Capítulo 6

6 Enzimas
Kirk L. Parkin
CONTENIDO
6.1 Introducción ................................................................................................................................................................ 358

6.2 Naturaleza general de las enzimas ............................................................................................................................. 359
6.2.1 Las enzimas como biocatalizadores ............................................................................................................ 359
6.2.2 Naturaleza proteica y no proteica de las enzimas ........................................................................................ 359
6.2.3 Poder catalítico de las enzimas .................................................................................................................... 360
6.2.3.1 La teoría de la colisión para la catálisis de las reacciones ........................................................... 362
6.2.3.2 La teoría del estado de transición de la catálisis enzimática ....................................................... 362
6.2.4 Mecanismos de catálisis enzimática ............................................................................................................ 364
6.2.4.1 Naturaleza general de los sitios activos de las enzimas .............................................................. 364
6.2.4.2 Mecanismos catalíticos específicos ............................................................................................. 365
6.2.5 Cinética de las reacciones enzimáticas ........................................................................................................ 374
6.2.5.1 Modelos simples para las reacciones enzimáticas ....................................................................... 374
6.2.5.2 Expresiones de la velocidad de las reacciones enzimáticas ........................................................ 376
6.2.5.3 Análisis gráfico de las reacciones enzimáticas ............................................................................ 377
6.2.6 Especificidad y selectividad de la acción enzimática .................................................................................. 381
6.2.6.1 Patrones de especificidad de determinadas enzimas alimentarias .............................................. 382
6.2.6.2 Nomenclatura y clasificación de las enzimas .............................................................................. 388
6.3 Usos de enzimas exógenas en los alimentos .............................................................................................................. 390
6.3.1 Consideraciones generales ........................................................................................................................... 390
6.3.2 Enzimas que transforman los carbohidratos ................................................................................................ 390
6.3.2.1 Enzimas que transforman el almidón .......................................................................................... 392
6.3.2.2 Transformación de los azúcares y aplicaciones ........................................................................... 400
6.3.2.3 Transformación enzimática de la pectina .................................................................................... 403
6.3.2.4 Otras glucosidasas ........................................................................................................................ 406
6.3.3 Enzimas que transforman las proteínas ....................................................................................................... 407
6.3.3.1 Serín proteasas ............................................................................................................................. 407
6.3.3.2 Aspártico (ácido) proteasas .......................................................................................................... 408
6.3.3.3 Cisteín (sulfhidrilo) proteasas ...................................................................................................... 409
6.3.3.4 Metaloproteasas ............................................................................................................................ 410
6.3.3.5 Aplicaciones de la acción proteolítica ......................................................................................... 410
6.3.3.6 Transglutaminasa .......................................................................................................................... 414
6.3.4 Enzimas que transforman los lípidos ........................................................................................................... 415
6.3.4.1 Lipasa ........................................................................................................................................... 415
6.3.4.2 Aplicaciones de las lipasas .......................................................................................................... 416
6.3.4.3 Lipooxigenasas ............................................................................................................................. 419
6.3.4.4 Fosfolipasas .................................................................................................................................. 419
6.3.5 Aplicaciones misceláneas de las enzimas ................................................................................................... 420
357
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358 Química de los alimentos
6.4 Influencia del ambiente sobre la acción enzimática .................................................................................................. 420

6.4.1 Temperatura ................................................................................................................................................. 421
6.4.1.1 Respuestas generales de la acción enzimática a la temperatura .................................................. 421
6.4.1.2 Temperatura óptima para la función enzimática .......................................................................... 422
6.4.1.3 Resumen de los efectos de la temperatura ................................................................................... 423
6.4.2 Efectos del pH ............................................................................................................................................. 424
6.4.2.1 Consideraciones generales ........................................................................................................... 424
6.4.2.2 La estabilidad enzimática en función del pH .............................................................................. 424
6.4.2.3 Efectos del pH sobre la actividad enzimática .............................................................................. 426
6.4.2.4 Otros tipos de comportamiento frente al pH ............................................................................... 431
6.4.3 Los estados del agua y la actividad enzimática ........................................................................................... 431
6.4.3.1 Efectos de la desecación y de la actividad de agua ..................................................................... 431
6.4.3.2 Efectos osmóticos de la desecación ............................................................................................. 434
6.4.3.3 Desecación por congelación ........................................................................................................ 435
6.4.4 Técnicas de procesado no térmico ............................................................................................................... 438
6.5 Las enzimas endógenas de los alimentos y su control ............................................................................................... 438
6.5.1 Efectos celulares y tisulares ......................................................................................................................... 438
6.5.2 Actividades enzimáticas relacionadas con la calidad del color de los alimentos ....................................... 440
6.5.2.1 Fenoloxidasas ............................................................................................................................... 440
6.5.2.2 Peroxidasas ................................................................................................................................... 445
6.5.2.3 Otras oxidorreductasas ................................................................................................................. 448
6.5.3 Enzimas relacionadas con la biogénesis del flavor .................................................................................... 449
6.5.3.1 Lipooxigenasa .............................................................................................................................. 449
6.5.3.2 Hidroperóxido liasa y transformaciones enzimáticas relacionadas ............................................. 453
6.5.3.3 Biogénesis de otros flavores derivados de los lípidos ................................................................. 455
6.5.3.4 Origen y control de los flavores pungentes y de otros efectos bioactivos .................................. 456
6.5.4 Enzimas que afectan a la calidad de la textura en los alimentos ................................................................ 460
6.5.4.1 Control de las enzimas que modifican los polímeros de carbohidratos ...................................... 460
6.5.4.2 Control de las enzimas que modifican las proteínas ................................................................... 461
6.5.4.3 Atenuación de los defectos de textura usando moléculas pequeñas para controlar enzimas ..... 462
Referencias ............................................................................................................................................................................ 463
Bibliografía ........................................................................................................................................................................... 469
6.1 INTRODUCCIÓN
Durante los años del 1600 al 1800 las acciones de las enzimas desarrolladas en tejidos vivos o que respiraban se
denominaban «fermentos». Algunos ejemplos representativos de los albores de la enzimología de los alimentos son
las fermentaciones alcohólicas de las levaduras, los procesos digestivos en los animales y el malteado de los granos
para reproducir la actividad «diastásica», provocando una conversión del almidón en glucosa. El término «enzima»
fue acuñado por W. Kühne en el año 1878 a partir del término griego enzyme, que significa «en la levadura».
Las enzimas alimentarias se pueden clasificar en general en dos categorías: las que se añaden a los alimentos (de
fuentes exógenas) para producir una modificación deseable y las que existen en los alimentos (de origen endógeno) y
que pueden, o no, ser responsables de reacciones que afectan a la calidad de los alimentos. Las enzimas exógenas
pueden obtenerse a partir de diversas fuentes y las elecciones entre las enzimas exógenas están basadas en criterios de
costes y funcionalidad. La funcionalidad apropiada está relacionada con la actividad catalítica, la selectividad y la
estabilidad en las condiciones que van a prevalecer durante la aplicación específica. El control de las enzimas endógenas
plantea mayores retos, puesto que se encuentran en las matrices alimentarias en niveles variables y existen limitaciones
Enzimas 359
a la hora de manejar los alimentos para modular la actividad enzimática. En algunos alimentos, las enzimas endógenas
pueden ser responsables de reacciones que pueden tanto mejorar la calidad de los alimentos como disminuirla. El
objetivo de este capítulo es proporcionar la base química para el conocimiento de cómo funcionan las enzimas y cómo
puede usarse este conocimiento para controlar la acción de las enzimas con las finalidades de transformar los alimen-
tos, producir ingredientes alimentarios y mantener, incrementar y monitorizar la calidad de los alimentos.
6.2 NATURALEZA GENERAL DE LAS ENZIMAS
6.2.1 LAS ENZIMAS COMO BIOCATALIZADORES
Las enzimas poseen tres características importantes: Son proteínas y catalizadores, presentan selectividad hacia
los sustratos y están sujetas a regulación. Las enzimas son las formas más comunes y ubicuas de catalizadores
biológicos. Son responsables de procesos vitales y son mediadoras de funciones sintéticas, de renovación, señaliza-
ción celular y metabólicas. El único catalizador biológico conocido operante en la naturaleza aparte de las enzimas
es el ARN catalítico o «ribozimas», que están involucradas en la modificación del ARN y la unión de los aminoácidos
durante la síntesis proteica (traducción). Pueden desarrollarse anticuerpos que actúen como catalizadores cuando se
generan frente a un hapteno que lleva un análogo del estado de transición de un sustrato deseado.
6.2.2 NATURALEZA PROTEICA Y NO PROTEICA DE LAS ENZIMAS [30,43,94]
Todas las enzimas son proteínas cuya masa molecular oscila entre ~8 kDa (aproximadamente 70 aminoácidos,
por ejemplo, algunas tiorredoxinas y glutarredoxinas) y 4.600 kDa (el complejo piruvato descarboxilasa). Las enzimas
de mayor tamaño están formadas por múltiples cadenas polipeptídicas o subunidades y poseen una estructura
cuaternaria. Estas subunidades la mayoría de las veces están asociadas a través de fuerzas no covalentes comunes
(ver Capítulo 5), y estas asociaciones pueden establecerse entre cadenas polipeptídicas idénticas (homólogas) o
distintas (heterólogas). Las enzimas oligoméricas pueden poseer lugares activos múltiples y algunas enzimas gran-
des pueden presentar varias actividades catalíticas en una única cadena polipeptídica. En este último caso, como
ocurre en el complejo ácido graso sintetasa de los organismos superiores, las diferentes actividades están asociadas
a diferentes dominios proteicos existentes en el polipéptido, y estos polipéptidos grandes pueden asociarse a su vez
como dímeros u oligómeros. Las enzimas monoméricas con un único lugar activo pueden tener también diferentes
dominios dentro de la cadena polipeptídica, teniendo cada uno de ellos una función diferente relacionada con la
catálisis o con otras propiedades biológicas.
Algunas enzimas necesitan componentes no proteicos llamados «cofactores», «coenzimas» o «grupos prostéticos»
para llevar a cabo su función catalítica [112]. Los cofactores más comunes están constituidos por iones metálicos
(metaloenzimas), flavinas (flavoenzimas), biotina, lipoato, muchas de las vitaminas del grupo B y derivados de la
nicotinamida (que son en realidad cosustratos que se hallan fuertemente unidos y sufren reacciones de oxidorreducción
reversibles). Las enzimas cuando contienen en su molécula un cofactor esencial se llaman «holoenzimas», mientras
que cuando están privadas de él se denominan «apoenzimas» y en este estado carecen de actividad catalítica. Las
enzimas pueden contener otros componentes no proteicos unidos a ellas, tales como lípidos (lipoproteína),
carbohidratos (unidos a ASN*, glucoproteína) o fosfato (unido a SER, fosfoproteína); estos componentes normal-
mente no tienen ningún papel en la catálisis, pero afectan a las propiedades fisicoquímicas de la enzima y le propor-
* La identificación de los residuos de aminoácidos en las enzimas se hará utilizando los códigos de tres letras reconocidos habitualmente
(con letras mayúsculas). La posición en la secuencia primaria de la proteína, cuando sea necesario, se indica con subíndices.
cionan sitios de reconocimiento celular. Las enzimas que se sintetizan en forma de precursores latentes se denomi-
nan «zimógenos» y necesitan una transformación proteolítica para aumentar su actividad (como ocurre con las
enzimas digestivas y la quimosina de ternero).
Las enzimas que son proteínas monoméricas (una cadena polipeptídica única) generalmente tienen masas
moleculares en el intervalo 13-50 kDa. La mayoría de las enzimas celulares tienen masas moleculares comprendidas
entre 30 y 50 kDa. Las enzimas oligoméricas generalmente oscilan entre 80 y 100 kDa y están formadas por
subunidades de 20-60 kDa. Sólo alrededor de un 1-3% de las proteínas celulares tienen una masa molecular superior
a los 240 kDa [130]. Las enzimas oligoméricas a menudo están involucradas en procesos metabólicos en el organis-
mo en el que se encuentran, y la presencia de subunidades les permite varios niveles de regulación por los metabo-
litos celulares, un comportamiento alostérico (cooperación entre las subunidades) y la interacción con otros compo-
nentes o estructuras celulares.
Las enzimas extracelulares y las que se excretan tienden a ser polipéptidos monoméricos de menor tamaño, a
menudo con actividades hidrolíticas y generalmente más estables que las enzimas intracelulares. Estas enzimas hidrolíticas
extracelulares ayudan en las tareas de movilizar o asimilar nutrientes y factores de crecimiento presentes en el entorno
donde el microorganismo, en caso de no existir estas enzimas, tendría un escaso control sobre factores tales como la
temperatura, pH y composición. Muchas de las enzimas exógenas usadas en los alimentos proceden de microorganis-
mos en los que pueden producirse rápidamente a gran escala mediante aislamiento a partir del medio de fermentación.
Sin embargo, las enzimas también pueden extraerse de fuentes vegetales o animales y tales extractos pueden ofrecer
ventajas en algunas aplicaciones alimentarias. Las fuentes microbianas de enzimas siguen siendo un área de gran
interés debido a que pueden usarse la selección de cepas y las técnicas moleculares para seleccionar de modo rápido o
modificar determinados caracteres de una enzima necesaria para ciertos procesos alimentarios.
Una enzima puede existir en formas múltiples que difieren ligeramente en su secuencia primaria, pero poseen
una función catalítica casi idéntica. Estas pequeñas diferencias en la secuencia se pueden traducir en diferencias
sutiles o incluso profundas en la selectividad se sustrato/producto y en las temperaturas y valores de pH óptimos de
actuación. Estas entidades se denominan «isoformas» de las enzimas (otros términos menos actuales son los de
«isozimas» o «isoenzimas»).
En base a la amplitud del conocimiento actual sobre la estructura y secuencia de las proteínas, las enzimas se
agrupan taxonómicamente en «familias» constituidas por miembros que comparten funciones catalíticas y caracte-
res estructurales comunes (con elementos estructurales que reciben nombres curiosos tales como barriles, hélices,
claves griegas y rollos de gelatina; términos que uno esperaría escuchar más en una fiesta de fraternidad que en una
discusión sobre proteínas y enzimas). Este agrupamiento está relacionado con el origen evolutivo y con el destino.
El conocimiento de la secuencia peptídica es un instrumento para relacionar enzimas sobre la base de la similitud en
su estructura primaria (homología), y la presencia de secuencias peptídicas «conservadas» como «motivos» ayuda a
identificar o a confirmar la existencia del sitio activo putativo en enzimas relacionadas mecanísticamente. La com-
prensión de cómo está relacionada la estructura de la proteína con la función catalítica supone la base de los esfuer-
zos encaminados a mejorar el uso de las enzimas en los alimentos.
6.2.3 PODER CATALÍTICO DE LAS ENZIMAS [30,43,54,151]
Los catalizadores son agentes que aceleran la velocidad de las reacciones sin experimentar ellos mismos ninguna
modificación química neta. Los catalizadores operan reduciendo la barrera de energía a superar para la transforma-
ción de un reactante en un producto. Esto se ilustra mejor con el uso de una hipotética «coordenada de reacción»,
representando el cambio de energía libre asociado con una reacción para dar un producto (P) (Fig. 6.1). En las
reacciones catalizadas, el sustrato (S) se eleva hasta un estado de transición (S‡) con un costo reducido de energía
libre (ΔG‡cat) en comparación con la reacción no catalizada (ΔG‡no cat). La Figura 6.1 constituye una simplificación,
puesto que pueden existir múltiples estados intermedios en una coordenada de reacción. Sin embargo, generalmente
existe una única etapa crítica o limitante de la velocidad que posee bien la mayor magnitud o el mayor grado de
cambio de +G y que generalmente gobierna la velocidad global de cualquier proceso químico. Las reacciones con
un descenso neto de la energía libre (–ΔGnet) son favorables, pero esto no indica cómo de rápido va a transcurrir la
Enzimas 361
Figura 6.1 Coordenadas de reac-

ción comparativas de las reacciones
Coordenada de reacción catalizadas y no catalizadas.
reacción. La velocidad de reacción viene determinada termodinámicamente por ΔG‡. En la Tabla 6.1 se resumen
ejemplos del poder catalítico de determinadas enzimas.
La terminología relacionada con la catálisis enzimática se ha estandarizado con la finalidad de evitar ambigüeda-
des y descriptores arbitrarios [3]. Una unidad internacional (U) de actividad enzimática es la cantidad de enzima que
provoca la conversión de 1 μmol de sustrato por minuto en condiciones estándar (generalmente optimizadas). La
unidad de actividad enzimática del SI es el katal, que se define como la cantidad de enzima que provoca la conver-
TABLA 6.1
Ejemplos del poder catalítico de las enzimas.
Reacción Catalizador Energía libre Velocidad de

de activación (kcal mol–1) reacción relativaa
H2O2 → ½O2 + H2O Ninguno (acuoso) 18,0 1,0

Yoduro 13,5 2,1 × 103
Platino 11,7 4,2 × 104
Catalasa (1.11.1.6) 5,5 1,5 × 109
Hidrólisis de p-nitrofenil acetato Ninguno (acuoso) 21,9 1,0
H+ 18,0 7,2 × 102
OH– 16,2 1,5 × 104
Imidazol 15,9 2,5 × 104
Seroalbúminab 15,3 6,9 × 104
Lipoproteín lipasa 11,4 5,0 × 107
Hidrólisis de la sacarosa H+ 25,6 1,0
Invertasa (3.2.1.26) 11,0 5,1 × 1010
Urea + H2O → CO2 + 2NH3 H+ 24,5 1,0
Ureasa (3.5.1.5) 8,7 4,2 × 1011
Hidrólisis de la caseína H+ 20,6 1,0
Tripsina (3.4.4.4) 12,0 12,0 × 106
Hidrólisis del etil butirato H+ 13,2 1,0
Lipasa (3.1.1.3) 4,2 4,0 × 106
Fuentes: O’Connor, C.J. and Longbottom, J.R., J. Colloid Interface Sci., 112, 504, 1986; Sakurai, Y. et al., Pharm. Res., 21, 285, 2004;
Whitaker, J.R., Voragen, A.G.J., and Wong, D.W.S. (Eds.), Handbook of Food Enzymology, Marcel Dekker, New York, 2003.
a
Velocidades relativas calculadas a partir de e–Ea/RT (Ecuación 6.1) a 25°C.
b
No considerada una reacción enzimática.
sión de 1 mol de sustrato por segundo en condiciones definidas. La actividad molecular de las enzimas se define a
través de un «número de recambio» (kcat) o número de moléculas de sustrato que pueden ser convertidas por una
molécula de enzima (sitio activo) por minuto en condiciones definidas. El límite superior del valor de kcat observado
para las enzimas es de ~107.
6.2.3.1 La teoría de la colisión para la catálisis de las reacciones

Existen dos enfoques para explicar cuantitativamente las velocidades de las reacciones químicas (cinética) y la
catálisis. La más simple es la teoría de la colisión, que se expresa como:
k = PZe–Ea/RT (6.1)
donde
k es la constante de velocidad de la reacción
P es la probabilidad de la reacción (incluye como factor la orientación molecular)
Z es la frecuencia de colisión, y el término exponencial está relacionado con la proporción de reactivos
colisionantes poseedores de la suficiente energía de activación (Ea) para permitir la reacción
R es la constante de los gases
T es la temperatura.
El factor más importante en la determinación de las velocidades de reacción en función de la temperatura en esta
ecuación es el término exponencial, puesto que un incremento de 10°C da lugar a sólo un incremento de ~4% de
«Z», pero da lugar a un incremento del 100% (se dobla) del término e–Ea/RT si Ea es 12 kcal/mol. La Ea de las
reacciones enzimáticas a menudo oscila entre 6 y 15 kcal/mol [122]. La relación representada en la Ecuación 6.1 fue
desarrollada empíricamente por S. Arrhenius a finales del siglo XIX y muestra su mayor utilidad en su forma
integrada en la que puede cuantificarse la respuesta de la enzima frente a la temperatura (Sección 6.4.1).
6.2.3.2 La teoría del estado de transición de la catálisis enzimática

El otro enfoque, más válido desde el punto de vista macanístico, para estimar las velocidades de las reacciones
enzimáticas está basado en la teoría del estado de transición de las velocidades de reacción absolutas. Esta teoría se
atribuye en gran medida a H. Eyring (años 1930) y se basa en la premisa de que para que ocurra una transformación
de un sustrato (S) en un producto (P) el estado basal de S debe alcanzar un estado activado o de transición (S‡), tras
de lo cual se ve abocado a transformase en P (Fig. 6.1). La proporción de S y S‡ viene dada por una constante de
pseudoequilibrio K‡ de tal manera que
(6.2)
y la velocidad de reacción o descomposición de S‡ en P viene dada por la expresión
(6.3)
donde kd es la constante de velocidad de primer orden para la descomposición de S‡ en P. El parámetro termodiná-

mico importante es la variación de la energía libre de activación (ΔG‡) entre S y S‡:
(6.4)
Combinando las equivalencias de las Ecuaciones 6.2 y 6.4 nos resulta:
(6.5)
Enzimas 363
La constante de velocidad kd (Ecuación 6.3) es equivalente a la frecuencia vibracional (v) del enlace que está
resultando transformado. Esto se basa en la asunción de que una molécula en el estado de transición se encuentra tan
debilitada que tendrá lugar su descomposición en la siguiente vibración del enlace [54]. La descomposición de S‡
tiene lugar cuando la energía vibracional del enlace es igual a la energía potencial, y la relación se convierte en:
(6.6)
donde
kB es la constante de Boltzmann y
h es la constante de Planck.
Así pues, la teoría sostiene que todos los estados de transición se descomponen a la misma velocidad y que la
velocidad de reacción está únicamente influenciada por [S], por la temperatura y por la ΔG‡ característica (que
define K‡, Ecuación 6.4) para una reacción enzimática con un S específico. Tras la sustitución de kd por su equiva-
lente de acuerdo con la Ecuación 6.6 y de S‡ por su equivalente de acuerdo con la Ecuación 6.5, la velocidad de la
reacción según la Ecuación 6.3 ahora se convierte en:
(6.7)
‡
Así pues, en un rango fijo de [S], la velocidad de reacción y la constante de velocidad kS (kS [S] = kBT/h × exp–ΔG /RT)
pueden determinarse experimentalmente y después puede calcularse ΔG‡. Una vez se ha determinado ΔG‡, la ecua-
ción se puede reorganizar para permitir el cálculo de las magnitudes termodinámicas ΔH‡ y ΔS‡.
Si se conoce la reducción en la energía libre de activación que proporciona un catalizador, se puede cuantificar o
predecir la cuantía en la que la reacción va a acelerarse en base a la teoría de la colisión (Ecuación 6.1) o a la teoría
del estado de transición (Ecuación 6.7), puesto que el resultado será el mismo y viene determinado por el término
exponencial de la energía libre. Por ejemplo, si una enzima reduce la energía de activación (G‡ o Ea) de una reacción
química en 5,4 kcal/mol, lo que es una reducción bastante modesta, la velocidad relativa de la reacción enzimática
se multiplica por un factor de 250.000 con respecto a la reacción no catalizada.
La fuerza de la teoría del estado de transición radica en su simplicidad en la explicación de cómo las enzimas
funcionan mecanísticamente, de cómo evolucionan para convertirse en catalizadores más eficientes, y cómo se
distinguen las enzimas de los anticuerpos (las selectividades de ambos reconocen a ligandos). En el contexto de la
catálisis enzimática, el sustrato libre (S) debe primeramente unirse a la enzima libre (E) para dar lugar a un complejo
de asociación que se encuentra repartido entre el estado basal (ES) y el estado activado (ES‡). El papel de la enzima
consiste en reducir la ΔG‡, y por lo tanto aumentar K‡ o la proporción de S que se encuentra en forma activada S‡ en
el estado estacionario, en comparación con una reacción no catalizada. Esto está indicado en la Figura 6.1 para la
catálisis en general, pero algunas características clave de la catálisis enzimática cuando actúa por estabilización del
estado de transición se ilustran mejor en una coordenada de reacción modificada (Fig. 6.2a). La asociación de E y S
para formar ES tiene una energía libre de unión característica (ΔGS) (a menudo negativa en las reacciones de
sustrato único). Con independencia de la magnitud de ΔGS, esta asociación proporciona interacciones favorables
entre E y S, denominadas de un modo simplista «energía de unión», que pueden emplearse para facilitar la catálisis
(Sección 6.2.4.2). El siguiente paso en la catálisis es la elevación de S hasta el estado de transición ES‡ (el cual
después da lugar a P y E libre). Este paso se representa termodinámicamente como ΔG‡. El cambio mínimo neto de
energía libre de activación necesario para que la reacción tenga lugar (para la transformación de S libre en P) es ΔGT.
ΔGT es la suma de las energías libres de los pasos individuales de unión (ΔGS) y de catálisis (ΔG‡). Utilizando este
diagrama resulta fácil ver dónde radica la ventaja catalítica de las enzimas a medida que evolucionan para reconocer
los sustratos. Si el lugar de unión para el sustrato en la enzima evoluciona sólo de manera que reconozca mejor (se
haga más complementario para) el estado basal de S, la afinidad entre E y S mejorará y la unión se vuelve más
favorable (ΔGS más negativa; Fig. 6.2b). La consecuencia es que no hay un cambio en ΔGT, peso sí un incremento de
ΔG‡ y se debe superar una barrera de energía mayor en el paso de transformación de ES en ES‡. Alternativamente,
Coordenada de reacción
Figura 6.2 Coordenada de reacción de la reacción enzimática y ventaja evolutiva. (a) Reacción enzimática típica. (b) Conse-
cuencia de la evolución de la enzima hasta hacerse más complementaria para el estado basal del sustrato (S). (c) Consecuencia de
la evolución de la enzima hasta hacerse complementaria para la forma del sustrato S en estado de transición. Las flechas en
negrita señalan cuándo los cambios de ΔG son evidentes en relación con la gráfica (a). (Adaptado de Fersht, A., Enzyme Structure
and Mechanism, 2nd edn., W.H. Freeman & Company, New York, 1985).
si el único cambio en el reconocimiento enzima-sustrato radica en que el sitio de unión se haga más complementario
para la estructura representada por S‡, entonces la energía libre tanto para la reacción neta (ΔGT) como para el paso
de formación/rotura del enlace (ΔG‡) se reduce (Fig. 6.2c). Debe quedar claro que la ventaja radica en que la enzima
reconozca o estabilice la forma de S en estado de transición*.
6.2.4 MECANISMOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA [30,43,151]
A nivel molecular, las enzimas poseen sitios activos que se unen a S y estabilizan S‡. Los residuos de aminoácidos
que forman el sitio activo y cualquiera de los cofactores necesarios interaccionan colectivamente con el sustrato a
través de interacciones covalentes y/o no covalentes. Las enzimas pueden utilizar diversos mecanismos para catalizar
la formación/rotura de enlaces y los procesos de reorganización atómica, y la capacidad para hacer esto está basada
en los aminoácidos específicos y su organización espacial dentro del sitio activo. Aparte de los aminoácidos esencia-
les para la catálisis, otros aminoácidos pueden actuar como asistentes en la catálisis a través del reconocimiento de
S y la estabilización de S‡.
6.2.4.1 Naturaleza general de los sitios activos de las enzimas

Los responsables de la actividad catalítica de las enzimas son ciertos aminoácidos. Considerando el tamaño de
las proteínas, puede parecer sorprendente que sólo un número limitado de aminoácidos, generalmente comprendi-
do entre 3 y 20, sean responsables de la función catalítica [30], siendo este número de alguna manera proporcional
al tamaño de la enzima. Por otra parte, el grupo de enzimas conocidas como serín proteasas tienen un tamaño que
oscila entre 185 y 800 residuos de aminoácidos, lo que corresponde a 20-90 kDa (la mayoría tienen 25-35 kDa),
pero poseen la misma unidad catalítica (tríada) HIS-ASP-SER. Estas comparaciones ilustran el hecho de que las
enzimas contienen muchos más residuos de aminoácidos de los necesarios para la actividad catalítica, y esto nos
incita a hacer una pregunta, «¿por qué las enzimas son tan grandes?» [130]. Los residuos de aminoácidos catalíticos
de las enzimas raramente son proximales uno de otro en la secuencia primaria y están distribuidos a lo largo de toda
* Nota: S se convierte en, o se estabiliza como, S‡, una vez realizada la unión, a través de la utilización de parte de la energía de unión
y de las fuerzas mecanísticas involucradas en la catálisis enzimática.
Enzimas 365
la cadena polipeptídica. Por ejemplo, la tríada catalítica es HIS64-ASP32-SER221 en la proteasa de Bacillus subtilis
denominada subtilisina, e HIS257-ASP203-SER144 en la lipasa de Rhizomucor miehei (las serín proteasas y las lipasas
están relacionadas mecanísticamente) [23,63]. Así pues, una función de las porciones no catalíticas de la cadena
polipeptídica es disponer los residuos catalíticos en el mismo espacio tridimensional en virtud de las estructuras
secundaria y terciaria de la proteína. La organización espacial precisa de los residuos catalíticos les permite funcio-
nar como una unidad catalítica, y el plegamiento del polipéptido también reúne a otros residuos que contribuyen
con fuerzas de unión a posibilitar el reconocimiento del sustrato. Así pues, la conformación del polipéptido actúa
como un «andamio» que, dentro del espacio tridimensional, sitúa en una posición correcta a los residuos de
aminoácidos que tienen funciones catalíticas y de reconocimiento del sustrato.
Otro papel de la cadena polipeptídica consiste en proporcionar un empaquetado compacto de los átomos, de tal
manera que el agua quede mayoritariamente excluida del interior de la enzima [43]. La limitación del contenido de
agua al 25% del volumen de la proteína permite que se formen cavidades y hendiduras interiores que son relativa-
mente no-polares y están desprovistas de agua, y esto puede incrementar las fuerzas dipolares, facilitando la catá-
lisis. Otros residuos de aminoácidos no catalíticos pueden participar en el funcionamiento global de la enzima
sirviendo como sitios de unión de cofactores o de efectores, o como sitios de reconocimiento superficiales para la
interacción con otros componentes celulares o para atraer/atrapar sustrato [43,130]. Finalmente, los aminoácidos
no involucrados en la catálisis o en el reconocimiento del sustrato pueden determinar la sensibilidad de la confor-
mación de la proteína frente a factores ambientales tales como el pH, la fuerza iónica y la temperatura, de tal
manera que modulan la actividad enzimática y globalmente confieren estabilidad a la enzima.
6.2.4.2 Mecanismos catalíticos específicos

Los mecanismos por los que las enzimas funcionan como catalizadores pueden reducirse a cuatro categorías
generales [30,54]. Estas son la aproximación, la catálisis covalente, catálisis general ácido-base, y la deforma-
ción molecular o distorsión (Tabla 6.2). Cuando se considere oportuno, se identificarán otras fuerzas que contri-
buyen a la catálisis.
TABLA 6.2
Mecanismos habituales de la catálisis enzimática.
Mecanismo Fuerzas involucradas Residuos y cofactores

potencialmente involucrados
Aproximación Modelizada como catálisis Residuos del sitio activo y residuos

intra vs. intermolecular implicados en el reconocimiento
del sustrato
Catálisis covalente Nucleofílicas SER, THR, TYR, CYS, HIS (base)
LYS (base), ASP–, GLU–
Electrofílicas LYS (base de Schiff) piridoxal, tiamina,
metales (cationes)
Catálisis general ácido-base Asociación/disociación de protones, HIS, ASP, GLU, CYS, TYR, LYS
estabilización de cargas
Distorsión conformacional Ajuste inducido, deformación inducida, Residuos del sitio activo y residuos
mecanismo de cremallera y flexibilidad implicados en el reconocimiento
conformacional del sustrato
Fuentes: Copeland, R.A., Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Function, Mechanism, and Data Analysis, 2nd edn., John
Wiley, New York, 2000; Saier, M.H., Enzyme in Metabolic Pathways: A Comparative Study of Mechanism, Structure, Evolution and
Control, Harper & Row, New York, 1987; Walsh, C., Enzymatic Reaction Mechanisms, W.H. Freeman & Company, San Francisco, CA,
1979.
6.2.4.2.1 Papel de la energía de unión

Antes de describir cada uno de los mecanismos enzimáticos más importantes, es necesario abundar en el papel de
la energía de unión, que fue introducido en la Sección 6.2.3.2, puesto que contribuye a todos los mecanismos que
describiremos más adelante. Energía de unión es el término usado para referirse a las interacciones favorables deriva-
das de la asociación del sustrato a la enzima en el sitio de unión [30,43,151]; la energía de unión deriva de la
complementariedad existente entre la enzima y el sustrato. La complementariedad (geométrica y electrónica) puede
estar «preformada» (basada en el antiguo modelo «llave y cerradura» de reconocimiento entre la enzima y el sustrato
desarrollado por E. Fischer), o «desarrollarse» durante la unión, o tratarse de una combinación de ambas posibilida-
des. La energía neta de unión se define también como el cambio de energía libre (a menudo negativo) resultante de la
desolvatación del sustrato como consecuencia de la interacción con la enzima. La pérdida de entropía debida a la
asociación enzima-sustrato está compensada por la entropía ganada por el solvente (generalmente agua). Alguna de
esta energía de unión puede usarse con fines productivos en la catálisis, siendo convertida en energía de activación
mecánica y/o química. Puede usarse para movilizar S en el sitio activo, para desestabilizar S, o para estabilizar S‡. La
capacidad de una enzima para reaccionar más rápidamente con un sustrato que con otro (definida como «selectivi-
dad») puede estar relacionada directamente con la cantidad de energía de unión que puede usarse para facilitar el paso
catalítico. Los residuos de aminoácidos no esenciales desde el punto de vista de la catálisis situados en el sitio activo
o en las proximidades a menudo ayudan a la catálisis mediante el uso de energía de unión.
6.2.4.2.2 Aproximación
La mejor situación para la aproximación tiene lugar cuando las unidades catalíticas y el sustrato están próximas
las unas del otro con una orientación favorable, facilitándose la reactividad. Otra manera de visibilizar el poder
catalítico de la aproximación es que cuando los reactantes están localizados en el mismo espacio dentro del sitio
activo de la enzima su molaridad efectiva se ve muy aumentada en relación con sus concentraciones en la disolu-
ción. Este mecanismo ofrece la contribución entrópica a la catálisis, pues ayuda a superar el gran descenso de
entropía que de otro modo sería necesario para unir a todos los participantes en la reacción. Así pues, la contribu-
ción de los efectos de la aproximación a la catálisis a menudo se explica por la existencia de concentraciones
efectivas (aumentadas) en el contexto de los efectos de la acción de masas sobre las velocidades de reacción.
La vida media de las asociaciones intermoleculares entre reactantes que colisionan en solución es generalmente
seis órdenes de magnitud más corta que la de un complejo formado por la unión típica del sustrato y la enzima
[151]. El bolsillo de unión de la enzima permite el «atraque» o el «anclaje» del sustrato en el sitio activo en un
medio con una cantidad de agua reducida. La duración más larga de la interacción conduciría por sí misma a una
mayor probabilidad de alcanzar el estado de transición. Así pues, la aproximación puede también considerarse
como una reacción intramolecular en la que todos los reactantes son considerados como presentes dentro de una
única molécula (la enzima), en comparación con lo que ocurre en una reacción intermolecular.
El efecto catalítico neto de la aproximación se basa en cálculos bastante teóricos, pero se ha visto que propor-
ciona un aumento de la velocidad de hasta 104-1015 en una reacción química que involucra a entre uno y tres
sustratos (mayor aumento en las reacciones de sustrato múltiple) [151,154]. La aproximación es un carácter
mecanístico que no es conferido por aminoácidos específicos, sino más bien por la naturaleza química y física del
sitio activo y por la constelación de aminoácidos incluidos en él (Tabla 6.2).
6.2.4.2.3 Catálisis covalente

La catálisis covalente implica la formación de un intermediario covalente enzima-sustrato o cofactor-sustrato, y
este mecanismo de catálisis se inicia por un ataque nucleofílico o electrofílico. (El comportamiento nucleofílico y
electrofílico de las enzimas/cofactores puede ocurrir también en mecanismos no covalentes). Los centros nucleofí-
licos son ricos en electrones, a veces están cargados negativamente, y buscan centros pobres en electrones (nú-
cleos) con los que reaccionar, tales como carbonos carbonílicos, o grupos funcionales fosforilo o glucosilo. La
catálisis electrofílica implica la retirada de electrones de los centros de reacción por acción de electrófilos, también
denominados «sumideros» de electrones. Puesto que la catálisis covalente involucra tanto grupos nucleofílicos
como electrofílicos entre los reaccionantes, la clasificación de la reacción en uno u otro tipo se basa en cuál es el
centro en el que se inicia la reacción.
Enzimas 367
En la formación de un intermediario covalente es implícita la existencia de al menos dos pasos a lo largo de la

coordenada de reacción, a saber, la formación y la rotura del aducto covalente (Enz-Nu-P2), cada una con una ΔG‡
característica (Fig. 6.3). Las múltiples etapas de la catálisis también reflejan la presencia de múltiples formas de la
enzima, mostrando una coordenada de reacción cinéticamente más complicada que la que se representa en la
Figura 6.1. La catálisis covalente es común en muchas clases de enzimas, que incluyen las serín y tiol proteasas,
lipasas y carboxilesterasas, y muchas glucosil hidrolasas. El efecto catalítico neto de la catálisis covalente se estima
que proporciona un aumento de la velocidad de hasta 102-103 con respecto a una reacción química no catalizada.
6.2.4.2.3.1 Catálisis nucleofílica Los residuos de aminoácidos de las enzimas que proporcionan centros nu-
cleofílicos se enumeran en la Tabla 6.2. Generalmente, el carácter nucleofílico depende de la alcalinidad del grupo
funcional, que está relacionada con la capacidad de donar un par de electrones a un protón [30,43]. Así pues, la
constante de velocidad nucleofílica está correlacionada positivamente con el pKa en compuestos relacionados
estructuralmente (valores de pKa más elevados proporcionan velocidades de reacción mayores). Sin embargo, los
grupos nucleofílicos en las enzimas normalmente operan en un rango de pH limitado (a menudo a pH en torno a 7),
lo cual es propicio para mantener la estabilidad conformacional de la enzima. Así pues, aunque la ARG puede
actuar potencialmente como un nucleófilo, el valor de pKa de su cadena lateral de ~12 determina que sólo podría
existir casi exclusivamente en forma de ácido conjugado en las enzimas virtualmente bajo todas las condiciones
naturales, lo que explica por qué no aparece incluida en la Tabla 6.2. Otro factor que incide sobre la velocidad de
la catálisis nucleofílica es la naturaleza del «grupo saliente» o de los productos que se generan durante la formación
del intermediario covalente (P1 en la Fig. 6.3). Cuanto menor es la alcalinidad (menor valor del pKa) del grupo
saliente, mayor es la velocidad de reacción para un nucleófilo determinado.
La tríada catalítica HIS-ASP(GLU)-SER, que es característica de las familias de enzimas serín proteasas y
lipasas/carboxilesterasas, constituye uno de los ejemplos mejor estudiados de catálisis nucleofílica. Estas enzimas
catalizan la hidrólisis de enlaces amida (peptídicos) y éster, respectivamente, vía un intermediario covalente. El
funcionamiento de la unidad catalítica HIS-ASP-SER es un ejemplo clásico de catálisis nucleofílica como meca-
nismo de reacción, pero en el curso de la catálisis enzimática están involucradas otras fuerzas mecanísticas. En la
tríada catalítica de la subtilisina (proteasa de B. subtilis, 3.4.21.62), la SER221 actúa como un nucleófilo, donando
electrones al carbono amida del enlace peptídico (Fig. 6.4) [23,24]. El carácter nucleofílico del átomo de oxígeno
de la SER221 se ve incrementado por la HIS64 que actúa como una base general aceptando un protón, y el residuo de
Coordenada de reacción
Figura 6.3 Coordenada de reacción para una reacción enzimática con catálisis nucleofílica con un intermediario covalente.
ENZ-Un, enzima con grupo catalítico nucleofílico; S, sustrato; Px, productos.
Figura 6.4 Mecanismo de reacción de las serín proteasas. El esqueleto del péptido que actúa como sustrato está en negrita. Los
grupos P1 y P1’ son las cadenas laterales de los aminoácidos ubicados, respectivamente, en los lados N y C-terminal del enlace
peptídico a escindir. (Adaptado de Carter, P., and Wells, J.A., Nature, 332, 564, 1988; Carter, P., and Wells, J.A., Protein Struct.
Funct. Genet., 7, 335, 1990).
ASP32 adyacente estabiliza la carga que aparece en HIS64. Esto da como resultado la formación del intermediario
tetraédrico acil enzima transitorio. En la última etapa, la HIS64 actúa como un ácido general y dona un protón al
fragmento peptídico N-terminal del péptido roto que constituye el grupo saliente, y se forma un aducto covalente
acil enzima. Aunque no se muestra en esta figura, el ciclo de catálisis se completa cuando el agua, actuando como
nucleófilo terminal, desplaza el fragmento peptídico desde la SER221, formando otro intermediario tetraédrico
utilizando la misma maquinaria catalítica que se acaba de describir. El residuo ASN155 es menos crítico para la
catálisis, pero opera estabilizando el intermediario tetraédrico que se está formando (un «oxianión») dentro de un
espacio en la enzima que se conoce como el «agujero del oxianión».
El comportamiento de los mutantes para la subtilisina (en la que algunos residuos de aminoácidos específicos se
reemplazan por otros, utilizando técnicas moleculares) revela la importancia de los aminoácidos que integran la
tríada. La enzima nativa tiene una eficiencia catalítica (expresada como kcat/KM, según se explica en la Sección
6.2.5.3) de 1,4 × 105 (Tabla 6.3). Si cualquiera de los residuos SER221, HIS64 o ASP32 se sustituye por ALA, la
eficiencia catalítica se reduce alrededor de 104-106. Cuando dos cualesquiera de ellos o los tres residuos se sustitu-
yen por ALA, no se observa más disminución o una disminución adicional muy pequeña en la eficiencia catalítica, lo
que muestra que los tres residuos de aminoácidos actúan como una unidad, en lugar de hacer cada uno de ellos una
contribución sumatoria al poder catalítico. Estos mismos tres residuos de aminoácidos componen la tríada catalítica
de las lipasas (y de la mayoría de las carboxilesterasas). En el caso de las lipasas, tiene lugar la misma secuencia de
eventos que se representa en la Figura 6.4, con la excepción de que el sustrato es un éster (R–CO–OR’), en donde el
grupo acilo (R–CO–) es el que va a formar el mismo intermediario acil enzima, mientras que el alcohol liberado
TABLA 6.3
Efecto de mutaciones puntuales sobre las constantes catalíticas de la proteasa subtilisina.
Enzima kcat (s–1) μM)

KM (μ kcat/KM (s–1 M–1)
Tipo salvaje 6,3 × 101 440 6,3 × 105

Mutación SER221 → ALA 5,4 × 10–5 650 8,4 × 10–2
Mutación HIS64 → ALA 1,9 × 10–4 1.300 1,5 × 10–1
Mutación ASP32 → ALA 1,8 × 10–2 1.400 1,3 × 101
Las tres mutaciones 7,8 × 10–3 730 1,1 × 10–1
Fuentes: Carter, P., and Wells, J.A., Nature, 332, 564, 1988; Carter, P., and Wells, J.A., Protein Struct. Funct. Genet., 7, 335, 1990.
Enzimas 369
(R’OH) constituye el grupo saliente. La tríada catalítica de HIS-ASP(GLU)-SER es una unidad catalítica que se
encuentra muy conservada en las lipasas y carboxilesterasas, mientras que las proteasas pueden trabajar siguiendo
cualquiera de los cuatro mecanismos catalíticos diferentes (Sección 6.3.3). Existen tres carboxilesterasas que usan
unidades y mecanismos catalíticos alternativos: la fosfolipasa A2 secretora (pancreática, de las abejas y del veneno
de serpiente; usa una díada HIS/ASP), la acil hidrolasa de los lípidos de la patata (emplea una díada ASP/SER), y
la pectín metil esterasa (actúa con una díada ASP/ASP).
6.2.4.2.3.2 Catálisis electrofílica La catálisis electrofílica constituye otro tipo de mecanismo covalente en la
que el paso característico en la coordenada de reacción es un ataque electrofílico. Los residuos de aminoácidos de
las enzimas no tienen grupos electrofílicos adecuados. En su lugar, los electrófilos son atraídos de cofactores
deficientes en electrones o de un derivado nitrogenado catiónico formado entre el sustrato y los residuos catalíticos
de la enzima, iniciándose la catálisis electrofílica (Tabla 6.2).
Algunas de las reacciones enzimáticas mejor conocidas que transcurren mediante catálisis electrofílica utilizan
fosfato de piridoxal (un nutriente esencial con actividad vitamínica, la vitamina B6, Capítulo 7) como cofactor;
muchas de estas enzimas están involucradas en la transformación/metabolismo de aminoácidos [43,140]. Un me-
canismo general de las reacciones enzimáticas que utilizan fosfato de piridoxal implica la transferencia
(transaldiminación) de una base de Schiff (–C=N–) unida al grupo piridoxal desde un residuo LYS de la enzima
hasta un aminoácido reactivo unido al sitio activo de la enzima (Fig. 6.5a). La base de Schiff intermediaria es
estabilizada por el anillo piridina, que actúa como un «sumidero» de electrones. Un residuo en la enzima actúa
entonces como una base (B:) absorbiendo el protón liberado por el sustrato como un primer paso común en la ruta
de la reacción. El que el grupo sustituyente determine que el centro quiral (–R, –H, –COO–) resulte roto (lisado) o
transferido viene determinado por cuál de los grupos sustituyentes α-C esté perpendicular al plano del intermedia-
rio de piridinio, puesto que éste presenta la Ea más baja para la transformación/eliminación (Fig. 6.5b).
Algunas de las características del sitio activo compartidas por muchas enzimas que contienen piridoxal se
ilustran con la acción de la aliina-liasa (EC 4.4.1.4, S-alqu(en)il-L-cisteína sulfóxido [ACSO] liasa) sobre los
ACSO (Fig. 6.6). A esta enzima se la conoce comúnmente como aliinasa y es responsable de la generación de los
Figura 6.5 Mecanismo general de reacción de las enzimas que contienen piridoxal. (a) Pasos iniciales de transaldiminación y
eliminación del átomo α-H. (b) Relación entre la configuración de α-C y los tipos de reacciones catalizadas. (Adaptado de
Fersht, A., Enzyme Structure and Mechanism, 2nd edn., W.H. Freeman & Company, New York, 1985; Tyoshimura, T. et al.,
Biosci. Biotech. Biochem., 60, 181, 1996).
flavores pungentes de los vegetales del género Allium (cebolla, ajo, puerro, cebollino, etc.) tras la rotura o corte
de los tejidos frescos. En la enzima del ajo, la LYS251 (LYS285 en la cebolla; LYS280 en el cebollino) se coordina
con el cofactor piridoxal, ayudada por la «copa de fijación de fosfato» y por residuos adicionales que se unen al
N del piridinio y a grupos hidroxilo [69]. El sustrato se coordina con otros residuos de la enzima (ARG401, la
amida de la SER63 y la GLY64, y TYR92) para conferir a la enzima (estereo) selectividad hacia los sulfóxidos de
la (+)S-alquil-L-cisteína. La aliinasa provoca una β-rotura del sustrato, generando el ácido sulfénico (R–S–OH,
un grupo saliente útil).
6.2.4.2.4 Catálisis general ácido-base

