las
decisiones y aceptar los errores cometidos. Por otro lado, quedó claro que el
trabajo en equipo propicia que los resultados sean exitosos o erróneos.

90
IV. BIBLIOGRAFÍA

1. Medio diferencial y selectivo - Labster Theory [Internet].

theory.labster.com. Available from: https://theory.labster.com/differential-
selective-media-es/

2. Edwin R. Peralta. Medios de cultivo diferenciales [Internet]. 2013.

Available from: https://es.slideshare.net/xxarthasxx/medios-de-cultivo-
diferenciales

3. Medios diferenciales [Internet]. Laboratorio microbiología. Available from:

https://microbiologia-monitoria.weebly.com/medios-diferenciales.html

91
PREPARACIÓN
Y SIEMBRA DE
MUELLER
HILTON-
LECTURA DEL
ANTIBIOGRAMA
Y REPORTE

92
 I. INTRODUCCIÓN

En el presente informe se detallará la preparación y siembra en el agar Mueller

Hinton, medio de cultivo que tiene como uso principal la prueba de sensibilidad
a los antibióticos. La composición del medio Mueller Hinton permite el
crecimiento de las bacterias no exigentes (enterobacterias, bacilos gram-
negativos no fermentadores, estafilococos y enterobacterias). Se inoculó la
bacteria Escherichia Coli, la cual es poco exigente en sus necesidades nutritivas.
Posteriormente realizamos el antibiograma (disco-placa) en la superficie del agar
detallado por el docente, con sumo cuidado para evitar posibles contaminaciones
o errores.

93
 II. MARCO TEÓRICO

ANTIBIOGRAMA
El antibiograma se utiliza para determinar qué agente antimicrobiano será capaz
de inhibir el crecimiento de bacterias u hongos causantes de la infección. Los
resultados de esta prueba ayudaran al médico a establecer el tratamiento más
efectivo frente a la infección.

Algunas infecciones requieren la realización del antibiograma, porque las

bacterias u hongos que se aíslan a partir del foco infeccioso presentan una
susceptibilidad impredecible a los antibióticos normalmente empleados.

A veces, se pueden aislar a partir de un único foco infeccioso, varios

microorganismos y en estos casos el antibiograma determinará el antibiótico o la
combinación de antibióticos más efectiva para tratar la infección causada por
diferentes tipos de bacterias.

Los resultados de esta prueba suelen informarse como:

 Sensible: Es probable, aunque no garantizado totalmente, que el fármaco

es capaz de inhibir al microorganismo patógeno; puede ser una elección
apropiada para el tratamiento.
 Intermedio: El fármaco puede ser efectivo a elevadas dosis o con
dosificaciones más frecuentes, o efectivo solamente en algunas zonas del
organismo en las que el antibiótico penetra fácilmente alcanzando
concentraciones adecuadas.
 Resistente: El fármaco no es efectivo para inhibir el crecimiento del
microorganismo; no es un fármaco de elección para el tratamiento.

La resistencia adquirida se desarrolla a través de un proceso de selección.

Cuando se trata a un individuo con un agente antimicrobiano, los
microorganismos más sensibles son los que mueren primero. Si se interrumpe
el tratamiento antes de que se haya conseguido matar a todos los
microorganismos, los que sobreviven pueden desarrollar resistencia al
antimicrobiano en cuestión. Así cuando vuelvan a verse expuestos a la acción
del mismo agente antimicrobiano, este puede resultar inefectivo, ya que el
microorganismo y su descendencia recuerdan la resistencia anteriormente
desarrollada frente al fármaco.