La mayoría de las reacciones enzimáticas implican transferencia de protones en algún momento durante la
catálisis y esta transferencia se realiza a manudo por residuos de aminoácidos que actúan como ácidos generales
donando un protón y como bases generales aceptando un protón. La catálisis general ácido-base contempla una
transferencia de protones en el sitio activo a medida que los sustratos se convierten en productos durante el ciclo
catalítico. Esto la distingue de la catálisis ácido-base específica, la cual requiere que difundan hasta el sitio activo
grupos H+ u OH– provenientes del disolvente. Los residuos de aminoácidos que pueden actuar como ácidos o bases
generales normalmente tienen valores de pKa que quedan comprendidos dentro del rango de pH óptimo para la
estabilidad y actividad enzimática (generalmente pH entre 4 y 10); tales residuos se muestran en la Tabla 6.2.
Recordar que el comportamiento general ácido-base contribuye al mecanismo nucleofílico de las serín proteasas,
lipasas y carboxilesterasas (Fig. 6.4). De hecho, la HIS es un residuo a menudo implicado en la catálisis general
ácido-base, puesto que el pKa del grupo imidazol en el seno de las proteínas se encuentra normalmente en el rango
6-8, lo que lo hace ideal para funcionar ya sea como un ácido o como una base en las condiciones en las que son
activas la mayoría de las enzimas.
Un ejemplo de catálisis general ácido-base lo encontramos en la lisozima (ES 3.2.1.17, mucopéptido
N-acetilmuramil hidrolasa, también denominada muramidasa), una enzima presente en la saliva, lágrimas y clara
de huevo de gallina. El mecanismo que sigue la lisozima la emplean las glucosil hidrolasas en general (Sección
6.3.2), incluidas las enzimas que hidrolizan el almidón, los azúcares y la pectina [126]. La lisozima puede usarse
como agente bactericida en los alimentos, puesto que hidroliza los heteropolímeros de peptidoglucano de las
paredes celulares de los procariotas (especialmente de microorganismos Gram positivos, que incluyen muchos
patógenos alimentarios). El mecanismo de acción, que se observa mejor a un valor de pH próximo al óptimo ~5,
está relacionado con la naturaleza general ácido-base de los aminoácidos GLU35 y ASP52 del sitio activo
[33,126,154].
Figura 6.6 Sitio activo de las aliinasas del ajo. El esqueleto

del sustrato S-alquil-L-cisteína sulfóxido aparece en negrita.
(Adaptado de Kuettner, E.B. et al., J. Biol. Chem., 277, 46402,
2002).
Enzimas 371
(6.8)
El residuo GLU35 actúa como un ácido general y dona un protón al átomo de oxígeno del enlace glucosídico a
escindir; el carboxilato de ASP52, actuando como base, sirve para estabilizar electrostáticamente el ion carboxenio
que se está desarrollando en el sustrato*. El agua entrante necesaria para completar la hidrólisis (no mostrada)
resulta parcialmente ionizada por el grupo carboxilato del GLU35, y activa la adición de –OH (procedente del agua)
al C1 del glucósido original, pasando el H+ al GLU35 para volver el sitio activo al estado inicial. La exclusión de
agua y una abundancia de residuos hidrofóbicos en la hendidura del sitio activo de la enzima crean un entorno
no polar en la proximidad del residuo GLU35, convirtiéndolo en menos capaz de ionizar y confiriéndole un valor
de pKa anormalmente alto (de 6,1). Esto le permite funcionar como un catalizador general ácido a pH 5. La
relativa falta de agua para proteger a las cargas también permite la emergencia de dipolos fijos entre los residuos
catalíticos y el intermediario que se está formando. Esto sirve para reducir el valor de Ea en una cantidad mayor
o igual a 9 kcal/mol (lo que corresponde con un incremento de la velocidad en más de 106) en comparación con la
reacción no catalizada en agua [33].
Un ejemplo de reacciones de transferencia de protón/electrón (comunes en las metaloenzimas) en las enzimas
lo encontramos en la xilosa isomerasa (EC 5.3.1.5, D-xilosa cetol-isomerasa), también denominada glucosa
isomerasa. Esta enzima cataliza una reacción de establecimiento de un equilibrio entre los isómeros de aldosas y
cetosas. Casi todas las xilosa isomerasas que han sido caracterizadas son homotetrámeros, con dos sitios activos,
cada uno de ellos con un catión como cofactor (generalmente Mg2+, pero también Mn2+ o Co2+) [154]. En la enzima
de Streptomyces spp., existe una secuencia conservada en el sitio activo que incluye residuos que unen a los
cationes (GLU180, 216, ASP244, 254, 256, 286, HIS219) y otros que se encuentran recubriendo el sitio activo (HIS53, PHE93,
TRP135, LYS182, GLU185) [126]. El sitio activo está bifurcado con áreas muy polares y con áreas hidrofóbicas
(especialmente TRP135), sirviendo estas últimas para excluir el agua. Esta enzima ha sido citada históricamente
como ejemplo de catálisis ácido-base general, pero una idea más actual es que cataliza una reacción de transferen-
cia de hidruro. Los pasos específicos en la secuencia de la reacción incluyen la apertura del anillo, un paso de transfe-
rencia de hidrógeno que limita la velocidad, y el cierre del anillo [48,49]. De los dos iones Mg2+, el Mgs es estructural
y se coordina con el O2 y el O4 del azúcar sustrato, y el Mgc es catalítico (Fig. 6.7). Tras la apertura del anillo (no
mostrado), se genera –OH a partir de agua por efecto del carboxilato de ASP254 que actúa como una base general
eliminando un H+. Se transfiere un protón desde O2 hasta el –OH unido al Mgc, tras de lo cual Mgc es atraído hacia el
O2 cargado negativamente (en realidad Mgc se mueve) para estabilizar el estado de transición, y en esto colabora el
establecimiento de puentes de hidrógeno entre la LYS182 y el O1. Este movimiento del Mgc está sincronizado con la
transferencia del hidruro (–H:) desde el C2 hasta el C1. Se trata de una reacción en equilibrio y la transferencia del
hidruro puede revertirse esencialmente mediante los mismos pasos con la unión Mgc:–OH actuando como lanzadera
de H+ desde los alcóxidos O1 al O2 para facilitar la transferencia del hidruro desde el C1 al C2.
* Muchas glucosil hidrolasas, incluida la lisozima, se consideran ejemplos de catálisis nucleofílica debido a que se forma un interme-
diario covalente [126] aunque no se muestra en la Ecuación 6.8. El carboxilato de ASP52 es un buen nucleófilo (Tabla 6.2). Los
mecanismos de la glucosil hidrolasa se explican en profundidad en la Sección 6.3.2.
Figura 6.7 Mecanismo de reacción de la xilosa (glucosa) isomerasa. (Adaptado de García-Viloca, M. et al., J. Am. Chem. Soc.,
124, 7268, 2002; García-Viloca, M. et al., Science, 303, 186, 2004).
Se consiguen generalmente aumentos de la velocidad de reacción de 102-103 a través de la catálisis ácido-base

general, en la que se necesita el aporte o la retirada de electrones a lo largo de la coordenada de reacción. En el
ejemplo de la lisozima, el mayor incremento global de la velocidad se basa en otros factores (estabilización
electrostática, deformación del sustrato) que contribuyen a la catálisis.
6.2.4.2.5 Deformación y distorsión

Esta explicación mecanística se basa en la premisa de que las regiones de los sustratos y de las enzimas que
interaccionan no son tan rígidas como implicaría el concepto llave-cerradura de la catálisis enzimática avanzado
por E. Fischer en 1894. La distorsión o la deformación como factores que rigen la catálisis fue sugerida por J.B.S.
Haldane y L. Pauling, pues está relacionada con la teoría del estado de transición de la catálisis enzimática. Así
pues, si bien existe una complementariedad estructural y electrónica entre la enzima y el sustrato que proporciona
fuerzas atractivas, esta complementariedad no es «perfecta». Si la complementariedad preexistente fuese perfecta,
sería poco probable que tuviese lugar la catálisis, debido a la gran barrera de energía que haría falta superar para
alcanzar un estado de transición (recordar la Fig. 6.2b).
Una cierta complementariedad preexistente entre los sitios de unión de la enzima y el sustrato proporciona el
reconocimiento del sustrato y la consecución de la energía de unión, y ayuda a orientar el sustrato hacia el sitio
activo. La utilización provechosa de la energía de unión que surge de la asociación enzima-sustrato puede manifes-
tarse induciendo tensión/deformación en la enzima y/o el sustrato, permitiendo que se desarrolle una mayor
complementariedad hacia un estado de transición. Es poco probable que los efectos sobre el sustrato sean de
estiramiento o retorcimiento de los enlaces, o de doblado de los ángulos de los enlaces, debido a las grandes
fuerzas que se estiman necesarias para tales acontecimientos [43]. Más bien, la deformación del sustrato ocurre con
más probabilidad debido a una restricción en la libertad rotacional de los enlaces, compresión estérica y repulsión
electrostática entre enzima y sustrato. Así pues, en un sentido puramente físico, el sustrato puede someterse a
tensión (pero no tiene lugar en él una distorsión) al unirse a la enzima, de modo que el alivio de esa tensión a través
de la utilización de cierta energía de unión ayudaría a alcanzar el estado de transición. Un ejemplo de esto lo
encontramos en el mecanismo de acción de la lisozima, en el que el estado de transición representado por el ion
carboxenio del derivado piranosa (Ecuación 6.8) adopta una conformación de media-silla («sofá») en vez de una
conformación más estable de silla entera.
Las enzimas, como proteínas que son, se considera que poseen estructuras más flexibles que los sustratos
pequeños inorgánicos. En contraste con la complementariedad preexistente, la flexibilidad conformacional de la
proteína proporciona la base de la hipótesis del «ajuste inducido» inicialmente formulada por D. Koshland para la
catálisis enzimática. En tal hipótesis, se considera que las perturbaciones conformacionales en el sitio activo de la
enzima al unirse el sustrato facilitan la estabilización del complejo ES‡. Al hacerlo, las modulaciones conformacio-
nales en el sitio activo de la enzima al unirse el sustrato pueden ayudar a alinear los grupos reactivos tanto de la
enzima como del sustrato para facilitar la catálisis.
Un ejemplo de un mecanismo de catálisis de ajuste inducido es la activación en superficie de las lipasas, donde
una zona de la proteína que constituye una «tapadera» que cubre el sitio activo sufre un cambio conformacional
Enzimas 373
que permite al sustrato (un éster de un ácido graso) acceder al sitio activo de la enzima y resultar hidrolizado. Un
movimiento molecular más sutil en las enzimas es el movimiento del Mgc en la xilosa isomerasa que acabamos de
describir (Fig. 6.7), el cual se estima que provoca una aceleración de la velocidad de reacción de alrededor de 104
[49]. Un tercer ejemplo de ajuste inducido es la papaína, una sulfhidrilo proteasa, en la que la deformación induci-
da estéricamente al unirse el sustrato se alivia con la formación de un intermediario tetraédrico; la especificidad y
el mecanismo de acción de la papaína se tratarán más adelante en las Secciones 6.2.6 y 6.3.3. Se está evidenciando
que muchas, sino la mayoría, de las enzimas experimentan cierto grado de ajuste inducido durante la función
catalítica. Aunque se considera que el efecto catalítico neto de la deformación es difícil de cuantificar, el incremen-
to de la velocidad de reacción que provoca oscila entre 102 y 104.
6.2.4.2.6 Otros mecanismos enzimáticos

Las enzimas redox (oxidorreductasas) catalizan reacciones de transferencia de electrones a través de alter-
nancia de los estados redox de los grupos prostéticos. Los grupos prostéticos pueden ser metales de transición
(hierro o cobre) o cofactores tales como las flavinas (las nicotinamidas, como el NAD(P)H, son cosustratos en
las reacciones redox). La lipooxigenasa (linoleato-oxígeno oxidorreductasa; EC 1.13.11.12) está ampliamente
distribuida en las plantas y animales y posee un hierro no hemo como grupo prostético. Reacciona con los ácidos
grasos que tienen un grupo 1,4-pentadieno, grupo que está presente en los ácidos grasos poliinsaturados (puede
haber multitud de estos grupos en los ácidos grasos), representados por el ácido linoleico (18:29c,12c). Las
lipooxigenasas inician la degradación oxidativa de los ácidos grasos, transformándolos en productos que colec-
tivamente pueden impartir flavores tanto indeseables (rancio) como deseables; pueden también degradar pigmentos
a través de reacciones secundarias. La lipooxigenasa a menudo se aísla de los tejidos que la contienen en el
estado «inactivo» Fe(II) (Fig. 6.8). La activación tiene lugar mediante reacción con un peróxido (existen bajos
niveles de peróxidos en todos los tejidos biológicos), dando lugar al complejo activado HO-Fe(III) en el que el
grupo hidroxilo coordinado actúa como la base que abstrae un átomo de H (a través de un proceso denominado
«tunelización»*) del carbono metileno (estos enlaces C-H presentan la menor energía de enlace en los ácidos
grasos). El radical libre que se genera como aducto se estabiliza por resonancia, y se añade O2 al radical alquilo
en los sitios donde es posible, que están en el lado del sustrato opuesto al Fe (ver la discusión sobre especificidad
que se hace más adelante, Sección 6.2.6). El radical peroxilo resultante abstrae un átomo de H del complejo
inactivo agua-grupo prostético Fe(II) para generar como producto un hidroperóxido del ácido graso (hidroperóxido
13-S-ácido linoleico en el caso de la lipooxigenasa mayoritaria en la soja) y devolver la enzima otra vez a un
estado activo.
La metalocatálisis y la catálisis electrostática con frecuencia se definen como un mecanismo catalítico discreto.
El autor decidió ilustrar estas características mecanísticas como una parte del comportamiento catalítico de otras
enzimas que se describen en este capítulo tales como la lipooxigenasa, xilosa isomerasa, carboxipeptidasa A y
termolisina.
6.2.4.2.7 Efectos netos de la catálisis enzimática

Se estima que el efecto neto de diversas combinaciones de mecanismos de catálisis enzimática podría producir
un incremento de la velocidad de la reacción de 1017-1019 en relación con las reacciones no catalizadas [49,105,154].
La mayoría de este incremento es debido a la estabilización del estado de transición (reducción de la energía de
activación) y también una pequeña contribución podría proceder de los procesos de «tunelización», particularmen-
te en los pasos de transferencia de hidrógeno.
* La «tunelización» es un mecanismo (modelizado como un coeficiente de transmisión) utilizado para describir la transferencia de H
cuando para esta transferencia se requiere una energía menor que la esperada (se «excava» un atajo o túnel por debajo de la barrera de
energía). Esto puede implicar que la transferencia de H se realice en dos etapas inseparables, primero la del núcleo seguida de la del
electrón [49].
Figura 6.8 Mecanismo de reacción de la lipooxigenasa. (Adaptado de Brash, A.R., J. Biol. Chem., 274, 23679, 1999; Casey, R.
and Hughes, R.K., Food Biotechnol., 18, 135, 2004; Sinnott, M. (Ed.), Comprehensive Biological Catalysis. A Mechanistic
Reference, Vol. III, Academic Press, San Diego, CA, 1998).
6.2.5 CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
Los mecanismos de catálisis enzimática que acabamos de describir explican la química de la transformación del
sustrato, pero ilustran poco la cinética de las reacciones enzimáticas (la rapidez con la que transcurren). Puesto
que las enzimas se usan para acelerar las reacciones con la finalidad de mejorar y/o añadir valor a los alimentos, el
conocimiento de la rapidez con la que pueden transcurrir las reacciones enzimáticas es un factor crítico en la
decisión sobre si, y cuándo, usar un proceso enzimático. Puesto que las enzimas son también selectivas, el conoci-
miento de cuánto es mayor la selectividad de una enzima frente a un sustrato que frente a otro puede ser también un
factor crítico en la toma de decisión del uso de un proceso enzimático. La velocidad de cualquier reacción, enzimá-
tica o no, depende de factores cinéticos intrínsecos (relacionados con las energías de activación; Figs. 6.1 y 6.2) y
de las concentraciones de los reactantes y los catalizadores (efectos de la ley de acción de masas). Ya que las
concentraciones pueden variar entre las distintas condiciones de reacción, es más válido comparar el poder catalítico
relativo sobre la base de factores intrínsecos tales como las constantes cinéticas. Si se conocen las constantes de
velocidad de una reacción para un conjunto de condiciones ambientales, entones se pueden predecir las velocida-
des de reacción para cualquier combinación de concentraciones de reactantes y catalizadores bajo esas condicio-
nes generales.
6.2.5.1 Modelos simples para las reacciones enzimáticas [31,122]

Las enzimas son bastante únicas en cuanto al tipo de cinética que exhiben. Consideremos la reacción enzimáti-
ca más simple, el modelo de equilibrio rápido conocido como cinética de Michaelis-Menten. En este modelo, una
enzima (E) actúa sobre un único sustrato (S) para formar un complejo de asociación único (ES) (que se denomina
en ocasiones el complejo de Michaelis) que proporciona un único producto (P):
(6.9)
Enzimas 375
Se asume que la unión del S a la E representa las condiciones de equilibrio entre los pasos de asociación (E + S → ES)
y disociación (ES → E + S), teniendo cada uno de ellos unas constantes de velocidad de segundo orden (k1) y de
primer orden (k–1) respectivas y características. Existe un acuerdo en bioquímica consistente en representar los
equilibrios de unión como procesos de disociación y, por lo tanto, la condición de equilibrio para el paso de unión
de sustrato se expresa como:
(6.10)
Nótese que un valor menor de KS indica que existe una mayor proporción de enzima en la forma ES y que existe
una mayor unión o afinidad entre E y S. El segundo paso de la reacción enzimática es el paso catalítico de ES → E
+ P, caracterizado por la constante de velocidad catalítica de primer orden kcat.
Así, la velocidad inicial (v) de una reacción enzimática puede expresarse como:
(6.11)
y la velocidad de formación de P en este modelo se considera que no interfiere en los equilibrios de unión entre E
y S, de ahí la referencia al modelo de equilibrio rápido para la cinética enzimática.
Un enfoque cinético alternativo asume que la velocidad de descomposición de ES para formar P puede influir
sobre la proporción de distribución de la enzima entre el estado libre E y el estado ES. Para compaginar esto,
puede asumirse que durante un breve período de tiempo que se observe una reacción, la [ES] no cambia o lo hace
de un modo insignificante (esto se denomina la aproximación al estado estacionario, desarrollada por G. Briggs
y J. Haldane). En este escenario:
(6.12)
Así pues, la velocidad de formación de ES es equivalente a la de su desaparición. Puesto que la formación de ES

procede de la unión de S con E (el paso k1) y la desaparición de ES se explica por la suma de los procesos de
disociación de ES (los pasos k–1 y kcat).
(6.13)
Esta ecuación puede reescribirse como si se tratase de un proceso de disociación de la forma:
la constante de Michaelis (6.14)
Esta ecuación es similar a la Ecuación 6.10, excepto en que dictamina que [ES] viene determinada por las rutas
tanto de disociación como de catálisis. También recoge que la magnitud relativa de k–1 y kcat es clave para la
relación entre KS (Ecuación 6.10) y KM (Ecuación 6.14). Si kcat es dos órdenes de magnitud menor que k–1, entonces
kcat puede ignorarse y la distribución de la enzima entre el estado libre E y ES viene determinada únicamente por el
equilibrio de unión, haciendo que KM sea equivalente a KS. Si, por otra parte, kcat es del mismo orden de magnitud
que k–1, entonces la distribución predicha de la enzima entre E y ES en el equilibrio de unión no se alcanzará nunca,
porque el paso kcat es suficientemente rápido para agotar ES hasta niveles por debajo de los valores de equilibrio.
Así pues, en este caso, KM ≠ KS y KM no indica únicamente afinidad. Las enzimas que se comportan de este modo
se considera que se adaptan al modelo cinético de estado estacionario. KM se considera una constante de
pseudodisociación de ES y tiene unidades de molaridad (M) al igual que S (y KS). Esto permite que las magnitudes
de KM y de [S] puedan compararse directamente, puesto que ambos parámetros tienen las mismas unidades; el
significado de esta relación se indicará más adelante. En los casos en que kcat >> k–1, kcat/ KM = k1, lo que significa
que la velocidad de la reacción está limitada por el paso de la asociación. Puesto que las constantes de velocidad de
asociación de las enzimas a menudo tienen un valor de ~107-108 s–1M–1, la existencia de condiciones de estado
estacionario puede diagnosticarse a partir de los valores estimados de kcat/KM, que son de 106-108 s–1M–1 [43,151].
Muchas de las enzimas que catalizan reacciones de oxidación-reducción y de isomerización presentan cinéticas de
estado estacionario, mientras que la mayoría (pero no todas) las enzimas hidrolíticas no lo hacen (así, en la mayoría
de las enzimas hidrolíticas KM ≈ KS, y KM constituye generalmente una medida de afinidad).
6.2.5.2 Expresiones de la velocidad de las reacciones enzimáticas

Las expresiones de la velocidad de las reacciones enzimáticas pueden crearse tomando las relaciones entre dos
equivalencias: La expresión de la velocidad (Ecuación 6.11) y una expresión para la conservación de la enzima total (ET):
(6.15)
La ecuación se simplifica mucho si las especies enzimáticas se expresan sólo en la forma [ES], lo que se puede
hacer escribiendo la Ecuación 6.14 como [E] = (KM × [ES])/[S] y sustituyendo [E] por esta equivalencia en la
Ecuación 6.15. Si se considera que la mayor rapidez de una reacción enzimática (Vmáx) tiene lugar cuando toda la
enzima está en forma [ES], entonces:
(6.16)
La Ecuación 6.15 entonces se simplifica y queda de la manera siguiente:
(6.17)
Ésta se convierte en una relación muy poderosa en muchos sentidos. Puesto que Vmáx y KM son constantes, esta
ecuación toma la forma de:
(6.18)
Esta ecuación, en la que a y b son constantes, se define como una hipérbola rectangular, y la cinética enzimática
simple a menudo se denomina cinética hiperbólica. La Ecuación 6.17 también ayuda a ilustrar cómo las velocida-
des de las reacciones enzimáticas son dependientes del sustrato, y a [S] baja, KM >> [S], y:
(6.19)
Así pues, cuando S está a una concentración limitante tendiendo hacia una dilución infinita, la velocidad de la
reacción viene determinada por la constante combinada Vmáx/KM, la reacción es una reacción de primer orden con
respecto a S, y la reacción enzimática a una [S] diluida se representa como:
(6.20)
Este modelo expresa la capacidad de una enzima de reconocer, y transformar después, a un sustrato en un estado
diluido, y proporciona una medida de la «eficiencia catalítica», que se cuantifica por la constante Vmáx/KM (también
denominada la «constante de especificidad»). Las comparaciones en términos cuantitativos de la selectividad enzi-
mática frente a múltiples sustratos, en base a los valores de Vmáx/KM, permite hacer inferencias acerca de cómo la
enzima reconoce a los sustratos (Sección 6.2.6). Puesto que Vmáx/KM son constantes, la comparación de las constan-
tes de selectividad entre los sustratos competidores es válida a todos los niveles de [S]. En la otra posibilidad
extrema, si [S] >> KM, entonces la Ecuación 6.17 se simplifica hasta:
Enzimas 377
(6.21)
Debería ser obvio que la velocidad de reacción es de orden cero con respecto a [S], y bajo esta condición toda
la enzima está saturada con sustrato, de tal manera que la reacción enzimática se puede modelar simplemente
como
(6.22)
La importancia de esta situación radica en el hecho de que la velocidad de reacción depende sólo de [ET]
(recordar la Ecuación 6.16), y es importante satisfacer esta condición si se desea desarrollar un ensayo destinado a
cuantificar la cantidad de actividad enzimática presente, como ocurre en el caso en el que se usa la actividad
enzimática como indicador de la eficacia del proceso.
Puede haber casos en los que las reacciones enzimáticas no se ajusten a la cinética de Michaelis-Menten con-
vencional, bien porque el modelo no sea aplicable, o bien porque la capacidad de ajustar los datos experimentales
al modelo se ve dificultada por otros factores en juego (por ej., inhibición por S, existencia de un inhibidor endógeno
en S, múltiples enzimas catalizando la misma reacción). Estas y otras complejidades se pueden solucionar utilizan-
do técnicas más avanzadas [31,122]. En cualquier caso, el uso de términos tales como la KM se reserva sólo para
situaciones en las que se haya validado el comportamiento según la cinética de Michaelis-Menten; en caso contra-
rio, se recomiendan como análogos los términos S0,5 y K0,5.
En este capítulo no discutiremos otros modelos cinéticos y las relaciones que se aplican con menos frecuencia
a los sistemas enzimáticos en los alimentos. Sin embargo, es importante identificarlos, e incluyen las reacciones
bisustrato con un orden obligatorio o aleatorio de adición de sustratos y/o productos, las reacciones de equilibrio,
y las enzimas alostéricas [31,122].
6.2.5.3 Análisis gráfico de las reacciones enzimáticas

Entre los casos extremos de concentración infinita (saturación) y dilución infinita de S, resulta fácil predecir las
velocidades de las reacciones enzimáticas si se conocen los valores relativos de Vmáx, KM y S; los dos últimos tienen
unidades de molaridad, de tal manera que S puede expresarse como múltiplo de KM (xKM). Y si v se expresa como
una proporción de Vmáx (dividiendo los dos miembros de la Ecuación 6.17 por Vmáx), la expresión de la velocidad de
la reacción enzimática se simplifica a
(6.23)
Si en la Ecuación 6.23 sustituimos «x» por una serie de valores (1, 2, 3, etc., y 0,5, 0,33, 0,2, etc.) se puede
construir una relación típica de cinética enzimática como una función de [S] o [S]/KM, que nos proporciona una
hipérbola rectangular (Fig. 6.9; una asíntota es Vmáx, mientras que la otra se produce a un valor biológicamente
irrelevante de –1 para el cociente [S]/KM). Esta figura muestra hasta que punto la reacción es de primer orden con
respecto a [S] con una pendiente de la tangente dibujada hacia la dilución infinita de [S] equivalente a Vmáx/KM como
predice la Ecuación 6.19. La reacción se aproxima al orden cero a medida que [S] aumenta y nos acercamos a la
saturación de la enzima. Además, puede construirse una gráfica así una vez se hayan determinado Vmáx y KM para una
reacción enzimática, y debería haber un buen ajuste entre el comportamiento observado y el predicho. Si no ocurre
así, quiere decir que la enzima no se comporta de un modo estricto de acuerdo con el modelo de Michaelis-Menten, lo
que sugiere que la reacción tiene una naturaleza más compleja*.
* Muchas reacciones enzimáticas complejas, tales como las reacciones multisustrato, exhibirán una cinética típica hiperbólica en la
medida en la que sólo un sustrato sea limitante, o variable, para la reacción, de tal manera que se comporta cinéticamente como una
reacción monosustrato o de «pseudo primer orden».
Figura 6.9 Cinética de Michaelis-Menten (hiperbólica). Se asume que la hipotética enzima tiene una Vmáx de 52 μmol/min y
una KM de 2,2 mM. Los símbolos huecos muestran los datos representados sobre el eje formado por la ordenada izquierda y la
abscisa inferior; los símbolos rellenos muestran los datos representados sobre el eje formado por la ordenada derecha y la abscisa
superior. La gráfica curva representa un ajuste de regresión no lineal.
La determinación de Vmáx (proporcional a kcat) y KM es importante para cualquier enzima de interés, puesto que
son estos dos términos los que permiten predecir lo rápida que va a ser la catálisis en un rango de condiciones de E
y S. Una aplicación particularmente útil de los parámetros cinéticos en el procesado de los alimentos deriva de la
forma integrada de la expresión de velocidad de Michaelis-Menten:
(6.24)
donde
So es la concentración inicial de sustrato
S es la concentración de sustrato a tiempo t.
El tiempo necesario para la conversión de una cantidad deseada (X) de sustrato [X = (So – S)/So] es:
(6.25)
Esta relación puede proporcionar una estimación razonable de cuanta enzima (término Vmáx) debe añadirse para
alcanzar una amplitud específica de reacción dentro de un período de tiempo específico (tal como en una situación
de procesado). Esta ecuación sólo puede proporcionar estimaciones aproximadas, puesto que existen muchas razo-
nes por las que la actividad enzimática puede apartarse del curso predicho; tales razones incluyen el agotamiento
de un correactante/sustrato, la inhibición por el sustrato, la desactivación progresiva de la enzima y el cambio de las
condiciones que afectan al progreso de la reacción, entre otras.
Las constantes de velocidad derivadas de la ecuación de Michaelis-Menten tienen otros significados. La cons-
tante de primer orden kcat tiene relación únicamente con el comportamiento de ES y otras especies similares (otros
intermediarios, más el complejo enzima-producto EP). Recordemos que esta constante también se denomina nú-
mero de renovación de la enzima. KM, la constante de Michaelis, a menudo recibe el nombre de constante de
disociación aparente, porque esta constante puede ser representativa del comportamiento de múltiples especies
unidas a la enzima (ver la Fig. 6.3 como ejemplo). La denominación «aparente» también deriva de que KM a
Enzimas 379
Figura 6.10 Curvas de progreso de las reacciones enzimáticas

en función de [S]. El progreso de las reacciones se basa en los
parámetros enzimáticos hipotéticos que aparecen en la leyenda de
la Figura 6.9 y aparece representado con líneas continuas y sím-
bolos. Las tangentes a la velocidad inicial o a la porción «lineal»
de las curvas aparecen representadas con líneas discontinuas de
puntos.
menudo se determina a través de datos experimentales generando gráficas de v versus [S] y no por determinación
directa de constantes de velocidad compuestas (k1, k–1, kcat). KM es la concentración de sustrato a la cual la enzima
reacciona a una velocidad equivalente a la mitad de la Vmáx y a la que la enzima está saturada a la mitad por el
sustrato. KM es en teoría independiente de [E], aunque pueden darse comportamientos anómalos, particularmente
en sistemas enzimáticos concentrados y complejos. Por último, la comparación de KM con [S] en una matriz ali-
mentaria puede ser bastante reveladora. Los metabolitos intermediarios en los sistemas celulares están presentes a
menudo en concentraciones en el rango de KM; así, esto permite un control fino de la reacción en la que la actividad
puede aumentar o disminuir con un cambio ligerísimo de [S] [131]. En contraste, si [S] >> KM en los sistemas
celulares, esto implica que tiene que existir alguna barrera para la actividad de la enzima sobre ese sustrato (tal
como una separación física o «compartimentalización») para que persista la condición de [S] >> KM. Aunque el
valor de KM para muchas enzimas y sus sustratos está en el rango de 10–6-10–2 M, algunos valores de KM pueden ser
bastante elevados, tales como los 40 mM de la glucosa oxidasa para la glucosa, 250 mM de la xilosa (glucosa)
isomerasa para la glucosa, y 1,1 M de la catalasa para el H2O2 [154]. La constante de velocidad aparente de
segundo orden kcat/KM (proporcional a Vmáx/KM) está relacionada con propiedades de la enzima libre (recuérdese la
Ecuación 6.20) y también se denomina «constante de especificidad». La magnitud de esta constante no puede ser
mayor que ninguna otra constante de segundo orden en el sistema enzimático y, como tal, representa un valor
mínimo de la constante de asociación (paso k1 en la Ecuación 6.9) en un sistema enzima-sustrato.
6.2.5.3.1 Características críticas de los ensayos enzimáticos

Mientras que el conocimiento de las características cinéticas de las reacciones enzimáticas ayuda a dirigir su
uso y control en las matrices alimentarias, es igualmente importante el conocimiento de cómo obtener tales cons-
tantes con precisión y fiabilidad. El enfoque tradicional consiste en tomar datos observados experimentalmente
sobre cómo la velocidad de reacción (v) varía con [S] (como en la Fig. 6.9). La marcha de la reacción puede
monitorizarse utilizando métodos continuos o discontinuos, en los que P se va acumulando a lo largo del tiempo,
para obtener un conjunto de datos sobre la velocidad de reacción (Fig. 6.10). Una de las cuestiones más críticas
consiste en asegurarse de que se están midiendo velocidades lineales o velocidades iniciales (vo), puesto que las
expresiones de velocidad desarrolladas tomando como base los modelos de Michaelis-Menten (y muchos otros
modelos enzimáticos) sólo son válidas para un nivel inicial específico de sustrato [So] y no a medida que [S]
disminuye. En la práctica, esto se consigue permitiendo que no se consuma más del 5-10% de la [S] original
durante el período de observación [30]. Esto es especialmente importante a una [S] inicial baja ([So] < KM) donde la
velocidad de reacción se aproxima a una cinética de primer orden con respecto a [S]. Incluso en este caso, se puede
todavía estimar la velocidad lineal o vo trazando una tangente y linearizando el tramo inicial de la curva de progre-
so de la reacción (ver Fig. 6.10). En condiciones de ([So] >> KM) existe una menor oportunidad de que la reacción
se desvíe de la linealidad puesto que la reacción permanecerá próxima al orden cero con respecto a [S] incluso tras
un agotamiento del sustrato >10% de [So]. Además de las complicaciones derivadas de la dependencia de las
velocidades de reacción cuando [S] < KM, se observa un mayor grado de error cuando se miden velocidades de
reacción más lentas dentro de un rango de [S], debido a las limitaciones de sensibilidad del método (analítico) de
ensayo.
6.2.5.3.2 Estimación de KM y Vmáx

Una forma común de estimar KM y Vmáx a partir de datos experimentales de velocidad consiste en usar cualquie-
ra de las tres transformaciones lineales de la expresión original de velocidad de Michaelis-Menten (Ecuación 6.17,
Fig. 6.11). Aunque estas transformaciones adoptan diferentes formas, son equivalentes matemáticamente y, si se
emplean datos precisos, deberían dar resultados idénticos. Sin embargo, todas las observaciones experimentales
llevan errores implícitos y estos errores permiten distinguir las fortalezas y debilidades de estos métodos lineales
alternativos. La transformación lineal más usada (y también la más mal usada) es la representación doble recíproca
(Lineweaver-Burk) [46,57]. La principal limitación de esta representación radica en que se da el mayor peso a los
puntos procedentes de los datos más débiles de la serie (por ej., las menores [S] estudiadas son las que están sujetas
al mayor % de error), y el grado de incertidumbre (error, a lo largo del eje Y) todavía resulta más amplificado por la
Figura 6.11 Gráficas de transformación lineal e hiperbólica de los datos de velocidad enzimática. (a) Hiperbólica (b) Lineweaver-
Burk (c) Eadie-Scatchard (d) Hanes-Woolf. Las hipotéticas observaciones experimentales realizadas para una enzima con
parámetros cinéticos que se aproximan a los mostrados en la leyenda de la Figura 6.9 aparecen ajustadas en las gráficas que
presentan líneas continuas y símbolos en negrita. Las ecuaciones de todas las gráficas lineales están expresadas en la forma de
y = mx + b. Las gráficas representadas mediante líneas discontinuas de puntos y rayas corresponden a los tipos de inhibición
modelados en la Figura 6.12 y asumiendo la presencia de un inhibidor y valores de KI de 0,8 mM y 0,5 mM, respectivamente,
para una inhibición competitiva (Comp) y no competitiva (No C). La gráfica representada por una línea discontinua localizada
por debajo de la gráfica de línea continua en el recuadro (b) se corresponde a una reacción sin inhibición corregida para los
puntos procedentes de datos «atípicos» observados para las concentraciones más bajas de sustrato evaluadas; este punto corres-
pondiente a un valor «atípico» se identifica en el recuadro (c).
Enzimas 381
naturaleza recíproca de las coordenadas (Fig. 6.11b). Por lo tanto, incluso un pequeño error o imprecisión puede
influir enormemente en la localización de la línea de regresión. Siendo justos, Lineweaver y Burk reconocieron que
se debe llevar a cabo una «ponderación» apropiada de las coordenadas, pero esto generalmente se ignora en la
actualidad. La representación de Hanes-Woolf es opuesta a la representación doble recíproca en cuanto a que
deposita mayor énfasis (peso) sobre los puntos obtenidos a partir de los datos menos afectados por errores (los
obtenidos a las [S] más elevadas de la serie) (Fig. 6.11d). Sin embargo, esto también crea sesgos gráficos dentro de
la serie de datos hacia la porción de la curva en que [S] > KM. Finalmente, la representación de Eadie-Scatchard
deposita un peso similar sobre cada punto de los datos de la serie, pero adolece de un error (incertidumbre) que se
halla en los dos ejes, puesto que la variable dependiente (vo) constituye un factor en ambos (Fig. 6.11c). Esta
representación lineal también tiene utilidad por el hecho de que permite una identificación más fácil de puntos
procedentes de datos «atípicos» que las otras representaciones (se destaca el punto de la vo menor).
Con independencia de la representación gráfica que se use, la serie de datos utilizados debe incluir observacio-
nes que incluyan un buen balance de valores de [S] por encima, por debajo y próximos a KM [31,122]. Esto evita
que la serie de datos esté sesgada bien hacia la región superior o bien hacia la inferior de la curva hiperbólica
(Fig. 6.9). De un modo más preciso, se trata de la respuesta de la velocidad de reacción en la región donde el valor
de [S]/KM varía entre 0,2 y 4, que es la más importante y sirve para definir la curvatura de la gráfica y cómo la
velocidad depende de [S]. Las transformaciones lineales no son la única manera de estimar las constantes cinéticas
de las reacciones enzimáticas. Los datos experimentales pueden ajustarse a una hipérbola rectangular, un ajuste
específico de regresión no lineal (Ecuación 6.17; Figs. 6.9 y 6.11a) para obtener valores estimados de KM y Vmáx
directamente a partir del conjunto de datos originales (y no transformados). Esta curva también permite la estima-
ción visual razonable de KM y Vmáx y comprobar cómo de bien se aproximan los datos reales a la curva ajustada.
Las representaciones lineales también tienen utilidad en la caracterización de la acción de los inhibidores (I) de
las reacciones enzimáticas (Fig. 6.11, gráficas con líneas discontinuas). Los dos tipos comunes de inhibición son la
competitiva y la no competitiva (Fig. 6.12). Los inhibidores competitivos tienen estructuras que se parecen a las de
los sustratos e interfieren en la unión de S en el sitio activo, haciendo que la reacción enzimática se comporte como
si tuviera valores elevados de KS o KM (sin afectar al paso de kcat o al valor de Vmáx). Por otra parte, los inhibidores
no competitivos no interfieren en la unión del S (no tienen efecto sobre los valores de KS o KM), pero «envenenan»
eficazmente la enzima reduciendo la Vmáx en una proporción equivalente a la cantidad de enzima que se halla unida
al inhibidor ([EI] + [ESI]) a una [I] determinada y a la respectiva constante de disociación del inhibidor (KI) en el
sistema. El efecto de un inhibidor competitivo puede atenuarse añadiendo un exceso de [S] para sobrepasar en
concentración al inhibidor y tirar del equilibrio de la reacción hacia ES, y ES → E + P. En contraste, en el caso del
inhibidor no competitivo esto no ocurre puesto que el inhibidor puede unirse tanto a E como a ES, y, por lo tanto,
la cantidad de [EI + ESI] no se ve afectada por [S] a una [I] determinada. Una inspección detenida de las correspon-
dientes pendientes e intersecciones de las líneas que representan los dos tipos de inhibición en las representaciones
lineales (Fig. 6.11, recuadros del b al d) revela que en la inhibición competitiva Vmáx permanece constante mientras
KM aumenta, y que en la inhibición no competitiva Vmáx disminuye y KM permanece constante, siempre en compa-
ración con las reacciones que transcurren sin inhibición. Las ecuaciones para obtener los valores de KI en estos
tipos de inhibición aparecen en la Figura 6.12, y los valores de KM y Vmáx resultan modificados por el factor (1 + [I]/KI)
según corresponda [31,122].
Otros tipos de inhibición menos comunes incluyen los inhibidores suicidas (sustratos), que se unen al sitio
activo y son transformados por la enzima en un derivado que reacciona con la enzima inactivándola, y los inhibidores
incompetitivos, que sólo se unen a ES e inhiben la acción enzimática. Las informaciones referidas a la inhibición
incompetitiva deben manejarse con gran escepticismo, dado que existen sólo unos pocos casos documentados de
este tipo de comportamiento [31].
6.2.6 ESPECIFICIDAD Y SELECTIVIDAD DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA [43]
Aunque los términos especificidad y selectividad a menudo se usan como equivalentes, ambos términos están
relacionados de distinta manera con el poder discriminatorio de la acción enzimática. Las enzimas pueden discri-
Figura 6.12 Modelo para las inhibiciones

simples (a) competitiva y (b) no competitiva
de las reacciones enzimáticas.
minar entre sustratos competidores en base a diferencias en las afinidades de unión y en la facilidad para la catáli-
sis. Una enzima puede ser específica si reacciona sólo con sustratos que presenten un cierto tipo de enlace (por ej.,
peptídico, éster, glucosídico) o grupo químico (por ej., aldohexosa, alcohol, pentadieno), y una enzima puede
presentar una especificidad (casi) absoluta cuando cataliza una única reacción química en un sustrato/unos sustratos
definido/s. Además, las enzimas pueden también presentar especificidad por el producto y especificidad
estereoquímica. Así pues, se puede considerar que el término especificidad denota la naturaleza general y/o exclu-
siva del tipo de reacción enzimática catalizada. El término selectividad se refiere a la preferencia relativa o reacti-
vidad de una enzima hacia sustratos similares que son competidores y viene determinada por los valores del co-
ciente Vmáx/KM (Sección 6.2.5). Para el lector ocasional, puede ser aceptable el uso de los términos especificidad y
selectividad como equivalentes.
6.2.6.1 Patrones de especificidad de determinadas enzimas alimentarias

6.2.6.1.1 Enzimas proteolíticas
Algunos de los primeros trabajos (considerados clásicos) realizados sobre el papel de los sitios no catalíticos de
las enzimas implicados en el reconocimiento del S fueron realizados en la papaína (EC 3.4.22.2), la cisteín proteasa
procedente del látex de la papaya con aplicación comercial como agente ablandador de la carne. Utilizando una
serie de sustratos peptídicos sintéticos, se «mapearon» diferentes sitios de la enzima y de los sustratos [118,119], y
se infirió la base de la selectividad enzimática a partir de la reactividad relativa de los miembros de este conjunto de
sustratos (Fig. 6.13). El protocolo que se desarrolló se aplica ahora a todas las reacciones proteasa-péptido. Se
considera el enlace escindible de los sustratos peptídicos aquel que une los residuos P1 y P1’, mientras que los otros
residuos aminoácido del sustrato se denominan como P2, P3, …, Pi hacia el extremo N-terminal y P2’, P3’, …, Pi’
hacia el extremo C-terminal. Los sitios correspondientes de la papaína que interaccionan con los subsitios del
sustrato se denominan S y S’ con los mismos códigos numéricos que los residuos del sustrato correspondientes.
Mientras que la serie de residuos P del sustrato se corresponden con aminoácidos individuales, un único o diversos
residuos de aminoácidos pueden integrar y compartir el mismo «espacio» Sx en la enzima e interaccionar de modo
colectivo con el correspondiente residuo del sustrato. Los datos de selectividad usados para «mapear» los residuos
importantes de la papaína se muestran también en la Figura 6.13.
Aunque se considera que la papaína tiene una selectividad amplia para hidrolizar enlaces peptídicos, este estu-
dio mostró una clara preferencia por los sustratos con PHE (un residuo aromático y no polar) en el sitio P2 del
sustrato (no se incluyeron en la figura otros sustratos examinados). Por consiguiente, aunque PHE no forma parte
del enlace peptídico hidrolizado, la enzima muestra una preferencia en el reconocimiento de PHE en el sitio S2 y
esto dicta el enlace peptídico que resulta elegido como enlace escindible. Se infiere que el «espacio» del subsitio S2
en la papaína está ocupado por residuo(s) igualmente hidrofóbico(s), y que la interacción entre los residuos P2 y S2
Enzimas 383
Figura 6.13 Mapeo a través de sustratos del sitio activo de la

papaína a través de análisis cinéticos utilizando sustratos peptídicos.
(Los datos se seleccionaron y la figura se adaptó de Schechter, I.
and Berger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 157, 1967;
Schechter, I. and Berger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 32,
898-912, 1968). Los autores normalizaron las velocidades de reac-
ción, puesto que la reactividad de los sustratos se determinó por
análisis de punto final tras distintos tiempos de incubación (no se
midieron las velocidades iniciales). La flecha y la línea discontinua
indican el registro de los enlaces peptídicos escindibles.
realiza una gran contribución a la selectividad de la papaína hacia los enlaces peptídicos hidrolizados. El sitio
activo de la papaína está formado por una hendidura profunda, situándose los residuos catalíticos CYS25 y HIS159
en los bordes opuestos de la hendidura [126]. Hasta siete residuos no polares de ambos lados de la hendidura están
implicados en la integración del espacio S2 de la papaína. Comparativamente, las serín proteasas ante todo exhiben
selectividad de sustrato a través de interacciones en el/los subsitio(s) S1/P1, y los residuos de aminoácidos críticos
y la selectividad resultante hacia el enlace de la tripsina, quimotripsina y elastasa están conferidos en gran parte por
factores estéricos y electrostáticos tal como se muestra en la Figura 6.14.
Quizás ninguna enzima sea tan conocida en cuanto a su selectividad de reacción como la proteasa ácida quimosina
(EC 3.4.23.4, también denominada renina), utilizada de modo exclusivo en la fabricación del queso. La prepara-
ción bruta de la enzima, denominada «cuajo», que se obtiene del estómago de los terneros jóvenes, es muy selecti-
Quimotripsina Tripsina Elastasa
Figura 6.14 Bolsillos de unión del sustrato de las serín proteasas. Se observa una preferencia de unión de la cadena lateral del
aminoácido P1 con las cadenas laterales de otros aminoácidos situados en los sitios de la enzima 216, 226 y 189 en los bolsillos
de unión. (Adaptado de Fersht, A., Enzyme Structure and Mechanism, 2nd edn., W.H. Freeman & Company, New York, 1985;
Whitaker, J.R., Principles of Enzymology for the Food Sciences, 2nd edn., Marcel Dekker, New York, 1994).
va en la hidrólisis del enlace PHE105-MET106 de la κ-caseína durante la etapa inicial de coagulación de la leche en
la fabricación de queso. Los estudios cinéticos de la acción de la quimosina sobre péptidos sintéticos que modela-
ban porciones del sustrato κ-caseína revelaron los factores responsables de su selectividad (Tabla 6.4). Primera-
mente, se observó que la quimosina es una endopeptidasa selectiva con el tamaño de su sustrato, exigiendo para
mostrar actividad al menos un pentapéptido en el que ni PHE ni MET sean residuos terminales (datos no mostrados
en la Tabla 6.4). Así pues, la reactividad con los fragmentos peptídicos (a) y (b) representa una referencia o nivel
basal para la actividad de la quimosina sobre el enlace PHE-MET en los péptidos con un tamaño mínimo. El
aumento del tamaño del péptido hacia el C-terminal de la κ-caseína (sustratos del c al g) aumenta la selectividad de
la reacción (kcat/KM) frente al enlace PHE-MET en 2-3 órdenes de magnitud en relación con el sustrato (b), con un
mayor impacto sobre la elevación de kcat que sobre la reducción de KM, aunque se ven afectados ambos parámetros.
Esto demuestra la importancia del papel que tienen los residuos ILE-PRO-PRO108-110 en el reconocimiento del
sustrato y especialmente en la estabilización del estado de transición, jugando un papel fundamental la rigidez de
los residuos de PRO, imponiendo quizás un estado de deformación/distorsión. En el caso de la κ-caseína completa,
PRO puede ayudar a exponer el enlace escindible a la acción de la proteasa (Capítulo 14). Igualmente, el aumento
del tamaño del péptido sustrato hacia el extremo N-terminal (sustratos (h) e (i)) aumenta más la selectividad en
2 órdenes de magnitud. Esto se lleva a cabo casi exclusivamente por aumento de la afinidad (unión) del sustrato
hacia la enzima, puesto que KM disminuye, mientras que hay un pequeño cambio en kcat. El clúster formado por los
residuos HIS98,100,102 que están cargados positivamente al valor de pH al que transcurre la reacción ayuda a «conge-
lar» el sustrato en el sitio activo coordinándose con los grupos electronegativos correspondientes de la enzima en
los subsitios S8-S6-S4, proporcionando una atracción electrostática. Este ejemplo demuestra cómo la estructura del
sustrato puede aumentar la selectividad de la reacción a través de un amplio rango de interacciones con la enzima,
en este caso aumentando la selectividad (kcat/KM) en ~5 órdenes de magnitud hacia el enlace a escindir. Este
ejemplo también explica porqué ha sido tan complicada la identificación y el uso de «cuajos microbianos» (susti-
tutos de la quimosina) para la fabricación de queso, puesto que estas proteasas alternativas generalmente muestran
menores valores de la ratio capacidad coagulante de la leche/actividad proteolítica (0,10-0,52) que la quimosina
(1,4), y esto provoca que se siga produciendo una degradación de la cuajada (comprometiendo la calidad de la
textura) y un amargor indeseable a medida que el queso va madurando [73].
TABLA 6.4
Interacciones enzima-sustrato involucradas en la selectividad de la quimosina hacia el enlace PHE-MET de la κ-caseína.
κ-caseína 100 Péptido 110 kcat kM kcat/KM

105 ↓ 106 (s–1) (mM) (s–1 mM–1)
Ref His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys
a Ser-Phe-Met-Ala-Ile-OMe 0,33 8,5 0,04
b Leu-Ser-Phe-Met-Ala-OMe 0,58 6,9 0,08
c Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-OMe 18,3 0,85 21,6
d Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-OMe 38,1 0,69 55,2
e Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-OMe 43,3 0,41 105
f Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-OH 33,6 0,43 78,3
g Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-OH 29,0 0,43 66,9
h His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-OH 66,2 0,026 2.510
i His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-OH 61,9 0,028 2.210
Fuente: Visser, S., Neth. Milk Dairy J. 35, 65, 1981.
Enzimas 385
6.2.6.1.2 Glucosil hidrolasas (Glucosidasas) [126,154,159]

Las glucosil hidrolasas actúan sobre los enlaces glucosídicos en los di, oligo y polisacáridos. La naturaleza y
amplitud del reconocimiento enzima-sustrato y el mapeo de los subsitios se han estudiado muy bien en este grupo
de enzimas. Son ejemplos de ello la glucoamilasa, una exohidrolasa que actúa liberando unidades de glucosa a
partir del extremo no reductor de los maltooligosacáridos lineales unidos por enlaces α-1→4; la lisozima, una
endohidrolasa que reconoce una secuencia repetida del heterodímero de [N-acetilglucosamina (NAG) → Ácido N-
actetilmurámico (NAM)]n unido por enlaces α-1→4; y la α-amilasa, una endohidrolasa que rompe al azar segmen-
tos de [glucosa]n lineales unidos por enlaces α-1→4 en la molécula del almidón (Fig. 6.15). De un modo análogo
a lo realizado en el mapeo del sito activo de las proteasas, los subsitios de unión al sustrato de la glucosil hidrolasa
se mapean como (–n…–2, –1, +1, +2…+n) [35]. La hidrólisis tiene lugar en el enlace glucosídico establecido entre
el residuo que suministra el grupo carboxilo localizado en el subsitio –1 y el que suministra el grupo alcohol
localizado en el subsitio +1. La interacción enzima-sustrato en uno o en estos dos subsitios (especialmente en –1)
Figura 6.15 Mapeo de los subsitios del sustrato de las glucosil hidrolasas mediante análisis cinéticos. Se analizó la actividad
de (a) la glucoamilasa y (c) la α-amilasa frente a un conjunto de oligómeros de glucosa que tenían entre 1 y 7 unidades de glucosa
unidas por enlaces α-1→4. La maltosa es el sustrato más pequeño para ambas enzimas, pero la glucosa es capaz de unirse a la
enzima en el caso de la glucoamilasa. En el caso de la glucoamilasa, las constantes cinéticas varían coincidiendo con el aumento
del tamaño del sustrato desde –1 hasta n; en el caso de la α-amilasa, las constantes cinéticas varían coincidiendo con el DP de los
oligómeros; en el caso de la lisozima (b) la constante cinética corresponde a sustratos modelo en los que G = N-acetilglucosamina
y M = ácido N-acetilmurámico. Las estimaciones de ΔGS son las coincidentes con cada subsitio y las flechas indican el enlace
escindible. (Datos tomados de Christophersen, C. et al., Starch/Stärke, 50(1, Suppl), 39, 1998; Meagher, M.M. et al., Biotechnol.
Bioeng., 34, 681, 1989; Nitta, Y. et al., J. Biochem., 69, 567, 1971).
puede contribuir a un cambio desfavorable de energía libre de asociación (+ΔGS). Esto sería lo esperable, puesto
que los enlaces que van a ser transformados dentro del sustrato necesitan ser elevados hasta un estado de transi-
ción. En cambio, la interacción en los subsitios que rodean al/los residuo(s) que resultan transformados contribuye
a la variación favorable (negativa) de la energía de unión, y esta energía de unión puede usarse para facilitar la
catálisis. La extensión de la interacción entre los subsitios del sustrato y la enzima se mapeó hasta que el aumento
de la longitud del sustrato hacia los subsitios +n o –n no tuvo incidencia sobre los parámetros catalíticos. En el caso
específico de la glucoamilasa (Fig. 6.15a), los sitios que van del +1 al +3 aumentan de modo particular tanto la
unión como la catálisis, mientras que otros sitios sirven para aumentar la unión y tienen escaso efecto sobre la
catálisis.
En el caso de la lisozima (Fig. 6.15b), las interacciones con los residuos en los subsitios –2 y +1 son igualmente
esenciales para el aumento de la reactividad, pero incluso las interacciones que tienen lugar en los subsitios más
remotos de –4 y +2 tienen efectos considerables en la catálisis [43,151,159]. Los puentes de hidrógeno constituyen
un factor principal en el reconocimiento enzima-sustrato, especialmente entre los residuos –4/–3 del sustrato y la
ASP101. La estructura del sustrato es también importante y en el subsitio –1 se prefiere el residuo NAM comple-
to, que es más voluminoso; las mitades lactil del NAM presentan un impedimento estérico para ocupar los
subsitios –4, –2 y +1 de unión a la enzima. En el caso de la α-amilasa (Fig. 6.15c), los residuos inmediatamente
adyacentes (–2/+2) a la unidad de maltosa a escindir (–1/+1) proporcionan una mayor –ΔGS para la unión y una
aceleración de la catálisis. Un mayor grado de polimerización (DP) continúa aumentando la unión (KM) más que la
catálisis (kcat). En los tres ejemplos, las interacciones enzima-sustrato remotas proporcionan la energía necesaria
para estabilizar el estado de transición en el sitio activo.
6.2.6.1.3 Enzimas que transforman lípidos

En las lipasas, existen sitios de unión para ambas mitades (acilo y alcohol) del enlace éster que va a ser hidrolizado,
y cada sitio posee dos subsitios (Fig. 6.16a) [63]. Estos sitios están recubiertos por residuos hidrofóbicos y la
selectividad está en gran parte conferida por el volumen de los bolsillos de unión. Por ejemplo, los tamaños de los
subsitios acilo grande (LA) y mediano (MA) de la lipasa de Candida rugosa son compatibles con los tamaños
respectivos de los grupos n-acilo C8 y C4 (Fig. 6.16b; [96]), dando lugar a la preferencia marcada en términos de
reactividad por esos grupos acilo (pero no por el grupo n-acilo C6 que está estrechamente relacionado). Muchas
lipasas presentan óptimos múltiples para la longitud de la cadena del ácido graso [2,74,108]. El grupo alcohol del
sustrato éster se une a un sitio expuesto al solvente comprendido por los subsitios que albergan los grupos grandes
(Lalc) y medios (Malc) constitutivos de la mitad alcohol (y grupo saliente; Fig. 6.16a). Al menos tres residuos de
aminoácidos de las lipasas (adyacentes a los residuos SER/HIS catalíticos y a los grupos amida que estabilizan el
oxi-anión) interaccionan con el grupo Malc para conferir selectividad hacia el grupo alcohol [63]. Otras caracterís-
ticas de los sitios de unión al sustrato de las lipasas, que incluyen características de accesibilidad, volumen y
topografía, confieren regioselectividad hacia los grupos éster (Fig. 6.16c, como sn-1,3-regioespecífico o no especí-
fico), así como selectividad hacia los ácidos grasos (por ej., saturados vs. insaturados) [2,74,108]. La contribución
relativa de todos estos factores de selectividad hacia los grupos acilo y alcohol gobierna la estereoespecificidad
(casi todos los triacilgliceroles mixtos presentan quiralidad), y un estudio realizado utilizando dos sustratos modelo
(trioleína y trioctanoína) muestran el rango de estereoespecificidad entre las lipasas y cómo éste puede estar influi-
do por la estructura del sustrato (Fig. 6.16d).
Son un conjunto amplio de factores los que confieren selectividad a las lipooxigenasas (LOX), las cuales reac-
cionan exclusivamente con el grupo 1,4-pentadieno de los ácidos grasos poliinsaturados, representados por el
ácido linoleico (18:29c,12c) [88]. La selectividad posicional (regioselectividad) en la oxigenación del ácido
araquidónico (20:45c,8c,11c, 14c) se ha convertido en una de las bases para clasificar las lipooxigenasas (como 5-LOX,
8-LOX, 9-LOX, 11-LOX, 12-LOX, 15-LOX). Las lipooxigenasas poseen dos cavidades que dan acceso al sitio
activo. Una cavidad larga, en forma de embudo, está recubierta por residuos hidrofóbicos con ILE553 y TRP500
controlando el acceso de O2 al sitio activo [88,105]. La otra cavidad está también recubierta por residuos neutros e
hidrofóbicos y se dobla para formar una «U» o un bolsillo en forma de «bota» cerca del centro activo, el cual aloja
el sustrato ácido graso (Fig. 6.17). Las lipooxigenasas son selectivas en la oxigenación del carbono del pentadieno
en las posiciones [–2] o [+2] a partir del carbono metilénico (sitio de la abstracción del H), considerado en relación
Enzimas 387
Figura 6.16 Características de la selectividad de sustrato de las lipasas. (Datos y figuras adaptados de Kazlauskas, R.J., Trends
Biotechnol., 12, 464, 1994; Parida, S. and Dordick, J.S., J. Org. Chem., 58, 3238, 1993; Rogalska, E. et al., Chirality, 5, 24,
1993). Los cuadros indican: (a) sitios de reconocimiento del sustrato, (b) selectividad hacia la longitud de la cadena acilo, (c)
numeración estereoespecífica en los glicerolípidos, (d) estereoespecificidad de algunas lipasas frente a sustratos modelo. El
diferente relleno de las barras en el cuadro (b) denota diferentes sesgos estéricos en la reacción entre los diferentes sustratos
ácidos grasos rac-α-hidroxilados. La codificación numérica de las lipasas en el cuadro (b) es la que aparece en la Tabla 6.8; en
esta codificación las letras mayúsculas que acompañan a algunos números se refieren a una isoforma de la enzima; LPL, lipasa
de las lipoproteínas de la leche; GL, lipasa gástrica humana; 7Ps, lipasa de Penicillium simplicissimum; 7Pc, lipasa de Penicillium
camemberti.
con el grupo ácido carboxílico terminal. Esto refleja una diferencia básica en la especificidad de producto de la
lipooxigenasa en cómo «cuenta carbonos» basándose en si la orientación preferida de la unión del sustrato es
cuando entra primero en el bolsillo de unión el extremo carboxilato (tipo [–2]) o cuando entra primero el extremo
metilo (tipo [+2]).
El lugar de oxigenación también depende de cuál de los posibles múltiples sistemas 1,4-pentadieno existentes
en la molécula del ácido graso (el 18:39c,12c, 15c tiene dos; el 20:45c,8c,11c,14c tiene tres) se alinee con el hierro del sitio
activo, y esto depende en parte del tamaño del bolsillo de unión con el ácido graso. Los residuos LEU546 e ILE552
posicionan el carbono metilénico del pentadieno alineado con el hierro catalítico. Los bolsillos de unión más
grandes acomodan porciones más grandes del ácido graso sustrato y cambian la selectividad hacia el extremo
carboxílico (tal como en la 5-LOX) para los ácidos grasos que insertan primero el grupo metilo. El tamaño del
bolsillo de unión con el ácido graso está también controlado por los residuos THR709 y SER747 del bolsillo, situados
en el área marcada por la ARG707 en la Figura 6.17. Finalmente, la estereoespecificidad de producto de las
lipooxigenasas (S o R-hidroperóxidos de los ácidos grasos) se basa en un único residuo de aminoácido de la enzima
(por ej., el residuo 542 en el caso de la isoforma 1 de la LOX de la soja), que puede ser ALA (grupo R = CH3) o
GLY (grupo R = H), respectivamente [29]. La ALA542 obstruye estéricamente la adición de O2 al sitio proximal
(pro-R, C-9) y confiere estereoselectividad 13S, mientras que la GLY542 permite la oxigenación en el sitio proximal,
dando lugar a los productos hidroperóxidos 9R (Fig. 6.17). Esta característica es aplicable a todas las lipooxigenasas
Figura 6.17 Sitio activo y (estéreo) selectividad posicional de la lipooxigenasa. (Adaptado de Boyingtonm J.C. et al., Science,
260, 1482, 1993; Coffa, G. and Brash, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 15579, 2004; Newcomer, M.E. and Brash, A.R.,
Protein Sci., 24, 298, 2015; Prigge, S.T. et al., Biochimie, 79, 629, 1997).
analizadas hasta la actualidad [88]. La selectividad de reacción de la LOX también depende de si el ácido graso
está esterificado y en qué forma de agregación (micelas, complejos con detergentes o en forma de sal) y a qué
valores de pH (lo que dicta el grado de ionización del grupo carboxilo) se encuentra. El efecto del pH sobre la
selectividad de producto a menudo se explica en base a un factor de orientación del sustrato [154]. La LOX-1 de la
soja muestra selectividad de producto a un pH óptimo ~9, a cuyo valor se produce preferencialmente el
13-hidroperoxi-octadienoato frente al 9-hidroperoxi-octadienoato en una proporción ~10:1, mientras que a pH ~7
los dos productos se forman en una proporción casi idéntica. A pH 9, el carboxilato ionizado confiere posiciona-
miento al linoleato como se muestra en la Figura 6.17, mientras que a pH 7 el ácido linoleico protonado se puede
unir en la orientación «inversa», la del grupo carboxilo primero, colocando el grupo C-9 en el lugar para la adición
de oxígeno. Este ejemplo muestra cómo la estructura del sustrato puede también influir sobre la selectividad de
reacción.
6.2.6.2 Nomenclatura y clasificación de las enzimas

Puesto que los nombres «triviales» a menudo resultan insuficientes para describir la naturaleza precisa de una
reacción enzimática, las enzimas se denominan y catalogan* de un modo sistemático de acuerdo con reglas de
nomenclatura definidas por la Comisión de Enzimas (EC) de la Unión Internacional de Bioquímicos y Biólogos
Moleculares (IUBMB). Aunque los nombres triviales todavía se usan al referirse a enzimas, la asignación de un
número «EC» elimina la ambigüedad que podría existir sobre la reacción específica que se está describiendo. El
número EC está formado por 4 números enteros separados por puntos, cada uno de los cuales describe alguna
característica de la reacción enzimática catalizada (Tabla 6.5).
El primer número describe la clase general de la reacción. Las hidrolasas (que constituyen la clase 3) son la
clase de enzimas más importantes en los alimentos, seguidas de las oxidorreductasas (clase 1). Los nombres trivia-
les de las enzimas pertenecientes al grupo de las transferasas (clase 2) a veces incluyen el término «sintasa», que no
parece muy distinto del término «sintetasa», siendo este último reservado para las ligasas (clase 6), las enzimas
verdaderamente sintéticas o formadoras de enlaces. Las liasas (clase 4) son enzimas que rompen enlaces mediante
procesos no hidrolíticos, y los nombres triviales de las enzimas que catalizan la reversión de las reacciones «liasa»
pueden incluir los términos «sintasa» e «hidratasa». Las isomerasas (clase 5) provocan una reorganización
intramolecular de los átomos. Los dígitos segundo y tercero profundizan en la identificación de la reacción y del
(de los) sustrato(s) y/o enlace(s) transformados. Las reacciones enzimáticas que no se hallan definidas suficiente-
* El día 1 de enero de 2016 estaban incluidas en la lista 5.684 enzimas: http://www.enzyme-database.org/stats.php.
TABLA 6.5
Reglas y normas de la nomenclatura sistemática para la clasificación de enzimas.
1.º Clase de enzima 2.º Subclase 3.º Sub-subclase 4.º Número de serie para diferenciar Formato
(tipo de selección) sustrato, donador, otro grupo distintivo, enzimas que tienen los tres de la nomenclatura
enlace (ejemplos) sustrato, aceptor, primeros números iguales sistemática
rasgo (ejemplos) (ejemplos, nombres comunes)
1. Oxidorreductasa Grupo en el donador oxidado Aceptor reducido Donador-aceptor

(oxidación- 1. Grupo CH-OH 1. NAD(P) 1.1.1.1 Alcohol deshidrogenasa oxidorreductasa
reducción) 10. Difenol (o relacionado) 3. O2 1.10.3.1 Catecol (difenol) oxidasa
13. Donador único, O2 11. Se incorporan dos átomos de O 1.13.11.12 Lipooxigenasa
14. Par de donadores, O2 18. Se incorpora un átomo de O 1.14.18.1 Monofenol monooxigenasa
2. Transferasa Grupo transferido Grupo caracterizado en detalle Donador-aceptor

(transferencia 3. Grupo acilo 1. Uno distinto del grupo amino 2.3.1.175 Alcohol aciltransferasa transferasa de grupos
de grupos) 2. Grupo amino 2.3.2.13 Transglutaminasa
4. Grupo glucosilo 1. Grupo hexosilo 2.4.1.19 Ciclodextrina glucosiltransferasa
3. Hidrolasa Enlace hidrolizado Clase de sustrato Hidrolasa

(hidrólisis) 1. Ésteres 1. Éster carboxílico 3.1.1.3 Lipasa
2. Glucosidasa 1. O- o S-glucosilo 3.2.1.147 Mirosinasa (tioglucosidasa)
4. Péptido 24. Metalopeptidasa 3.4.24.27 Termolisina
4. Liasa (eliminación) Enlace escindido Grupo eliminado Sustrato grupo liasa

1. C–C 2. Aldehído liasa 4.1.2.32 TMNO aldolasa
2. C–O 2. Actúa sobre polisacáridos 4.2.2.10 Pectín liasa
4. C–S 1. (Ninguno, sólo 23 enzimas) 4.4.1.4 Aliín liasa
5. Isomerasa Tipo de reacción Sustrato, posición, quiralidad Racemasa, epimerasa

(isomerización) isomerasa, mutasa
2. Isomerasa cis-trans 1. (Ninguno, sólo 10 enzimas) 5.2.1.5 Linoleato isomerasa
3. Redox intramolecular 1. Interconversión aldosa-cetosa 5.3.1.5 Xilosa isomerasa
6. Ligasa Enlace sintetizado Sustrato, cosustrato(s) X-Y ligasa (sintetasa)

(formación de enlace) 4. C–C 2. Ácido-aminoácido (péptido) 6.3.2.3 Glutatión sintetasa
Enzimas
Fuente: IUBMB, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/.
389
mente tienen en el tercer dígito el número «99». El último dígito tiene una función «contable» para diferenciar las
enzimas que comparten los mismos tres primeros dígitos, y proporcionando además información sobre alguna
característica de la reacción para distinguirla de las demás enzimas conocidas. En las secciones de este capítulo
expuestas hasta ahora se han proporcionado e identificado varios números EC, mencionando previamente los
nombres específicos de las enzimas aludidas.
6.3 USOS DE ENZIMAS EXÓGENAS EN LOS ALIMENTOS [3,50,139,155]
6.3.1 CONSIDERACIONES GENERALES
La decisión acerca de cuándo emplear un proceso enzimático se basa en varias consideraciones [19,98]. Las
enzimas son la mejor opción cuando: (1) se deben aplicar condiciones de procesado suaves para mantener inalterados
los atributos positivos del alimento (2) los subproductos potenciales de un proceso químico son inaceptables (3) un
proceso químico es difícil de controlar (4) se debe mantener en el producto la denominación «natural» (5) el
alimento o el ingrediente son de valor superior (6) se necesita sustituir o incrementar un proceso químico tradicio-
nal, o (7) se necesita especificidad de reacción. La ratio relativa coste-beneficio también es un factor crítico para
tomar la decisión. Algunas enzimas pueden usarse como preparaciones «inmovilizadas», en las que permanecen
activas fijadas o unidas a matrices o partículas inertes. Esto permite que la enzima sea empaquetada en una colum-
na/biorreactor a través del cual se perfunde el sustrato; también permite que la enzima sea recuperada tras la
reacción en discontinuo con el sustrato, mediante un proceso de filtración o sedimentación, con lo que la enzima
puede usarse de modo repetido hasta que pierda actividad hasta niveles por debajo del aceptable. De esta manera,
los costes imputables a la enzima se reducen proporcionalmente.
Los usos perfectamente establecidos de enzimas exógenas abarcan la producción de ingredientes o artículos
alimentarios, tales como jarabes de maíz, glucosa, jarabes de maíz ricos en fructosa, azúcar invertido y otros edulcorantes,
hidrolizados de proteínas y lípidos estructurados; la modificación de componentes dentro de una matriz alimentaria,
tales como la estabilización de la cerveza, coagulación de la leche (en la fabricación de queso), ablandamiento de la
carne, eliminación del amargor en el zumo de limón, y ablandamiento de la miga de pan; la mejora de procesos, tales
como la maduración del queso, extracción de zumos, clarificación de zumos/vinos, extracción de aceites de frutos y
semillas, filtración de bebidas (cerveza/vino), aceleración del proceso de mezcla de masas, fermentación y estabiliza-
ción de productos de panadería; y el control de procesos, tales como el uso de biosensores o el análisis de componen-
tes en continuo. A continuación, presentaremos los usos más importantes de las enzimas exógenas ordenados aten-
diendo a la naturaleza del componente alimentario que sufre la transformación.
6.3.2 ENZIMAS QUE TRANSFORMAN LOS CARBOHIDRATOS [126,155,159]
La mayoría de las enzimas usadas comercialmente para actuar sobre los carbohidratos de los alimentos son hidrolíticas
y se denominan colectivamente glucosil hidrolasas o glucosidasas. Algunas de estas enzimas pueden catalizar transfe-
rencias de grupos glucosilo y/o la reversión de reacciones hidrolíticas en procesos alimentarios en los que los niveles
de sustrato son a menudo elevados (30-40% de sólidos) debido a los efectos de la ley de acción de masas. Este grupo
de enzimas suponen aproximadamente la mitad de las enzimas usadas (en términos de coste) como auxiliares del
procesado en la industria alimentaria, fundamentalmente para la producción de edulcorantes y agentes de volumen/
espesantes (dextrinas) a partir del almidón, y para la modificación de los carbohidratos en algunos usos en panadería.
Las aplicaciones especiales de varias glucosidasas continúan emergiendo en la actualidad.
Algunas propiedades generales de este grupo de enzimas son perfectamente conocidas como consecuencia del
análisis estructural y de la secuencia de miembros de más de 60 familias de glucosidasas que han sido definidas en
base a sus secuencias. Las glucosil hidrolasas actúan sobre los enlaces glucosídicos, y las enzimas de este grupo
Enzimas 391
comparten muchas propiedades estructurales y catalíticas. Muchas de las glucosidasas son proteínas multidominio,
donde una porción de la proteína actúa como unidad catalítica y otros dominios tienen funciones alternativas,
siendo una de ellas la de unir los sustratos polisacáridos extendidos. Los sitios activos de las glucosidasas contie-
nen residuos duales carboxilo/carboxilato (ASP/GLU) de modo similar a lo que se mostró para el mecanismo de la
lisozima (Ecuación 6.8). Mecanísticamente, este grupo de enzimas funciona por un mecanismo de catálisis general
ácido-base y/o catálisis nucleofílica (con asistencia de efectos electrostáticos y/o de deformación/distorsión). En
todos los casos, un residuo ácido dona un H+ al átomo O del enlace glucosídico para dar lugar a un ion oxocarbenio
como estado de transición (Fig. 6.18). El residuo carboxilato, o bien desprotona y activa el agua generando el
nucleófilo –OH para completar la hidrólisis, o bien actúa directamente como un nucleófilo y forma un intermedia-
rio covalente; en ambos casos, el residuo alcohol se libera como grupo saliente.
Las glucosidasas se pueden clasificar en dos tipos, «conservador» e «inversor», en base al destino de la configu-
ración anomérica (α o β) del enlace glucosídico que hidrolizan (Fig. 6.18). Las del tipo «inversor» presentan una
mayor distancia entre los residuos ácidos catalíticos (~9,5Å), lo que permite a la molécula de agua activada
(nucleófilo) el acceso al sitio anomérico alternativo en relación con el sitio de liberación del ROH a partir del
enlace glucosídico. Las del tipo «conservador» tienen un espacio menor entre los residuos catalíticos (~5,5Å), con
lo que el agua entra en el sitio activo sólo después de que el grupo alcohol liberado lo haya abandonado (lo que se
denomina una reacción de doble desplazamiento). En el mecanismo de la reacción «conservadora», el intermedia-
rio covalente glucosil-enzima formado con el residuo carboxilato sirve para dirigir el agua (transformada en un
nucleófilo por el residuo que actúa como una base general eliminando H+) hacia la misma posición anomérica que
ocupaba el grupo ROH saliente y, por lo tanto, la configuración anomérica se «conserva». Únicamente las
glucosidasas conservadoras catalizan tanto las reacciones de hidrólisis como las de transferencia de glucosilo,
mientras que las del tipo inversor sólo catalizan reacciones de hidrólisis. Otro criterio de diferenciación entre las
Inversor
Conservador
Figura 6.18 Diversidad mecanística entre las glucosil hidrolasas. (Adaptado de Sinnott, M. (Ed.), Comprehensive Biological
Catalysis. A Mechanistic Reference, Vol. I, Academic Press, San Diego, CA, 1998).
glucosidasas es su modo de actuación, según sean «endo» o «exoglucosidasas». Los tipos «exo» unen su sitio
activo a la porción terminal del sustrato (mayoritariamente, pero no siempre, al extremo no reductor) y eligen en él
el enlace a escindir, mientras que las «endo» atacan al azar los enlaces glucosídicos interiores del sustrato. La
denominación trivial de las glucosidasas como «α» o «β» (como en el caso de las amilasas o glucosidasas) se
refiere a la configuración anomérica del grupo reductor liberado, según sea axial o ecuatorial, respectivamente. En
la Tabla 6.6 se ofrece un resumen de los tipos y clasificación de las glucosidasas de mayor importancia en los
alimentos. El mapeo del sitio activo/sustrato ya se trató con anterioridad (Fig. 6.15); puede observarse que el enlace
glucosídico escindible se encuentra en los subsitios –1/+1. Con pocas excepciones, uno o dos residuos hidrofóbicos
de la enzima interaccionan con el grupo C5-hidroxil-metilénico del residuo –1 del sustrato para proporcionar una
«plataforma hidrofóbica» que estabiliza el estado de transición [87].
6.3.2.1 Enzimas que transforman el almidón

Las enzimas que actúan sobre el almidón se usan fundamentalmente para aplicaciones básicas, tales como la
producción de jarabes de maíz, dextrinas, jarabe de maíz rico en fructosa, y otros edulcorantes tales como los
jarabes de maltosa y glucosa. Las transformaciones del almidón también son deseables en menor medida en pro-
ductos de panadería, añadiéndose glucosidasas exógenas con las finalidades de retardar el endurecimiento y facili-
tar el esponjamiento por efecto de las levaduras.
6.3.2.1.1 α-Amilasa [126,143,154,159]

Las amilasas se usan para hidrolizar el almidón (obtenido fundamentalmente a partir de maíz) hasta dextrinas
de menor tamaño y conseguir así suspensiones de almidón más «ligeras». La α-amilasa (EC 3.2.1.1, 1,4-α-D-
glucano glucanohidrolasa) es una endo enzima, α→α-conservadora, principal responsable de una reducción rápi-
da del tamaño molecular medio del polímero almidón. Es el miembro representativo de la familia 13 de las
glucosidasas, varias de las cuales son usadas en el procesado del almidón. Esta familia se caracteriza por poseer al
menos tres dominios separados dentro de la proteína, uno para la catálisis, otro para servir de sitio de unión del
almidón granular, y el tercero para permitir la unión de calcio y servir de nexo de unión de los otros dos dominios.
El tamaño molecular de la enzima de diferentes orígenes (se han descrito más de 70 secuencias distintas) general-
mente oscila entre 50 y 70 kDa (aunque algunas pueden acercarse a los 200 kDa). Las α-amilasas tienen múltiples
sitios de unión de Ca2+, el más importante de los cuales está situado cerca de la hendidura del sitio activo, de tal
manera que estabiliza las estructuras secundaria y terciaria. El Ca2+ está fuertemente unido y sirve para ampliar la
estabilidad frente al pH de la enzima, haciendo que sea estable en un rango de valores entre 6 y 10; la estabilidad
frente al calor de la α-amilasa es bastante dependiente de su origen. El sitio activo está formado por al menos cinco
subsitios (posiciones de la –3 a la +2, Tabla 6.6; comparar con Fig. 6.15c) y exige un sustrato que tenga una
longitud de al menos tres unidades de glucosa. De los tres residuos conservados en el sitio activo (en la α-amilasa
pancreática porcina), ASP197 es el nucleófilo que forma el intermediario covalente glucosil-enzima, GLU233 está
situado en el subsitio +1 y es el catalizador ácido general, y ASP300 está situado en el subsitio –1 y sirve para unirse
a los grupos C2-OH y C3-OH del sustrato para provocar en él deformación/estrés. Los residuos conservados
HIS299 y HIS101 están involucrados en la unión al sustrato y en la estabilización del estado de transición para reducir
colectivamente Ea en 5,5 kcal/mol. La HIS201 interacciona con el residuo catalítico GLU233 para desplazar el valor
de pH óptimo desde 5,2 hasta 6,9. Debido a la importante contribución de los residuos de HIS a la actividad y al
perfil de actividad en función del pH, durante mucho tiempo se pensó que HIS estaba involucrada en el mecanismo
de acción de la α-amilasa. El pH óptimo de actuación también depende de la longitud del sustrato, y los
maltooligosacáridos que no ocupan totalmente los 5 subsitios de unión reaccionan en un rango de pH más estrecho.
Otros residuos conservados no polares son TRP, TYR y LEU, los cuales están involucrados en la unión al sustrato
y al gránulo de almidón a través de interacciones hidrofóbicas que favorecen el apilamiento [34,154].
Existen varias fuentes de α-amilasas, muchas de las cuales son microbianas, aunque también están disponibles
amilasas de malta (cebada o trigo). Los productos finales típicos de la acción de la α-amilasa son dextrinas ramificadas
α-límite y maltooligosacáridos de 2-12 unidades de glucosa, predominantemente con un número de unidades de
glucosa en el extremo superior de este rango [154,155]. La viscosidad del almidón se reduce rápidamente, debido
TABLA 6.6
Propiedades catalíticas de las glucosil hidrolasas.
Enzima Selectividad Selectividad Residuos catalíticosb Mapeo del subsitio del sustratoc
de enlace de productoa
α-Amilasa α-1 → 4 glucosa CON α → α GLU233, ASP300 (ácido, nucl./base) Endo
β-Amilasa α-1 → 4 glucosa INV α → β GLU186, GLU380 (ácido, nucl./base) Exo
Pululanasa α-1 → 6 glucosa Probablemente GLU706, ASP677 (ácido, nucl./base) Endo

CON α → α
Glucoamilasa α-1 → 4 (α-1 → 6) INV α → β GLU179, GLU400 (ácido, nucl./base) Exo

glucosa
Ciclomaltodextrín- α-1 → 4 glucosa CON α → α GLU257, ASP229 (ácido, nucl./base) Endo

transferasa
Invertasa β-1 → 2 fructosa CON β → β GLU204, ASP23 (ácido, nucl./base) β-D-frutofuranosil = –1; glucosa = +1
(continúa)
Enzimas
393
394
TABLA 6.6 (Continuación)

Propiedades catalíticas de las glucosil hidrolasas.
Enzima Selectividad Selectividad Residuos catalíticosb Mapeo del subsitio del sustratoc
de enlace de productoa
Química de los alimentos
β-Galactosidasa β-1 → 4 galactosa CON β → β GLU461/Mg2+, GLU537 β-D-galactopiranosil= –1; glucona/aglucona = +1

(ácido, nucl./base)
β-Glucosidasa β-1 → 4 , β-1 → CON β → β GLU170, GLU358 Exo

aglicona glucosa (ácido, nucl./base)
Poligalacturonasa α-1 → 4 INV α → β ASP201 ASP180,202 Endo (también existen tipos exo)
galacturonato (ácido, nucl./base)
Xilanasa α-1 → 4 xilosa CON β → β GLU172, GLU78 (ácido, nucl./base) Endo (existen algunos tipos exo, algunos inversores)
Lisozima α-1 → 4- CON α → α GLU35, ASP52 (ácido, nucl./base) Endo, la unidad NAM-NAG se une a –1/+1
NAM-NAG-d
a
CON, conservadora; INV, inversora.
b
Enzima de referencia citada en el texto; nucl. = nucleófilo.
c
*, algunas enzimas presentan este subsitio.
d
Unidad repetitiva N-acetilmuramato-N-acetilglucosamina. Referencias citadas en el texto.
Enzimas 395
a que la hidrólisis se produce al azar, lo cual reduce rápidamente la masa molecular media de las cadenas de
amilosa/amilopectina. Entre las amilasas microbianas, los parámetros óptimos de actuación se encuentran general-
mente en los rangos de pH de 4-7 y entre 30 y 130°C de temperatura [95]. Las preparaciones comerciales más
comunes para la transformación del almidón incluyen las α-amilasas de especies de los géneros Bacillus y Aspergillus.
Las α-amilasas de Bacillus son termoestables y pueden usarse a 80-110°C, a pH 5-7 y con 5-60 ppm de Ca2+ [155].
Las enzimas fúngicas (de Aspergillus) operan de modo óptimo a 50-70°C, pH 4-5 y ~50 ppm de Ca2+ [95,155].
Aunque las amilasas fúngicas actúan también como endoenzimas, degradando los enlaces en las partes centrales de
las cadenas, tienden a favorecer la acumulación de maltooligosacáridos más cortos (n = 2-5) como productos
finales de la degradación del almidón [139]. También se ha identificado una α-amilasa singular «maltogénica» de
Bacillus (EC 3.2.1.133) [28] y, aunque la producción de maltosa está asociada más comúnmente con la acción de
las β-amilasas (véase la sección siguiente), las α-amilasas maltogénicas parecen producir niveles elevados de
maltosa, bien a través de una hidrólisis exhaustiva (prolongada) del almidón, o por medio de episodios hidrolíticos
múltiples («procesivos») sobre una cadena de amilosa que permanece unida, hasta que ésta se disocie completa-
mente del sitio activo [34].
Las amilasas con un pH óptimo de actuación alcalino (de 9-12) presentan un interés particular, potencialmente
como auxiliares en el procesado de alimentos (y detergentes), y de ellas interesa especialmente el cómo puede
funcionar a pH elevado el carácter glucosidasa conservado de los restos ASP/GLU del sitio activo. La adaptación
a la alcalinidad de una α-amilasa de Bacillus spp. se asoció con una proporción decreciente de los residuos de
GLU, ASP y LYS, y con un aumento de ARG, HIS, ASN y GLN. Esto sirve para mantener el balance de la carga a
valores de pH alcalinos y modifica la dinámica del sitio activo que eleva el pK de los grupos de los restos catalíticos
ASP/GLU [124]. Estos cambios, así como un aumento del contenido hidrofóbico y de la compacidad de la estruc-
tura, y una reducción del agua en las proximidades del sitio activo, se observaron en muchas glucosil hidrolasas
adaptadas a las condiciones de alcalinidad [8].
6.3.2.1.2 β-Amilasa [95,126,139,154]

La β-amilasa (1,4-α-D-glucano maltohidrolasa, EC 3.2.1.2) es una glucosidasa α→β-inversora, exoactuante,
que libera unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de las cadenas de amilosa y es un miembro de
la familia 14 de las glucosidasas. La acción intensa de la β-amilasa sobre el almidón da lugar a una mezcla de
maltosa y dextrinas β-límite; estas últimas conservan los puntos de ramificación α-1,6 y permanecen como porcio-
nes lineales que resultan inaccesibles (vía restricciones estéricas) para la enzima. Las dextrinas β-límite tienen una
masa molecular media mayor que la de las dextrinas α-límite debido a que la β-amilasa exoactuante no puede
actuar más allá de los puntos de ramificación α-1,6, mientras que la α-amilasa puede hacerlo, comportándose como
una enzima endoactuante. Las β-amilasas de soja, boniato y Bacillus spp. están entre las mejor caracterizadas. Las
enzimas de origen vegetal tienen ~56 kDa (la enzima del boniato es un tetrámero), mientras que las enzimas
microbianas oscilan entre 30 y 160 kDa. La β-amilasa es singular por el hecho de tener una estructura con un único
dominio, en contraste con la estructura multidominio de otras glucosidasas amilolíticas. Los residuos catalíticos
(en la β-amilasa de soja) son GLU186 (ácido general) y GLU380 (base general), y están separados por una distancia
de 10-11 Å en el interior de un bolsillo profundo. La unión del sustrato forma una especie de tapadera, que propor-
ciona una energía de unión favorable estimada en 22 kcal/mol; esta tapadera blinda el sitio activo frente a la entrada
del solvente. Esto posiblemente intensifica las fuerzas dipolares que facilitan la catálisis y constituye otro ejemplo
de mecanismo de «ajuste inducido». Existen cuatro subsitios de unión al sustrato con los residuos catalíticos GLU
orientados en las caras opuestas al subsitio –1. HIS93 está posicionado en los subsitios –1 y –2 y puede conferir
sensibilidad al pH en el rango alcalino. El equivalente a dos unidades de maltosa se une al sitio activo (subsitios del
–2 al +2) y esta propiedad puede determinar lo cerca de los puntos de ramificación que la enzima puede operar en
el almidón. En el pasado, se creyó que los residuos de CYS estaban involucrados en la catálisis, pero mutaciones
puntuales han revelado ahora que estos residuos tienen una función catalítica pequeña, aunque pueden tener un
papel en la estabilidad conformacional de la enzima. Mientras que las enzimas de origen vegetal no pueden unirse
al almidón crudo y digerirlo, algunas de las enzimas microbianas tienen dominios separados que les confieren esta
propiedad. La β-amilasa resulta inhibida de modo competitivo por la α-ciclodextrina, y esta inhibición parece estar
mediada por la LEU383 que forma un complejo de inclusión y bloquea el acceso al sitio activo. Las β-amilasas
tienen generalmente valores de pH óptimos de actuación más alcalinos (pH 5,0-7,0) que las α-amilasas, no necesi-
tan Ca2+, y tienen temperaturas óptimas en el rango de 45-70°C, dependiendo del origen (las de origen microbiano
son más termoestables).
6.3.2.1.3 Pululanasa [82,143,154,159]

Las pululanasas del tipo I (EC 3.2.1.41, pululan 6-glucanohidrolasa) se denominan enzimas «desramificantes»
o «dextrinasas límite», puesto que hidrolizan dextrinas que contienen enlaces glucosídicos α-1,6 que constituyen
los puntos de ramificación de la amilopectina. La pululanasa está presente en muchas bacterias, algunas levaduras,
y cereales, y los análisis de sus secuencias las colocan en la familia 13 de las α-amilasas (enzimas α→α-conserva-
doras). La enzima es una lipoproteína de 1.150 aminoácidos (con una masa molecular estimada de 145 kDa) con
cinco dominios con cinco sitios de unión al calcio. Los residuos del sitio activo (en la enzima de Klebsiella
pneumoniae) son GLU706 (ácido) y ASP677 (nucleófilo/base) con el ASP734 ayudando (Tabla 6.6), conservando los
subsitios del sustrato del –4 al +2 y las características de la α-amilasa. La pululanasa se caracteriza (y de ahí su
nombre trivial) por su capacidad de actuar sobre el pululano, una molécula formada por repetición de la unidad
[α-D-Glc-(1→4)-α-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Glc]. La pululanasa puede actuar sobre fragmentos mayo-
res, pero no menores que el pululano; actúa lentamente sobre la amilopectina y prefiere las dextrinas límite que se
producen durante las fases avanzadas de la licuefacción y sacarificación del almidón [159]. Los productos de la
acción de la pululanasa son glucooligosacáridos lineales tan pequeños como la maltosa. Las pululanasas se obtie-
nen habitualmente de microorganismos de los géneros Klebsiella y Bacillus, tienen masas moleculares de ~100 kDa,
temperaturas máximas de actuación de 55-65°C y valores de pH óptimos de 3,5-6,5, no necesitando cofactores
(aunque algunas resultan activadas por el Ca2+). Las pululanasas de origen vegetal también se denominan dextrinasas
límite, y las fuentes más ricas de estas enzimas son los granos germinados o malteados, especialmente los de
cebada. Las pululanasas del tipo II (o amilopululanasas, EC 3.2.1.41 o EC 3.2.1.1) tienen sobre todo un origen
microbiano, presentan una actividad combinada α-amilasa-pululanasa y, en el almidón, pueden hidrolizar tanto los
enlaces α-1,4 como los α-1,6. Otras enzimas relacionadas son la neopululanasa (EC 3.2.1.125) y la isopululanasa
(EC 3.2.1.57) que, en el pululano, actúan sobre los enlaces α-1,4 hacia los extremos no reductor y reductor, respec-
tivamente, desde el punto de ramificación, dando lugar a los α-1,6-trisacáridos ramificados panosa e isopanosa.
6.3.2.1.4 Glucoamilasa [95,126,154]