94
MEDICIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN
Medir la zona de inhibición de cada disco contra una superficie oscura bajo luz
reflejada. Medir el diámetro de la zona incluyendo los 6 mm del disco, con una
regla sobre el respaldo de la caja de Petri sin remover la tapa.
Una lectura de 6 mm indica que no hay zona de inhibición. Si se ha usado agar
sangre para la prueba, la medición de la zona de inhibición debe hacerse sobre
la superficie removiendo la tapa de la
caja. El punto final de inhibición
completa del crecimiento se estima a
simple vista, excepto para las
sulfonamidas y para algunas especies
de Proteus.
Con las sulfonamidas puede ocurrir un
discreto crecimiento en la zona de
inhibición, debido a que algunos
microorganismos crecen por algunas
generaciones antes de que la acción de
la sulfonamida tenga lugar y debido
también, al hecho de que el medio de Mueller-Hinton contiene Timidina la cual
inhibe la actividad de la sulfonamida. Sin embargo, la zona de inhibición está
usualmente bien delimitada y este tipo de crecimiento invasivo, debe ser
ignorado.

AGAR MUELLER HILTON

Medio de cultivo nutritivo no selectivo que promueve el desarrollo microbiano.
Por su composición, ha sido recomendado, para ser utilizado en forma rutinaria
en la realización del antibiograma en medio sólido, debido a que presenta buena
reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido en
inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de
los patógenos microbianos crece satisfactoriamente y una gran cantidad de
datos adicionales que han sido evaluados y avalados usando este medio de
cultivo. Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, permite realizar las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
También, con el agregado de sangre puede utilizarse para el cultivo y aislamiento
de microorganismos nutricionalmente exigentes.

95
 a. Objetivos

General:

 Determinar la susceptibilidad a antibióticos.

Específicos:
 Conocer el procedimiento para la preparación del agar Mueller Hinton.
 Realizar la técnica correcta para el sembrado.

96
b. Materiales

Asa siembra

Mechero

Agua destilada

Placas Petri

Frasco para autoclave

Caldo Escherichia coli.

97
 Hisopos estériles

Tubos de ensayo

Disco de antibióticos

Agar Mueller Hinton

EPP´S

98
 c. Procedimiento

1er paso Preparar 3.4 mg del medio de cultivo Mueller Hinton en 100 mL de
agua destilada y disolverlo con ayuda de una espátula sobre un mechero a
punto de ebullición.

A B C

2do paso Llevar el medio a la autoclave a 120 °C por 45 min.

3er Paso Realizar el plaqueo del medio.

A B

99
4to Paso Con un asa de siembra esterilizado sumergiremos 2 veces en un tubo
de caldo de Escherichia coli y lo diluiremos en suero fisiológico.

A B C

5to Paso Con un hisopo estéril tomaremos una muestra del caldo diluido en
suero fisiológico para realizar las estrías en la placa con el medio.

6to Paso Colocar el disco de antibiótico con una pinza estéril en el centro del
medio de cultivo.

7mo Paso Incubar por 24 horas a 37 °C.

100
d. Resultados

 Sensible: La aplicación del antibiótico tiene alta probabilidad de éxito en el

tratamiento.
 Intermedio: La probabilidad de éxito es imprevisible.
 Resistente: Nula probabilidad de éxito al tratamiento.

Observación:
La medición del halo depende de cada antibiótico empleado

101
 III.CONCLUSIÓN

El Agar Mueller Hinton es usado de forma rutinaria para la realización de la

prueba de sensibilidad a los antibióticos.
En este informe se realizó el sembrado de la muestra con la posterior colocación
de los antibióticos, las cuales se realizaron con las técnicas adecuadas para ello.
Así como de las medidas de bioseguridad y el uso de EPP’S en todo el proceso.
Para lo cual se observará si la bacteria es resistente, intermedio o sensible a los
antibióticos colocados con la formación o no de un halo. Cada antibiótico tiene
un rango de medición para el halo ya estandarizado según las “Normas de
rendimiento para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos”.

102
IV. BIBLIOGRAFÍA

1. BIOMEDICA[citado el 20 de junio de 2023]. Disponible en:

http://file:///C:/Users/Pc/Downloads/lgomez,+vol4no3y4_Parte5.pdf

2. Antibiograma [Internet]. www.labtestsonline.es. Available from:

https://www.labtestsonline.es/tests/antibiograma#:~:text=El%20a
ntibiograma%20se%20utiliza%20para

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