La glucoamilasa (1,4-α-D-glucano glucanohidrolasa, EC 3.2.1.3), también conocida por el nombre trivial de
amiloglucosidasa, es una enzima α→β-inversora, exoactuante que constituye la única enzima de la familia 15 de
las glucosidasas. Hidroliza unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de los fragmentos lineales del
almidón. Aunque la glucoamilasa es selectiva para el enlace glucosídico α-1,4, puede también actuar lentamente
sobre el enlace α-1,6 característico de la amilopectina y del pululano. En consecuencia, el único producto de una
digestión exhaustiva con glucoamilasa es la glucosa. Tiene características estructurales y mecanísticas similares a
las de la α-amilasa, que incluyen los residuos catalíticos ácido y base respectivos GLU179 y GLU400 (en la enzima
de Aspergillus spp.), un dominio separado para la unión al almidón y un dominio de enlace corto. Algunas
glucoamilasas pueden actuar sobre el almidón nativo granular (bruto). Dos residuos, TRP52, 120, actúan como asis-
tentes de la catálisis a través de uniones mediante puentes de H al GLU179, lo que aumenta su acidez. El dominio
catalítico tiene cinco subsitios además del residuo de glucona escindible en el subsitio –1 (compárese con la
Fig. 6.15a), y los subsitios del +1 al +5 presentan todos ellos –ΔG para la unión (favorable), especialmente el
subsitio +1. Puesto que la ΔG aumenta progresivamente en los distintos subsitios, la enzima muestra mayor selec-
tividad de reacción cuanto más largos sean los glucooligosacáridos lineales C2-C6+. Este patrón de selectividad es
propicio para obtener una hidrólisis consecutiva de los enlaces y una degradación exhaustiva de los segmentos
cortos de amilosa hasta glucosa. El sustrato oligomérico debe penetrar por un «hueco» para acceder al sitio activo,
y, debido a estas restricciones estéricas, la disociación y la unión de nuevo del sustrato que queda por hidrolizar es
el paso limitante de la velocidad.
Las glucoamilasas se obtienen fundamentalmente a partir de bacterias y hongos [95]. Su masa molecular oscila
entre 37 y 112 kDa, pueden existir en múltiples isoformas, no tienen cofactores, y exhiben una actividad óptima en
el rango de pH de 3,5-6,0 y en el de temperatura de 40-70°C. La glucoamilasa de Aspergillus es de uso común
Enzimas 397
puesto que es más activa y estable a pH 3,5-4,5, con un rango óptimo de temperatura de 55-60°C [154]. La enzima de
Rhizopus es interesante debido a que una isoforma puede también hidrolizar fácilmente los puntos de ramificación
α-1,6 [95]. Las glucoamilasas son glucosidasas que actúan con relativa lentitud en relación con otras involucradas en
la transformación del almidón, y los diseños de los procesos se han adaptado para acomodarlos a esta característica.
6.3.2.1.5 Ciclomaltodextrina glucanotransferasa [126,154,155]

La ciclomaltodextrina glucanotransferasa (CGT, 1,4-α-D-glucano 4-α-D-(1,4-α-D-glucano)-transferasa (ciclasa),
EC 2.4.1.9) cataliza reacciones tanto de hidrólisis como de transglucosilación intra e intermolecular. Las reaccio-
nes de ciclización dan lugar a los hexa-(α), hepta-(β) y octa-(γ) sacáridos más comúnmente conocidos como
ciclodextrinas. La CGT es una enzima α→α-conservadora, endoactuante, perteneciente a la familia 13 de las
glucosidasas; tiene en su molécula proteica dos dominios adicionales además de los tres observados en la α-amilasa,
incluyendo sitios adicionales para la unión del sustrato (específicamente la maltosa). Los múltiples sitios de unión
le permiten la interacción con el almidón bruto (aunque la CGT no es muy activa sobre el almidón bruto) y ayudan
a guiar los fragmentos lineales de almidón hasta el surco del sitio activo. Las CGTs son de origen microbiano y son
monómeros típicos con una masa molecular ~75 kDa. Los residuos catalíticos (en la enzima de Bacillus circulans)
incluyen ASP229 (base/nucleófilo) y GLU257 (ácido general), mientras que ASP328 e HIS140, 327 tienen papeles en la
unión del sustrato y en la estabilización del estado de transición, ARG227 orienta el nucleófilo, e HIS233 se coordina
con el Ca2+ necesario (al igual que ocurre con algunas α-amilasas). En el sitio activo hay nueve subsitios, del –7 al
+2, lo que concuerda con el hecho de que la β-ciclodextrina sea el producto preferido de la ciclización intramolecular
(Tabla 6.6).
Aunque las ciclodextrinas son los productos comerciales más importantes preparados con la ayuda de la CGT,
esta enzima es bastante promiscua en lo referente a su selectividad de sustrato y producto, y puede catalizar diver-
sas reacciones, incluyendo las de hidrólisis, ciclización, desproporción (dismutación), o acoplamiento. Por ejem-
plo, puede reaccionar con glucosa y almidón para formar maltooligosacáridos de varios tamaños de cadena, así
como acoplar azúcares (reconoce a muchos monosacáridos) con grupos alcohol tales como los del ácido ascórbico
y de los flavonoides. Estos últimos procesos ofrecen potencial para la preparación de compuestos nuevos con
funciones singulares en los sistemas alimentarios. Las CGTs muestran típicamente una actividad óptima a pH 5-6,
y su temperatura óptima se ha mejorado desde 50-60°C hasta 80-90°C en los últimos años mediante la introducción
en los procesos de formas termoestables. Las CGTs de diferentes orígenes favorecen la formación de ciclodextrinas
diferentes (hexa, hepta, u octaoligómeros) como producto principal.
6.3.2.1.6 Aplicaciones de la transformación del almidón

6.3.2.1.6.1 Hidrólisis del almidón La transformación industrial del almidón comienza con la formación de una
pasta del sustrato con un 30-40% de sólidos con un pH inicial de 4,5 (Fig. 6.19). La «licuefacción», que es seguida
de un ajuste del pH hasta un valor de 6,0-6,5, del almidón ocurre mediante un calentamiento breve hasta 105°C
(para gelatinizar el almidón) y después atemperando hasta 90-95°C durante 1-3 horas en presencia de una α-amilasa
termoestable (de origen bacteriano) y tras la adición de Ca2+. Esta etapa permite la obtención de una mezcla de
dextrinas lineales y ramificadas (maltodextrinas) con un grado de hidrólisis variable entre 8 y 15 DE (DE = equiva-
lentes de dextrosa), y esto resulta suficiente para evitar la gelificación del almidón tras el enfriamiento en los pasos
sucesivos (de ahí el término licuefacción). A partir de este momento existen tres pasos alternativos. Uno es para la
producción de maltodextrinas de 15-40 DE (jarabes de maíz utilizados como espesantes, para dar volumen y para
incrementar la viscosidad) que se lleva a cabo mediante una mayor exposición a la acción de una amilasa (en
algunos casos, se usa un ácido [HCl] para licuar inicialmente el almidón gelatinizado). Los otros dos destinos
conducen a la obtención de edulcorantes, a temperaturas de ~60°C y pH 4,5-5,5 adaptados a las condiciones
óptimas de las enzimas empleadas. Para la conversión en un jarabe que tenga un 95-98% de glucosa (95 DE), los
sólidos deben reducirse al 27-30% y tratar con glucoamilasa (la cual a menudo se usa como enzima inmovilizada
en una columna), con o sin pululanasa, durante 12-96 h. El jarabe con >95% de glucosa puede después ser refina-
do, concentrado hasta un 45% de sólidos y tratado en una columna de xilosa (glucosa) isomerasa inmovilizada a
pH 7,5-8,0 y 55-65°C con adición de Mg2+ para generar un jarabe de maíz de alto contenido en fructosa con un
42% de fructosa (52% de glucosa), que puede con posterioridad refinarse y/o enriquecerse hasta contener un 55%
Licuefacción
Sacarificación
Figura 6.19 Transformación comercial del almidón mediante procesado con enzimas. Las unidades de glucosa (proyecciones
de Haworth) que aparecen rellenas son extremos reductores, y las unidades de glucosa punteadas son extremos no reductores que
existen en el almidón original y evolucionan durante la etapa de licuefacción. Referencias citadas en el texto.
de fructosa. El otro edulcorante producido a partir del almidón licuado se obtiene mediante adición de una α-amilasa
o β-amilasa fúngica (maltogénica), con o sin adición de pululanasa, para dar lugar a un amplio rango de jarabes con
entre un 30 y un 88% de maltosa para su uso en confitería. Dependiendo del origen de la amilasa maltogénica
seleccionada, los maltooligosacáridos predominantes que se acumulan en la mezcla resultante tienen un tamaño
variable de entre 2 y 5 unidades de glucosa.
Existen otros dos tipos de productos no edulcorantes que se preparan a partir de la pasta original de almidón
mediante la acción de varias α-amilasas que se añaden antes de que el almidón sea calentado progresivamente
hasta el punto de gelificación. Esto conduce a un patrón y grado de hidrólisis controlado (DE 3-8) que propor-
ciona dextrinas grandes (denominadas, de modo general, productos de la hidrólisis del almidón) que pueden
formar geles termorreversibles y comportase como imitativos de la grasa. Muchos de los detalles de la prepara-
ción de estos productos se hallan en los textos de las patentes, pero el proceso generalmente implica la acción
limitada de una amilasa en un rango de temperaturas [139]. De modo alternativo, puede añadirse una ciclodextrina
glucosiltransferasa (CGT) termoestable a la pasta de almidón nativo, tras ajustar el pH a 5-6, y después incubar
a 80-90°C. Los rendimientos totales de ciclodextrina tras la acción de la CGT sobre el almidón son inversamente
proporcionales a la concentración de almidón y al grado de licuefacción [159]. Así pues, la producción de
ciclodextrina en los procesos comerciales a menudo se lleva acabo a niveles de almidón de ~30% de sólidos (se
han descrito concentraciones de 1-33% en los textos de las patentes [135]) como una solución de compromiso
entre % de rendimiento (eficiencia) y rendimiento total (producción). La CGT termoestable puede hidrolizar
tanto el almidón nativo (gelatinizado) en presencia de Ca2+ añadido, como transglucosilar (ciclizar) los fragmen-
tos resultantes. También puede usarse CGT no termoestable, pero su uso requiere una digestión previa y limitada
del almidón para proporcionar licuefacción (hasta alrededor de 10 DE para evitar la gelificación), tras de lo cual
Enzimas 399
se añade la CGT a temperaturas bajas (50-60°C). Los rendimientos de ciclodextrinas pueden aumentarse me-
diante co o pre-tratamiento del almidón con una enzima desramificante y mediante incorporación de agentes
acomplejantes (disolventes o detergentes) para dirigir la reacción hacia la producción de una o más de las especies
de ciclodextrinas [135,159].
En el futuro, los esfuerzos para mejorar el procesado y transformación del almidón deberán centrarse en aumen-
tar la estabilidad frente al pH (hasta valores de 4-5) y disminuir los requerimientos de Ca2+ de la α-amilasa, y en el
aumento de la capacidad de digerir el almidón bruto por la β-amilasa [95,143]. En todas las enzimas involucradas,
el aumento de la estabilidad frente al calor generará más eficiencia en el procesado, así como la posibilidad de
realizar procesos en una sola etapa. Además, continuará siendo una prioridad el descubrimiento de los determinan-
tes de la selectividad de producto de las reacciones, para obtener los productos, o la distribución de los productos,
preferidos.
6.3.2.1.6.2 Panadería y productos de la panificación [28,104,143] Prácticamente todas las glucosidasas que
se han discutido con anterioridad han sido añadidas con algún efecto beneficioso en aplicaciones en el campo de la
panadería, y las α-amilasas han sido las más usadas. Inicialmente, se creyó que las amilasas actuaban principal-
mente degradando el almidón y proporcionando a las levaduras carbohidratos fermentables. También se añadían a
las masas para degradar el almidón dañado y/o suplementar la actividad de las amilasas endógenas en las harinas de
mala calidad (en términos de aptitud para la panificación). Sin embargo, actualmente se reconoce que las amilasas
que se añaden directamente a la masa reducen la viscosidad de la masa y mejoran el volumen del pan, la suavidad
de la miga (antiendurecimiento) y el color de la corteza. La mayoría de estos efectos pueden atribuirse a una
hidrólisis parcial del almidón durante la panificación, a medida que el almidón se gelatiniza. Una viscosidad más
baja (aligerado) ayuda a mejorar el volumen y la textura porque permite que reacciones implicadas en el acondicio-
namiento de la masa y en la panificación transcurran de un modo más rápido (efecto sobre la transferencia de
masa). El efecto antiendurecedor se cree que es conferido por una hidrólisis limitada de las cadenas de amilosa, y
especialmente de las de amilopectina, de tal manera que se retarda la velocidad a la que retrogradan, y ésta es la
razón principal del uso actual de las α-amilasas en los productos de panadería*. Una adición excesiva de α-amilasas
da lugar a panes gomosos o con texturas pegajosas, y este efecto se asocia con la acumulación de maltodextrinas
ramificadas de 20-100 DP. Por lo tanto, se debe tener cuidado de añadir la cantidad adecuada de amilasa para cada
producto específico; las amilasas no deben sobrevivir al proceso de panificación, de lo contrario puede tener lugar
en la fase de post producción una actividad residual no deseada. Esto se ha logrado ajustando la estabilidad a la
temperatura, y la cantidad añadida, de la amilasa a cada aplicación particular para controlar la extensión con la que
la enzima actúa y persiste durante el proceso de panificación [56]. Más recientemente, se ha reconocido que los
tipos maltogénicos de las α-amilasas tienen propiedades superiores como agentes antiendurecedores, puesto que
tienden a formar maltooligosacáridos más cortos (DP 7-9) y dextrinas grandes (que son plastificantes) que los
procedentes de la endoacción de las α-amilasas convencionales. Así pues, las amilasas maltogénicas tienden a
mantener en el pan intacta la red del almidón gelatinizado (blanda, pero no gomosa), y la reducción ligera del
tamaño de las cadenas del almidón mantiene la elasticidad de la masa siendo a la vez suficiente para retardar el
endurecimiento.
6.3.2.1.6.3 Fabricación de cerveza y fermentaciones [154,155] Las hidrolasas que operan sobre el almidón
hace mucho tiempo que se consideran enzimas esenciales en la industria cervecera; esta consideración comenzó en
1833 con el hallazgo de actividad «diastásica» en granos malteados (germinados), llevando hasta la comercialización
de las α y β-amilasas. Sin embargo, las amilasas endógenas de los granos malteados son insuficientes para movili-
zar todos los carbohidratos fermentables puesto que están en una concentración insuficiente, carecen de estabilidad
frente al calor habida cuenta de los procesos involucrados, y/o existen inhibidores endógenos en los granos. Así
* Se estima que el valor de los productos de panadería alterados por endurecimiento y desechados por tal causa en Estados Unidos en
1990 fue alrededor de 1 billón de dólares [56].
pues, se añaden α y β-amilasas, glucoamilasa y pululanasa, y enzimas que hidrolizan las paredes celulares (casi
únicamente de origen microbiano) para maximizar la disponibilidad de azúcares fermentables. Las glucanasas y
xilanasas (que se discuten más adelante) se añaden para hidrolizar los glucanos (similares a la celulosa, pero con
enlaces β-1,3 y β-1,4) y los xilanos (polímeros formados predominantemente por xilosa y que son el mayor compo-
nente de la hemicelulosa de las paredes celulares). Las α y β-amilasas que se añaden se usan para completar la
degradación del almidón hasta dextrinas α y β-límite, lo que no pueden lograr las amilasas termolábiles de la malta.
Las dextrinas límite que permanecen en la cerveza proporcionan cuerpo al producto final. Sin embargo, las dextrinas
límite pueden convertirse en fermentables añadiendo glucoamilasa (y/o pululanasa), de tal manera que las cervezas
producidas añadiendo esta enzima tienen un contenido calórico más bajo («light»). Las enzimas exógenas se aña-
den durante (o inmediatamente después) de la etapa de «maceración», que se realiza a temperaturas moderadas
(45-65°C), y resultan destruidas durante la etapa siguiente de ebullición del «mosto».
6.3.2.2 Transformación de los azúcares y aplicaciones
6.3.2.2.1 Isomerización de la glucosa

La xilosa (glucosa) isomerasa (EC 5.3.1.5, D-xilosa cetol-isomerasa) es una de las enzimas más ampliamente
utilizadas en la producción de edulcorantes a partir del almidón de maíz y sólo se halla en los microorganismos
[3,139,154]. Aunque es más selectiva para la xilosa, reacciona con eficiencia suficiente con la glucosa en una
reacción de isomerización en equilibrio que da lugar a fructosa, de tal manera que se ha convertido en unas de las
enzimas industriales más importantes utilizada para la producción de un jarabe de maíz con alto contenido en
fructosa (edulcorante). El mecanismo de acción de esta enzima y los residuos importantes del sitio activo ya se han
descrito de modo detallado en la Sección 6.2.4.2 de este capítulo. La enzima es un homotetrámero, con una masa
molecular que oscila entre 170 y 200 kDa y con dos cofactores metálicos esenciales por cada subunidad (los más
comunes son Mn2+, Mg2+ y Co2+). La enzima está disponible comercialmente (obtenida principalmente a partir de
Streptomyces spp.) en forma inmovilizada y empaquetada en una columna a través de la que se hace circular el
jarabe de glucosa. Las fases típicas de la producción incluyen un intercambio iónico y un tratamiento con carbón
para refinar un jarabe de glucosa que contiene un 40-50% de sólidos (el 93% de los cuales son glucosa) procedente
de la sacarificación del almidón (Fig. 6.19). El pH se ajusta a ~7,5 (un valor de compromiso entre la máxima
estabilidad que se logra a pH 5-7 y la máxima actividad que se consigue a valores entre 7 y 9), se añade Mg2+ a una
concentración de 1,5 mM y el jarabe se perfunde a través del reactor, manteniendo un tiempo de estancia apropiado
para obtener el grado de conversión deseado a 55-65°C (aun cuando la temperatura óptima sea de 75-85°C). El
valor de la temperatura es el de compromiso para, a un mismo tiempo, maximizar la estabilidad de la enzima (que
le permita trabajar desde varias semanas hasta meses), reducir la viscosidad, evitar el crecimiento microbiano, y
limitar las reacciones del tipo de la de Maillard (glicación) de los grupos amino terminales de las cadenas de la
enzima que provocarían una inactivación. La mayor limitación en el uso industrial de la glucosa isomerasa es su
inestabilidad frente al calor. Dependiendo de las condiciones del proceso, un jarabe de glucosa (DE ~95) puede
convertirse en un jarabe con un 42-45% de fructosa (balance de glucosa). Operando con la enzima a temperaturas
más elevadas se favorecería el rendimiento en fructosa (en base a la dependencia frente a la temperatura de la
constante de equilibrio) y, en este sentido, se están realizando esfuerzos investigadores en el campo de la biología
molecular para dotar a la enzima de una estabilidad térmica mayor.
6.3.2.2.2 Oxidación de la glucosa [127,154]

La glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4, β-D-glucosa-oxígeno 1-oxidorreductasa) se obtiene principalmente de Aspergillus
niger. Es una glucoproteína dimérica de 140-160 kDa, provista de un bolsillo de unión profundo que alberga a la
glucosa a través de 12 puentes de hidrógeno y múltiples interacciones hidrofóbicas, lo que determina su especifici-
dad para el azúcar que utiliza como sustrato. A pesar de esto, su valor de KM para la glucosa es bastante alto, de
~40 mM, pero esto es compensado por los elevados valores de recambio/velocidad catalítica de la reacción. La
enzima es bastante estable hasta una temperatura de 60°C y en un rango de pH de 4,5-7,5, lo que permite el uso de
la glucosa oxidasa como ayuda en procesos en condiciones muy diversas. La glucosa oxidasa se usa principalmente
para eliminar la glucosa de la clara de huevo y reducir así la posibilidad de pardeamiento a través de la reacción de
Enzimas 401
Maillard durante la deshidratación y almacenamiento posterior. El valor de pH de las claras de huevo debe ajustar-
se inicialmente desde ~9 hasta <7 con ácido cítrico antes de añadir la glucosa oxidasa conjuntamente con H2O2
(que sirve como fuente que proporciona O2 en presencia de actividad catalasa); la enzima se deja operar a 7-10°C
durante un tiempo de hasta 16 h antes de la deshidratación por atomización [85]. Otros usos potenciales de la
glucosa oxidasa, tales como su empleo para la eliminación de oxígeno en líquidos o en el interior de envases, o en
la generación de ácido glucónico (un producto ácido de fermentación y agente de esponjamiento químico), todavía
no se han generalizado. La glucosa oxidasa puede también usarse para generar H2O2 que actúa como agente
antibacteriano (en pastas de dientes y vía acción de la lactoperoxidasa en la leche) o como acondicionador de las
masas (fortalecedor) al aportar agentes oxidantes que pueden actuar como un agente «natural» para sustituir a los
bromatos en su papel de inducir la formación de puentes disulfuro en el gluten [155].
6.3.2.2.3 Hidrólisis de la sacarosa (Inversión) [126,154]

La invertasa (EC 3.2.1.26, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa) ha sido motivo de estudio durante mucho
tiempo, y la invertasa de las levaduras fue la enzima seleccionada por Michaelis-Menten (1913) para generar los
datos utilizados en la construcción de su modelo cinético. Se han secuenciado alrededor de 40 invertasas, y existen
bajo diferentes isoformas en tejidos vegetales y microorganismos, tratándose de proteínas monoméricas u
oligoméricas con masas moleculares que oscilan entre 37 y 560 kDa. Muchas son glucoproteínas, y las isoformas
vegetales a menudo se denominan invertasas ácidas o neutras/alcalinas para reflejar las condiciones de su actividad
óptima (valores de pH de 4-5 y 7-8, respectivamente). La invertasa es una glucosil transferasa β→β conservadora,
y su nombre común «invertasa» refleja su capacidad de cambiar («invertir») la rotación óptica de una disolución de
sacarosa y no la estereoquímica de su acción (Tabla 6.6). La enzima es única en su capacidad de resistir y permane-
cer activa a valores altos de osmolaridad (hasta 30 M de sacarosa). Los residuos catalíticos (en la enzima de las
levaduras) son GLU204 (ácido) y ASP 23 (nucleófilo/base). Presenta selectividad de sustrato hacia los β-D-
fructofuranosil glucósidos, el más importante de los cuales es la sacarosa. La invertasa (de levaduras) se utiliza
como una enzima exógena principalmente en la elaboración de golosinas con el centro blando y en la producción
de miel artificial a partir de sacarosa. Para el uso en confitería, la enzima puede tanto inyectarse en el interior de
dulces recubiertos o mezclarse con la mezcla granular de azúcares (fondant) inmediatamente antes de hacer el
recubrimiento. Las golosinas han de dejarse después reposar para dar tiempo a que la invertasa actúe sobre la
sacarosa y provoque una licuefacción viscosa de la parte central.
6.3.2.2.4 Hidrólisis de la lactosa [62,126,154]

La β-D-galactosidasa (EC 3.2.1.23, β-D-galactósido galactohidrolasa, o lactasa) se encuentra en los mamíferos
(en el tracto intestinal) y en microrganismos, y pertenece a la familia 2 de las glucosil hidrolasas. Estas enzimas son
típicamente homotetrámeros de cadenas polipeptídicas y su masa molecular oscila entre ~90 y 120 kDa; la enzima
de Escherichia coli (lacZ) es representativa de las lactasas (la subunidad monomérica tiene 1.023 aminoácidos con
cinco dominios estructurales). Cada unidad dimérica presenta dos unidades catalíticas (una en cada polipéptido,
cada una de las cuales suministra un bucle para completar el sitio activo). Así pues, existen cuatro sitios activos en
cada tetrámero y el bolsillo de unión es una hendidura profunda en la superficie de contacto de las cadenas
polipeptídicas. La díada catalítica está formada por los residuos GLU537 (nucleófilo/base, en E. coli) y GLU461
(ácido). De los varios Mg+ unidos a cada subunidad, dos están relacionados directamente con la actividad. El Mg+
(o Mn+) estrechamente unido al sitio activo está coordinado con el residuo catalítico GLU461, GLU416, HIS418 y tres
moléculas de agua. El otro Mg+ interacciona con GLU797 para estabilizar la estructura en forma de bucle del sitio
activo. También existen iones K+ y Na+ que confieren estabilidad a la unión dímero-dímero, aumentan la afinidad
por los sustratos y estabilizan el estado de transición y el intermediario covalente. La lactasa actúa sobre muchos
β-D-galactósidos, lo que indica una especificidad bastante estricta por el residuo glucona (subsitio –1), aunque no
se ha realizado todavía un análisis completo de las relaciones entre los subsitios. El puente de hidrógeno estableci-
do entre la HIS540 de la enzima y C2–OH, C4–OH y C6–OH confiere estabilidad al estado de transición y puede
tener un papel en la especificidad por la glucona. La especificidad amplia hacia los residuos no galactosilo ha
hecho que se use un modelo, un sustrato cromogénico, el o-nitrofenil β-D-galactósido, para el ensayo fácil y
rutinario de la enzima. De acuerdo con su carácter de enzima β→β-conservadora, la β-D-galactosidasa puede
catalizar también reacciones de transglucosilación de la galactosa con otros azúcares (lactosa, galactosa, glucosa)
a través de enlaces β-1,6 para formar oligosacáridos inusuales de 2-5 DP.
La enzima de origen microbiano presenta un amplio rango de valores de pH óptimo (5,5-6,5 en las bacterias,
6,2-7,5 en las levaduras, y 2,5-5,0 en los hongos) para aplicaciones comerciales. La temperatura óptima es de
35-40°C para las enzimas de origen bacteriano y las procedentes de levaduras, y de hasta 55-60°C para las
enzimas fúngicas. La enzima fúngica es la única que no resulta activada por Mg2+ o Mn2+. Esta diversidad en
cuanto a condiciones de operación permite el uso de β-D-galactosidasas de origen microbiano en alimentos
ácidos (suero ácido, productos lácteos fermentados), así como en la leche y suero dulce. La enzima está sujeta a
inhibición por el producto (galactosa) y también por el Ca2+ y el Na+, por ejemplo. La hidrólisis de la lactosa
puede usarse para aumentar el poder edulcorante, los sustratos fermentables y los azúcares reductores, para
reducir el impacto de la cristalización de la lactosa (por ej., «paladar arenoso» en helados), y para permitir que
los productos lácteos puedan ser consumidos por los individuos intolerantes a la lactosa (aquellos que carecen
en el intestino de una lactasa-florizina hidrolasa, una enzima que tiene dos sitios activos y dos funciones). La
leche líquida con su lactosa hidrolizada se produce comercialmente por adición directa (procesado en disconti-
nuo) de la enzima procedente de levaduras, la cual puede conseguir ~70% de hidrólisis; la enzima se destruye a
continuación mediante un tratamiento de pasteurización [155]. El suero o los sólidos de suero permeados pue-
den procesarse mediante reactores con la enzima inmovilizada, utilizando la β-D-galactosidasa de Aspergillus,
logrando ~90% de hidrólisis de la lactosa.
6.3.2.2.5 Otras glucosidasas

Las β-glucosidasas (EC 3.2.1.21; β-D-glucósido glucohidrolasa) constituyen un grupo de enzimas diverso que
comprende partes de las familias 1 y 3 de las glucosil hidrolasas. La β-glucosidasa es una enzima β→β-conservadora
cuyos residuos ácido y nucleofílico son, respectivamente, GLU170 y GLU358 (separados por 5,5 Å en la enzima de
Alcaligenes faecalis) (Tabla 6.6). Las β-glucosidasas proceden de muchas fuentes microbianas y vegetales, siendo la
enzima que se encuentra disponible con más facilidad la procedente de la almendra (también denominada «emulsina»).
Las β-glucosidasas tienden a ser estables en un rango amplio de pH (4-10) y presentan una actividad óptima a pH 5-7,
dependiendo de su origen. En la práctica, los valores más altos del rango de temperaturas a las que son activas son de
40-50°C y, aunque la enzima es sensible a los reactivos sulfhidrilo (lo que implica un papel estabilizante de la CYS),
su estructura compacta hace que la enzima sea bastante resistente al ataque proteolítico. Las β-glucosidasas pueden
hidrolizar azúcares (tales como la celobiasa que hidroliza la celobiosa), tioglucósidos, y β-D-glucósidos de grupos
alquilo y arilo (que constituyen la porción aglicona). Estos últimos tipos de β-glucósidos pueden generar compuestos
aromáticos en bebidas hechas a partir de futas (vino y zumos) así como en el té [154,156]. Puede eliminarse el
amargor (naringina) de los zumos de cítricos mediante el uso de β-glucosidasas, cuya actividad puede estar presente
en las preparaciones de pectinasa que se usan en la preparación de extractos/zumos de frutas. Algunas β-glucosidasas
endógenas pueden ser responsables de la emanación de agentes activos, tales como el HCN (a partir de glucósidos
cianogénicos tales como la linamarina de los brotes de yuca y lima, la durrina del sorgo, la amigdalina de las almen-
dras, de los melocotones y de los huesos de los albaricoques), y los isotiocianatos anticarcinogénicos y goitrogénicos
(que poseen también un flavor pungente/amargo) que se forman a partir de los glucosinolatos en las Brassicas (por
acción de la enzima mirosinasa, que se discute más adelante). Mientras que algunas glucosidasas presentes en las
preparaciones de «pectinasa» pueden liberar flavores aromáticos a partir de sus precursores en los zumos de fruta así
tratados, también existen efectos perjudiciales que incluyen la pérdida del color debido a antocianinas y la producción
de flavores adversos (de «fruta podrida») debidos a la liberación de ácido ferúlico [156].
La isomaltulosa sintasa es una enzima dotada tanto de actividad glucosil hidrolasa como de capacidad de
transglucosilación. Los residuos del sitio activo incluyen ASP241 y GLU295 (en la enzima LX3 de Klebsiella spp.),
que actúan como nucleófilo/base y como ácido, respectivamente [162]. La ruta metabólica transcurre en dos pasos
e incluye una hidrólisis inicial de la sacarosa (α-D-glucosil-1,2-β-D-fructosa), seguida de la glucosilación de la
fructosa en el sitio C6-OH para dar lugar a isomaltosa (α-D-glucosil-1,6-β-D-fructosa). El efecto neto es una
isomerización, y ambos pasos de la reacción transcurren en un único sitio activo. Existe un proceso industrial que
utiliza células bacterianas inmovilizadas [19] para producir isomaltulosa (también denominada isomaltosa), un
edulcorante no carcinogénico, con efecto probiótico potencial y que constituye el sustrato para una posterior
hidrogenación que da lugar al alcohol disacárido edulcorante conocido como Isomalt®.
Enzimas 403
La α-galactosidasa (EC 3.2.1.22) se utiliza para, en el azúcar de remolacha, transformar la rafinosa en sacarosa,
incrementando así el rendimiento del proceso en un 3% y facilitando la recristalización de la sacarosa. Los pellets
de micelio de Mortierella vinacea son la fuente de la enzima comercial [19].
6.3.2.3 Transformación enzimática de la pectina [154]

Las enzimas que degradan la pectina se clasifican en tres tipos generales: poligalacturonasa, pectato y pectín
liasas, y pectín metil esterasa. Las reacciones específicas posibilitadas por estas tres actividades pectinasas se
muestran en la Figura 6.20. Estas enzimas se encuentran habitualmente en las plantas y microrganismos (especial-
mente hongos) y existen en isoformas múltiples. De modo colectivo, este grupo de actividades enzimáticas forman
las preparaciones de «pectinasa», a menudo obtenidas de A. niger, que se usan en la mayoría de las aplicaciones
comerciales para el procesado de tejidos de frutas y vegetales, extracción de zumos y clarificación.
6.3.2.3.1 Poligalacturonasa [12,101,145,154]

Las poligalacturonasas (galacturónido 1,4-α-galacturonidasa, EC 3.2.1.15 para la forma endoactuante y EC
3.2.1.67 y EC 3.2.1.82 para las formas exoactuantes) son enzimas α→β-inversoras que pertenecen a la familia 28
de las glucosil hidrolasas (Tabla 6.6). La endoenzima de A. niger tiene tres residuos conservados ASP180, 201, 202 que
funcionan como las unidades catalíticas generales ácido-base pero que perecen estar dentro de una distancia de
4,0-4,5 Å, y no de 9,0-9,5 Å como resulta común en las glucosidasas inversoras. La visión predominante es que el
par ASP180, 201 activa al agua como nucleófilo, mientras que ASP202 protona el grupo saliente y es asistido por el
residuo HIS223 (también conservado), y un residuo conservado TYR291 también asiste a la catálisis. Existen de 4 a
6 subsitios de unión al sustrato (del –5/–3 al +1, dependiendo de la isoforma), lo que resulta consistente con su
Figura 6.20 Sitio de acción y mecanismo de reacción de las enzimas que degradan la pectina. (Adaptado de Benen, J.A.E.
et al., Structure-function relationships in polygalacturonases: A site-directed mutagenesis approach, in Recent Advances in
Carbohydrate Engineering, Gilbert, H.J., Davies, G.J., Henrissat, B., and B. Svensson (Eds.), The Royal Society of Chemistry,
Cambridge, U.K., pp. 99-106, 1999; Pickersgill, R.W. and Jenkins, J.A., Crystal structure of polygalacturonase and pectín
methylesterase, in Recent Advances in Carbohydrate Engineering, Gilbert, H.J., Davies, G.J., Henrissat, B., and B. Svensson
(Eds.), The Royal Society of Chemistry, Cambridge, U.K., pp. 144-149, 1999; Whitaker, J.R., Voragen, A.G.J., and D.W.S. Wong
(Eds.), Handbook of Food Enzymology, Marcel Dekker, New York, 2003).
condición de enzima endoactuante, y esta característica determina el tamaño mínimo de sustrato aceptado. Las
isoformas con la mayor fuerza de unión (afinidad) en el subsitio –5 no reaccionan al azar, sino que lo hacen de
modo procesivo, uniéndose de nuevo e hidrolizando repetidamente una única cadena. La LYS258 es importante en
el subsitio –1 y puede conferir la exigencia de que exista en el sustrato un residuo GAlpA que se una a este sitio a
través de interacciones iónicas con el grupo carboxilato.
Las enzimas fúngicas son las más activas en un rango de pH de 3,5-6,0 (como lo son también las enzimas
vegetales), y a 40-55°C, y tienen masas moleculares que varían entre 30-75 kDa. El resultado de la acción de la
poligalacturonasa es la despolimerización de la pectina y la solubilización progresiva de las estructuras de poliurónido.
En la práctica, el resultado de tal actividad es la rotura de las barreras intercelulares (laminillas medias) y disminu-
ye la viscosidad mientras se mantenga la acción de la enzima. Aunque las exopoligalacturonasas también son de
origen fúngico y están disponibles, no son activas cuando se une al subsitio +1 un residuo de ácido galacturónico
metilado y, puesto que no son eficientes en labores de despolimerización y reducción de la viscosidad, tienen una
utilidad limitada.
6.3.2.3.2 Pectín esterasa [101,154]

Las pectín metil esterasas (EC 3.1.1.11, pectín pectilhidrolasa) se han caracterizado mejor en los hongos, aunque
también son prevalentes en los tejidos vegetales. Colectivamente, estas enzimas existen como múltiples isoformas
(ácidas, neutras y alcalinas) para cada origen determinado. Tienen una masa molecular que oscila entre 25 y 54 kDa,
una estabilidad amplia frente al pH (el rango general de actuación es de pH 2-10), y una estabilidad térmica moderada
(40-70°C), dependiendo del origen. Las enzimas fúngicas tienen valores de pH óptimos entre 4 y 6, mientras que las
de origen vegetal tienen valores óptimos más alcalinos (pH 6-8) y a menudo exigen cantidades submilimolares de
Na+. Dada su condición de carboxilesterasas, las unidades catalíticas y el mecanismo es esperable que se parezcan a
la tríada ASP-HIS-SER (como ocurre con las lipasas y serín proteasas). Sin embargo, entre las pectín metil esterasas
se hallan conservados dos residuos ASP178, 199 y uno ARG267 (en la enzima de Erwinia chrysanthemi). Una ASP está
no protonada y sirve para activar al agua como nucleófilo que ataca al carbono carbonilo, mientras que la otra ASP es
ácida y protona un oxígeno del carbonilo (Fig. 6.20). Se forma un intermediario no covalente tetraédrico y se disgrega
para dar lugar al ácido libre y metanol. Los estudios realizados en la enzima de A. niger sugieren la existencia de
4-6 sitios de unión para la glucona y la desmetilación puede no ocurrir en el extremo no reductor de un fragmento de
pectina. Las selectividades de sustrato/producto varían entre las pectín metil esterasas (y sus isoformas) en términos
de grados de metilación preferidos en la pectina que actúa como sustrato, de si está o no favorecida la hidrólisis
continuada sobre una única cadena de pectina y si la hidrólisis se produce al azar o en sitios muy próximos.
6.3.2.3.3 Pectato liasa [116,154]

La pectato liasa (EC 4.2.2.2, (1→4)-α-D-galacturonano liasa) y la pectín liasa (EC 4.2.2.10, (1→4)-6-O-metil-
α-D-galacturonano liasa) también despolimerizan la pectina; la primera de ellas reconoce a los residuos ácidos
adyacentes al enlace escindible y la segunda reconoce a los residuos metil esterificados adyacentes al enlace escindible
(el residuo de galacturonato que va a ser atacado está posicionado en el subsitio +1). Ambas enzimas existen en
isoformas múltiples. La pectato liasa necesita hasta cuatro Ca2+ para coordinar el grupo galacturonato y los múlti-
ples residuos y los residuos ASP/GLU en el (o en las proximidades) del sitio activo. Estas enzimas son prevalentes
en los hongos y también se encuentran en bacterias (las enzimas de E. chrysanthemi se encuentran entre las mejor
conocidas), mientras que están presentes de modo limitado en las plantas. Para las pectato liasas, los valores de pH
óptimos de actuación están a menudo en el rango alcalino de 8,5-9,5, y como sustrato prefieren las pectinas con
pocos grupos metoxi. Las pectín liasas tienen valores de pH óptimos ~6 en consonancia con su preferencia de
actuación sobre las formas de pectina ácidas (protonadas) o totalmente metoxiladas y el origen común es Aspergillus
spp. Aunque las pectín liasas no necesitan Ca2+, este catión estimula su actividad y desplaza su pH óptimo hacia
una zona más ácida. Ambas liasas son estables hasta ~50°C y en la pectato liasa (en la enzima Pe11C de
E. chrysanthemi) un residuo conservado ARG218 actúa como la base en el mecanismo de reacción para abstraer el
protón de C5 (Fig. 6.20). La actuación de ARG como base catalítica es inusual, pero el pK calculado para este
residuo es 9,5 (el pK resulta disminuido por el Ca2+ localizado), lo que resulta consistente con el pH óptimo
alcalino. La LYS cumple el mismo cometido que la ARG en otras pectato liasas. Aunque se desconoce el grupo
específico que actúa como donante del protón, muchos residuos ASP/GLU recubren el sitio activo, y el agua que
Enzimas 405
actúa como disolvente puede también cumplir esta función. Las enzimas exoactuantes disponen de pequeños subsitios
(limitados a las posiciones –1 o –2 en el sentido hacia el extremo no reductor), mientras que las enzimas endoactuantes
varían en la topografía de sus subsitios desde –2/+2 hasta –7/+3, dependiendo de la isoforma. Debido al valor de
pH de los tejidos vegetales y en especial de los de las frutas que se procesan para zumos, las pectín liasas son
generalmente más aplicables que las pectato liasas como ayuda en el procesado.
6.3.2.3.4 Aplicaciones de las enzimas que degradan la pectina [3,50,85,154,155]

Los usos comunes de las preparaciones de pectinasa y de enzimas relacionadas incluyen la maceración de
tejidos, licuefacción de tejidos, aumento del rendimiento en la recuperación o en la extracción (en zumos o acei-
tes), clarificación y facilitar el pelado (especialmente en frutas cítricas). Las preparaciones comerciales de «pectinasa»
a menudo son mezclas brutas de varios tipos de enzimas que degradan pectina, celulosa y hemicelulosa y la evolu-
ción de las aplicaciones de la «pectinasa» se hará en el futuro hacia la implementación de enzimas más específicas
para usos y productos concretos. En la mayoría de los casos, los tratamientos con enzimas se llevan a cabo a 20-
30°C durante varias horas en los procesos suaves o a 40-50°C durante 1-2 h en los más rigurosos (maceración,
licuefacción) al valor de pH del zumo o extracto concreto que se trate. El procesado de tejidos se inicia con un
triturado (molienda) o troceado grosero del tejido (Fig. 6.21). Los tejidos acondicionados groseramente se someten
a la acción de preparaciones enzimáticas seleccionadas para hidrolizar y despolimerizar las láminas medias (sus-
tancias pécticas), ya que esto es un paso que conduce a la liberación de las células individuales y agregados con sus
paredes celulares intactas (Fig. 6.21a). Así pues, la endopoligalacturonasa (especialmente) o las endopectín liasas
son las enzimas más adecuadas y las suspensiones de células resultantes pueden usarse en zumos o néctares que
lleven pulpa, en alimentos infantiles, o como ingredientes para otros productos.
Otras secuencias de procesado se inician con una molienda o trituración más fina del tejido (a menudo en un
molino de martillos), en la que el resultado deseado es la máxima expulsión del líquido, y a veces de la materia
Figura 6.21 Procesado comercial de los extractos de frutas y vegetales utilizando pectinasas. (Recopilado de la información
presente en Godfrey, T. and West, S. (Eds.), Industrial Enzymology, 2nd edn., Stockton Press, New York, 1996; Nagodawithana,
T. and Reed, G. (Eds.), Enzymes in Food Processing, 3rd edn., Academic Press, New York, 480p, 1993; Whitehurst, R.J. and
Law, B.A. (Eds.), Enzymes in Food Technology, 2nd edn., CRC Press, Boca Raton, FL, 2002).
pulposa. Los «extractos» de frutas pomáceas y bayas a menudo requieren la adición de enzimas para convertir el
puré viscoso en un puré semigelatinoso de fruta triturada (causado por la solubilización parcial de las pectinas y la
elevada capacidad de retención de agua de los sólidos) para maximizar la extracción del zumo durante el prensado
subsiguiente (Fig. 6.21b). Las enzimas que degradan las pectinas capaces de despolimerizar y degradar las pectinas
muy metoxiladas son más adecuadas e incluyen a la endopoligalacturonasa y la pectín metil esterasa en particular,
aunque la endopectín liasa puede usarse también. Los zumos preparados de esta manera pueden ser tanto claros
como turbios, dependiendo del tejido específico y de la combinación de enzimas utilizada.
La licuefacción de la fruta o del material vegetal se utiliza para transformar la masa del tejido en un producto
líquido, y esto también elimina la necesidad de una filtración o prensado posterior (Fig. 6.21c). Esto se logra con
una combinación robusta de pectinasas (poligalacturonasa, pectín metil esterasa, y pectín liasas), celulasas (tanto
exo como endo-β-glucanasas) y hemicelulasas (que actúan sobre los xilanos, mananos, galactanos y arabinanos).
Una vez se ha solubilizado la mayor parte del material de las láminas medias y de las paredes celulares (tanto como
el 80%), las células explotan con facilidad por efecto de la presión osmótica o por fuerzas de cizalla y liberan su
contenido líquido. La licuefacción se usa para convertir muchas frutas pulposas tropicales (mango, guayaba, bana-
na), aceitunas y manzanas en zumos o en extractos oleaginosos. Estos zumos pueden obtenerse turbios o claros
dependiendo del tejido y de las enzimas que se utilicen.
La última aplicación importante de las enzimas exógenas degradadoras de la pectina y de las paredes celulares
es la clarificación de zumos o extractos (Fig. 6.21d). Esta función exige la puesta en marcha de fenómenos que
desestabilicen cualquier «turbidez» presente en el zumo o en el extracto. La turbidez puede ser deseable en algunos
zumos (por ej., naranja), pero no en otros tales como los de manzana y uva, que se prefieren transparentes. La
turbidez viene conferida por partículas coloidales consistentes en proteínas (cargadas positivamente a los valores
de pH de los zumos) recubiertas de pectina (los residuos de ácido galacturónico están disociados parcialmente y
cargados negativamente). Las enzimas que despolimerizan la pectina solubilizan y rompen la capa de pectina, lo
que permite que las proteínas interaccionen electrostáticamente con las capas de pectina de otras partículas, dando
lugar a un proceso de agregación y floculación que proporciona una clarificación fácil. El valor de pH óptimo para
este proceso se ha estimado en ~3,6 y la clarificación se ve facilitada más a menudo por la pectín metil esterasa,
especialmente en combinación con la endopoligalacturonasa, o por la pectín liasa añadida en solitario en el caso de
las pectinas muy metoxiladas (por ej., en la manzana). El papel de la acción de la pectín metil esterasa consiste en
proporcionar sitios para que se formen enlaces cruzados entre las partículas mediados por el Ca2+, dando lugar a la
formación de agregados que sedimentan con facilidad. En algunos casos, los zumos clarificados pueden volverse
de nuevo turbios. La arabinosa supone ~90% del material polisacárido que participa en esta turbidez y dicha
turbiez se minimiza si se añade endoarabinanasa en el tratamiento de prensado y/o clarificación.
En zumos de cítricos (naranja), se realiza un proceso denominado «lavado de la pulpa» que utiliza las pectinasas
para reducir la viscosidad de la pulpa residual extraída con agua antes de que ésta sea de nuevo añadida al zumo
exprimido inicialmente de los tejidos. Los cítricos también pueden someterse a un pelado enzimático, rallando la
piel e infundiendo con ayuda de vacío pectinasa durante 1 h a 20-40°C; esto permite la digestión parcial de la capa
subcutánea blanca esponjosa (albedo), haciendo que la fruta sea más fácil de pelar y segmentar. Existen considera-
ciones específicas sobre los procesos y enzimas que deben utilizarse para las frutas concretas y sobre los productos
que se obtienen; tal información aparece recogida en otros tratados [155].
6.3.2.4 Otras glucosidasas

Las xilanasas (EC 3.2.1.8, β-1,4-D-xilano xilohidrolasa) son mayoritariamente glucosidasas β→β-conservado-
ras de las familias 10 y 11 (también existen xilanasas en otras familias) capaces de hidrolizar polímeros lineales de
unidades de xilosa unidas por enlaces β-1,4 (con varios grupos sustitutivos tales como arabinosa) [126,154] (Ta-
bla 6.6). Existen múltiples isoformas y pueden ser endo o exoenzimas (las endoactuantes son más importantes en
los alimentos). Los xilanos son un componente principal de la hemicelulosa que, conjuntamente con la celulosa,
integra la mayor parte del material de las paredes celulares de los productos vegetales. Las xilanasas se encuentran
en los vegetales (de una manera especialmente importante en los cereales), bacterias y hongos, y su masa molecular
generalmente varía entre los 16 y los 40 kDa. La enzima de B. circulans cuenta con residuos catalíticos de GLU78
Enzimas 407
(nucleófilo) y GLU172 (ácido/base general), variando de forma cíclica el pKa de este último residuo entre valores de
6,7 (en la enzima libre) y 4,2 (en la enzima unida al sustrato). La xilanasa A de Pseudomonas fluorescens tiene
subsitios para la unión al sustrato con una topografía de –4 a +1. En general los subsitios comprenden de 4 a 7
residuos. Las enzimas bacterianas se obtienen de especies de los géneros Bacillus, Erwinia y Streptomyces, mien-
tras que las de origen fúngico se obtienen de las especies de los géneros Aspergillus y Trichoderma. Las enzimas de
origen bacteriano tienen valores de pH óptimos de actuación de 6,0-6,5, mientras que las fúngicas son más activas
a pH 3,5-6,0, dependiendo del origen; la mayoría de las xilanasas son estables en un rango amplio de pH (entre 3 y
10). Las temperaturas óptimas para su actuación varían entre 40 y 60°C.
Las enzimas xilanasas son beneficiosas pues despolimerizan los arabinoxilanos (insolubles en agua) dando
lugar a pentosanos (solubles en agua) que tienen una elevada capacidad de retención de agua [104]. Esto aumenta
la viscosidad de la masa y provoca un incremento de la elasticidad, fuerza del gluten, y volumen final del pan. Una
adición excesiva de xilanasas o el empleo de xilanasas que actúan de modo preferencial sobre arabinoxilanos
solubles en agua, o bien no tiene efecto o da lugar a una masa pegajosa (provocada por una degradación excesiva
de los pentosanos que retienen agua), comprometiendo el rendimiento. La combinación de amilasas y xilanasas es
particularmente importante en la formulación de masas para congelar [155].
Las endoxilanasas son unas de las hemicelulasas usadas en el procesado de frutas y vegetales. Las xilanasas
también se usan en la industria cervecera para reducir la viscosidad del mosto, lo que facilita las operaciones de
separación/filtración, reduce la turbidez y aumenta ligeramente los rendimientos de los procesos. Se han usado
hemicelulasas/xilanasas de especies de Trichoderma y Penicillium en un proceso de molienda en húmedo para
separar el almidón del gluten en los granos de los cereales, especialmente en el trigo [50].
Otras enzimas degradadoras de la pared celular importantes son las que hidrolizan los enlaces β-1,4 y β-1,3 de
los glucanos y que se denominan colectivamente celulasas y glucanasas [154]. Estas enzimas se añaden para
ayudar en los procesos de licuefacción de las frutas y tejidos vegetales y a los granos en la fabricación de cerveza
para aumentar el contenido de azúcares fermentables, ayudar en la separación por filtración de los granos agotados
y del mosto, y reducir la incidencia de formación de turbidez debida a glucanos [3,155].
La lisozima ya ha sido descrita en lo relacionado con su mecanismo de acción (Ecuación 6.8, Fig. 6.15b y Tabla
6.6). Presenta potencial para su uso como agente antimicrobiano, particularmente frente a los microorganismos
Gram positivos [154]. Se encuentra entre las enzimas más pequeñas (14 kDa) y su origen más común es la clara de
huevo de gallina. Es estable a pH ligeramente ácido y pierde actividad en la clara de huevo durante el almacena-
miento a medida que el pH de la clara va aumentando hasta ~9. Se ha usado como agente antiséptico en la fabrica-
ción de queso [155] donde previene el «hinchamiento tardío» (formación de gas) por parte de especies del género
Clostridium en algunas variedades de queso [3,50].
6.3.3 ENZIMAS QUE TRANSFORMAN LAS PROTEÍNAS [154]
Para referirse a las enzimas que hidrolizan las proteínas, se usan los términos proteinasas o proteasas de modo
indistinto. Las reglas de nomenclatura permiten el uso de estos términos, pero es preferible denominar a estas
enzimas como exopeptidasas o como endopeptidasas. Las proteasas son algunas de las enzimas que han sido mejor
caracterizadas en cuanto al reconocimiento de su papel vital en el aparato digestivo humano y han sido también las
sometidas a una comercialización más temprana (Christian Hansen puso en el mercado un cuajo de ternero estan-
darizado para la fabricación de queso en al año 1874). Las peptidasas que transforman las proteínas alimentarias in
situ, o las que se añaden de modo exógeno para provocar la transformación de las proteínas, pertenecen a alguna de
las cuatro clases que se describen a continuación.
6.3.3.1 Serín proteasas

Entre las enzimas proteolíticas que primero se estudiaron se encuentran las serín proteasas secretadas por el
páncreas: tripsina (EC 3.4.21.4), quimotripsina (EC 3.4.21.1) y elastasa (EC 3.4.21.37); todas ellas están involucradas
en los procesos de digestión y asimilación de nutrientes en el organismo humano. La serín proteasa subtilisina (de
Bacillus subtilis) se puso como ejemplo de mecanismo nucleofílico asistido por un sistema de liberación de carga
en la Figura 6.4. La mayoría de los miembros de este grupo tienen masas moleculares de 25-35 kDa, y se caracte-
rizan por poseer un surco o hendidura superficial como sitio de unión para el sustrato. La selectividad les viene
conferida por el reconocimiento bien del residuo N-terminal (P1, para las enzimas pancreáticas antes citadas) o
bien del C-terminal (P1’) que integran el enlace peptídico escindible. Las subtilisinas procedentes de varias espe-
cies del género Bacillus son usadas ampliamente en la preparación de hidrolizados de proteínas y tienden a mostrar
una selectividad amplia por los aminoácidos que integran el enlace peptídico (el sitio de interacción S4/P4 también
confiere selectividad). Las endopeptidasas pancreáticas también se usan en varias aplicaciones y sus patrones de
selectividad fueron ilustrados en la Figura 6.14.
6.3.3.2 Aspártico (ácido) proteasas

Las aspártico proteasas se caracterizan por tener dos residuos de ASP altamente conservados como unidad
catalítica, y la mayoría de ellas son también activas en condiciones de acidez (pH 1-6) con valores óptimos en las
proximidades de pH 3-4 [154]. Algunos miembros conocidos de este grupo son la enzima digestiva pepsina, la
quimosina de ternero (también conocida como «renina» o como «cuajo», usada en la fabricación de queso), la
catepsina (que puede estar involucrada en el ablandamiento post mortem de la carne), y las peptidasas utilizadas
como sustitutos de la quimosina obtenidas de las especies de Mucor. Estas endopeptidasas tienen una masa molecular
típica de 34-40 kDa, son monoméricas y tienen en la proteína dos dominios separados por un bolsillo profundo de
unión al sustrato. Debido a su papel en la asimilación de nutrientes, las pepsinas muestran una amplia especificidad
por los enlaces peptídicos con una hendidura de unión al sustrato que se extiende desde P5 hasta P3’ [90]. El
mecanismo de reacción de la hidrólisis implica el concurso de una díada de residuos de ASP conservados que
actúan como ácido/base generales (ASP34, 216 en la quimosina) y un intermediario no covalente. En base a lo
observado en la pepsina humana, los residuos ASP32, 215 forman una plataforma coplanar que alberga agua en el
mismo plano, con la ASP215 actuando como la base general que activa el agua como nucleófilo (Fig. 6.22) [39,90].
El residuo ASP34 aumenta la electrofilicidad del carbono del enlace peptídico a escindir mediante el establecimien-
to de un puente de hidrógeno de barrera baja con el átomo de oxígeno del grupo carbonilo. La consecución del
intermediario tetraédrico (no unido covalentemente a la enzima) viene seguido de una transferencia sincronizada
intermolecular de un protón para protonar el átomo de N, lo que conduce a la rotura del enlace peptídico. La
disociación de los productos de la hidrólisis y la transferencia de un H+ de vuelta al residuo ASP32 regenera el
estado activo pendiente de la unión de otra molécula de agua. Esta arquitectura molecular, y este mecanismo,
explican el perfil de actividad a valores bajos de pH de las proteasas aspárticas (valores de pK de 1,5 y 4,5 para la
pepsina humana) y su capacidad de provocar reacciones de transpeptidación. El mecanismo por el que se produce
la transpeptidación todavía no es del todo bien conocido, pero debe necesitar velocidades diferenciales de libera-
ción de los fragmentos peptídicos y la unión de otro péptido antes de la siguiente molécula de agua en el ciclo
catalítico.
Figura 6.22 Mecanismo de reacción de las proteasas aspárticas. (Redibujado a partir de Wlodawer, A. et al., Catalytic pathways
of aspartic peptidases, in Handbook of Proteolytic Enzymes, 3rd edn., Rawlings, N.D. and G. Salveson (Eds.), Vol. 1, Academic
Press, New York, 2013, pp. 19-26.).
Enzimas 409
La selectividad en la hidrólisis proteica entre las proteasas aspárticas es bastante parecida y viene determinada
por el hecho de que reconocen residuos no polares (aminoácidos aromáticos, LEU) con una selectividad amplia
(incluyendo ASP y GLU) en el sitio P1 del sustrato. Con anterioridad, en este capítulo se ha presentado un análisis
de las características particulares de la especificidad de la quimosina hacia los análogos de la κ-caseína (Tabla 6.4).
6.3.3.3 Cisteín (sulfhidrilo) proteasas [126,154]

Las cisteín proteasas son un grupo diverso de enzimas (se conocen más de 130) presentes en los animales,
plantas y microorganismos. La mayoría de los miembros de este grupo pertenecen a la familia de la papaína, siendo
otros miembros la quimopapaína (EC 3.4.22.6) (con múltiples isoformas) y la caricaína (EC 3.4.22.30) presentes
en el látex de la planta Carica papaya, la actinidina (EC 3.4.22.14) del kiwi y la grosella, la ficina (EC 3.4.22.3) del
higo (látex), la bromelaína (EC 3.4.22.4) de la piña, y las catepsinas lisosomales de los tejidos animales [154]. Un
sistema cisteín proteasa singular en el músculo lo constituye la calpaína (con múltiples isoformas), una enzima que
consta de dos subunidades, es activada por el Ca2+ y juega un papel destacado en el ablandamiento post mortem del
músculo. Por lo general, las enzimas de este grupo tienen una masa molecular de 24-35 kDa, presentan una activi-
dad óptima a pH 6,0-7,5 y pueden resistir temperaturas de hasta 60-80°C (propiedad conferida en parte por la
presencia de tres puentes disulfuro). Los residuos conservados (tomando la papaína como referencia) incluyen la
unidad catalítica formada por el par de iones CYS25 e HIS159, asistida por ASN175, y GLN19 para ayudar a estabili-
zar el oxianión intermediario. Cada uno de los dos dominios de la proteína contribuye con un residuo catalítico al
par iónico que se halla posicionado en una hendidura profunda situada entre los dominios. El mecanismo es único
por cuanto la catálisis nucleofílica y la ácida general tienen lugar a través de un par de iones tiolato-imidazolio
(Fig. 6.23). El grupo tiolato (RS–) ataca a la amida electrofílica C, dando lugar a un intermediario covalente oxianión
estabilizado por el NH de la amida de CYS25 y GLN19. La protonación general ácida del grupo amino saliente por
la HIS159 proporciona el intermediario tioéster que resulta desplazado finalmente por el complejo HIS159-agua
Figura 6.23 Mecanismo de reacción de las cisteín proteasas. (Redibujado a partir de Sinnott, M. (Ed.), Comprehensive Biological
activada (a través de otro intermediario tetraédrico). No se muestra el papel de ASN175, cuyo oxígeno del grupo
amida forma un puente de hidrógeno con el átomo Nε2 del imidazol de HIS159. Las cisteín proteasas son similares
en cuanto a selectividad hidrolítica. Se considera que poseen una selectividad amplia hacia los enlaces peptídicos,
con una preferencia por los aminoácidos aromáticos y básicos en la posición P1 y por los residuos no polares del
sustrato (especialmente PHE) en la posición P2 del sustrato peptídico (recordar la Fig. 6.13).
6.3.3.4 Metaloproteasas
Las metaloproteasas constituyen la cuarta clase general de enzimas proteolíticas. Los miembros más conocidos
de este grupo incluyen la carboxipeptidasa A exoactuante (peptidil-L-aminoácido hidrolasa, EC 3.4.17.1, una enzi-
ma digestiva), la termolisina endoactuante (de Bacillus thermoproteolyticus, EC 3.4.24.27) aislada originalmente
en una estación termal en Japón, y la endoproteasa neutra de Bacillus amyloliquefaciens [154]. La mayoría de las
metaloproteasas de importancia para la calidad y en el procesado de los alimentos son enzimas exoactuantes y
necesitan Zn2+ como metal. Se clasifican en cinco familias en base a la geometría de la zona rica en HIS que se une
al metal y que cuenta también con un residuo GLU; sus secuencias primarias son proteínas que varían en tamaño entre
15 y 87 kDa. Tanto la carboxipeptidasa A (87 kDa) como la termolisina (35 kDa) tienen bolsillos de unión hidrofóbicos
que favorecen el alojamiento dentro de ellos de las cadenas laterales de los aminoácidos no polares y aromáticos
(especialmente LEU y PHE) posicionados en el subsitio P1’ del sustrato. En la carboxipeptidasa A se crea un pequeño
«agujero» en parte por los aminoácidos ARG145 y ASN144 en el subsitio S1’ de la enzima, y esto le confiere su
naturaleza de enzima exoactuante en el extremo C-terminal mediante coordinación con el grupo P1’-COO– del
sustrato. La termolisina (una endopeptidasa) no tiene un bolsillo de unión tan constreñido como el de la
carboxipeptidasa y puede albergar un segmento más largo del péptido.
Se ha propuesto un modelo mecanístico unificado para las metaloproteasas, compatible al mismo tiempo con
una diversidad de los residuos catalíticos [126]. En la termolisina, el Zn2+ está coordinado con –OH/H2O (el coor-
dinado tienen un pKa de ~5) y resulta desplazado al unirse el sustrato (Fig. 6.24). La HIS231 actúa como un catali-
zador base general con un pKa de ~8 (asistida por la ASP226) para activar el agua nucleofílica. Aunque durante un
tiempo se pensó que GLU143 era el catalizador base, en la actualidad se cree que proporciona estabilidad electrostática
al intermediario tetraédrico δ+C–O del enlace peptídico escindible; Zn2+ se coordina también con el carbonilo δ–O
del enlace peptídico escindible. Finalmente, la desintegración del intermediario, para dar lugar a los péptidos que
constituyen los productos, restaura el sitio activo. En el caso de la carboxipeptidasa A, la ausencia de HIS que actúe
como base general se ve compensada por la capacidad del residuo carboxilo terminal del sustrato para activar el
agua nucleofílica (la catálisis asistida por el sustrato no resulta rara). Por lo demás, las características mecanísticas
son casi idénticas a las de la termolisina. Aunque la acción exopeptidásica de la carboxipeptidasa puede estar
conferida por el pequeño tamaño del bolsillo hidrofóbico de unión, el hecho de que el sustrato deba proporcionar la
función de base general (carboxilato) puede resultar igual de importante.
6.3.3.5 Aplicaciones de la acción proteolítica [76,85,154,155]

Se dispone de proteasas comerciales con varios grados de pureza, y algunas contienen agentes proteolíticos
múltiples como ocurre de modo característico con las preparaciones de Aspergillus spp. Dependiendo de la aplica-
ción, se necesita una selectividad más estricta o más amplia en la hidrólisis proteica. La selectividad amplia tam-
bién puede conseguirse añadiendo preparaciones de proteasas múltiples. En muchos casos, las proteasas secretadas
por los microorganismos fermentadores, bien adventicios o añadidos deliberadamente como un cultivo, contribu-
yen sustancialmente a la proteólisis en las matrices alimentarias. En esta sección se describen algunas de las apli-
caciones comerciales importantes de las enzimas proteolíticas.
6.3.3.5.1 Hidrolizados de proteínas [85,154]

La hidrólisis de las proteínas por acción de peptidasas se lleva acabo para mejorar la funcionalidad de las
proteínas/péptidos en relación con sus propiedades nutricionales, de flavor/sensoriales, texturales, y fisicoquímicas
(solubilidad, capacidad espumante, emulsificante, gelificante), así como para reducir su alergenicidad (se citan
ejemplos concretos en el Capítulo 5). Generalmente, una proteína aislada se trata con una endopeptidasa seleccio-
Enzimas 411
Figura 6.24 Mecanismo de reacción de las metaloproteasas. (Redibujado a partir de Sinnott, M. (Ed.), Comprehensive Biological
nada en un proceso discontinuo durante unas pocas horas, tras de lo cual la enzima añadida se inactiva con ayuda
de un tratamiento térmico. Los factores más importantes que determinan la elección de la proteína que va a usarse
como fuente del hidrolizado son el valor/coste, propiedades funcionales intrínsecas (que se limitan de alguna
manera para garantizar el procesado hidrolítico), la composición en aminoácidos, y hasta cierto punto la secuencia
primaria (si se conoce). Estos factores se consideran en contexto con la información disponible sobre la selectivi-
dad de la endopeptidasa, especialmente si existen sitios preferidos para la hidrólisis de cara a obtener la funciona-
lidad deseada. Además, las exigencias en cuanto a pH y temperatura también influyen a la hora de elegir entre las
proteínas o los péptidos candidatos para obtener un resultado deseado. Habitualmente se utilizan endopeptidasas
para obtener descensos rápidos del peso molecular medio de los péptidos, mientras que se usan exopeptidasas para
hidrolizar pequeños oligopéptidos hasta sus aminoácidos constitutivos.
Las proteínas (generalmente procedentes de carne, leche, pescado, trigo, vegetales, legumbres o levaduras)
deben someterse a un pretratamiento que las desnaturaliza parcialmente, lo que facilita el acceso de las peptidasas
y el ataque hidrolítico (una desnaturalización excesiva puede conducir a una agregación e impedir la hidrólisis).
Las cantidades de proteína y enzima se deben equilibrar de tal manera que la cantidad de proteína sea suficiente-
mente alta para que la enzima reaccione en las proximidades de su Vmáx con una autodigestión de la enzima limita-
da, a pesar de que la inhibición por los productos provocada por los péptidos que se van acumulando puede atenuar
la reactividad. Los niveles de proteína en las reacciones en discontinuo a menudo son del 8-10% siempre que no
haya limitaciones en la solubilidad, y la cantidad de enzima que se añade es generalmente de ~2% de la proteína,
dependiendo de la pureza de la preparación enzimática. El progreso de la reacción se monitoriza de una o varias
maneras (véase Capítulo 5), y la reacción se detiene una vez se ha alcanzado el grado de hidrólisis (DH) deseado.
Generalmente son deseables valores de DH de 3-6% (tamaño medio de los péptidos de 2-5 kDa, respectivamente)
para obtener una funcionalidad física determinada; los valores de DH ~8% y un tamaño medio de los péptidos de
1-2 kDa proporcionan una solubilidad óptima para emplear el hidrolizado en la confección de preparados para
deportistas y para uso en nutrición clínica; los valores de DH más exhaustivos (de hasta 50-70%), para dar lugar a
pequeños péptidos de un tamaño molecular medio <1 kDa y a aminoácidos, se utilizan para la elaboración de
alimentos infantiles, o alimentos hipoalergénicos, o para la preparación de ingredientes saborizantes con tonos
salados para sopas o salsas. Cuanto mayor es el DH alcanzado, mayor es la posibilidad de acumulación de péptidos
amargos (pequeños e hidrofóbicos) y a menudo se necesita adoptar medidas para controlar este defecto potencial
del flavor (que se discute más adelante). Más recientemente, han aparecido publicaciones que describen la prepa-
ración de péptidos bioactivos a partir de hidrolizados de proteínas, incluyendo fosfopéptidos obtenidos de las
caseínas que se unen al Ca2+ y se usan para aumentar la biodisponibilidad de minerales, preparaciones antioxidantes,
y péptidos que inhiben la enzima que transforma la angiotensina en el plasma humano (como modo potencial de
intervención para reducir la presión sanguínea). Las proteasas también pueden usarse para recuperar los restos de
proteínas musculares, a partir de las espinas y huesos de pescados y animales, en forma de hidrolizados de proteí-
nas; esta operación generalmente comprende una incubación a 55-65°C durante 3-4 h. La mezcla final, producto de
la hidrólisis enzimática de las proteínas, puede necesitar un postratamiento de refinado y/o separación de cara a
obtener un producto derivado adaptado de modo ideal a la aplicación prevista.
6.3.3.5.2 Coagulación de la leche [3,154]

La quimosina de ternero (cuajo) y los sustitutos de la quimosina se añaden a la leche para conseguir su coagu-
lación inicial como primer paso en el proceso de elaboración del queso. La actividad coagulante de la leche se
relaciona con la hidrólisis específica del enlace PHE105-MET106 de la κ-caseína, liberándose un glucomacropéptido
(la fase enzimática) que crea una superficie hidrofóbica sobre las micelas que las lleva a agregarse (una fase no
enzimática). La especificidad singular de la quimosina ya fue descrita antes en este capítulo (Tabla 6.4). Se añaden
cultivos iniciadores a la leche a 40-45°C para provocar un descenso del pH hasta valores de 5,8-6,5, tras de lo cual
se añade la quimosina para iniciar la coagulación. Como resultado de las fases subsiguientes de la fabricación del
queso, una parte de esta actividad enzimática queda retenida en la cuajada y contribuye a la maduración del queso
y al desarrollo del flavor durante la maduración. Las proteasas de los cultivos iniciadores también contribuyen a la
proteólisis continuada y al desarrollo del flavor durante la maduración. La primera enzima obtenida por ingeniería
genética autorizada para el uso alimentario fue una quimosina recombinante de E. coli K-12 (CHY-MAX®); actual-
mente, son de uso común preparaciones comerciales similares a ella. Las enzimas sustitutivas de la quimosina
incluyen las pepsinas bovina y porcina y las endopeptidasas aspárticas de Rhizomucor spp. y Cryphonectria
parasitica; estas enzimas poseen valores de la ratio capacidad coagulante/actividad proteolítica decrecientes en el
orden en el que se han citado (lo que conduce a una disminución del rendimiento del proceso de coagulación y a la
presencia potencial de amargor en el queso).
6.3.3.5.3 Ablandamiento de la carne [3,139]

La papaína y otras sulfhidrilo endopeptidasas (bromelaína y ficina) se aplican a los músculos o a las carnes que
no se ablandan lo suficiente durante la maduración post mortem. Estas enzimas son eficaces para esta finalidad
puesto que pueden hidrolizar el colágeno y la elastina, que son proteínas del tejido conjuntivo que contribuyen a la
dureza de la carne. Sin embargo, el ablandamiento mediante la adición de endopeptidasas exógenas presenta dos
inconvenientes: Es posible que las enzimas se añadan en una «sobredosis» y el patrón de ablandamiento no sea el
mismo que ocurre en la carne madurada/ablandada de modo natural (los patrones de selectividad proteolítica son
diferentes). La enzima (generalmente la papaína) en forma de polvo (utilizando sal u otro material innocuo como
vehículo) puede aplicarse directamente sobre la superficie de las carnes o, en una disolución salina, puede inyectarse
en las piezas o las piezas pueden sumergirse en un baño de dicha disolución. Es posible la aplicación de la enzima ante
mortem, inyectando en los animales por vía endovenosa una disolución salina de la enzima bastante pura 2-10 minu-
tos antes del sacrificio, a veces tras el aturdimiento; esta práctica ayuda a la distribución de la enzima por todos los
tejidos musculares. La inyección de papaína inactivada (en forma de disulfuro) elimina cualquier molestia para los
animales, puesto que la enzima sólo resulta activada por las condiciones reductoras que se instauran post mortem
Enzimas 413
en el músculo. En muchos casos, habida cuenta de la relativa estabilidad frente al calor de estas endopeptidasas,
quizás se produzca tanto efecto ablandador durante el cocinado de la carne como durante el manejo y almacena-
miento a refrigeración de la misma.
6.3.3.5.4 Elaboración de bebidas [85,139]

En la cerveza, existe un defecto denominado «turbidez de la refrigeración» que puede estar causado por la
asociación (formación de un complejo) entre los taninos y las proteínas. La papaína se usa desde hace mucho
tiempo (desde 1911) para hidrolizar la proteína y minimizar la formación de turbidez, si bien en la actualidad
pueden usarse con esta finalidad la bromelaína y la ficina, así como otras proteasas bacterianas y fúngicas. La
endopeptidasa se añade en la post fermentación y antes del filtrado final. La papaína se destruye al final a través del
tratamiento de pasteurización típico que se aplica a la cerveza; una actuación excesiva de la papaína puede condu-
cir a una pérdida de estabilidad de la espuma [155]. Otras proteasas, particularmente la proteasa neutra de
B. amyloliquefaciens, se añaden durante la etapa de maceración para aumentar la formación de nitrógeno soluble a
partir de la proteína para ayudar a la fermentación posterior (y a la vez dejar menos proteína disponible para
participar en la formación de turbidez). En la cerveza es importante el control y la medida de la proteólisis, puesto
que es necesaria la presencia de alguna proteína residual para mantener los atributos de calidad específicos.
6.3.3.5.5 Acondicionamiento de las masas de panadería [3,85,155]

Las formulaciones de las masas y los distintos tipos de harina usados (de aptitud panaria o galletera) confieren la
fuerza y las propiedades reológicas de la masa y esto influye sobre la calidad del producto final. El pH de la masa es
generalmente ~6, pero puede variar ampliamente y aproximarse a 8,0 en algunos casos; las proteasas disponibles son
adecuadas para el rango de pH neutro/alcalino en el caso de las enzimas de origen bacteriano (Bacillus spp.) y para el
rango ácido en el de las enzimas de origen fúngico (Aspergillus spp.). Las proteasas se usan para modificar y optimizar
la fuerza de la masa para un producto particular y sirven para reducir el tiempo de amasado necesario para obtener la
viscoelasticidad apropiada de la masa. Las proteasas también pueden mejorar las prestaciones de harinas con el gluten
dañado, lo que daría lugar a masas con menor elasticidad y más rígidas. Las proteasas exógenas se añaden para influir
sobre la hidrólisis controlada del gluten durante la fase de acondicionamiento de la masa, aunque las proteasas pueden
continuar actuando durante la elaboración del pan hasta que resultan finalmente inactivadas por el calor. La hidrólisis
del gluten debilita la red tridimensional del gluten, lo que da como resultado un aumento de la extensibilidad y de la
viscoelasticidad de la masa que se va desarrollando, y estas propiedades están asociadas con un aumento del volumen
del pan, el desarrollo de una miga uniforme y la terneza del producto final. La hidrólisis controlada se consigue
utilizando una proteasa con selectividad moderada hacia el enlace peptídico (para evitar una hidrólisis exhaustiva) y
utilizando una dosis que proporcione el grado de hidrólisis deseado antes de la inactivación durante el proceso de
cocción. Una proteólisis excesiva dará lugar a un producto con poco volumen y defectos de textura. El uso de proteasas
menos específicas (o una mezcla de proteasas) es apropiado cuando se necesitan masas más débiles para darle deter-
minadas formas tales como la pizza, barquillos o galletas. La elección de la proteasa puede resultar crítica para la
calidad del producto, puesto que las proteasas presentan diferentes especificidades de reacción frente a las proteínas
mayoritarias del gluten, gliadina o glutenina (Tabla 6.7). Tales diferencias pueden explicar los diferentes grados de
mejora de los comportamientos de las masas conseguidos con la elección de la proteasa exógena.
6.3.3.5.6 Modulación del flavor (eliminación del amargor) [106]

Los hidrolizados de proteínas y los alimentos fermentados (queso, cacao, cerveza, carnes curadas, salsa de
pescado, soja) sometidos a grados de proteólisis intermedios por acción de endoproteasas pueden desarrollar amar-
gor cuando se acumulan pequeños péptidos hidrofóbicos por encima de sus umbrales de percepción por el sentido
del gusto. Para eliminar el amargor en tales alimentos, se utilizan exopeptidasas. Se dispone a tal fin de enzimas de
origen bacteriano, fúngico, vegetal y animal (más de 70 catalogadas por la IUBMB). Las exopeptidasas pueden ser
específicas para el extremo C-terminal (carboxipeptidasas) o para el N-terminal (aminopeptidasas) y también para
la liberación de un único aminoácido, un dipéptido o de un tripéptido a partir del sustrato. Existe una selectividad
para algunos residuos de aminoácidos en el(los) sitio(s) P1/P1’ o P2/P2’ del sustrato que se superpone con los otros
tipos de selectividad anteriormente comentados; dos ejemplos de ello los constituyen la X-PRO-dipeptidil amino-
TABLA 6.7
Selectividad hidrolítica de las proteasas frente a las proteínas mayoritarias del gluten.
Actividad relativa frente a la

Ratio de actividad
Preparación de proteasa Glutenina Gliadina sobre la glutenina-gliadina
A 1,00 2,17 0,46

B 0,50 0,17 3,0
C 0,69 0,064 11
D 1,30 0,90 1,4
E 0,37 0,19 2,0
F 0,55 0,87 0,63
H 2,07 3,02 0,68
I 2,68 0,38 7,0
G 0,60 0,038 16
Fuente: Adaptada de Tucker, G.A. and Woods, L.F.J. (Eds.), Enzymes in Food Processing, 2nd edn., Blackie, New York, 1995.
Nota: En el estudio original no se especificaba la naturaleza de las preparaciones individuales de proteasas.
peptidasa y la LEU-aminopeptidasa. Las exopeptidasas a menudo necesitan la acción previa de endopeptidasas

específicas para asegurar que se degradan de modo eficiente los péptidos amargos. Las exopeptidasas de las bacte-
rias lácticas se encuentran entre las mejor estudiadas y este conocimiento de sus características permite la utiliza-
ción estratégica de cultivos iniciadores o fermentadores, o de extractos celulares, para controlar el amargor en los
alimentos fermentados o proteolizados. A modo de ejemplo, Lactobacillus helveticus CNRZ32 es una cepa comer-
cial que reduce el amargor e intensifica en desarrollo del flavor en el queso. Esta bacteria posee un sistema enzimático
proteolítico complejo que incluye endopeptidasas con especificidad por la posprolina (PRO en el sitio S1) y una
aminopeptidasa de acción general [17]. Actuando de modo asociado, estas actividades enzimáticas facilitan la
degradación de los péptidos amargos hasta aminoácidos libres, reduciendo de este modo el amargor.
6.3.3.5.7 Síntesis de aspartamo [19,61,154]

La termolisina, una metaloproteasa, se usa para sintetizar aspartamo (L-ASP-L-PHE-OCH3), un sustituto del
azúcar usado fundamentalmente en bebidas analcohólicas bajas en calorías. La termolisina es un catalizador espe-
cialmente adecuado para este proceso: es estable hasta los 90°C, presentando una actividad óptima a 80°C. Resulta
activada >10 veces por los niveles elevados de sal (1-5 M), lo que le permite funcionar bien a osmolaridades
elevadas (concentraciones elevadas de sustrato), tolera los disolventes orgánicos, es selectiva en la preparación del
enlace peptídico actuando en el grupo α-COOH de la ASP (el método químico puede provocar reacciones en el
grupo β-COOH de la ASP, creando un análogo amargo), y no hidroliza el grupo metil éster de la PHE (que resulta
necesario para el efecto edulcorante). El proceso de síntesis ha evolucionado hasta el uso de una termolisina
inmovilizada en un reactor que opera en discontinuo utilizando etil acetato-agua (monofase) como medio de reac-
ción, ofreciendo rendimientos de >95% a 55°C.
6.3.3.6 Transglutaminasa [36,154]

Las transglutaminasas (EC 2.3.2.12, γ-glutamil péptido, amino-γ-glutamil transferasa) se encuentran en anima-
les, plantas y microorganismos (especialmente Streptoverticillium spp.). En los animales, poseen papeles cruciales
en el entrecruzamiento (establecimiento de enlaces entrecruzados) de la fibrina (en la coagulación de la sangre) y
en la queratinización (desarrollo del tejido de la epidermis), entre otras funciones; en las plantas parecen estar
involucradas en la formación del citoesqueleto y de las paredes celulares, mientras que en las bacterias pueden
estar implicadas en el ensamblado de las capas en las células que se hallan esporulando. Las transglutaminasas de
los mamíferos (TG) son típicamente proteínas monoméricas de 75-90 kDa, mientras que las enzimas microbianas
Enzimas 415
tienen alrededor de 28-30 kDa. Por lo general necesitan Ca2+ para ejercer su actividad y actúan de modo óptimo a
valores de pH neutros o ligeramente alcalinos. Como ocurre con las endopeptidasas, las proteínas parcialmente
desnaturalizadas o desplegadas facilitan el acceso de las TG. Los tipos de reacción que catalizan las TG son los
siguientes ( representa el esqueleto de la proteína):
(6.26)
(6.27)
(6.28)
Estas reacciones son la base de las aplicaciones en los alimentos. La reacción más importante es el entrecru-
zamiento de las proteínas a través del establecimiento de un enlace isopeptídico (Ecuación 6.26), lo que hace que
aumente el tamaño de las proteínas resultantes y que se cree una red extensa dentro de la matriz alimentaria.
Algunos ejemplos de aplicaciones en las que se hace uso de esta reacción son la creación de geles irreversibles y
estables frente a la temperatura por entrecruzamiento de proteínas de huevo, leche o soja, y de gelatina.
La adición de TG durante las primeas fases de la producción de yogur sirve para aumentar la fuerza del gel y
reducir la sinéresis, mientras que en la fabricación de queso puede proporcionar un mayor rendimiento de proteína.
En los productos de panadería, la adición de TG a las masas facilita la formación de una red por parte del gluten,
aumentando la estabilidad de la masa, la fuerza del gluten, y la viscoelasticidad, provocando una mejora del volu-
men, la estructura y la miga del producto final. En los alimentos derivados del músculo, las aplicaciones de TG
giran alrededor del aumento o del control de la fuerza del gel en los productos de surimi, actuando como un agente
de unión en la creación de productos cárnicos reestructurados a partir de fragmentos de carne pequeños o triturados
con escaso valor comercial; también se emplean para aumentar la fuerza de los geles proteicos en los productos
derivados del jamón y en embutidos.
6.3.4 ENZIMAS QUE TRANSFORMAN LOS LÍPIDOS
6.3.4.1 Lipasa
Las lipasas (EC 3.1.1.3, triacilglicerol acilhidrolasa) difieren de otras carboxilesterasas en que sólo actúan en la
interfase aceite-agua. Este requisito se ve fácilmente al observar la relación entre la velocidad de reacción y los
niveles crecientes de sustrato (Fig. 6.25). Mientras que las esterasas reaccionan con los sustratos solubles siguien-
do la cinética convencional de Michaelis-Menten, las lipasas no acceden con facilidad a sus sustratos hasta que
estos han excedido su solubilidad y comienzan a formar agregados coloidales, tales como micelas, que presentan
una interfase. Las lipasas y las carboxilesterasas poseen de un modo casi invariable la tríada catalítica GLU(ASP)-
SER-HIS como locus transformador del mismo modo que se ilustró para las serín proteasas (Fig. 6.4). Así pues, el
mecanismo nucleofílico que implica la formación de un intermediario acil enzima y de dos intermediarios tetraédricos
es igualmente aplicable a las lipasas.
Mientras que la actividad de las lipasas endógenas a menudo se asocia con la hidrólisis de los acilgliceroles y con
problemas de degradación lipídica y/o rancidez hidrolítica (o que conducen a la rancidez oxidativa puesto que los
ácidos grasos liberados son más susceptibles de sufrir oxidación), las lipasas exógenas se usan con fines beneficiosos.
Actualmente, los usos comerciales de las lipasas están relacionados con la liberación de ácidos grasos (de cadena
corta) saborizantes a partir de lípidos y con la reorganización de los ácidos grasos en el esqueleto de glicerol para crear
triacilgliceroles más funcionales y de mayor valor a partir de lípidos con un valor bajo. Ambas aplicaciones se basan
en el empleo de lipasas con las selectividades de reacción necesarias para dar lugar a los productos deseados.
La selectividad de las lipasas fue presentada en la Figura 6.16 e incluye selectividad hacia el grupo acilo del
ácido graso, hacia la posición del enlace éster a lo largo del esqueleto del sn-glicerol, tamaño del glicérido
(mono di o triacilglicerol), así como interacciones entre estos factores, lo que les confiere una estereoselectividad
Figura 6.25 Diferenciación entre (a) esterasa y (b) lipasa en base a las propiedades del sustrato. (Redibujado a partir de Sarda,
L. and Desnuelle, P., Biochim. Biphys. Acta, 30, 513, 1958).
característica. Los tipos de selectividad que muestran muchas de las lipasas comercialmente relevantes o las lipasas
prometedoras caracterizadas a partir de más de 100 orígenes se muestran en la Tabla 6.8. Los tipos de selectividad
particularmente raros incluyen la preferencia hacia los sitios sn-2 del glicerol que muestran la lipasa A de Candida
antarctica y una isoforma minoritaria de la lipasa de Geotrichum candidum, aunque esta característica podría estar
relacionada con el tipo de sustratos (grupos acilo de ácidos grasos) que se usaron en el estudio de esta propiedad.
Muchas de las lipasas que se incluyen en la Tabla 6.8 fueron analizadas en cuanto a su estereoselectividad (Fig. 6.16d).
Las lipasas tienen habitualmente rangos de pH y de temperatura óptimos de actuación de 5,0-7,0 y 30-60°C, respecti-
vamente.
6.3.4.2 Aplicaciones de las lipasas

6.3.4.2.1 Generación de flavor
Las lipasas usadas para generar flavores «picantes» relacionados con el envejecimiento en quesos, especialmente
de las variedades italianas y de los madurados por mohos, son selectivas para la hidrólisis y liberación de ácidos
grasos de cadena corta (C4-C8) a partir de los triacilgliceroles de la grasa láctea e incluyen lipasas pregástricas de
cabrito, cordero y ternero [3,50,155]. Puesto que estos ácidos grasos de cadena corta están preferentemente situados
en la posición sn-3 del glicerol, una lipasa selectiva para este sitio sería la aplicable para este propósito. La lipasa del
látex de la papaya es selectiva para la posición sn-3 del glicerol, pero, puesto que el látex de la papaya contiene
papaína, no sería adecuado su uso en el queso. Como alternativa, algunas lipasas microbianas (de C. rugosa, o
de R. miehei y A. niger) también son conocidas por su capacidad de liberar ácidos grasos de cadena corta y/o ácidos
grasos unidos en las posiciones sn-1,3 del glicerol, a partir de la grasa láctea (Tabla 6.8). La mayoría de las lipasas
hidrolizan (liberan) ácidos grasos insaturados que pueden ser precursores de productos de oxidación de cetonas y
lactonas, algunos de los cuales son también resultado del metabolismo microbiano. Las lipasas también se usan para
preparar quesos modificados enzimáticamente para emplear como quesos procesados, productos para untar, salsas o
ingredientes saborizantes; una pasteurización posterior sirve para destruir la actividad enzimática residual. Una sobre-
dosificación de la enzima puede conducir a la aparición de flavores jabonosos o demasiado picantes.
6.3.4.2.2 Reestructuración de los acilgliceroles

Otro uso mayoritario de las lipasas es su empleo en la estrategia de reordenamiento de los grupos ácido graso
para obtener una distribución predeterminada en las posiciones sn del glicerol y para crear lípidos de alto valor a
Enzimas 417
TABLA 6.8
Patrones de selectividad de algunas lipasas de interés comercial o usadas en aplicaciones comerciales.
Preferencia hacia
Lipasa Sitios (sn) Ácido grasoa Glicerolípidob Otra propiedad

en el glicerol o comentario
1. Aspergillus niger sn-1,3 >> sn-2 Cadena corta, 16 AG

All rights reserved. May not be reproduced in any form without permission from the publisher, except fair uses permitted under U.S. or applicable copyright law.
2. Candida antarctica A: sn-2 > sn-1,3 Cadena corta, 18:X AG Bolsillo de unión con el
formas A y B B: sn-1,3 > sn-2 6-10 > amplia AG; GL ácido graso ~13°C
3. Candida rugosa sn-1,3 > sn-2; 4,8 > amplia AG Múltiples isoformas
no específica (antigua C. cylindracea)
Bolsillo de unión con el
ácido graso ~17°C
4. Carica papaya sn-1,3 > sn-2 4, cadena corta AG La fuente es el látex que
contiene papaína
5. Geotrichum candidum No específica; 8, cadena larga, 18:X AG Múltiples isoformas
sn-2 > sn-1,3 (la isoforma minoritaria
es selectiva para sn-2)
6. Patatina (tubérculo sn-1,3 > sn-2 8,10 MAG > DAG; Acilhidrolasa general
de la patata) GL, PL de lípidos
7. Penicillium spp. No específica; Cadena larga MAG, DAG Múltiples isoformas
sn-1,3 > sn-2
8. Pancreática sn-1,3 4 > amplio AG Bolsillo de unión con el
(estrictamente ácido graso ~8°C
específica)
9. Pseudomonas spp. No específica; 8,16 AG Bolsillo de unión con el
sn-1,3 > sn-2 ácido graso similar al de
Burkholderia spp. ~14°C
10. Rhizomucor miehei sn-1,3 >> sn-2 8-18 AG; PL, GL Bolsillo de unión con el
ácido graso ~18°C
11. Rhizopus arrhizus sn-1,3 >> sn-2 8-14 AG; GL, PL Las lipasas de Rhizopus spp.
son casi idénticas
Fuentes: Ader, U. et al., Screening techniques for lipase catalyst selection, in Methods in Enzymology, Rubin, B. and E.A. Dennis (Eds.),
Vol. 286, Lipases, Part B. Enzyme Characterization and Utilization, Academic Press, New York, pp. 351-387, 1997; Gunstone, F.D.
(Ed.), Lipid Synthesis and Manufacture, CRC Press LLC, Boca Raton, FL, 472 p., 1999; Lee, C-H. and Parkin, K.L., Biotechnol.
Bioeng., 75, 219, 2001; Persson, M. et al., Chem. Phys. Lipids, 104, 13, 2000; Pinsirodom, P. and Parkin, K.L., J. Agric. Food Chem.,
48, 155, 2000; Pleiss, J. et al., Chem. Phys. Lipids, 93, 67, 1998; Rangheard, M-S. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1004, 20, 1989;
Sugihara, A. et al., Protein Eng., 7, 585, 1994; Yamaguchi, S. and Mase, T., Appl. Microbiol. Biotechnol., 34, 720, 1991.
Nota: Son frecuentes las ambigüedades e inconsistencias entre las observaciones recabadas; tal situación es debida a la variedad de
diseños de reacción en base a los que se establecieron los patrones de selectividad.
a
Los ácidos grasos se designan por el número de átomos de carbono en la cadena n-acilo; 18:X quiere decir un ácido graso con 18
átomos de carbono y con X = 0-3 dobles enlaces.
Copyright 2019. Editorial Acribia, S.A.
b
AG, acilgliceroles; GL, glucolípido; PL, fosfolípido; MAG, monoacilglicerol; DAG, diacilglicerol.
partir de lípidos con un valor bajo [53]. El resultado previsto es la preparación de «lípidos estructurados». El
planteamiento básico en la reestructuración de los lípidos por acción de lipasas se basa en el empleo de un medio de
reacción microacuoso (<1% de humedad) constituido generalmente por un disolvente orgánico o por el mismo
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sustrato lipídico (que sirve a la vez como «disolvente»). En estas condiciones, la reactividad neta de los lípidos
con la lipasa se produce en la dirección de la (re)síntesis de los ésteres, y no de su hidrólisis. Los distintos tipos
de procesos mediados por las lipasas que pueden producirse (Fig. 6.26) incluyen: Reacciones en las que inter-
viene un único sustrato triacilglicerol (interesterificación, ruta D); reacciones entre un sustrato triacilglicerol y
una fuente exógena de ácido(s) graso(s) (acidólisis, ruta A), de éster(es) de ácido(s) graso(s) (transesterificación,
ruta B), o de alcohol(es) (alcoholisis, ruta C); o reacciones entre un ácido graso y un alcohol, que actúan ambos
como cosustratos (esterificación, ruta E). Las aplicaciones más exitosas han aprovechado de una manera estra-
tégica las selectividades características de las lipasas en combinación con el conocimiento de la distribución de
los ácidos grasos dentro de la grasa de partida (fuentes naturales de triacilgliceroles); destacaremos tales aplica-
ciones en el párrafo siguiente.
La manteca de cacao es una grasa excelente debido a su «pureza» natural con >80-90% de triacilgliceroles de
distinta naturaleza molecular, siendo mayoritarios el POSt (38-44%), StOSt (28-31%), y POP (15-18%)*, lo que le
proporciona un perfil de fusión cooperativo nítido ([53], Capítulo 4). Pueden prepararse sustitutos de la manteca de
cacao empleando una lipasa regioselectiva para las posiciones sn-1,3 y un aceite de palma de fracción media (58%
POSt) combinado con ácido esteárico exógeno, utilizando un proceso de «acidólisis» (Fig. 6.26a) en un tanque
reactor en condiciones de agitación durante 16 h a 40°C. El resultado obtenido es un producto que contiene 32%
POSt, 13% StOSt y 19% POP. El proceso emplea lipasas de Aspergillus, Rhizomucor o Rhizopus que también
pueden inmovilizarse en un reactor de lecho empacado para una obtención más rápida del producto. La primera
preparación lipídica obtenida por reestructuración enzimática que se comercializó es el llamado Betapol®, un
Figura 6.26 Tipos de reacciones de reestructuración de los acil lípidos mediadas por lipasas en medios microacuosos:
(a) acidólisis, (b) transesterificación, (c) alcoholisis, (d) interesterificación, y (e) esterificación.
* Los tipos de triacil-sn-gliceroles se identifican utilizando los nombres abreviados de los ácidos grasos, St para el ácido esteárico, P para
el palmítico y O para el oleico (véase Capítulo 4), citados en el orden en el que se hallan situados en las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3.
Enzimas 419
derivado graso enriquecido en OPO, que es el triacilglicerol mayoritario en la grasa de la leche humana [120]. Así
pues, el OPO es un producto valioso nutricionalmente para su inclusión en fórmulas de leches infantiles. Para esta
aplicación, el material de partida adecuado es la tripalmitina (PPP; enriquecida en estearina de palma) y se puede
hacer reaccionar con ácido oleico (1:1, peso/peso) en una reacción de acidólisis (Fig. 6.26a) catalizada por una
lipasa selectiva para las posiciones sn-1,3. Un proceso en dos epatas catalizado por una lipasa selectiva para las
posiciones sn-1,3 incluye una reacción de alcoholisis inicial del PPP con etanol (Fig. 6.26c) para dar lugar a sn-2-
palmitoglicerol, seguida de una reacción de esterificación (Fig. 6.26e) en presencia de ácido oleico. El Betapol
también puede prepararse a partir de fuentes naturales de lípidos: Fracción de aceite de palma rica en PPP y aceite
de girasol o de canola ricos en ácido oleico. Pueden usarse estrategias similares para preparar otros «lípidos
estructurados» con ayuda de lipasas, incluyendo lípidos con usos médicos/dietéticos. Si bien, los productos comer-
ciales actuales en su inmensa mayoría se obtienen a través de procesos químicos.
6.3.4.2.3 Mejora de las masas

Las lipasas son ingredientes comunes en las masas de pan [3,139,155]. Suplementan la acción de las lipasas
endógenas de los granos de los cereales y se añaden como mejorantes de las masas, una mejoría que se manifiesta
en el incremento del volumen del pan, en la consecución de una miga y unas cavidades de aire más uniformes y en
una menor tendencia al endurecimiento, todo ello sin afectar a las propiedades reológicas (de mezclado) de la
masa. Estas mejorías se derivan de la acción hidrolítica de las lipasas sobre los lípidos de los cereales y/o los
añadidos, generando agentes emulsionantes, tales como mono y diacilglicerolípidos, los cuales ayudan a incorpo-
rar y estabilizar pequeñas burbujas de aire en la masa. Los monoacilgliceroles también pueden formar complejos
de inclusión con la amilosa que reducen la tendencia del almidón a retrogradarse (endurecerse) después de la
elaboración del pan. La adición de lipasas en sustitución de los agentes emulsionantes que se añaden como ingre-
dientes también permite poder realizar en el etiquetado una declaración de «alimento más puro». Las lipasas que se
usan generalmente en panificación [50] se obtienen de las especies de Rhizomucor y Rhizopus y pueden hidrolizar
glucolípidos y fosfolípidos además de los acilgliceroles (Tabla 6.8); los lisofosfolípidos y los lisoglucolípidos son
agentes con una potente actividad de superficie. Las lipasas también se utilizan en la formulación de pastas alimen-
ticias pues mejoran la blancura, que es un atributo de calidad importante en estos productos [155]. Este efecto
puede derivar de la oxidación de los ácidos grasos insaturados que resultan liberados y del posterior blanqueamien-
to de la masa mediante reacciones secundarias. La adición de lipasas también reduce la rotura de las pastas
deshidratadas y su pegajosidad tras la cocción; estos efectos son debidos a la disminución de las pérdidas de
almidón, posiblemente a través del establecimiento de complejos con ácidos grasos y lisoglicerolípidos.
6.3.4.3 Lipooxigenasas
En general, se considera que la acción de las lipooxigenasas tiene efectos perjudiciales sobre la calidad de los
alimentos y los lípidos; este aspecto se abordará más adelante en este capítulo. No obstante, una aplicación benefi-
ciosa de la lipooxigenasa consiste en proporcionar capacidad oxidante durante el acondicionamiento de las masas
[155]. La lipooxigenasa oxida los ácidos grasos insaturados (que están disponibles por acción de las lipasas añadi-
das), generándose condiciones oxidantes que ayudan a fortalecer la red de las proteínas del gluten mediante el
establecimiento de enlaces cruzados disulfuro dentro del gluten, lo que aumenta la viscoelasticidad de la masa. La
adición de harina de soja a la masa del pan es el modo preferido para la incorporación de lipooxigenasa, y esta
práctica puede reducir o eliminar la necesidad de añadir agentes oxidantes más convencionales tales como los
bromatos. Las reacciones secundarias de oxidación también pueden destruir carotenoides endógenos y producir un
blanqueamiento de los productos finales, lo cual resulta deseable en las pastas alimenticias y en algunas variedades
de pan.
6.3.4.4 Fosfolipasas
Las fosfolipasas se clasifican en diferentes tipos A1, A2, C y D, teniendo cada uno una selectividad diferente y
exclusiva frente a los enlaces de los fosfolípidos (Fig. 6.27). Una aplicación comercial es la adición de fosfolipasa
A2 (EC 3.1.1.4) (los orígenes más frecuentes son Aspergillus spp. y la secreción pancreática) al aceite crudo duran-
Figura 6.27 Especificidad de enlace de las enzimas lipolíticas que actúan sobre los glicerolípidos polares.
te la etapa de desgomado dentro del proceso de refinado, para hidrolizar los fosfolípidos en la posición sn-2 y crear
el correspondiente lisofosfolípido [50]. Esta operación resulta importante para la eliminación de los fosfolípidos
que no son hidratables de otro modo. La fosfolipasa A2 es potencialmente utilizable como agente para crear
lisofosfolípidos con propiedades emulsionantes superiores a partir de fuentes ricas en fosfolípidos tales como la
yema de huevo [3]; este efecto puede tener lugar in situ en la elaboración del pan mediante la adición de lipasas que
presentan una actividad similar a la de la fosfolipasa A2 (Tabla 6.8).
6.3.5 APLICACIONES MISCELÁNEAS DE LAS ENZIMAS
Se ha autorizado una ureasa ácida (EC 3.5.1.5, urea aminohidrolasa) de Lactobacillus fermentum para su uso en
el vino con la finalidad de evitar la acumulación de urea; en caso contrario, la urea podría reaccionar con el etanol
para formar etilcarbamato, que ha demostrado ser un carcinógeno para los animales. La hexosa oxidasa (EC 1.1.3.5)
se ha añadido a la masa del pan, donde existen multitud de hexosas y están disponibles como sustratos, para dar
lugar a sus equivalentes oxidados que actúan como acondicionadores de la masa [3]. La catalasa (EC 1.11.1.6,
H2O2- H2O2 oxidorreductasa) se añade de modo específico para eliminar la H2O2 residual de la leche que ha sido
tratada con este compuesto para reducir su carga microbiana cuando no se puede disponer de la refrigeración como
medio de control del crecimiento de los microorganismos [50]. La sulfhidrilo oxidasa (tiol oxidasa, EC 1.8.3.2,
tiol-O2 oxidorreductasa) ha sido considerada durante mucho tiempo como una solución para combatir el defecto
denominado «sabor a cocido» de la leche UHT causado por los tioles formados durante el tratamiento térmico
[154]. La sulfhidrilo(tiol) oxidasa de A. niger se ha sugerido como posible agente acondicionador de la masa del
pan al proporcionar poder oxidante y formar enlaces disulfuro en el gluten [3].
De cara al futuro, a medida que los costes de la producción de enzimas vayan reduciéndose en consonancia con
los avances de la biotecnología y la genética, el incremento de la competitividad de los procesos conducidos por
enzimas llevará a una expansión de sus usos comerciales. Las limitaciones de espacio nos impiden la mención y
discusión de otras enzimas con potencialidad comercial como auxiliares en procesos. El incremento de los rangos
de temperatura y pH en los que las enzimas permanecen estables sigue siendo una prioridad, y la obtención de
moléculas de elevado valor a partir de los subproductos de la actividad agrícola a través de procesos enzimáticos
está atrayendo una atención creciente.
6.4 INFLUENCIA DEL AMBIENTE SOBRE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA
La temperatura, el pH y la actividad de agua se encuentran entre los factores ambientales más importantes que
tienen influencia sobre la actividad enzimática, y los cambios en los valores de estos parámetros suponen los
medios físicos principales de control de la actividad enzimática en las matrices alimentarias. En esta sección exa-
minaremos los fundamentos de cómo estos factores afectan a la función enzimática.
Enzimas 421
6.4.1 TEMPERATURA
6.4.1.1 Respuestas generales de la acción enzimática a la temperatura

La temperatura tiene efectos predecibles y opuestos (tanto de activación como de desactivación) sobre la activi-
dad enzimática. El aumento de la temperatura conlleva un incremento de la energía libre en el sistema; el resultado
neto es el descenso de la barrera de energía a superar para que tengan lugar las reacciones, con lo cual las reaccio-
nes resultan aceleradas. Recuérdese la Ecuación 6.1 (Sección 6.2.3.1), y si el factor de frecuencia de Arrhenius «A»
se sustituye por las constantes combinadas «PZ», la transformación logarítmica da lugar a:
(6.29)
La Ecuación 6.29 predice una relación lineal entre ln k y 1/T con una pendiente de –Ea/R. Mayores valores de Ea
significan una mayor dependencia de las reacciones frente a la temperatura.
Nótese que esta relación (Ecuación 6.29) sólo es válida para examinar y predecir contantes de velocidad (kx) o
parámetros compuestos por, o directamente proporcionales a, constantes de velocidad tales como kcat, Vmáx, KM y
Vmáx/KM o KS, con tal de que el orden de la reacción no cambie con la temperatura. La simple medida de la actividad
enzimática bajo unas condiciones específicas no satisface este requisito. Las «interrupciones» o discontinuidades
en la porción lineal (con pendiente negativa) o la ausencia de linealidad de las gráficas de Arrhenius, se han
propuesto como evidencias de eventos bioquímicos relevantes, tales como transiciones de la fase lipídica en las
enzimas que operan en las membranas o la presencia de isoformas múltiples. Es igual de probable que tales inte-
rrupciones sean fruto de un cambio inducido por la temperatura en la magnitud de una constante de velocidad tal
como la KM, o de un cambio en el orden de reacción, en la etapa limitante de la velocidad, o en el estado de
ionización de un residuo crítico [54,125].
La utilidad de la representación de Arrhenius reside en que proporciona una estimación de Ea, que es un indica-
dor del poder catalítico en una reacción enzimática en relación con la reacción correspondiente sin catalizar o
catalizada químicamente (comparar con Tabla 6.1). En las gráficas de Arrhenius que representan la actividad
enzimática se produce un abandono de la linealidad (pero no una «interrupción») a valores de temperatura progre-
sivamente elevados (a ~0,0030 K–1 en el eje de las x en la Fig. 6.28a) debido al segundo efecto de la temperatura
Figura 6.28 Sensibilidad térmica de la pectín metil esterasa del fruto del tomate. (a) Representación de Arrhenius (redibujada
a partir de Laratta, B. et al., Proc. Biochem., 30, 251, 1995.), en la que los datos originales aparecen representados por círculos
y únicamente se usaron los círculos rellenos para construir las aproximaciones lineales. Las representaciones que aparecen como
cuadrados huecos son las realizadas con los datos obtenidos del cuadro (b). (b) Representaciones de inactivación de primer orden
(redibujadas a partir de Anthon, G.E. et al., J. Agric. Food Chem., 50, 6153, 2002.), en las que las curvas de pendiente creciente
se corresponden con las temperaturas de incubación de 69,8°C, 71,8°C, 73,8°C, 75,8°C y 77,8°C.
sobre las enzimas que consiste en provocar desnaturalización. Los aumentos de la temperatura por encima del valor
«máximo» o del «óptimo» para la actividad enzimática conducen a un descenso brusco en la constante de velocidad
de la reacción y esta porción lineal de la gráfica con pendiente positiva representa una Ea de la inactivación de la
enzima (102 kcal/mol en este ejemplo). Los valores de Ea de la inactivación de la enzima generalmente oscilan
entre 40-200 kcal/mol en comparación con las 6-15 kcal/mol de la activación. La desnaturalización proteica impli-
ca el despliegue de grandes segmentos de la cadena polipeptídica, un proceso global que necesita un cambio total
de energía libre mayor que el necesario para estabilizar el estado de transición en el sito activo (un proceso locali-
zado).
Puede resultar dificultosa la determinación precisa de la vo de la reacción (es decir, velocidades lineales) a
temperaturas a las que la enzima es activa inicialmente, pero se inactiva rápidamente, como medio para determinar
la inactivación térmica de una enzima (como en la Fig. 6.28a). Un modo más directo de determinar los parámetros
de inactivación térmica de una enzima consiste en incubar la enzima a varias temperaturas y medir la actividad
residual que queda tras la incubación; esta medida se hace en unas condiciones estandarizadas de ensayo de la
actividad (generalmente al valor de pH óptimo y a una temperatura no inactivante) tras varios intervalos de tiempo
(Fig. 6.28b). El el ensayo enzimático se deberían usar [S]>>KM*, de modo que las velocidades de reacción resultan-
tes son ~Vmáx (proporcionales a ET), [S] limitantes de la velocidad y lineales con respecto a [E]. Puesto que la
inactivación enzimática a menudo es un proceso que sigue una cinética de primer orden ([Eo] es el nivel inicial)
(6.30)
Los resultados se interpretan haciendo representaciones semilogarítmicas (se usa un factor de 2,303 para
interconvertir representaciones de log en representaciones de ln), y para cada temperatura ensayada se puede
estimar su kd (constante de velocidad de inactivación) correspondiente mediante regresión lineal (pendientes
= –kd/2,303) (Fig. 6.28b). El conjunto de los valores de kd obtenidos pueden llevarse a una representación de
Arrhenius (Fig. 6.28a) para estimar la Ea de la inactivación de la enzima, que es una Ea de 109 kcal/mol en este
ejemplo. Así pues, se ha observado una buena concordancia entre los resultados de los estudios independientes
llevados a cabo utilizando sistemas alternativos para determinar la sensibilidad a la temperatura de la pectín metil
esterasa del fruto del tomate.
6.4.1.2 Temperatura óptima para la función enzimática

La temperatura óptima para la actividad enzimática es el resultado neto de los efectos activadores e inactivadores
de la temperatura. Mientras que la temperatura óptima es aquella a la cual la velocidad de la reacción enzimática
(vo) es la mayor, esta condición permanece con una duración limitada en el tiempo; pronto domina una desnatura-
lización progresiva y la mayor parte de la actividad original se pierde. Un ejemplo de patrones típicos de compor-
tamiento de las enzimas frente a la temperatura es el proporcionado por la pululanasa de Aerobacter aerogenes
(Fig. 6.29a). Nótese la progresión más suave de la pendiente ascendente para la curva de actividad a 10-40°C en
comparación con el ascenso brusco de la constante de la velocidad de inactivación (kd) a 50-60°C y el descenso
brusco de la actividad/estabilidad enzimática a 50-60°C. Estas tendencias de una mayor dependencia con la tempe-
ratura (valores de Ea mayores) de la inactivación enzimática en relación con la activación, también pueden obser-
varse a partir de las representaciones obtenidas para la pectín metil esterasa del tomate (Fig. 6.28a). Así pues, a
medida que aumenta la temperatura, la aceleración de la inactivación enzimática en un determinado punto se
convierte en el efecto dominante de la temperatura. En la Figura 6.29b se muestran los perfiles de dependencia
frente a la temperatura de la actividad y estabilidad de varias enzimas relacionadas con los alimentos. En la prácti-
ca, los límites superiores de los valores de temperatura a los que transcurre una reacción enzimática en las aplica-
* A veces las restricciones en la solubilidad de S u otros factores de complicación hacen que esta condición sea difícil de satisfacer.
Enzimas 423
Figura 6.29 Sensibilidad térmica de (a) pululanasa y (b) diferentes enzimas comerciales. (Datos seleccionados y figuras
redibujadas a partir de Godfrey, T. and West, S. (Eds.), Industrial Enzymology, 2nd edn. Stockton Press, New York, 1996; Ueda,
S. and Ohba, R., Agric. Biol. Chem., 36, 2382, 1972). En el recuadro (a), los símbolos rellenos representan la estabilidad
enzimática, los símbolos huecos representan la actividad enzimática y la línea discontinua representa la dependencia de la
constante de velocidad de inactivación de la enzima. En el recuadro (b) las líneas con trazo grueso (en negrita) representan el
rango de temperatura óptima intrínseca de la enzima, y las líneas con trazo normal (estrecho) indican las temperaturas de los
procesos en los que se usan las enzimas generalmente.
ciones en alimentos están a menudo de 5-20°C por debajo de la temperatura a la que se observa la mayor velocidad
de la reacción, con el objetivo de mantener una actividad enzimática elevada y persistente durante todo el proceso
programado.
Se utiliza una representación análoga para evaluar el efecto de la temperatura sobre los procesos de equilibrio.
La representación es similar a la Figura 6.28a excepto en que en el eje de ordenadas se representa el log K y la
pendiente es proporcional a ΔHo en lugar de a Ea:
(6.31)
Un ejemplo es el que resume la dependencia frente a la temperatura de la constante de equilibrio (Keq) para la
reacción de isomerización glucosa  fructosa catalizada por la enzima xilosa isomerasa (Fig. 6.30). Esta represen-
tación es útil para la caracterización de las dependencias frente a la temperatura de otros equilibrios relacionados
con el funcionamiento óptimo de las enzimas tales como la K‡ para la teoría del estado de transición, la ionización
de la cadena lateral de los aminoácidos (Ka) implicados en la actividad enzimática, o las funciones de cinética
enzimática que representan (pseudo)-equilibrios (KM, KS).
Existen otros efectos de la temperatura sobre la actividad enzimática. En las enzimas oligoméricas puede tener
lugar una inactivación por el frío cuando existen fuerzas no-polares implicadas en la asociación de los polipéptidos.
La temperatura baja reduce la fuerza de estas interacciones (Capítulo 5) y puede promover una disociación de las
subunidades y comprometer la actividad. La temperatura elevada generalmente reduce la solubilidad de los gases
en el agua, y las reacciones que necesitan O2 pueden verse limitadas en función de la KM para el O2 y de la
solubilidad del O2 disuelto. Algunos sustratos lipídicos experimentan transiciones de fases en rangos de temperatu-
ra relevantes para los alimentos. La presencia de dominios en fase sólida, especialmente en las bicapas de fosfolípidos,
constituyen un defecto en la superficie y permiten el acceso de las enzimas lipolíticas, lo que a menudo conduce a
un incremento de la hidrólisis.
6.4.1.3 Resumen de los efectos de la temperatura

Aunque cada enzima presenta un comportamiento único, se pueden hacer algunas observaciones generales en
relación con la estabilidad térmica de las enzimas. Los ligandos (los sustratos e incluso los inhibidores) mejoran la
Figura 6.30 Sensibilidad a la temperatura de la constante de equilibrio de reacción de la xilosa isomerasa. (Figura redibujada
a partir de Rangarajan, M. and Hartley, B.S., Biochem. J., 283, 223, 1992).
estabilidad porque ayudan a mantener la estructura nativa en y alrededor del sitio activo. Otros factores composi-
cionales del medio pueden también aumentar o disminuir la estabilidad térmica. Algunas tendencias generales de la
estabilidad térmica de las enzimas consisten en que esta se ve aumentada a medida que desciende el tamaño
molecular de la enzima, que disminuye el número de cadenas polipeptídicas, que aumenta en la molécula el núme-
ro de enlaces disulfuro y puentes salinos, y que aumentan los niveles de proteína; la estabilidad es mayor en el
medio nativo que in vitro, en las proteínas solubles que en las presentes en las membranas, y en las enzimas
extracelulares que en las intracelulares.
6.4.2 EFECTOS DEL pH
6.4.2.1 Consideraciones generales

Todos los grupos ionizables de las proteínas experimentan transiciones dependientes del pH en base a los
valores de pKa intrínsecos de los residuos de aminoácidos (Tabla 6.9). Muchas de estas transiciones influyen sobre
la estabilidad enzimática y en un rango estrecho de pH pueden actuar cooperativamente y desestabilizar la enzima
por completo (ver Capítulo 5). Por otra parte, las ionizaciones de las cadenas laterales de la mayoría de los
aminoácidos tienen un impacto nulo o limitado sobre la actividad enzimática y tienen un comportamiento «transpa-
rente» en el contexto de la función enzimática. Más bien, hay un número limitado (a menudo 1-5) de residuos de
aminoácidos cuyo estado de ionización confiere la dependencia frente al pH de la actividad enzimática. La ionización
del sustrato, producto, inhibidor y cofactores puede tener también un impacto sobre la actividad enzimática, y el
pH puede tener influencia sobre la Keq o sobre la distribución de los reactantes en el equilibrio en una reacción
enzimática.
6.4.2.2 La estabilidad enzimática en función del pH

Las enzimas tienen una dependencia característica de su estabilidad frente al pH. La pululanasa de A. aerogenes
es un ejemplo de ello (Fig. 6.31a). Existen dos tendencias generales, tales consisten en que (1) el rango de pH de
estabilidad es generalmente más amplio que el rango de pH de actividad de la enzima, y (2) la estabilidad de la
enzima disminuye rápidamente a valores de pH desestabilizantes, debido a que la desestabilización por efecto del
pH es un proceso cooperativo. En contraste, el descenso de la actividad enzimática en función del pH generalmente
muestra una transición más moderada con características de una curva de titulación, en la que entre 1 y 3 grupos
ionizables son los únicos determinantes de la respuesta de la actividad frente al pH donde ocurre cada transición.
La estabilidad de las enzimas frente al pH se mide exponiendo (preincubando) la enzima a varios valores de pH y
Enzimas 425
TABLA 6.9
Propiedades de ionización de los grupos ionizables de los aminoácidos en las enzimas.
Grupo ionizable pKa (25°C) ΔHion Grupo ionizable pKa (25°C) ΔHion
(kcal mol–1) (kcal mol–1)
Carboxilo Amonio
C-terminal (α) 3,0-3,2 ~0 ± 1,5 N-terminal (α) 7,5-8,5 10-13
β/γ-carboxilo (ASP, GLU) 3,0-5,0 ε-amino (LYS) 9,4-10,6
Imidazolio (HIS) 5,5-7,0 6,9-7,5 Fenol (TYR) 9,8-10,4 6,0-8,6
Sulfhidrilo (CYS) 8,0-8,5 6,5-7,0 Guanidio (ARG) 11,6-12,6 12
Fuente: Fersht, A., Enzyme Structure and Mechanism, 2nd edn. W.H. Freeman & Company, New York, 1985; Segel, I.H., Enzyme
Kinetics. Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1975;
Whitaker, J.R., Principles of Enzymology for the Food Sciences, 2nd edn., Marcel Dekker, New York, 1994.
midiendo después la actividad residual en condiciones estándar de pH próximo al valor óptimo y de una tempera-
tura específica no desnaturalizante. Se puede usar una representación similar a la empleada para caracterizar los
valores de Kd de la sensibilidad térmica de las enzimas reemplazando la temperatura por el pH como variable de
interés (Fig. 6.28b). Como ocurre con la sensibilidad frente a la temperatura, la estabilidad enzimática frente al pH
puede depender de los constituyentes y condiciones del medio; por ejemplo, la presencia de sustrato y de otros
ligandos puede aumentar la estabilidad frente al pH, siendo un ejemplo de ello el aumento del rango de pH de
estabilidad de la α-amilasa; esta enzima tiene una actividad >50% en un rango de pH de 4-7, que aumenta a 4-11 en
presencia de Ca2+ [153]. En algunos casos, las pérdidas de actividad inducidas por el pH pueden ser reversibles,
pero generalmente dentro de un rango limitado de pH desestabilizante y para una duración de la exposición limita-
da. La pululanasa es inactiva pero estable a pH 9-11 durante al menos 30 min y, dentro de este período de tiempo,
la actividad puede recuperarse totalmente ajustando el pH a valores de 6-7 (Fig. 6.31a).
El conocimiento de la estabilidad frente al pH de las enzimas, obviamente, resulta importante para seleccionar
una enzima compatible con las condiciones imperantes de cara a una aplicación potencial, de tal manera que la
actividad enzimática persista el tiempo suficiente para cumplir la función deseada. También es importante conocer
Figura 6.31 Sensibilidad frente al pH de (a) pululanasa y (b) varias enzimas comerciales. (Datos seleccionados y figuras
redibujadas a partir de Godfrey, T. and West, S. (Eds.), Industrial Enzymology, 2nd edn. Stockton Press, New York, 1996; Ueda,
S. and Ohba, R., Agric. Biol. Chem., 36, 2382, 1972). En el recuadro (a), los símbolos rellenos representan la estabilidad
enzimática y los símbolos huecos representan la actividad enzimática. En el recuadro (b) las líneas con trazo grueso (en negrita)
representan el rango en el que la enzima mantiene >80% de la actividad, y las líneas con trazo normal (estrecho) indican los
rangos en los que la enzima exhibe >80% de estabilidad.
si la desestabilización de la enzima contribuye a un descenso en su actividad a un valor de pH dado, de modo que

el análisis de los efectos del pH sobre la actividad pueda interpretarse de un modo exacto (sección siguiente). La
estabilidad frente al pH de algunas enzimas comerciales seleccionadas se muestra en la Figura 6.31b; los rangos de
pH en los que hay estabilidad mostrados en la figura lo son a las temperaturas reinantes durante el procesado, en las
que la estabilidad es más limitada que en el ejemplo de la pululanasa (en el que la estabilidad frente al pH fue
determinada a una temperatura no desnaturalizante de 40°C). Del mismo modo, la estabilidad frente a la tempera-
tura se ve reducida a valores de pH alejados del valor óptimo para la estabilidad de la enzima. Así pues, la tempe-
ratura y el pH tienen influencias coordinadas sobre la estabilidad de la enzima.
6.4.2.3 Efectos del pH sobre la actividad enzimática [43,122,153]

Al igual que el locus catalítico de una enzima está integrado por unos pocos aminoácidos críticos, la respuesta
al pH de la actividad enzimática se basa también en unos pocos aminoácidos ionizables. El papel de estos aminoácidos
puede ser (1) el de conferir estabilidad conformacional en el sitio activo, o estar involucrado en (2) la unión al
sustrato o en (3) la transformación del sustrato; el estado de ionización sería en todos los casos crítico para estas
funciones. El rango de pH en el que se mantiene >80% de la actividad máxima a las temperaturas comunes de
procesado para algunas enzimas alimentarias seleccionadas también se muestra en la Figura 6.31b.
Para entender los fundamentos del efecto del pH sobre la actividad enzimática, considérese la gráfica de
dependencia de la actividad frente al pH con forma típica de campana que a menudo se observa para las enzimas
(Fig. 6.32a). La característica esencial de este perfil es la presencia de transiciones separadas en el lado alcalino y
en el lado ácido, a las que se denominan fases de activación por H+ y de inactivación por H+, respectivamente. Así
pues, la protonación del grupo de pKa alcalino permite a la enzima funcionar, y la protonación del grupo de pKa
ácido atenúa la función de la enzima. En la Figura 6.32b se muestran otros tipos de comportamiento frente al pH
que han sido observados; tales comportamientos incluyen una única transición dependiente del pH (gráfica 1), una
única transición con una disminución de la actividad más acusada que en el caso anterior (gráfica 2), y un caso en
el que la transición en función del pH conduce a un estado enzimático menos activo (en lugar de a un estado
inactivo) (gráfica 3).
La medida empírica del pH «óptimo» de la «actividad» enzimática en condiciones específicas de ensayo de la
actividad (como ocurre en la Fig. 6.31a) es bastante arbitraria y tiene una significación limitada. Ofrece más infor-
mación el discernir si el efecto del pH se ejerce sobre la estabilidad conformacional, sobre la unión al sustrato o
sobre la transformación del sustrato. Así pues, el análisis de la dependencia frente al pH de Vmáx y KM proporciona
una visión de cómo la función enzimática responde frente al pH. El comportamiento frente al pH de los grupos
ionizables críticos de la enzima se modeliza del mismo modo que el estatus de ionización de otros ácidos y bases
débiles:
(6.32)
Figura 6.32 Respuestas típicas de la actividad enzimá-

tica frente al pH. Ver las explicaciones en el texto.
Enzimas 427
Estas ionizaciones de la enzima existen tanto en su forma «libre» (E) como en la «unida» al sustrato (ES) y pueden
identificarse para cada una de las transiciones del lado ácido (Ka1) y del lado alcalino (Ka2). Tal comportamiento puede
representarse por tres estados de ionización de la enzima libre:
(6.33)
(6.34)
Este mismo patrón de comportamiento puede preverse para el complejo ES, donde
(6.35)
(6.36)
En este escenario, todos los equilibrios de ionización y cinéticos pueden ensamblarse como se acaba de descri-
bir en el contexto de los pasos catalíticos de la acción enzimática (Fig. 6.33). En este modelo, los estados más
activos de la enzima son las formas EH y EHS y están asociados con los valores de Vmáx y KM óptimos o «intrínse-
cos» (de acuerdo con la Fig. 6.32a). El modelo puede aplicarse para determinar si el descenso de la «actividad» en
el rango ácido o alcalino de pH viene provocado porque ciertas formas enzimáticas (HEH+ y E–) no se unen al S o
porque otras (HEH+S y E–S) son incapaces de transformar S→P. El modelo también recoge que todas las especies
enzimáticas son parcialmente activas dentro de un rango de pH específico (como en la gráfica 3 de la Fig. 6.32b)
con sus constantes cinéticas modificadas por el pH (α/β KMH+ y α/β VmáxH+), estando los modificadores α/β gene-
ralmente en el rango de 1→∞ y 1→0, respectivamente, para estas constantes cinéticas. Los términos KMH+ y VmáxH+
representan la dependencia de estas constantes cinéticas frente al pH en comparación con los valores intrínsecos de
KM y Vmáx al valor de pH óptimo.
Con cualquier enzima, en base a la curva pH-actividad en forma de campana, se puede suponer de una manera
razonable que existen tres estados de ionización, y cada uno tiene la capacidad de unirse al S, pero sólo la forma
que se encuentra ionizada de un modo óptimo es capaz de hacer la transformación S→P. Esta suposición modifica-
ría el modelo general (Fig. 6.33) omitiendo los cuadros «a» y «h». Si se combina con las ecuaciones de la velocidad
de reacción aplicadas antes (Ecuación 6.15)
(6.37)
especies «E» especies «ES»
En la parte derecha de la ecuación, todas las especies enzimáticas pueden expresarse en la forma de EHS,
utilizando los equilibrios de ionización (Ecuaciones 6.34 y 6.36) y cinéticos (Ecuación de la Fig. 6.33) apropiados.
Puesto que todas las especies enzimáticas están en equilibrio, cualquier especie enzimática particular puede expre-
sarse en términos de cualquier otra de las especies enzimáticas. De modo específico, los equilibrios utilizados para
expresar cada especie enzimática en la forma de EHS son los siguientes:
Para EH, KM; para HEH+, KE1 y después KM; para E–, KE2 y después KM.
Para HEH+S, KES1 después KM; para E–S, KES2 y después KM.
Después, eliminando de la factorización EHS, factorizando ambos lados de la ecuación por ET (y usando la
Ecuación 6.16), y después dividiendo el numerador y denominador de la parte derecha por S/KM, seguido de KM, da
lugar a:
Figura 6.33 Modelo cinético de la respuesta de la actividad enzimática frente al pH. Los cuadros (a), (b) y (c) representan los
pasos catalíticos en el rango ácido del pH; los cuadros (h), (i) y (j) representan los pasos catalíticos en el rango alcalino del pH;
los cuadros (d) y (e) representan los equilibrios de ionización en el rango ácido del pH; los cuadros (f) y (g) representan los
equilibrios de ionización en el rango alcalino del pH. (Adaptado de Copeland, R.A., Enzymes: A Practical Introduction to
Structure, Function, Mechanism, and Data Analysis, 2nd. edn., John Wiley, New York, 2000; Segel, I.H., Enzyme Kinetics.
Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1975;
Whitaker, J.R., Principles of Enzymology for the Food Sciences, 2nd edn., Marcel Dekker, New York, 1994).
(6.38)
Esta ecuación permite expresar colectivamente todas las especies «E» libres mediante un término de distribu-
ción (fE) dependiente del pH denominado función de pH de Michaelis, junto con un término análogo (fES) para
todas las especies «ES»*. Estas funciones reflejan la distribución cuantitativa o las proporciones de los tres estados
de ionización de las especies «E» o «ES» a cualquier valor de pH en función de los términos H+ y Ka (en esencia,
proporcionan curvas de «titulación»). Además, la división del numerador y el denominador de la parte derecha de
la Ecuación 6.38 por fES muestra cómo están influenciadas por el pH las constantes cinéticas clave:
(6.39)
y en consecuencia
(6.40)
(6.41)
* Nótese que estas funciones de pH de Michaelis han sido desarrolladas tomando la especie EHS como especie de referencia; estas
funciones pueden desarrollarse tomando cualquier especie de «E» como referencia y, aunque adoptan formas diferentes, el compor-
tamiento de la enzima se modelará de modo idéntico para un conjunto de valores de Ka y [H+] dado.
Enzimas 429
Y si se toma el cociente entre estas constantes cinéticas modificadas
(6.42)
Así pues, el término VmáxH+ está relacionado únicamente con el comportamiento de todas las especies «ES» (fES),
y el término VmáxH+/KMH+ está relacionado únicamente con el comportamiento de todas las especies libres «E» (fE;
recuérdense también las Ecuaciones de la 6.19 a la 6.22) en cuanto a cómo responden las enzimas al pH.
Las observaciones realizadas en la papaína pueden ilustrar cómo afecta el pH a la función de la enzima (Figuras
6.34a-c). Se observa un rango de pH óptimo amplio de 5-7, y las estimaciones de los valores óptimos de Vmáx y KM
permiten sustituir (por el autor) estos valores en las Ecuaciones 6.40 y 6.42 mostradas anteriormente para obtener los
valores de VmáxH+ y VmáxH+/KMH+, obteniéndose valores de pKa de 4,0 y 8,2, y de 4,2 y 8,2, respectivamente (Fig. 6.34a
y b). Los valores de pKa pueden obtenerse a partir de estas gráficas dejando caer perpendiculares desde los puntos de
las curvas en los que el valor de la ordenada representa el 50% del valor máximo observado. Puesto que existe una
escasa modificación de KM† en función del pH (cuadro c), puede concluirse que la ionización de la enzima inducida
por el pH tiene un efecto despreciable sobre la unión del sustrato y el efecto sobre la unión del sustrato puede atribuir-
se únicamente al efecto del pH sobre el paso catalítico en la región de pH evaluada. Resumiendo, para la papaína
existe(n) grupo(s) ionizable(s) para cada transición de pH; todos los estados de ionización de la enzima libre E son
capaces de unirse al S, pero sólo la forma EHS es capaz de transformar S→P. Así pues, el modelo asumido y que da
Figura 6.34 Análisis de la respuesta de la actividad enzimática frente al pH utilizando la papaína como ejemplo. Los cuadros
(a) y (d) muestran las respuestas de la Vmáx, los cuadros (b) y (e) muestran las respuestas de Vmáx/KM, y los cuadros (c) y (f)
muestran las respuestas de la KM. (Datos obtenidos a partir de Lowe, G. and Yuthavong, Y., pH-Dependence and structure-
activity relationships in the papain-catalysed hydrolysis of anilides. Biochem. J., 124, 117, 1971). Las líneas se ajustan a las
ecuaciones explicadas en el texto.
†Los cambios de KM menores de unas pocas unidades generalmente se consideran insignificantes y las diferencias deben acercarse a
≥ del triple para que puedan considerase significativas en la evaluación de la respuesta de la acción enzimática frente al pH.
lugar a la Ecuación 6.37 se ajusta al comportamiento de la papaína, y los cuadros a y h (Fig. 6.33) se omitirían del
modelo completo con α = β = 1 para KMH+ para describir el comportamiento de la papaína. La respuesta de la actividad
de la papaína (Vmáx) frente al pH en la Figura 6.34a se asemeja a la observada en la Figura 6.32a.
Para permitir un análisis más profundo de los efectos del pH [122], las transformaciones logarítmicas de las
Ecuaciones de la 6.40 a la 6.42 dan lugar a:
(6.43)
(6.44)
(6.45)
y los valores observados se representan de modo rutinario como «representaciones de Dixon» (en las Figs. 6.34d-f
para el comportamiento de la papaína). La Ecuación 6.45 no se representa per se, sino que en su lugar se representa
pKMH+ (p = –log), pues esto hace que cualquier desviación hacia abajo de la gráfica donde tiene lugar una transi-
ción de pH corresponda con la función obstaculizada, de modo similar a lo que ocurre en las representaciones de
las Ecuaciones 6.43 y 6.44. Las formas logarítmicas de las ecuaciones hacen que sean más fáciles de visualizar e
interpretar algunos aspectos del comportamiento enzimático en función del pH (Fig. 6.34d-f). La Vmáx se identifica
fácilmente en la porción plana (con pendiente ~0) de la representación, y el pH óptimo es el punto medio entre los
valores de pKa. Las pendientes de las transiciones ácida (+n) y alcalina (–n) en las porciones más inclinadas ascen-
dente y descendentemente de la curva de respuesta frente al pH representan el número de residuos de aminoácidos
ionizables involucrados en cada transición. En el caso de la papaína, las representaciones de Dixon proporcionan
pendientes de +1 y –1, lo que indica que la respuesta de la enzima frente al pH en cada transición es debida al
estado de ionización de un único residuo de aminoácido. Las pendientes de las representaciones de Dixon de la
función enzimática generalmente oscilan entre 1 y 3, y la presencia de grupos ionizables múltiples en la enzima da
lugar a transiciones más cooperativas (tal como se ve en la gráfica 2 de la Fig. 6.32b).
Las representaciones de Dixon también permiten la estimación de los valores de pKa por dos medios distintos.
Puesto que el punto en el que pH = pKa representa el estado en el que se halla protonada la mitad del (de los)
grupo(s) ionizable(s), este corresponde al punto en el que la actividad enzimática medida es el 50% de la máxima.
Así pues, en una escala logarítmica usada en las representaciones de Dixon, los valores de pKa pueden localizarse
en el punto donde la curva de respuesta frente al pH tiene en su ordenada un valor 0,3 unidades por debajo del
máximo. Otra manera de estimar los valores de pKa es prolongando las pendientes de las porciones ascendente y
descendente hasta la intersección con la respuesta máxima (una horizontal) y después trazando perpendiculares al
eje para identificar el valor de pKa. A veces la elección del método a usar depende de la naturaleza y amplitud de los
datos que se haya logrado reunir. Para la papaína, (Figs. 6.34d-f), las estimaciones realizadas por los dos métodos
ofrecen valores de pKa concordantes y próximos de 4,1 y 8,1, y de 4,2 y 8,2 para las formas ligada y libre de la
enzima, respectivamente. GLU/ASP y CYS son los residuos de aminoácidos con grupos ionizables que presentan
valores de pKa concordantes con estos valores (Tabla 6.9). Sin embargo, el comportamiento real de la papaína
frente al pH viene determinado por un par de iones imidazol-tiolato (HIS-CYS) (que actúa como una unidad,
compárese con la Fig. 6.23). La CYS25 es activa en su forma disociada, mientras que el residuo HIS159 debe estar
protonado para que se muestre funcional en el sitio activo. Este comportamiento supone otro ejemplo de cómo las
propiedades de ionización de los residuos de aminoácidos en las proteínas pueden modularse mucho en relación
con los potenciales intrínsecos de ionización que muestran los aminoácidos en disolución (Tabla 6.9).
Con el modelo precedente, el comportamiento de dependencia frente al pH de las enzimas puede aplicarse con
bastante amplitud a cualquier enzima de interés. Un análisis de la dependencia frente al pH de la xilosa isomerasa
indica que en un rango de pH 5-8 (la utilización comercial se lleva a cabo a pH 7-8) la capacidad de la enzima para
transformar S→P no se ve afectada (la curva de log Kcat es plana, Fig. 6.35a). Sin embargo, el valor de la pendiente
Enzimas 431
de la transición ácida (que es una unidad) indica que es el estado de ionización de un solo grupo ionizable de la
enzima el responsable de la unión al sustrato (la KM cambia; Fig. 6.35b), y, puesto que Kcat no cambia, entonces
ΔKM ≈ ΔKS en este análisis. La finalidad de identificar los valores de pKa que representan transiciones críticas de
sensibilidad al pH en el funcionamiento de las enzimas es la de poder insinuar la identidad de los residuos de
aminoácidos implicados en esa respuesta de la enzima. El valor de pKa del grupo ionizable en la xilosa isomerasa
es 5,7-6,1, lo que indica que posiblemente este residuo sea un residuo de HIS (Tabla 6.9). A menudo se usa la
relación de van’t Hoff (Fig. 6.30a, Ecuación 6.31) para profundizar en la labor de insinuar la identidad de los
aminoácidos participantes en base a los valores de ΔHion característicos. Para la xilosa isomerasa, el pKa del grupo
ionizable varió en función de la temperatura con un valor de ΔHion de 5,6 kcal/mol (a partir de la pendiente,
Fig. 6.35c), lo que resulta también concordante con lo observado para los residuos imidazol (Tabla 6.9).
6.4.2.4 Otros tipos de comportamiento frente al pH

Las reacciones enzimáticas pueden verse afectadas por otros tipos de comportamiento frente al pH. El estado de
ionización del sustrato, del producto o del inhibidor puede influir sobre la reactividad de la enzima en función de la
naturaleza de las interacciones que permiten a la enzima unirse a estos ligandos y transformarlos. Igualmente, la
ionización de las cadenas laterales de los aminoácidos de la enzima puede modular la selectividad de la reacción
entre los sustratos potenciales. Por ejemplo, muchas proteasas muestran valores de pH óptimos diferentes para su
actividad hidrolítica frente a diferentes sustratos proteicos [50].
6.4.3 LOS ESTADOS DEL AGUA Y LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA [37,41,121]
El control de la cantidad y del estado del agua en los alimentos es una de las principales formas de conservación y
puede afectar a la actividad y estabilidad enzimática. El agua influye sobre las velocidades de las reacciones sirviendo
como medio de difusión, controlando la dilución o concentración de los solutos, estabilizando y confiriendo plastici-
dad a las proteínas, y sirviendo como cosustrato en las reacciones hidrolíticas. La reducción de la cantidad del agua
total o de la que actúa como disolvente (mediante deshidratación o congelación) provoca varios cambios composicionales
y materiales interrelacionados en los alimentos que influyen sobre las reacciones enzimáticas.
6.4.3.1 Efectos de la desecación y de la actividad de agua

Los principales efectos de la reducción del agua total o de la que actúa como disolvente son la disminución del
papel del agua como medio de difusión y como cosustrato. La magnitud de la reducción del agua se define mejor a
Figura 6.35 Respuesta frente al pH de la actividad xilosa isomerasa. En el cuadro (a) los círculos huecos representan kcat/KM,
y los círculos rellenos representan kcat. El cuadro (a) muestra la respuesta de los pasos catalíticos, el (b) muestra la respuesta de la
KM, y el (c) muestra la respuesta frente a la temperatura del grupo ionizable involucrado en la catálisis. (Redibujado a partir de
Vangrysperre, W. et al., Biochem. J., 265, 699, 1990).
través del término termodinámico actividad de agua (aw), puesto que este término está relacionado con el cómo se
comporta el agua con respecto a los solutos (incluyendo las enzimas). Poniendo la lisozima como ejemplo, a
valores de aw de 0-0,1 el agua está fuertemente unida (como una monocapa) a los grupos cargados y muy polares de
las proteínas. A valores de aw de 0,1-0,4 el agua se une a los dominios menos polares de la proteína, incluyendo el
esqueleto peptídico. A valores de aw > 0,4 el agua de condensación forma una multicapa de agua y contribuye de un
modo creciente a la fracción de agua total o de agua disolvente. Los valores exactos de aw a los que tienen lugar
transiciones similares en los estados del agua en los alimentos dependen de los materiales. El efecto de la aw sobre
las reacciones enzimáticas se estudió con más profusión durante los años 1950-1980; en la Figura 6.36a se muestra
un ejemplo del comportamiento de aplicación general. A medida que se reduce el valor de aw en el rango 0,90-0,35,
la marcha de las reacciones hidrolíticas se enlentece y el equilibrio de las reacciones se alcanza con un grado de
hidrólisis cada vez más limitado. Cuando la aw se eleva después, la marcha de la reacción tiene lugar de modo
semejante a como ocurría inicialmente al valor de aw primitivo. Así pues, este efecto del agua es en gran parte
reversible y, en los alimentos y matrices biológicas, tal comportamiento se interpreta en términos de efectos de la
capilaridad que limitan el progreso de la reacción cuando los valores de aw son limitantes. Tales efectos se han
observado para la actividad de la lipasa, fosfolipasa e invertasa, pero son en general extensibles a todas las enzimas;
por ejemplo, la actividad de la polifenoloxidasa se reduce en un 90-95%, en términos de velocidad inicial y exten-
sión de la reacción, cuando la aw se reduce desde 1,0 hasta 0,60 [138]. Para las reacciones de síntesis de ésteres, las
lipasas de varios orígenes tienen distintos valores óptimos de aw (Fig. 6.36b).
Las enzimas presentan diferentes valores mínimos de aw para la función catalítica. A valores de aw iguales o
menores a los necesarios para que se forme una monocapa de agua alrededor de la enzima, la plasticidad de la
enzima es limitada, pero algunas enzimas todavía muestran actividad en esas condiciones. Los valores de aw meno-
res a los necesarios para la formación de la monocapa pueden restringir la actividad, pero esta situación también
aumenta la estabilidad térmica, puesto que la libertad conformacional se ve restringida y existe una menor tenden-
cia a desplegarse por parte de las proteínas a temperaturas que de otro modo resultarían desnaturalizantes. El
umbral de aw mínima necesaria para la actividad enzimática varía entre 0,25 y 0,70 para varias oxidorreductasas y
entre 0,025 y 0,96 para varias hidrolasas, tanto en matrices alimentarias como en sistemas modelo (Tabla 6.10).
Incluso una actividad enzimática residual baja puede ser suficiente para tener un impacto sobre la calidad de los
alimentos habida cuenta de los largos tiempos de almacenamiento de los alimentos de humedad intermedia.
Otro efecto de la reducción de la aw es su influencia sobre los equilibrios en los que está involucrada el
agua (las reacciones de hidrólisis) a través de los efectos de la ley de acción de masas. Así pues, para AB +
H2O  A’ + B’,
aw
Figura 6.36 Respuesta de la actividad enzimática frente a la aw. (a) Respuesta de la acción de la malta de cebada molida (fuente
de fosfolipasa) sobre un 2% de lecitina a 30°C, realizando un ajuste de la aw a un valor de 0,70 tras 48 días. (b) Respuesta de la
actividad sintética de ésteres de varias lipasas (RNL, lipasa de Rhizopus niveus; PSL, lipasa de Pseudomonas spp.; CRL, lipasa
de Candida rugosa). (Redibujado a partir de Acker, L. and Kaiser, H., Lebensm. Unters. Forsch., 110, 349, 1959; Wehtje, E., and
Adlercreutz, P., Biotechnol. Lett., 11, 537, 1997).
Enzimas 433
TABLA 6.10
Requisitos de aw para la actividad de enzimas particulares.
Enzima Matriz/sustrato aw mínima Enzima Matriz/sustrato aw mínima

Amilasas Harina de centeno 0,75 Amilasas Almidón 0,40-0,76
Pan 0,36
Fosfolipasas Pasta 0,45 Fosfolipasas Lecitina 0,45
Proteasas Harina de trigo 0,96 Lipasas Aceite, tributirina 0,025
Fitasa Granos 0,90 Fenoloxidasa Catecol 0,25
Glucosa oxidasa Glucosa 0,40 Lipooxigenasa Ácido linoleico 0,50-0,70
Fuente: Drapon, R. Modalities of enzyme activities in low moisture media, in Food Packaging and Preservation. Theory and Practice,
M. Mathlouthi (Ed.), Elsevier Applied Science Publishers, New York, pp. 181-196, 1986.
(6.46)
A medida que la aw disminuye, existe un desplazamiento en la posición de los reactantes y productos hacia la
acumulación de [AB]. Este efecto se explota comercialmente usando lipasas en medios microacuosos (<1% de
H2O) para provocar varias reacciones (Fig. 6.26) que conducen a la producción de lípidos con una funcionalidad
mejorada. De modo similar, el contenido de agua óptimo (relacionado con la aw) es de ~2-3% para las reacciones de
la termolisina que conducen a la formación del enlace peptídico durante la síntesis del aspartamo [86]. Muchas
enzimas muestran un valor de aw óptimo para su actividad y generalmente es >0,90.
La combinación de la ausencia de medio para la difusión con la falta de plasticidad puede provocar cambios en
las rutas de la reacción y en la distribución de los productos [37,121]. Para la reacción catalizada por la α-amilasa
sobre el almidón, a medida que se reduce la aw desde 0,95 hasta 0,75 hay un desplazamiento en la distribución de
los maltooligosacáridos que se producen desde una mezcla heterogénea de oligómeros con 1-7 unidades de gluco-
sa hasta productos con 1-3 unidades de glucosa. Esto indica que la hidrólisis se produce de una manera menos al
azar. La restricción en la difusión de la enzima y el sustrato favorece una mayor procesividad en el ataque enzimático,
puesto que la movilidad limitada de los reactantes hace que los segmentos del almidón sean sometidos a múltiples
acciones hidrolíticas en los sitios proximales. Igualmente, la difusibilidad restringida a valores de aw de 0,65 hace
que los productos finales de la reacción de la lipooxigenasa incluyan contenidos elevados de productos de conden-
sación del linoleato, con la correspondiente disminución de los hidroperóxidos del ácido graso. La capacidad de
difusión limitada permite a los hidroperóxidos alcanzar concentraciones locales elevadas y participar en reacciones
de adición bimolecular (condensación) de radicales libres.
La reducción de la aw también puede cambiar las constantes cinéticas o de equilibrio que gobiernan la reactivi-
dad enzimática. Por ejemplo, el pH óptimo de actuación de la polifenoloxidasa aumenta en 0,5 unidades cuando la
aw desciende de 1,0 hasta 0,85 [138]. Tal cambio es coherente con la disminución del carácter dieléctrico del medio
y el correspondiente incremento del pKa de los grupos ionizables importantes para la función enzimática. La lipasa
muestra un valor de KM mínimo a una aw de ~0,4 [37] y esto puede ser el resultado de un cambio en las propiedades
de la enzima o en la naturaleza de la interfase del sustrato. Dependiendo de la composición y de la aw de algunos
alimentos o de algunas matrices que se emplean como sistemas modelo, pueden producirse transiciones cristalinas,
en las que el movimiento molecular está muy restringido en relación con un medio en un estado más «elástico» o
más fluido (Capítulo 2). En algunos casos el estado cristalino resulta más estabilizador para las enzimas, pero las
enzimas generalmente muestran una sensibilidad en su estabilidad frente a la temperatura en los medios de bajo
contenido en humedad, con independencia de que se hallen en un medio cristalino o elástico [117]. En términos de
actividad enzimática, estudios en sistemas modelo han puesto de manifiesto que el incremento de la actividad
enzimática, cuando tiene lugar una transición en el medio desde el estado cristalino al elástico, no es tan obvio
como cabría esperar [27]. Factores composicionales específicos pueden modular la actividad y/o la estabilidad
enzimática en sistemas de baja humedad más que la mera presencia de un estado cristalino.
Finalmente, a medida que el agua se elimina, tiene lugar el aumento correspondiente de la viscosidad en la fase
que permanece en estado líquido, y esto puede servir para atenuar las reacciones enzimáticas a través de la reduc-
ción de la difusividad de los reactantes y los productos. El efecto de la viscosidad ha sido evaluado en algunos
casos de acción enzimática utilizando agentes «viscogénicos» inertes (por ej., glicerol, polioles, polímeros). Se ha
mostrado que aumentos de la viscosidad reducen la velocidad de las reacciones enzimáticas que están controladas
por la difusión o cuando el incremento de la viscosidad provoca un cambio en el paso que es limitante de la
velocidad, tal como el paso de disociación del producto. Se consideran reacciones enzimáticas controladas por la
difusión («casi perfectas») aquellas con valores de kcat/KM de ~108-109 M–1 s–1, aproximándose a las velocidades
limitadas por la difusión para las reacciones bimoleculares entre una molécula grande y una pequeña [151]. Los
primeros hallazgos de atenuación de las reacciones invertasa a concentraciones elevadas de sacarosa se interpreta-
ron como un efecto del aumento de viscosidad, pero más tarde se demostró que este efecto era debido en gran
medida a una inhibición por el sustrato [84]. Este ejemplo resalta la dificultad que supone el tratar de aislar el
efecto individual de un factor ambiental, como la modificación del contenido en agua, puesto que muchos otros
factores resultan modificados simultáneamente.
6.4.3.2 Efectos osmóticos de la desecación [41,160]

A medida que el agua se elimina progresivamente de los alimentos, o que se añaden solutos a un medio líquido,
los solutos que se hallan en disolución cada vez se concentran más en la fase acuosa que permanece líquida.
Consecuentemente, otro de los resultados de la desecación es un incremento de la fuerza iónica y de la osmolaridad.
La estabilidad, o, en un sentido más amplio, la actividad de las enzimas en medios hiperosmóticos está influenciada
por la naturaleza y concentraciones de los solutos presentes; las sustancias iónicas específicas se clasifican gene-
ralmente en «salting in» (desestabilizantes) y «salting out» (estabilizantes) de las proteínas (Capítulo 5). Cada
enzima muestra una respuesta característica frente a estos solutos y frente a los cambios en sus concentraciones a
medida que tiene lugar la desecación. Muchos procesos enzimáticos comerciales que utilizan niveles elevados
(10-40%) de sustrato (pectinasas, proteasas, amilasas y enzimas transformadoras de azúcares) resultan relevantes
para el comportamiento de la enzima en medios hiperosmóticos. Afortunadamente, muchos de estos sustratos son
también agentes estabilizantes de las proteínas, como ocurre con los polioles, azúcares y aminoácidos [160], y
niveles elevados de sustrato ayudan a estabilizar las enzimas frente a la desnaturalización térmica.
Otra consecuencia para las reacciones enzimáticas en medios con elevada concentración de sólidos es que se
ven favorecidas las reacciones reversas (especialmente en las reacciones de hidrólisis) por efecto de la ley de
acción de masas (recuérdese la Ecuación 6.46). Las reacciones reversas catalizadas por lipasas suponen un medio
para sintetizar los enlaces éster o reorganizarlos dentro de las moléculas de glicéridos (Fig. 6.26). Las plasteínas
formadas por las proteasas a concentraciones elevadas de péptidos vienen posibilitadas por reacciones de
transpeptidación; tales reacciones permiten la incorporación a moléculas proteicas de aminoácidos limitantes des-
de el punto de vista nutricional. El uso de glucoamilasa en condiciones comerciales específicas (Fig. 6.19) produce
un nivel limitado de acumulación de isomaltosa indeseable (enlace α,1→6) a través de reacciones de hidrólisis
reversa. La β-galactosidasa media en reacciones de glucosil transferencia a concentraciones de lactosa elevadas, lo
que da lugar a oligómeros de galactosa y glucosa que tienen un uso potencial como prebióticos.
Algunas enzimas están expuestas en la naturaleza a un estrés hiperosmótico de modo constante. Algunos ejemplos
de organismos que viven en medios hiperosmóticos incluyen a todas las especies marinas (el agua salada tiene ~3,5%
de NaCl), y a las plantas y microorganismos que habitan en aguas salobres, en suelos con una salinidad elevada, en
manantiales de agua mineral y en respiraderos de aguas marinas profundas. La congelación y la desecación también
provocan condiciones hiperosmóticas. Los sistemas osmorreguladores de los organismos han evolucionado para pa-
liar los efectos negativos de los medios con una elevada presión osmótica y una elevada fuerza iónica. Los
osmoprotectores son compuestos tales como los polioles (glicerol, manitol, sorbitol), azúcares (sacarosa, glucosa,
fructosa, trehalosa), aminoácidos (especialmente GLY, PRO, GLU, ALA, β-ALA) y una serie de aminas metiladas
(Fig. 6.37). En las estructuras de estos compuestos, nótese la frecuencia de los grupos funcionales estabilizantes –OH
(con capacidad para unirse al H), NH4+, RxNHy+, –CH2-COO– y SO32–; tales grupos estabilizan las proteínas contra-
rrestando o minimizando el efecto de los agentes desestabilizantes tales como Na+, K+, Cl–, urea y ARG.
Enzimas 435
Figura 6.37 Sistemas osmolito.
Se cree que el mecanismo por el cual actúan estos osmoprotectores incluye fenómenos de repulsión estérica entre
soluto-proteína (reforzando la estructura del agua, la compacidad y el estado nativo de la proteína) e interacciones
directas soluto-proteína (enlaces de H). Hay dos ejemplos de osmoprotección que merecen mención especial, como
son los protagonizados por las aminas metiladas y por la trehalosa. Los tejidos de los organismos marinos pueden
contener una concentración de hasta 10 mM de trimetilamina-N-óxido (TMAO). Este osmolito endógeno protege a
las enzimas tisulares frente a los efectos desestabilizantes (modificaciones adversas de la KM) de la sal, e incluso de la
urea (un poderoso agente desnaturalizante de las proteínas que existe en los tejidos de tiburones y rayas). Un com-
puesto relacionado, la betaína, mitiga los efectos inhibidores del NaCl sobre las enzimas en los tejidos de las plantas
que sufren un estrés salino. La trehalosa (glucopiranosil-α,1,1-glucopiranósido) se encuentra entre los osmoprotectores
más eficaces conocidos. Parece que se une a la proteína mediante enlaces de H y también refuerza la estructura del
agua, estabilizando las proteínas frente al estrés provocado por la desecación y la congelación [160]. Puesto que los
osmoprotectores conservan las actividades enzimáticas en los tejidos que los albergan en medios acuosos estresados,
estas sustancias también pueden añadirse a las preparaciones enzimáticas para hacerlas más estables. Esto se lleva a
cabo para la congelación y liofilización de las preparaciones enzimáticas, muchas de las cuales contienen ≤ de un 10%
de proteína activa, siendo el resto excipiente o material de soporte que puede incluir agentes crio/osmoprotectores.
Algunas enzimas pueden necesitar constituyentes iónicos para funcionar de manera óptima, o han evoluciona-
do para funcionar de modo correcto en condiciones de estrés acuoso, tales como las de los organismos halotolerantes
o halofílicos. Algunas de estas enzimas se han identificado de modo empírico a través del desarrollo y uso de varios
cultivos iniciadores en fermentaciones de productos a los que se añade sal (por ej., queso, salsa de soja). Las
enzimas de importancia en las fermentaciones deben ser suficientemente tolerantes para persistir y mostrar una
actividad suficiente que opere los cambios deseables durante la fermentación. En otros casos, se ha observado una
estimulación por la sal (osmótica) de la actividad. La termolisina, usada en la síntesis del aspartamo, un sustituto
del azúcar, se ve estimulada en su actividad 12 veces por la presencia de NaCl a una concentración de 4 M a un pH
óptimo de ~7 (Fig. 6.38), y su estimulación por los cationes monovalentes tiene lugar en un orden descendente: Na+
> K+ > Li+ [61]. La estimulación afecta sólo al paso kcat y no a la unión del S, y desplaza el pKa del grupo ácido
desde 5,4 hasta 6,7, mientras que el pKa del grupo alcalino permanece en un valor de ~7,8. El medio con una
elevada concentración de sal activa a la enzima a través de interacciones electrostáticas en la superficie de la
enzima y en el sitio activo, y esto se asocia con un cambio conformacional de la proteína. Esta enzima es ideal para
la síntesis de péptidos a niveles elevados de cosustrato.
6.4.3.3 Desecación por congelación

La congelación es distinta a otros procesos de desecación en el sentido de que la totalidad del agua se elimina
pasando al estado sólido y este fenómeno está acompañado de temperaturas más bajas (< 0°C) que las que se
Figura 6.38 Activación de la actividad termolisina

por la sal (NaCl). (Redibujado a partir de Inouye, K.
et al., J. Biochem., 122, 358, 1997).
registran en los alimentos deshidratados, los de humedad intermedia o los de elevada osmolaridad. Así pues, la
temperatura y el incremento de la concentración de los solutos son los condicionantes principales de la actividad
enzimática en el medio congelado, estando los efectos de la viscosidad y de la difusión comprendidos dentro de
estos dos condicionantes. La aw puede ser un factor menos importante en el medio congelado en comparación con
el desecado, puesto que viene dictada por la presión relativa de vapor del hielo y del agua sobreenfriada a la misma
temperatura; la aw sólo puede descender hasta 0,82 a –20°C (Capítulo 2). Los efectos de la congelación fueron
estudiados con detenimiento en los años 1960s-1980s, si bien los esfuerzos investigadores se mantienen aún vigen-
tes debido a que se mantiene el interés en la crioconservación de sistemas biológicos. En los estudios se emplearon
tanto sistemas modelo como reacciones en matrices alimentarias.
La influencia combinada de los dos factores dominantes que determinan los efectos de la congelación sobre las
reacciones enzimáticas pueden resumirse de la manera siguiente. La baja temperatura siempre reducirá la kcat y
provoca un descenso de la velocidad de reacción que resulta predecible en base a la Ea característica de la reacción.
Los efectos de la concentración son más variados y están relacionados con la concentración inicial de los agentes
que controlan la actividad enzimática (sustratos, inhibidores, efectores, cofactores, agentes con actividad tampón)
en el medio antes de congelarse y los efectos colectivos resultantes del incremento de sus concentraciones a resul-
tas de la eliminación del agua por su transformación en hielo. La concentración de los solutos puede tener un
impacto negativo o desestabilizar las enzimas a través de efectos osmóticos y/o inhibidores, especialmente si S >
KM, y las velocidades de reacción descenderán como consecuencia. El resultado neto sería una disminución general
de la velocidad de reacción al efectuar la congelación. Puede ocurrir un incremento limitado de la reactividad de la
enzima, provocado por factores tales como el incremento de la concentración de S o de algún efector positivo, pero
de manera que puede equilibrar aproximadamente el efecto depresor de la baja temperatura, dando como resultado
un cambio pequeño o inexistente cuando se congela. La tercera consecuencia potencial ocurre cuando el efecto de
la concentración de sustrato aumenta sustancialmente la reactividad, especialmente para una [S] inicialmente dilui-
da, de tal manera que este efecto domina sobre el de la temperatura y la consecuencia es un incremento neto de la
reactividad al congelar.
El acontecimiento físico de formación de cristales de hielo puede tener al menos tres consecuencias distintas.
Una de ellas es que en los sistemas celulares los cristales de hielo pueden romper las estructuras celulares y
provocar la mezcla de la enzima y los solutos que podían hallarse en compartimentos celulares diferentes. Este
efecto de descompartimentalización es, a menudo, el responsable de que los sistemas celulares muestren un
incremento de reactividad a temperaturas de congelación elevadas (entre –3 y –12°C), y a veces a temperaturas
tan bajas como –20°C. El tamaño de los cristales de hielo, que es principalmente función de cómo de rápido se
lleve a cabo la congelación (y secundariamente de los procesos de recristalización) también puede tener efectos
sobre la reactividad de las enzimas en los sistemas congelados. La congelación rápida favorecerá una mayor homo-
geneidad en la distribución de los cristales de hielo, que serán de menor tamaño, y la fase líquida, donde permanece
reactividad, estará formando «charcos» más dispersos. Esto puede mantener una cierta separación entre la enzima
y los reactantes, especialmente si estaban inicialmente contenidos en diferentes compartimentos celulares, aunque
Enzimas 437
el efecto neto de concentración sería equivalente al de la congelación lenta hasta la misma temperatura final. La
tercera consecuencia está relacionada con la velocidad de congelación y, aunque se ha considerado durante mucho
tiempo que cuanto más rápida sea la congelación en el rango de ~1-100°C/min mejor se conservará la actividad/
estabilidad enzimática, la regla general parece ser el efecto opuesto [22,132]. Una congelación más rápida crea
cristales de hielo más pequeños con mayor área superficial que en la congelación lenta, y con menos oportunidad
de agrupación del medio líquido no congelado. Los cristales pequeños parecen fomentar la desnaturalización su-
perficial de las enzimas. Algunas proteínas no son tan sensibles como otras y, en los sistemas celulares, las barreras
y compartimentos de las células pueden mitigar o exacerbar este fenómeno. De cualquier manera, las velocidades
de congelación de lentas a moderadas favorecen la estabilidad y la retención de la actividad enzimática durante el
almacenamiento a congelación. Generalmente, la actividad enzimática se pierde durante un almacenamiento a
congelación prolongado de los sistemas acuosos, pero esto ocurre con menor intensidad en los polvos liofilizados,
en los que el hielo se elimina antes del almacenamiento.
Las velocidades de descongelación tienen una profunda influencia sobre la retención de la actividad enzimática
en los medios biológicos. Una descongelación progresivamente más lenta, de 10 a 0,1°C/min, produce pérdidas
crecientes de varias enzimas en soluciones modelo, y el rango de temperatura en el que ocurre la mayor inactivación
es desde –10°C hasta el punto de descongelación [22,44]. La recristalización del hielo durante la descongelación
puede causar una tensión superficial y de corte adicionales que conduciría a una mayor desnaturalización de las
proteínas durante este proceso. También se observó que la descongelación lenta es particularmente desnaturalizante
para las enzimas en las matrices alimentarias, siendo un ejemplo de ello la aliinasa de la cebolla [149].
El incremento de la viscosidad en la fase líquida es otra consecuencia de la congelación, con una menor canti-
dad de agua disponible para servir como medio de difusión. Igual que se observó para la reducción de la aw, las
temperaturas de congelación más bajas limitan la velocidad y la amplitud de la reacción (Fig. 6.39). Más reciente-
mente, se ha realizado un intento de cuantificar el efecto de la viscosidad mediante el estudio de la fosfatasa
alcalina en soluciones de sacarosa congeladas [26]. La fosfatasa alcalina está distribuida ampliamente en la natura-
leza, y en la leche se usa como indicador de procesado térmico; se trata de una enzima eficiente que reacciona a una
velocidad (kcat/KM de 106-107 M–1 s–1) cercana al límite de la difusión. Las medidas de la función catalítica (kcat/KM)
concordaron bien con el efecto predicho de la viscosidad y podrían explicar el comportamiento en las disoluciones
parcialmente congeladas. Sin embargo, pueden ser importantes otros factores para las enzimas que reaccionan a
velocidades menores a las controladas por la difusión. Uno de estos otros factores todavía no discutido es la
eutéctica, que puede causar cambios iónicos y composicionales (pH) que pueden influir sobre la actividad y estabi-
lidad enzimática. También afectan a la sensibilidad de las enzimas frente a la congelación la concentración enzimá-
tica y la concentración proteica en el medio; las concentraciones mayores favorecen un mayor grado de retención
de la actividad enzimática, probablemente a través de interacciones proteína-proteína que resultan estabilizantes.
Figura 6.39 Efectos de la congelación sobre el progreso de la reacción de (a) la lipasa en guisantes no escaldados y (b)
oxidación del ácido linoleico por la lipooxigenasa en reacciones modelo. (Redibujado a partir de Bengtsson, B. and Bosund, I.,
J. Food Sci., 31, 474, 1966; Fennema, O. and Sung, J.C., Cryobiology, 17, 500, 1980).
Por último, la presencia de compuestos crioprotectores aumenta la estabilidad enzimática, siendo importantes los
mismos osmoprotectores y tal como se discutió con anterioridad, particularmente la trehalosa, otros polioles y los
azúcares.
6.4.4 TÉCNICAS DE PROCESADO NO TÉRMICO [137]
Las tecnologías no térmicas más importantes que están siendo evaluadas con fines de conservación de los
alimentos son el procesado con altas presiones hidrostáticas (HPP), campos eléctricos pulsados, ultrasonidos,
irradiación, luz ultravioleta y los procesos oxidativos (ozono, dióxido de cloro). Todos estos métodos persiguen
específicamente el control de los microorganismos, pero las HPP y los ultrasonidos pueden también inactivar
enzimas que resultan indeseables en los alimentos, manteniendo la «frescura» que se pierde como consecuencia del
procesado térmico. Las presiones suficientemente elevadas perturbarán y desplegarán las estructuras proteicas y
disociarán los oligómeros, conduciendo de este modo a descensos de la actividad enzimática. Los tratamientos
HPP utilizan presiones de 100-900 MPa; puede darse una activación enzimática en tratamientos de hasta ~400 MPa,
mientras que el aumento de las presiones hasta valores de 900 MPa a menudo provoca una inactivación que va
desde modesta a intensa. Las sensibilidades de las enzimas a la presión dependen de la matriz tisular, condiciones
del tratamiento HPP y tratamientos auxiliares, de modo que el desarrollo del proceso debe realizarse de modo
empírico. Los productos de frutas y vegetales (zumos, mermeladas, purés) son los más frecuentemente tratados con
HPP para incrementar su vida útil mediante inactivación enzimática. Uno de los éxitos comerciales más evidentes
e impactantes ha sido la posibilidad de conservar puré de aguacate durante varias semanas a refrigeración a través
de la inactivación y control de la fenoloxidasa.
6.5 LAS ENZIMAS ENDÓGENAS DE LOS ALIMENTOS Y SU CONTROL
En el contenido restante de este capítulo se tratará de la caracterización y manipulación de las actividades

enzimáticas endógenas de los alimentos, lo que supone un reto permanente para los científicos que trabajan en el
campo de los alimentos. El propósito es el de proporcionar conocimientos sobre la naturaleza y la disposición de
las enzimas en los tejidos, la complejidad de su comportamiento e interacciones, y sobre cómo se pueden emplear
estrategias físicas y químicas para atenuar o potenciar la acción enzimática según resulte necesario o deseable. Los
procesos bioquímicos complejos e interrelacionados tales como la maduración, la poscosecha, el metabolismo post
sacrificio de los animales, y la manipulación genética se abordan en otros capítulos.
6.5.1 EFECTOS CELULARES Y TISULARES
Las enzimas relacionadas con la calidad o con el procesado de los alimentos a menudo se estudian en prepara-
ciones puras o parcialmente puras que permitan conocer las propiedades intrínsecas y las características de la
enzima. Tales estudios in vitro a menudo utilizan concentraciones de enzima de 10–7-10–12 M. Un cálculo rápido
utilizando un alimento hipotético que tenga un 10% de proteína y que contenga 1.000 proteínas diferentes con una
masa molecular media de 100 kDa nos da como resultado que la concentración media de cada tipo de proteína
viene siendo 10–6 M [122]. Por supuesto que algunas proteínas individuales son mucho más abundantes que otras, de
tal manera que los rangos de concentraciones pueden ser fácilmente de ± 3 órdenes de magnitud (10–3-10–9 M). Así
pues, y por término medio, los niveles de las enzimas en los alimentos y en las matrices biológicas son varios órdenes
de magnitud más elevados que los usados en los estudios de caracterización de las mismas. En la Tabla 6.11 se
proporcionan ejemplos de niveles elevados de enzimas en alimentos de varios orígenes. Los niveles estimados en
esta tabla no dan cuenta de ningún enriquecimiento adicional conferido por la localización dentro de la célula
(compartimentalización), que puede aumentar las concentraciones otro orden de magnitud o más. Incluso los ali-
Enzimas 439
TABLA 6.11
Ejemplos de concentraciones elevadas de enzimas en los alimentos y tejidos.
Enzima Fuente Nivel hallado Concentración Comentario

(mM)
Gliceraldehído-3-fosfato Músculo (carne) >1% del peso fresco 0,34 Enzimas metabólicas rela-
deshidrogenasa cionadas: La aldolasa se
encuentra a 0,15 mM; la
lactato deshidrogenasa a
0,11 mM; existen comple-
jos multienzimáticos
Peroxidasa Raíz del rábano picante 20% de la proteína 0,2 Las isoformas pueden ser
citosólicas o plastídicas
Acilhidrolasa lipídica Tubérculo de la patata ~30% de la proteína 0,2 Proteína de almacenamiento
localizada en la membrana
extravacuolar y enriqueci-
da en la yema apical del
tubérculo
Aliinasa Bulbo de la cebolla ~6% de la proteína 0,02 Citosólica (cebolla), o enri-
Diente de ajo ~10% de la proteína 0,2 quecida en las envoltuas
(ajos)
Pancreatina (mezcla Páncreas ~0,04 g/g ~1, la La tripsina, la quimotripsi-
de proteasas de peso seco proteasa na y la elastasa pueden
digestivas) total existir como zimógenos
y en forma activa
mentos que no están organizados en tejidos como la leche y los huevos presentan una heterogeneidad estructural
que permite distribuir y concentrar los componentes endógenos entre las fases discretas.
La compartimentalización y la concentración in vivo de las enzimas influye de distintas maneras sobre sus
propiedades en los alimentos. Las propiedades de las enzimas pueden depender de su concentración. Esto es
especialmente cierto para las enzimas oligoméricas en las que la disociación se ve favorecida por la dilución, y por
lo tanto las propiedades cinéticas asociadas con las enzimas oligoméricas (alosterismo) pueden disminuir. Las
relaciones cinéticas entre E y S pueden también cambiar con los cambios de [E], aunque teóricamente las constan-
tes como la KM son independientes de [E]. Un ejemplo sorprendente lo constituye la fosfofructoquinasa muscular
(que influye sobre la velocidad de la glucólisis post mortem durante la transformación del músculo en carne)
(Fig. 6.40a). A niveles de enzima fisiológicamente relevantes (500 μg/mL, ~10–6 M), S0,5 es 0,5 mM, mientras que
a 5 μg/mL, ~10–8 M), S0,5 es ~10 veces mayor (6,4 mM). Además, al nivel más bajo de la enzima, la inhibición por
el ATP (que es también un cosustrato) en presencia de un activador, la fructosa-2,6-bifosfato, fue más pronunciada,
con una K1 de 1,2 mM, en comparación con una K1 de 10 mM a los niveles fisiológicos de la enzima. Otra
dimensión del comportamiento de las enzimas in situ es el hecho de que otros constituyentes puedan modular su
reactividad. En presencia de fructosa bifosfatasa, la fosfofructoquinasa muestra una cinética de tipo hiperbólico
con un S0,5 de 2,9 mM, mientras que cuando actúa en solitario muestra una cinética alostérica con un S0,5 que
aumenta hasta 9,2 mM (Fig. 6.40b). Por lo tanto, la fructosa bifosfatasa puede «activar» a la fosfofructoquinasa
in situ en el músculo a través de interacciones estructurales o de efectos metabólicos.
Otro factor que afecta a la reactividad enzimática in situ es el representado por los niveles relativos de enzimas,
sustratos y cofactores; son muchas las enzimas que pueden competir por los dos últimos grupos de compuestos. Por
ejemplo, los metabolitos intermediarios de la glucólisis oscilan entre 20-540 μM, mientras que las enzimas glucolíticas
oscilan entre 32-1400 μM [131]. Así pues, los sustratos pueden resultar limitantes de las reacciones tanto en las
rutas metabólicas primarias como en las secundarias. Los niveles de NAD+/NADH en el estado de equilibrio se
Figura 6.40 Efecto de las condiciones in situ simuladas sobre el funcionamiento de (a) fosfofructoquinasa y (b) fosfofructoquinasa
en presencia o ausencia de fructosa bifosfatasa (FBPasa). (Redibujado a partir de Bär, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
167, 1214, 1990; Ovádi, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 135, 852, 1986).
estima que son ~540/50 μM, y la competición y los valores relativos de KM para estos cosustratos entre las muchas
oxidorreductasas actuantes en los sistemas biológicos a menudo son los que dictan qué enzimas son las activas y
cuales no lo son (virtualmente no hay NAD+/NADH en estado «libre»). En cambio, en la caracterización in vitro de
la actividad enzimática a menudo se utilizan excesos de cosustrato(s) y [S] de 10–6-10–2 M.
Debería resultar ya evidente que la compartimentalización es un carácter clave en el control de la acción enzi-
mática en los alimentos y en los sistemas biológicos. Sin embargo, la compartimentalización significa más que una
simple separación por medio de una membrana, dentro de una organela, o la presencia de alguna otra barrera física.
Las enzimas pueden estar separadas de otras enzimas o de sus sustratos mediante una unión a otras proteínas,
membranas e incluso a polisacáridos. Las enzimas pueden estar co-compartimentalizadas a través de la interacción
o unión entre sí y esta asociación permite la canalización metabólica de los sustratos e intermediarios hasta produc-
tos finales, apartándolos del conjunto citosólico o metabólico difusional de las células. Las enzimas pueden estar
también compartimentalizadas funcionalmente manteniéndose en formas latentes por efecto de otros factores. Los
ejemplos de esto incluyen los valores de pH o de fuerza iónica (o gradientes) localizados, la presencia de un
inhibidor reversible, la ausencia de un efector positivo o de un cofactor, o la necesidad de la activación proteolítica
de las proenzimas para su transformación en enzimas.
La disposición de las enzimas en los alimentos puede controlarse con bastante facilidad en algunos casos. El
simple acto de romper los tejidos es una manera de ello. El que este tipo de actuaciones mejoren la calidad (como en
el caso de la generación del flavor) o la disminuyan (pardeamiento enzimático) depende del tipo de alimento, de sus
atributos de calidad específicos, y de la reacción particular que resulte favorecida. Por ejemplo, la acción de la
lipooxigensa sobre los lípidos puede dar lugar tanto a flavores rancios como a sensaciones agradables; el pardeamiento
enzimático es deseable en la «fermentación» química del té, pero no en las futas y verduras crudas cuando se cortan.
6.5.2 ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS RELACIONADAS CON LA CALIDAD DEL COLOR

DE LOS ALIMENTOS
6.5.2.1 Fenoloxidasas [129,142,150]

El pardeamiento enzimático está causado por enzimas que se denominan colectivamente fenolasa, fenoloxidasa,
polifenoloxidasa, catecolasa, cresolasa y tirosinasa. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en los microor-
ganismos, plantas, hongos y animales, incluido el hombre, donde su actividad es la responsable de la pigmentación
de la piel. Estas enzimas están relacionadas entre sí por el hecho de que poseen la misma arquitectura del sitio
activo caracterizada por la presencia de cobre binuclear del tipo 3 (acoplado oxidativamente) en el sitio activo.
Otro carácter común es que pueden catalizar las dos reacciones siguientes o la última de ellas:
Enzimas 441
Monofenol + O2 + 2H+ → o-difenol + H2O (6.47)
o-difenol + ½O2 → o-quinona + H2O (6.48)
La primera reacción implica hidroxilación y se categoriza como una actividad monofenol monooxigenasa
(EC 1.14.18.1), mientras que la segunda reacción conlleva oxidación y se clasifica como una actividad
1,2-bencenodiol-oxígeno oxidorreductasa (EC 1.10.3.1). La primera reacción es la base de la «actividad cresolasa»,
ya que el p-cresol generalmente representa a los monofenoles y se usa de modo rutinario como sustrato para
ejemplarizar la hidroxilación de monofenoles (y su oxidación posterior). El catecol es el nombre común del
1,2-bencenodiol (el o-difenol más simple) y, así pues, las actividades cresolasa y «catecolasa» se utilizan para
representar los pasos respectivos de hidroxilación y oxidación del difenol. «Tirosinasa» es un término que se utiliza
para denominar de modo genérico a las enzimas que catalizan ambas reacciones, de hidroxilación y de oxidación;
el nombre procede de la enzima abundante en el champiñón común (Agaricus bisporus), la cual actúa sobre un
sustrato endógeno, la tirosina. La acción enzimática no forma directamente los pigmentos pardos. Más bien, las
o-quinonas procedentes de la acción enzimática sufren reacciones químicas de condensación (y pueden también
involucrar a aminas y proteínas) para dar lugar a productos diversos poliméricos y conjugados denominados
«melaninas» que de modo general tienen un color marrón rojizo.
Cada átomo del cobre binuclear está fuertemente ligado a tres residuos de HIS (HIS88, 109, 118 e HIS240, 244, 274 en
la catecolasa del boniato) y este carácter constituye la secuencia más conservada entre las fenoloxidasas y las
enzimas que tienen cobre binuclear relacionadas [40,129]. Las enzimas de los vegetales superiores tienden a ser
monoméricas u homooligoméricas, con monómeros de 30-45 kDa de masa. Las tirosinasas a menudo están
glucosiladas y existen en isoformas múltiples que muestran selectividades de sustrato diferentes. El mecanismo de
las tirosinasas incluye reacciones redox en pasos de 2e– (Fig. 6.41). El estado de la enzima en los tejidos está
generalmente distribuido entre las formas MET (CuII-CuII-OH–) (~85%) y OXI (CuII-CuII-O22–) (~10-15%), debido
a lo cual la enzima se aísla con más frecuencia en la forma MET. Cualquiera de las dos formas oxida fácilmente a
los difenoles y las reacciones transcurren de modo rápido a través del ciclo que se muestra en el perímetro de la
Figura 6.41. Así pues, en un ciclo completo se utilizan un mol de O2 y 4e– del sustrato por cada dos moléculas de
H2O que se producen. En la porción del ciclo que se inicia con la forma DEOXI de la enzima, posiblemente el O2
se une antes que el difenol y forma un puente peróxido único (forma OXI), recibiendo electrones de CuI-CuI.
La hidroxilación a menudo presenta un período lag (de latencia) porque necesita el concurso de la forma menos
abundante de la enzima, la OXI-enzima, y la presencia de grupos sustituyentes en el anillo fenol del sustrato puede
impedir la reactividad debido a impedimentos estéricos para la orto-hidroxilación [129]. La secuencia de la
hidroxilación está representada por el ciclo interior de la Figura 6.41 y da lugar a un mol de H2O por cada mol de
O2 consumido. Los monofenoles parecen sufrir ambas reacciones secuenciales, de hidroxilación y oxidación, en un
único episodio catalítico. Los difenoles son activadores de la reactividad enzimática frente a los monofenoles y
reducen el período lag porque permiten que la enzima cambie rápidamente de la forma MET a la OXI (esta carac-
terística a menudo se expresa, como en la Ecuación 6.47, como la necesidad de contar con un donador de átomos
H, BH2 en lugar de 2H+). La inhibición competitiva recíproca, de los monofenoles sobre la oxidación de los
o-difenoles, y de los o-difenoles sobre la o-hidroxilación de los monofenoles, es concordante con las rutas compar-
tidas pero parcialmente divergentes del ciclo enzimático para cada actividad. Los bajos niveles de H2O2 pueden
activar a la tirosinasa a través de la conversión de la forma MET en la forma OXI; cantidades excesivas de H2O2
inactivan a la enzima, posiblemente por efecto de un radical cripto-oxi generado por el complejo Cu2 binuclear-
peróxido, que acaba por destruir los ligandos HIS que fijan el Cu al sitio activo. A pesar de las informaciones
iniciales que daban cuenta de la existencia de enzimas que poseían únicamente actividad cresolasa, parece ser que
todas las enzimas del tipo cresolasa tienen también actividad catecolasa con ratios entre las dos actividades que
generalmente oscilan de 1:10 a 1:40 [161]. La mayoría de las enzimas del tipo catecolasa tienen también actividad
cresolasa.
El pardeamiento enzimático acontece en las gambas y otros crustáceos, y constituye el defecto llamado mancha
negra. La hemocianina, una proteína con cobre involucrada en el transporte de O2 en los crustáceos y relacionada
estrechamente con la tirosinasa, puede tener alguna implicación en el desarrollo de la mancha negra. Las lacasas
Figura 6.41 Mecanismo de reacción y ciclo de la polifenoloxidasa. Las formas predominantes de la enzima en la naturaleza se
muestran en recuadros. Las especies OXI están coordinadas con dos átomos de O, mientras que las especies MET están coordi-
nadas con –OH. Algunas especies tienen difenol (D) o monofenol (T) unido al sitio activo. (Adaptado y redibujado a partir de
Eicken, C. et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 9, 677, 1999; Solomon, E.I., et al., Chem. Rev., 96, 2563, 1996).
(EC 1.10.3.2) constituyen otro grupo de enzimas distribuidas ampliamente en las plantas y hongos, que oxidan los
difenoles, pero no presentan actividad tipo cresolasa. Aunque pueden contribuir a reacciones de pardeamiento
enzimático en los alimentos, sus propiedades son suficientemente parecidas a las de las o-difenoloxidasas (hay
algunas diferencias en la sensibilidad a los inhibidores) como para que no hablemos más de ellas aquí.
Se cree que el papel de las fenoloxidasas en las plantas es el de defensa frente a plagas y patógenos [150]. La
acción de las difenoloxidasas en los tejidos vegetales representa un mecanismo clásico de activación por
descompartimentalización, puesto que la enzima es mayoritariamente plastídica (presente en los cloroplastos y
cromoplastos) y puede estar latente hasta en un 95-99%; puede estar formando un complejo con un inhibidor (por
ej., oxalato), y los sustratos están compartimentalizados en otra parte (en vacuolas o en celdas especializadas) o
existen en forma de precursores. La rotura de los tejidos puede activar a las fenoloxidasas latentes por efecto de
ácidos o por contacto con los sustratos (de las vacuolas), por modificación proteolítica del zimógeno, o por acción
de diferentes activadores químicos, especialmente surfactantes. Las o-quinonas producidas por la reacción enzimá-
tica son reactivas y pueden inactivar las enzimas segregadas por un microorganismo invasor, y la polimerización de
las o-quinonas (melanosis) puede proporcionar también una barrera química frente a la infestación.
Enzimas 443
En los alimentos, las fenoloxidasas causan pardeamiento enzimático, que puede ser deseable en productos tales
como uvas pasas, ciruelas, semillas de cacao, té, café y sidra de manzana. Se ha puesto de manifiesto que las
fenoloxidasas pueden producir enlaces cruzados ditirosina y esto puede resultar beneficioso en los casos en los que
se desea una «texturización» de las proteínas, como ocurre en la formación de geles y en el acondicionamiento de
la masa del pan (gluten). In vivo, se ha propuesto que la tirosina se halla implicada en la síntesis de la betalaína. Sin
embargo, en la mayoría de las frutas y hortalizas, especialmente en los productos mínimamente procesados, el
pardeamiento no enzimático se asocia con pérdida de calidad del color. La presencia de fenoloxidasas en los
granos, tales como el trigo, se correlaciona con la falta de «blancura» en los fideos, lo que supone una merma de la
calidad.
Las fenoloxidasas en las frutas y en los tejidos vegetativos tienen una actividad óptima en un rango de pH
4,0-7,0, y algunos sustratos influyen sobre el pH óptimo. Los efectos del pH están mediados por un único grupo
ionizable que afecta a la unión del sustrato (al paso de KM), pero no al paso catalítico (Vmáx) o a la conformación
global de la enzima. Las temperaturas óptimas para las fenoloxidasas están en el rango de 30-50°C, pero su estabi-
lidad frente a la temperatura es comparativamente alta y se caracteriza por vidas medias de varios minutos en el
rango de 55-80°C, dependiendo del origen. Así pues, durante el procesado térmico existe una gran oportunidad
para la activación de las fenoloxidasas, puesto que las temperaturas de ~60-65°C provocan escapes dentro de las
células (descompatimentalización) y mezcla de la enzima y el sustrato a una temperatura elevada.
Las preferencias por el sustrato dependen del origen de la enzima y de la isoforma. Entre los sustratos naturales
o endógenos más comunes se encuentran los derivados de los ácidos cafeoil-quínico, cafeoil-tartárico y cafeoil-
shiquímico, catequina, y otros que se muestran en la Figura 6.42, para los que los valores de KM están en el rango
general de 0,5-20 mM. Algunos sustratos se convierten en inhibidores a niveles suficientemente elevados.
Existe mucho interés en inhibir el pardeamiento enzimático y existen varias estrategias para hacerlo. La
deshidratación, la congelación y el procesado térmico son efectivos con tal de que el tiempo de tratamiento
necesario no provoque otros tipos de pardeamiento o cambios texturales que impliquen pérdida de calidad.
Otros medios físicos de inhibición incluyen el envasado en atmósferas modificadas en el caso de los alimentos
mínimamente procesados, o el recubrimiento de las superficies de corte con jarabes de azúcar (especialmente
para productos congelados) o con películas comestibles para limitar la disponibilidad de O2 que actúa como
cosustrato. Estas últimas medidas son realistas, puesto que el valor de KM para el O2 es de ~50 μM, y la concen-
tración de O2 en el agua saturada de aire a 25°C es de ~260 μM, proporcionando la oportunidad de una reduc-
ción significativa de los niveles de O2 presentes. En los productos que respiran existe una limitación que viene
dada por el hecho de que el O2 no puede eliminarse hasta un nivel que provoque la instauración de un metabo-
lismo anaerobio, que a menudo proporciona flavores anómalos. Aunque algunas fenoloxidasas sufren inactivación
por reacción (por reacción con la o-quinona), los miles de cambios que ocurren en la enzima antes de que tenga
Figura 6.42 Sustratos de la polifenoloxidasa.
lugar la inactivación limitan la potencialidad de explotar esta característica como medio de control del
pardeamiento enzimático en los alimentos.
Más populares son los tratamientos químicos basados tanto en la inhibición como en la inactivación de la enzima,
en la formación de complejos con los sustratos nativos o en la reducción de los niveles de quinonas por transforma-
ción de nuevo en o-dienoles y/o quinonas conjugadas, de modo que se evite la formación de melaninas. En esta última
estrategia, los compuestos químicos que actúan sólo como agentes reductores retrasan el pardeamiento sólo hasta el
momento en que se consumen y después ofrecen poca protección adicional. Algunos agentes reductores, especial-
mente los tioles, pueden conjugarse químicamente con las quinonas para formar aductos incapaces de polimerizarse,
pero este efecto también tiene una duración limitada, puesto que los tioles se consumen en el proceso:
(6.49)
Las estrategias que giran en torno a la inhibición enzimática tienen mayor eficacia a largo plazo e incluyen el
empleo de acidulantes, inhibidores enzimáticos, agentes quelantes e inactivadores de las enzimas. Los acidulantes
tales como los ácidos cítrico, málico y fosfórico explotan la sensibilidad de la acción enzimática a los bajos valores
de pH, siempre que puedan añadirse a niveles que no causen efectos adversos. Los inhibidores que se asemejan a
los sustratos naturales pueden ocupar de modo competitivo el sitio de unión con el compuesto fenólico; tales
inhibidores se muestran en la Figura 6.43.
Los quelantes como el EDTA o los ácidos cítrico u oxálico (incluidos los zumos que contienen estos ácidos
orgánicos tales como los de limón o ruibarbo) se coordinan con el cobre del sitio activo y en algunos casos hay
evidencia de que una porción del cobre puede resultar eliminada, aunque este extremo no es imprescindible para
que haya inhibición. Las HIS se unen al cobre de una manera bastante fuerte (log Kasoc de 10-18) y los agentes
quelantes del cobre (log Kasoc de 15-19 para el EDTA y log Kasoc de 4-9 para el oxalato) pueden no resultar eficaces
en la eliminación de cobre del sitio activo de la enzima. Otros inhibidores se coordinan con el cobre del sitio activo
e inhiben competitivamente la actividad; entre estos inhibidores se encuentran las sales de haluro, el cianuro, el CO
y algunos reactivos tiólicos. Las estrategias para formar complejos con los sustratos nativos y limitar su disponibi-
lidad o su acceso a la reacción enzimática se han centrado en los tratamientos con quitosano y ciclodextrinas. El
uso futuro de estos agentes puede limitarse al tratamiento de productos fluidos. La polivinilpirrolidona (forma
insoluble) es otra matriz capaz de formar complejos con los compuestos fenólicos; se usa fundamentalmente con
fines de investigación en las labores de aislamiento de las fenoloxidasas para minimizar la intensidad del pardeamiento
que tiene lugar durante la extracción inicial a partir de los tejidos. Sin embargo, esta solución puede disminuir el
valor nutricional de los zumos, ya que los fenoles y compuestos relacionados son considerados moléculas que
confieren beneficios para la salud (Capítulo 13).
Los agentes reductores tales como varios sulfitos, el ácido ascórbico y la cisteína tienen efectos múltiples en la
inhibición del pardeamiento enzimático. Pueden actuar reduciendo las o-quinonas, convirtiéndolas de nuevo en difenoles,
o produciendo la conjugación química de las o-quinonas, retrasando de este modo la formación de melaninas. Este
Ácido cinámico Ácido p-cumárico Ácido ferúlico Ácido benzoico
Figura 6.43 Otros inhibidores de la polifenoloxidasa que se asemejan a los sustratos.
Enzimas 445
efecto sería de duración limitada, puesto que los equivalentes reductores podrían agotarse durante una acción de la
enzima prolongada. Un efecto más importante de estos agentes, consistente en la inactivación covalente de las
fenoloxidasas, parece ser irreversible, puesto que la actividad enzimática no se restablece totalmente mediante la
subsecuente diálisis tras una preincubación prolongada en ausencia del sustrato [92]. Estos inhibidores parecen coor-
dinarse con el cobre del sitio activo y sufren reacciones de transferencia de electrones en condiciones aeróbicas para
dar lugar a «cripto» oxirradicales (difíciles de detectar o de identificar) en el sitio activo. Estas especies oxidantes
degradan los ligandos HIS del sitio activo, inactivando la enzima y probablemente liberando cobre. La capacidad de
los agentes inhibidores para funcionar de este modo en los tejidos rotos se basa en factores cinéticos, esto es, en la
rapidez y el grado de competitividad con el que se unen a la enzima y la inactivan en relación con la rapidez con la que
la enzima actúa sobre los sustratos. Los sulfitos y los reactivos tioles tienen una efectividad más duradera que el ácido
ascórbico como inhibidores del pardeamiento en los tejidos disgregados; esta diferencia está relacionada con el tiem-
po de inactivación de la enzima, que tiene lugar de un modo más rápido en los primeros compuestos citados [92]. La
tropolona y el 4-hexilresorcinol son otros dos inhibidores de la fenoloxidasa identificados recientemente (Fig. 6.44).
Ambos se asemejan al sustrato y se coordinan fuertemente con el cobre del sitio activo; estos inhibidores son
efectivos en un rango de concentración de ~1 μM. El 4-hexilresorcinol se ha aislado a partir de un extracto de higo
empleado como una preparación de ficina (proteasa). Se usa fundamentalmente para controlar la mancha negra en
los crustáceos, como sustituto de los sulfitos (está reconocido como GRAS por la FDA), los cuales están siendo
prohibidos progresivamente debido a las respuestas adversas que provocan en ciertos sectores de la población,
particularmente en las personas asmáticas. La tropolona no puede añadirse a los alimentos, pero es útil para discri-
minar entre el pardeamiento causado por fenoloxidasas y el provocado por peroxidasas. Otro tipo de inhibidores de
las fenoloxidasas son algunos péptidos de la miel y del plantón de maíz que están todavía por identificar, así como
varios ciclopéptidos pequeños [150]. El ácido kójico ha sido identificado en cultivos de Aspergillus y Penicillium
spp. como un inhibidor eficaz de la fenoloxidasa, probablemente actuando mediante coordinación con el cobre del
sitio activo; sin embargo, su uso debe limitarse a los alimentos fermentados en los que se usan estos microorganis-
mos, toda vez que tiene un historial de toxicidad para los animales.
6.5.2.2 Peroxidasas [38,142]

Las peroxidasas son enzimas ubicuas en las plantas, animales y microorganismos y se organizan en superfamilias
de origen vegetal (que incluyen a las de los microorganismos) y animal. Las peroxidasas vegetales son más impor-
tantes para la bioquímica de los alimentos, y las diferentes clases (familias) de peroxidasas de este origen incluyen
las de origen procariota, las secretadas por los hongos, y las peroxidasas vegetales clásicas. Las peroxidasas vege-
tales son proteínas glucosiladas, monoméricas, con un grupo hemo (protoporfirina IX) y de 40-45 kDa de masa;
poseen dos dominios similares que surgen de la duplicación de genes. Las peroxidasas vegetales son solubles en su
mayoría, estando en otros casos asociadas a las membranas y unidas covalentemente; estas últimas se liberan por
acción de enzimas que degradan la pared celular. Las funciones fisiológicas de las peroxidasas incluyen la forma-
ción y degradación de la lignina, la oxidación del ácido indolacético (un regulador vegetal implicado en la madu-
ración y los procesos catabólicos asociados a ella), la defensa evolutiva frente a plagas y patógenos, y la elimina-
ción del H2O2 celular. Poseen isoformas que se clasifican en ácidas, neutras y alcalinas en base al valor de su punto
isoeléctrico. La mejor estudiada es la peroxidasa C neutra de la raíz del rábano picante (EC 1.11.1.7; donante-H2O2
oxidorreductasa) y como tal se emplea como peroxidasa modelo; sus características son en general extensibles a
otras peroxidasas. La reacción general catalizada por la peroxidasa es:
2 AH (donante de electrones) + H2O2 → 2 H2O + 2A• (6.50)
La enzima puede existir en cinco estados de oxidación, siendo el estado de reposo el que tiene el hierro en forma
FeIII (Fig. 6.45). La reacción con el H2O2 tiene lugar tras una unión en las proximidades del hierro hemo, y el
residuo HIS42 actúa como base general que «arranca» un electrón y da lugar al anión hidroperoxilo, un nucleófilo
fuerte que coordina con el hierro. El residuo de HIS170 que se encuentra ligando el Fe actúa entonces como una
base general que empuja electrones hacia el peróxido y permite la rotura heterolítica del enlace O-O para dar lugar
Figura 6.44 Otros inhibidores de la polife-

noloxidasa que se asemejan a los sustratos.
a H2O como grupo saliente (un H+ procedente de la HIS42 actúa ahora como un ácido general), dando lugar al
compuesto I de la peroxidasa (FeV=O). Así pues, en términos netos se usan 2e– provenientes del FeIII hemo para
reducir el H2O2 y formar H2O. Dos pasos sucesivos de transferencia de 1e– (y H+) a partir de cada uno de los dos
donantes AH revierten el estado de la enzima hasta la situación de reposo (completando el ciclo peroxidásico)
pasando por el compuesto II de la enzima (H+–FeIV=O) y desprendiendo otra H2O como grupo saliente. Cada uno
de estos pasos es progresivamente más lento en comparación con la velocidad de formación del compuesto I. Las
peroxiadasas se inhiben más fácilmente por los compuestos químicos que se unen al grupo prostético hemo, siendo
los más frecuentes los cianuros, NaN3 y CO, así como algunos compuestos tiólicos. Sin embargo, el empleo de
tales inhibidores se limita a las labores de caracterización de las peroxidasas. Además, la ambigüedad general
existente en relación con el papel de las peroxidasas en la calidad de los alimentos debilita la justificación de la
adición de inhibidores específicos.
Los fenoles (por ej., p-cresol, catecol y los ácidos cafeico y cumárico; Figuras 6.42 y 6.43), el ácido ascórbico,
el NADH y las aminas aromáticas (por ej., ácido p-aminobenzoico) son donantes comunes de electrones para la
conversión del compuesto I en compuesto II y retornar la peroxidasa al estado férrico. Los 2A• resultantes del ciclo
peroxidásico pueden tener varios destinos. Si el AH es ácido ascórbico, entonces los 2A• van a dar lugar a un mol
de ácido ascórbico y a uno de dehidroascorbato. Si el AH es guayacol, entonces los 2A• sufrirán una reacción de
Figura 6.45 Mecanismo de reacción y ciclo de la peroxidasa. En el esquema de la mitad inferior de la figura, P es el ciclo
peroxidásico, C es el ciclo catalítico y O es el ciclo oxidásico. (Redibujado a partir de Dunford, M.B., Heme Peroxidases, John
Wiley & Sons, New York, 507 pp., 1999).
Enzimas 447
adición de radicales libres (polimerización) para dar lugar a tetrámeros; el color pardo que se genera en esta
reacción es lo que hace que se utilice guayacol en la determinación de la actividad peroxidasa, una prueba muy
usada como indicador de la eficacia del tratamiento de escaldado.
(6.51)
El pirogalol es otro de los sustratos que sufre reacciones de homocondensación de los radicales libres para dar
lugar a un dímero de color púrpura (purpurogalina). El tocoferol cuando actúa como AH puede dar lugar a radica-
les libres estables, mientras que si se usa tirosina los radicales libres que se originan como aductos pueden conden-
sarse para formar dímeros. Los enlaces cruzados ditirosina en la masa de pan (en el gluten) pueden aportar
viscoelasticidad y buenas cualidades para la panificación.
En presencia de un exceso de H2O2, la peroxidasa mantendrá un proceso catalítico (Fig. 6.45), reaccionando
con un segundo mol de H2O2 que transforma en H2O, formando el compuesto III (H+-FeII-O2). Las peroxidasas
muestran la máxima actividad sobre los donantes AH a concentraciones de H2O2 de 3-10 mM, y el uso de estos
niveles resulta importante en los ensayos de actividad peroxidasa que se realizan como pruebas indicadoras de
procesos de escaldado. Los ensayos utilizando un exceso de H2O2 darán lugar al compuesto III que no resulta
reciclado de nuevo hasta el estado de reposo de una manera eficiente, lo que se traduce en una subestimación de la
actividad peroxidasa.
Existen otras reacciones únicas catalizadas por la peroxidasa. Una involucra al NADH, el cual en presencia de
cantidades traza de H2O2 puede reaccionar en el ciclo peroxidásico actuando como AH para dar lugar a 2 molécu-
las de NAD•. El NAD• puede tener varios destinos y permitir que tengan lugar otras reacciones:
NAD• + O2 → NAD + –O2• (6.52)
–
O2• + 2H+ → H2O2 (6.53)
NAD• + peroxidasa férrica → NAD + peroxidasa ferrosa (6.54)
Peroxidasa ferrosa + O2 → Oxiperoxidasa (compuesto III) (6.55)
Oxiperoxidasa → peroxidasa férrica + –O2• (que después puede seguir la Ecuación 6.53) (6.56)
Así pues, utilizando NADH, la peroxidasa tiene la capacidad de generar su propio cosustrato (H2O2) cuando
existen sólo cantidades traza, utilizando tanto el ciclo peroxidásico como el oxidásico.
Otros tipos de actividades asociadas a la peroxidasa, la oxidación y la hidroxilación, son efectos indirectos de la
reactividad de la peroxidasa. La secuencia que utiliza NADH como AH en los ciclos peroxidásico y oxidásico
ilustra cómo la acción de la peroxidasa puede dar lugar a oxígeno reactivo y radicales oxi. Tales especies de
oxígeno pueden causar reacciones de oxidación. Las reacciones de oxidación pueden tener lugar si un cosustrato
da lugar a especies A• que pueden abstraer átomos de H de otros componentes. Una secuencia tal puede iniciar
otras reacciones de radicales libres que podrían posiblemente dar lugar a derivados poliméricos formados a partir
de componentes fenólicos, un proceso que recuerda al pardeamiento mediado por la fenoloxidasa. Así pues, la
reacción de la peroxidasa con un sustrato fenólico puede causar la oxidación indirecta (química) de otro, compli-
cando potencialmente una evaluación de la acción directa de la peroxidasa sobre componentes en un sistema mixto
como los alimentos. Los sustratos fenólicos de la peroxidasa que dan lugar a A• reactivo con el oxígeno también
formarán –O2• y H2O2 que pueden mediar más reacciones de oxidación. Así pues, el alcance del papel de las
peroxidasas en el pardeamiento y en otros procesos de modificación del color en los alimentos todavía es un
enigma. Algunas de las más recientes asignaciones de protagonismo a las peroxidasas en procesos de pardeamiento
están basadas en las asociaciones correlativas entre la actividad peroxidasa y los niveles o incidencia de pardeamiento;
tales observaciones son insuficientes para establecer una relación causa-efecto sólida.
Las peroxidasas de las plantas a menudo muestran valores óptimos de pH de 4,0-6,0, si bien el rango de pH para
formar compuesto I es muy amplio y se caracteriza por valores de pKa extremos de ~2,5 y 10,9. La transición ácida
viene determinada por el residuo HIS42, cuyo valor de pKa puede variar entre 2,5 y 4,1, dependiendo de la compo-
sición del medio. Se trata de un pKa inusualmente bajo para la HIS, que debe actuar primero como la base conjuga-
da, y viene determinado por las redes múltiples de enlaces de H que sirven para facilitar la disociación de H+. Los
valores de pH óptimos globales para las reacciones peroxidasa están relacionados con los pasos que utilizan AH
para regenerar la peroxidasa férrica en el ciclo peroxidásico. Las especies de AH son donantes de H (no solamente
donantes de e–) y por lo tanto tienen que estar protonadas (si tienen un H+ disociable) para servir como sustrato, y
los valores de pH óptimos a menudo son dependientes del sustrato.
Las peroxidasas están entre las enzimas más ubicuas y más termoestables de todas las presentes en los tejidos de
las plantas; estas características facilitan su uso como indicadores de tratamientos de escaldado. Lo razonable es
pensar que si una actividad peroxidasa endógena ha resultado destruida, también habrán sido destruidas todas las
demás enzimas que deterioran la calidad. La limitación de esta estrategia radica en el hecho de que a menudo se
aplica un tratamiento térmico excesivo que puede comprometer la calidad en otros aspectos varios (por ej., textura,
valor nutricional, lixiviación de componentes). Sin embargo, hasta que no se identifiquen otras enzimas específicas
que sean las más termoestables entre las que tienen un efecto directo sobre la calidad de los vegetales escaldados (y
congelados) y sean a la vez de fácil determinación, la peroxidasa seguirá siendo el indicador de elección del
proceso de escaldado. Los efectos de la temperatura sobre las peroxidasas varían con el tejido que las alberga.
Generalmente, la temperatura óptima para el desarrollo de su actividad es moderada, oscilando entre 40°C y 55°C.
La estabilidad térmica es bastante alta, y, dependiendo del origen, la inactivación completa puede requerir una
exposición de varios minutos a 80-100°C para un tamaño apropiado de las porciones intactas de los tejidos vegeta-
les. El grupo hemo prostético, la glucosilación, los cuatro enlaces disulfuro, y la presencia de dos moléculas de
Ca2+, con su posible participación en el establecimiento de puentes salinos, son los factores responsables de la
estabilidad de las peroxidasas frente al calor. La estabilidad frente al calor generalmente disminuye a medida que lo
hace el pH en el rango 3-7 y a medida que aumenta la fuerza iónica. La regeneración de la actividad peroxidasa
tienen lugar en el rango de pH de 5,5-8,0, tras un tratamiento térmico de corta duración, tal como el escaldado. La
regeneración se cree que implica la reconstitución del grupo hemo en el sitio activo, que se pierde en el curso de la
inactivación inicial. Un tratamiento térmico más intenso, como la esterilización, disminuye la propensión a regene-
rarse la enzima activa debido a que durante el calentamiento se producen cambios conformacionales más extensos
y reacciones covalentes. Sin embargo, la liberación del grupo hemo libre en el medio puede provocar la catálisis de
reacciones oxidativas y tales procesos han sido identificados como causantes de flavores anómalos en los vegetales
enlatados. Otras reacciones catalizadas por la peroxidasa que inciden en la calidad de los alimentos incluyen la
formación de radicales fenoxi que oxidan los lípidos de una manera indirecta, y la oxidación directa de la capsaicina,
el componente pungente de los pimientos.
Aunque el papel de la peroxidasa en el ampardeamiento enzimático permanece abierto a preguntas, se ha
mostrado de un modo concluyente que la peroxidasa puede destruir algunos pigmentos, particularmente las betalaínas
en las raíces de la remolacha de mesa. La peroxidasa también ha sido implicada en la decoloración de la clorofila
bajo condiciones específicas.
6.5.2.3 Otras oxidorreductasas [38]

La lactoperoxidasa es la peroxidasa de la leche y pertenece a la superfamilia de las peroxidasas animales. Es
una glucoproteína monomérica, con 78 kDa de masa, que contiene Ca2+ y una protoporfirina modificada IX que
está unida de modo covalente. La lactoperoxidasa tiene propiedades similares a las de la peroxidasa C del rábano
picante en cuanto a reactividad con el H2O2 y a que transita de una forma cíclica por las distintas formas de
Enzimas 449
peroxidasa. La lactoperoxidasa difiere de la peroxidasa C en que se muestra más reactiva frente a los haluros
(especialmente I–) y las especies químicas relacionadas. Resulta de particular interés su capacidad de reaccionar
con el tiocianato (SCN–), que está presente normalmente en la leche, como AH en el ciclo peroxidásico donde:
2SCN– + Enz-(FeV=O) → 2SCN• + Enz-(FeIII) → SCN– + HOSCN + H+ (6.57)
El ácido hipotiocianoso y la base conjugada (pKa 5,3) hipotiocianito (OSCN–) son agentes antimicrobianos. Así
pues, la adición de pequeñas cantidades de H2O2 (y también de SCN–, si no está en una cantidad abundante) a la
leche permite realizar un proceso de «pasteurización en frío» que reduce la carga microbiana de la leche cruda; esta
es una opción importante en climas subtropicales donde puede no disponerse de un acceso a la refrigeración. El
OSCN– generado por la enzima es más eficaz que este mismo compuesto químico añadido con un origen exógeno,
tal vez debido a que la lactoperoxidasa se adsorbe a las superficies y partículas y puede permitir la generación de
OSCN– en la proximidad de los microorganismos.
La catalasa (EC 1.11.1.6) es una hemoenzima tetramérica que está extendida en la naturaleza y está relacionada
con las peroxidasas. Su principal papel es el de detoxificar en las células el exceso de H2O2, puesto que la enzima
degrada el H2O2 generando H2O más ½O2. La catalasa es bastante termoestable y ha sido considerada una actividad
enzimática indicadora del proceso de escaldado. Es fácil de determinar tomando un pequeño disco de papel de
filtro, sumergiéndolo en un homogeneizado del vegetal escaldado, y después colocando el disco dentro de un tubo
de ensayo con H2O2 diluida. Un resultado positivo (presencia de catalasa residual) viene indicado por la presencia
del disco flotando en la superficie, impulsado por pequeñas burbujitas adherentes de O2 que se forman por acción
de la enzima activa que estaba absorbida en el disco.
6.5.3 ENZIMAS RELACIONADAS CON LA BIOGÉNESIS DEL FLAVOR
6.5.3.1 Lipooxigenasa [16,25,154]

El papel de las lipooxigenasas en los alimentos y en la calidad alimentaria continúa todavía en fase de evalua-
ción, a pesar de que estas enzimas llevan caracterizándose durante 80 años de estudios previos. Algunas de las
primeras caracterizaciones se referían a actividades «lipooxigenasa» y «caroteno oxidasa». Las lipooxigenasas (y
las oxigenasas relacionadas) están muy extendidas y se encuentran en plantas, animales, y hongos, aunque inicial-
mente se creía que existían exclusivamente en el reino vegetal. El mecanismo de la lipooxigenasa y la base de la
selectividad de reacción ya fueron descritos con anterioridad en este capítulo. Esta sección se va a centrar en la
multiplicidad de reacciones y rutas auxiliares de transformación de los ácidos grasos y en los papeles asociados de
los procesos mediados por lipooxigenasas en la caliad de los alimentos. La acción de las lipooxigenasas puede ser
deseable o indeseable, dependiendo del alimento específico y del contexto en el que actúe; muchos otros ejemplos,
aparte de los que se exponen en este capítulo, aparecen recogidos en diferentes revisiones [25,154].
La lipooxigenasa es bien conocida por causar defectos en la calidad de los vegetales procesados que no han sido
sometidos a un tratamiento térmico suficiente para destruir la enzima. Las legumbres (judías verdes, habas de soja,
guisantes) son particularmente susceptibles al desarrollo de rancidez oxidativa debida a niveles elevados de
lipooxigenasa (Tabla 6.12). La diversidad de las reacciones mediadas por lipooxigenasas puede explicarse porque
el ciclo de la reacción se extiende más allá de lo necesario para ilustrar el mecanismo (recordar la Fig. 6.8). El ciclo
anaeróbico logra que la enzima sea reactiva en ausencia de O2 o en medios empobrecidos en O2; esta porción
incluye la activación, por peróxido, del estado de reposo de la enzima (FeII) hasta el estado activo (FeIII), que a
veces se denomina actividad «lipoperoxidasa» (Fig. 6.46). Como resultado de esta activación, se libera una especie
radical oxi (XO•) que puede propagar reacciones de radicales libres; este ciclo puede continuar en ausencia de O2
y a través de él pueden formarse y liberarse radicales de ácido graso (L•). En los casos en los que XO• proviene de
un ácido graso insaturado, este puede experimentar una reorganización intramolecular y formar epóxidos reactivos.
Así pues, muchas lipooxigenasas causan reacciones secundarias de cooxidación por radicales libres cuando está
operativo el ciclo anaeróbico. Cuando abunda el O2, el mecanismo normal de reacción ocurre como se explicó
TABLA 6.12
450
Propiedades de lipooxigenasas e hidroperóxido liasas concretas.
Origen de lipooxigenasa Actividad relativa pH Especificidad 9:13, S/R Especificidad de la Compuestos dominantes
(isoforma) óptimo de la lipooxigenasa hidroperóxido liasa en los tejidos que la albergan
Semilla de soja (1) 4.200 9,0 4:96 13S (pH 9) S-13-LOOH (niveles bajos) n-hexanal, hexanales, flavores
23:77 13S (pH 6,6) anómalos
(2) 6,5 50:50 9R ≥ 9S
(3) 7,0 65:35 R ~ S
Germen de maíz – 6,5 93:7 9S (Trazas/niveles bajos) n-hexanal, flavores anómalos
(cetoles en el grano de maíz)
Semilla de guisante 1.800 6,6 67:33 R ~ S (pH 6,6) (Trazas/niveles bajos) Flavores anómalos
Química de los alimentos
(3 isoformas) 59:41 13S, 9R (pH 9)

Tubérculo de la patata 4.600 5,5 95:5 9S 9/13-LOOH trans-2-cis-6-nonadienal
Fruto del tomate 360 5,5 96:4 9S 13-LOOH (CYP74B) trans-2-hexenal, cis-3-hexen-1-ol,
(3 isoformas) n-hexanal
Fruto del pepino 30-120 5,5 75:25 9,13-LOOH trans-2-cis-6-nonadienal
Fruto del pimiento verde 300 5,5-6,0 Falta una evaluación 13-LOOH (CYP74B) cis-3-hexenal, trans-2-hexenal,
definitiva n-hexanal
Fruto de la pera Trazas 6,0 95:5 9-LOOH trans-2-cis-6-nonadienal
Fruto de la manzana <120 6,0-7,0 15:85 13-LOOH n-hexenal, trans-2-hexenal
Champiñón – 8,0 10:90 13S Véase el texto 1-octen-3-ol, 1-octen-3-nona
Hojas del té – 6,5 16:84 13S S-13-LOOH trans-2-hexenal, cis-3-hexenal,
n-hexanal
Fuentes: Galliard, T. and Chan, H.W.-S. Lipooxigenases, in The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise, Volume 4, Lipids: Structure and Function, P.K. Stumpf
(Ed.), Academic Press, New York, pp. 131-161, 1980; Grosch, W., Lipid degradation products and flavour, in Food Flavours. Part. A. Introduction, Morton, I.D. and A.J.
MacLeod (Eds.), Elsevier Scientific Publishing, New York, pp. 325-398, 1982; Kuribayashi, T. et al., J. Agric. Food Chem., 50, 1247, 2002; Matsui, K. et al. J. Agric. Food
Chem., 49, 5418, 2001; Vliegenthart, J.F.G. and Veldink, G.A., Lipoxygenases, in Free Radicals in Biology, W.A. Pryor (Ed.), Vol. V., Academic Press, New York, pp. 29-64,
1982.
Enzimas 451
antes (Fig. 6.8). Algunas lipooxigenasas tienen afinidades menores por los ácidos grasos y por los intermediarios
de la reacción, y el radical hidroperoxil (LOO•) puede disociarse de modo prematuro a través del «circuito de baja
afinidad» antes de que se complete el ciclo catalítico normal (Fig. 6.46). Esto exige que la enzima vuelva a ser
reactivada por peróxido en el ciclo anaeróbico. La afinidad por el sustrato de las isoformas 3 de la lipooxigenasa de
las semillas de guisante y de soja es 20 veces menor que la de las otras isoformas de las semillas respectivas [7,59].
Así pues, las isoformas 3 del guisante y la soja son las principales responsables de la producción de LOO•, causan-
do más autooxidación de ácidos grasos y reacciones de cooxidación mediante la evolución de especies reactivas de
oxígeno, incluyendo oxígeno singlete (1O2) durante el ciclo aeróbico (la mayoría de las isoformas provocan
cooxidación únicamente en el ciclo anaeróbico). Los ciclos aeróbico y anaeróbico constituyen rutas alternativas
del ciclo de la enzima y ambas rutas pueden operar de modo simultáneo. El nivel de O2 necesario no siempre es el
único determinante de la ruta preferencial del ciclo enzimático. Las características cinéticas de cada paso, los
niveles relativos de enzimas, sustratos e intermediarios y el microambiente que rodea a la enzima, todos estos
factores influyen sobre el grado de funcionamiento de cada ruta.
Las lipooxigenasas de los diferentes orígenes alimentarios difieren en el perfil de isoformas, en el pH óptimo, y en
la regio y estereoselectividad de la reacción (Tabla 6.12). Las lipooxigenasas son enzimas «solubles», pero las dife-
rentes isoformas se encuentran en compartimentos celulares distintos, lo que refleja su finalidad y papel singular en la
transformación de los ácidos grasos en el tejido que las alberga [45]. Las lipooxigenasas de la semilla de soja son las
más estudiadas e históricamente han constituido la base para la clasificación [7]. La isoforma 1 de la lipooxigenasa es
la más abundante en la semilla de soja y resulta única por su pH óptimo alcalino. Esta característica y la
estereoespecificidad de producto 13S hacen que se clasifique como una lipooxigenasa «tipo I». Las isoformas 2 y 3 de
la soja tienen valores de pH óptimos más próximos a la neutralidad y muestran una selectividad de producto menor;
estas características generales suponen las bases para su clasificación histórica dentro del «tipo II». Actualmente se ha
constatado que la mayoría de las lipooxigenasas tienen valores de pH óptimos próximos a la neutralidad y difieren
ampliamente en el grado de selectividad del producto, lo que hace que la clasificación original en «tipos» tenga una
utilidad limitada. Incluso la clasificación en base a la regioselectividad de la oxigenación del ácido araquidónico (por
ej., 5-LOX) descrita con anterioridad está cediendo frente a una clasificación realizada en base a similitudes estructu-
rales. Un estudio sobre la selectividad de las lipooxigenasas de las plantas (Tabla 6.12) revela que muchas son
regioselectivas para la oxigenación del carbono C9 del ácido linoleico (o linolénico) para dar lugar al hidroperóxido
Figura 6.46 Ruta de la reacción y ciclo de la lipooxigenasa. (Adaptado y redibujado a partir de Hughes, R.K. et al., Biochem.
J., 333, 33, 1998; Whitaker, J.R., Voragen, A.G.J., and D.W.S. Wong (Eds.), Handbook of Food Enzymology, Marcel Dekker,
New York, 2003; Wu, Z. et al., J. Agric. Food Chem., 47, 4899, 1999).
(LOOH) de configuración S. Algunas lipooxigenasas (especialmente las isoformas 2 y 3 de la soja y las isoformas de
la semilla de guisante) carecen de regio y estereoespecificidad. Esta propiedad está asociada con la reducida afinidad
por los sustratos ácido graso durante la secuencia de la reacción [7,56]. Si L• se libera de manera prematura, la
combinación con O2 molecular se realizará al azar, dando lugar a mezclas de rac-LOOH, mientras que si la oxigena-
ción tiene lugar cuando el sustrato está en el sitio activo, la enzima mostrará preferencia regional y estérica (Fig. 6.46).
Las isoformas de las lipooxigenasas que provocan reacciones de cooxidación dan lugar a productos de oxida-
ción múltiples, incluidos aldehídos y cetonas (carbonilos) producidos a través de un mecanismo de radicales libres.
La cooxidación también decolora los carotenoides, y, aunque este efecto puede destruir pronutrientes, ofrece un
resultado útil y deseable en el blanqueamiento de la masa del pan y de los productos de panadería relacionados (la
generación de oxirradicales también mejora las propiedades tensiles y viscoelásticas de la masa). Puesto que la
lipooxigenasa de trigo tiene una escasa actividad blanqueadora, pueden añadirse tanto harina de soja como de
guisante (así como harinas de patata y garbanzo) a la masa del pan para provocar efectos de eliminación de los
carotenos y mejorantes de la masa. Las lipooxigenasas de los frutos de tomate y pimiento verde también son
capaces de cooxidar los carotenoides. Muchos otros alimentos de origen vegetal tienen isoformas múltiples de
lipooxigenasas, incluyendo a la mayoría de los cereales y granos, así como a las judías verdes.
El defecto de rancidez oxidativa provocado por la lipooxigenasa puede atribuirse a dos fenónemos (explicados
en detalle en al Capítulo 4). Uno es la oxidación de los ácidos linoleico y linolénico hasta LOOH y la consiguiente
descomposición química en varios aldehídos y cetonas aromáticos. El segundo es la producción directa por la
enzima de radicales ácido graso, que son liberados hacia la matriz alimentaria y con posterioridad inician y propa-
gan reacciones de cooxidación y de autooxidación por radicales libres. El n-hexanal confiere un flavor a alubias y
se usa como índice general del grado de oxidación de los ácidos grasos. Entre los orígenes de lipooxigenasa
enumerados (Tabla 6.12), la soja, maíz y guisantes son los alimentos más propensos a desarrollar rancidez derivada
de la acción de la lipooxigenasa. Esto exige que el maíz y los guisantes sean escaldados al menos hasta el punto de
inactivación de la lipooxigenasa antes de su congelación y almacenamiento; en la soja, la actividad de la lipooxigenasa
debe destruirse o atenuarse antes de la congelación (mediante escaldado) de la molienda para la obtención de
harina (por deshidratación) o del fraccionamiento para obtener aceite y aislados de proteínas.
Las diferencias bastante sutiles entre las isoformas de las lipooxigenasas se han utilizado y tenido en cuenta en los
esfuerzos realizados para controlar la calidad de los alimentos. Se han estudiado variedades isogénicas de semillas de
soja, carentes de ciertas isoformas de lipooxigenasas, en relación con su propensión a causar flavores rancios en las
semillas, aceite de soja y alimentos formulados (pan). En las semillas de soja homogeneizadas, la lipooxigenasa 2
parece ser la responsable de la producción de los mayores niveles de n-hexanal [58]. La presencia de cualquieras de
las formas 1 ó 3, o de ambas, reduce la capacidad que tiene la isoforma 2 de producir n-hexanal, lo que sugiere que los
destinos de los hidroperóxidos de ácidos grasos dependen de la isoforma enzimática que los produjo. En estudios
efectuados utilizando en la fabricación de masa de pan harina de soja procedente de variedades carentes de isoformas
específicas, la isoforma 1 se asoció con los mayores incrementos del volumen del pan y la isoforma 2 se asoció con los
mayores incrementos de la fuerza y la viscoelasticidad de la masa [32]. La isoforma 2 también se asoció con los
mayores niveles de compuestos volátiles indeseables, y esta es la razón por la que las harinas de legumbres se añaden
en niveles <1% en las masas de pan. Estos ejemplos muestran cómo el conocimiento de las diferencias, incluso de las
más útiles, de la acción enzimática puede alumbrar nuevas estrategias para producir alimentos y controlar su calidad.
Las lipooxigenasas y las oxigenasas relacionadas (ciclooxigenasas) presentes en los tejidos animales y en el
músculo son las más relevantes en los alimentos [16,25]. Las lipooxigenasas animales son esencialmente idénticas
a las de las plantas y hongos en cuanto a su estructura y mecanismo de acción. Una gran diferencia reside en que los
sustratos naturales de las lipooxigenasas animales son el ácido araquidónico, y ácidos grasos de cadena más larga
y más insaturados, aunque también muestran actividad sobre los ácidos linoleico y linolénico. En el pescado fres-
co, se sabe que la lipooxigenasa endógena forma flavores deseables (Capítulo 11), pero todavía se desconocen las
relaciones entre las lipooxigenasas animales y la calidad de los alimentos.
La medida más eficaz para prevenir las consecuencias negativas de la acción de la lipooxigenasa es la aplica-
ción de un tratamiento térmico para inactivar la enzima, siendo el ajuste del valor del pH una opción secundaria. Se
han identificado muchos compuestos como inhibidores de la enzima, y los que presentan las propiedades típicas de
los antioxidantes fenólicos reprimen las reacciones secundarias de oxidación con poco efecto directo sobre la
Enzimas 453
enzima. Sólo se han identificado de manera consistente unos pocos inhibidores que inhiben de un modo directo a
la lipooxigenasa (Fig. 6.47); estas sustancias son el ácido nordihidroguayarético, los catecoles y la esculetina
(todos a una concentración de ~10 μM), que se coordinan con el Fe del sitio activo y/o lo reducen hasta el estado
FeII inactivo. También el resveratrol (a ~10 μM) y el SnCl2 (a 5 mM) son inhibidores competitivos de la enzima.
6.5.3.2 Hidroperóxido liasa y transformaciones enzimáticas relacionadas [13,148]

La descomposición de los LOOH de los ácidos grasos (derivados de la acción de la lipooxigenasa) a través de
reacciones químicas inespecíficas da lugar a carbonilos que provocan rancidez (Capítulo 4). Por el contrario, en
presencia de enzimas que dirigen específicamente la transformación de los LOOH en otros derivados surgen
aromas agradables. En muchos tejidos de frutas y vegetativos, esta ruta alternativa está posibilitada por la acción
de hidroperóxido liasas y conduce a la acumulación de un conjunto limitado de productos de degradación con
6, 9 y 12 átomos de carbono y con composición definida (Fig. 6.48, Tabla 6.12). La secuencia general de los
Figura 6.47 Inhibidores de la lipooxigenasa.
Liasa?
Figura 6.48 Transformación de los ácidos grasos por acción coordinada de lipooxigenasa (LOX), hidroperóxido liasa (HPL) y
enzimas auxiliares, para dar lugar a notas y flavores a «vegetales verdes». (Adaptado a partir de Blée, E., Prog. Lipid Res., 37, 33,
1998; Fuessner, I. and Wasternack, C., Annu. Rev. Plant Biol., 53, 275, 2002; Vliegenthart, J.F.G. and Veldink, G.A., Lipoxygenases,
in Free Radicals in Biology, W.A. Pryor (Ed.), Vol. V, Academic Press, New York, 1982, pp. 29-64).
acontecimientos es: La liberación del ácido graso a partir del glicerolípido intacto por acción de la acil hidrolasa
de lípidos, la dioxigenación del ácido graso hasta 9/13-hidroperóxidos por acción de la lipooxigenasa, la rotura
de los 9/13-hidroperóxidos por la hidroperóxido liasa, y después una posible isomerización y conversión final de
los aldehídos en alcoholes por medio de una actividad alcohol deshidrogenasa. La existencia de esta ruta se dedujo
por primera vez estudiando el origen del flavor del plátano, y la enzimología del proceso se estableció definitiva-
mente en el pepino y en el fruto del tomate [47,52,148].
La especificidad de especie de la ruta de transformación de los ácidos grasos en compuestos responsables de
flavores deseables deriva de los efectos combinados y de la especificidad tanto de la lipooxigenasa como de la
hidroperóxido liasa, y de la abundancia relativa de las enzimas auxiliares. Por ejemplo, para el fruto del tomate,
aunque el 9-LOOH de ácido graso es el producto dominante de la acción de la lipooxigenasa (Tabla 6.12), la
especificidad de la hidroperóxido liasa (9:13-LOOH a velocidades relativas de 1:62) determina que los fragmentos
de C6 y C12 sean los más producidos en el tejido disgregado. Por el contrario, la hidroperóxido liasa del fruto del
pepino es bastante inespecífica (9:13-LOOH a velocidades relativas de 2:1), y la dominancia de los fragmentos C9
generados a partir de la oxidación dirigida y de la fragmentación de los ácidos grasos viene determinada amplia-
mente por la selectividad de la lipooxigenasa. Los ejemplos enumerados en la Tabla 6.12 pueden clasificarse en
tres grupos: Los que forman principalmente flavores del tipo del pepino (especies de nonadienal), los que forman
flavores como los de las hojas de té, o los que generan una riqueza en flavores florales/afrutados que vienen
determinados por hexenal/hexanales/hexenoles. La razón por la que los miembros encuadrados dentro de un mis-
mo grupo (acumuladores de compuestos C9 o C6) no tienen el mismo flavor global es la dependencia de otros
factores involucrados en la biogénesis del flavor. Estos factores determinan la existencia de diferencias en los
niveles de las enzimas que integran la ruta metabólica, así como en las relaciones entre las cantidades de ácidos
linoleico y linolénico (que después actuarán como sustratos) liberadas por la acción de la acil hidrolasa de los
lípidos. En la Figura 6.48 se muestra la ruta para el ácido linolénico, pero pueden suceder las mismas reacciones
para el ácido linoleico para dar lugar a productos análogos pero con flavores de características diferentes, y las
diferencias en la selectividad de las enzimas por estos ácidos grasos determinará la composición del producto final.
Las diferencias entre los tejidos, en cuanto a las enzimas auxiliares, también dictarán la composición del producto
final. Aunque en el pepino, semilla de lino, germen de trigo, cebada y soja se han observado evidencias de la
presencia de enzimas isomerasas específicas [47,148], estos agentes de isomerización todavía son mal conocidos
[5,13]. La hidroperóxido isomerasa fue inicialmente introducida en la lista como EC 5.3.99.1 (y eliminada en
1992), pero en la actualidad se computa como una actividad global «hidroperóxido deshidratasa», y de modo
específico como una aleno-óxido sintasa (EC 4.2.1.92) y una aleno-óxido ciclasa (EC 5.3.99.6), aunque estas
actividades son más conocidas por dar lugar a jasmonatos y cetoles [5]. Así pues, la naturaleza de un «factor de
isomerización» permanece todavía sin clarificar. Poco se conoce también de la(s) alcohol-deshidrogenasa(s)
específica(s) implicada(s), aunque en muchos tejidos de las plantas están presentes al menos tres isoformas (codi-
ficadas por los genes ADH-1, 2 y 3) que podrían contribuir a esta función [13,133]. Cada tejido contiene también
otros agentes responsables de la formación del flavor, integrados por otras rutas metabólicas o enzimáticas que
contribuyen o incluso resultan dominantes en la determinación del flavor global característico de los alimentos
citados en la Tabla 6.12.
Las hidroperóxido liasas (clasificadas como citocromos, CYP74B y CYP74C) es probable que se trate de
tetrámeros formados por unidades monoméricas de 55-60 kDa y están en los tejidos unidas a las membranas
(plastídicas) [45]. Difieren de otros citocromos en que no necesitan O2 y NAD(P)H; en su lugar, utilizan los LOOH
de los ácidos a la vez como sustratos y como donadores de oxígeno para formar enlaces C-O nuevos. No es
sorprendente que muchos de los inhibidores de la lipooxigenasa (Fig. 6.47) lo sean también de la hidroperóxido
liasa, puesto que ambas enzimas se unen a las cadenas de los ácidos grasos. Además de con los cuatro ligandos del
anillo tetrapirrólico, el Fe se encuentra coordinado con una CYS [45]. Las enzimas de los frutos del pimiento,
tomate y guayaba tienen una especificidad muy elevada por los 13-LOOH y se ubican en la subfamilia CYP74B,
mientras que las del pepino y melón actúan frente a los 9/13-LOOH y se colocan en la subfamilia CYP74C. Otras
hidroperóxido liasas están todavía por caracterizar en profundidad y por clasificar. En los champiñones (y otros
hongos) se ha observado un conjunto único de productos fruto de la acción de este sistema enzimático, que está
integrado por fragmentos C10 y C8 formados a partir de los ácidos linoleico y linolénico dioxigenados (Tabla 6.12,
Enzimas 455
Fig. 6.48). Inicialmente, se propuso la presencia de una 10-LOX, pero se ha determinado que la LOX del champi-
ñón dioxigena el sitio C-13 [68]. Sin embargo, en el champiñón se forma el isómero 10-LOOH del linoleato, y las
preparaciones proteicas del champiñón pueden romper el derivado 10-LOOH hasta C10 oxo-ácido y 1-octen-3-ol.
Ahora parece que existen oxigenasas que producen factores psi (factores de crecimiento), que tienen un grupo
prostético hemo y que generan 8 y 10-peróxidos a partir del ácido linoleico [18].
Recientemente, se ha propuesto el mecanismo de acción de la hidroperóxido liasa (y de otros miembros de la
familia CYP74) a partir de estudios realizados en la enzima del fruto de la guayaba. El mecanismo homolítico
implica la presencia de un radical epoxialílico que da lugar a un hemiacetal que se escinde para dar productos de
fragmentación (Fig. 6.49). Este mecanismo probablemente opere en todas las hidroperóxido liasas, y es concordan-
te con el establecido en el citocromo P450s.
Los esfuerzos encaminados a aplicar los conocimientos obtenidos de la ruta lipooxigenasa-hidroperóxido liasa
a las frutas modificadas genéticamente han dado resultados desiguales. La introducción de una Δ9 desaturasa (para
aumentar los ácidos grasos que están disponibles como sustratos) y de una alcohol deshidrogenasa en el fruto del
tomate incrementaron el flavor en ambos casos, mientras que la supresión de la lipooxigenasa y la sobreexpresión
de una 9-hidroperóxido liasa no tuvo efectos [79]. Las opciones comerciales están empleando en la actualidad una
lipooxigenasa 13-específica muy activa y una 13-LOOH hidroperóxido liasa en combinación con una fuente barata
de ácido linolénico para producir las «notas verdes» del flavor conferidas por los aldehídos y alcoholes de 6C; el
mercado global de este proceso se estima que es de más de 40 millones de dólares USA al año.
6.5.3.3 Biogénesis de otros flavores derivados de los lípidos [114]

La enzima alcohol aciltransferasa (EC 2.3.1.84) es responsable de la emanación de ésteres aromáticos en mu-
chas frutas climatéricas, especialmente durante la fase de maduración después de la cual aumentan sus niveles en
los tejidos [114]. Esta enzima existe en frutas tales como manzanas, fresas, plátanos, melones y aceitunas, entre
otras, y también en levaduras y hongos. La reacción que cataliza es la siguiente:
→ Acil-éster + Coenzima A-SH

S-acil-Coenzima A + Alcohol ← (6.58)
El perfil típico de los ésteres formados por esta enzima durante la maduración de las frutas incluye ésteres acetato
y butanoato de grupos metil y etil-ramificados, feniletil o n-alcohol, normalmente con 2-8 átomos de carbono.
Otros flavores derivados de los lípidos en los alimentos pueden proceder de otras rutas. Las lipasas se han
considerado mediadoras de la formación de ésteres volátiles, a través de reacciones de hidrólisis reversa. No existe
evidencia de la existencia de esta reacción en los tejidos de los frutos, pero ocurre hasta cierto punto en las fermen-
taciones conducidas por levaduras, y la producción de niveles bajos de flavores afrutados puede estar mediada por
Figura 6.49 Mecanismo de reacción de la hidroperóxido liasa. (Adaptado y redibujado a partir de Gretchkin, A.N. and Hamberg,
M., Biochim. Biophys. Acta, 1636, 47, 2004).
organismos fermentativos y contribuir al flavor global de alimentos fermentados sometidos a una maduración
prolongada, como es el caso de algunos quesos. La biosíntesis de los terpenoides en plantas usadas normalmente
como hierbas y especias tiene lugar a través de una compleja ruta biosintética, que comprende múltiples pasos, a
partir de unidades de isopreno [114]. En la leche, existe una lipasa de las lipoproteínas (LPL, estimulada por las
lipoproteínas) a una concentración de 1-2 mg/L [154]; esta enzima puede provocar «rancidez espontánea» si la
leche se manipula de un modo incorrecto antes de su pasteurización.
6.5.3.4 Origen y control de los flavores pungentes y de otros efectos bioactivos

6.5.3.4.1 Transformación de los glucosinolatos por la mirosinasa [4,64,83]
Las plantas de la familia Brassicaceae, fundamentalmente el repollo, brócoli, coliflor, nabo, berza, coles de Bruse-
las, rábano, mostaza y wasabi son conocidas por su pungencia. Tras la disgregación de los tejidos, se establecen
condiciones favorables para la reacción entre la enzima mirosinasa (EC 3.2.1.147 [con anterioridad 3.2.3.1], tioglucósido
glucohidrolasa) y un grupo diverso de sustratos glucosinolatos carentes de olor, que hace estallar la denominada
«bomba de aceite de mostaza». La opinión imperante es que la mirosinasa se localiza dentro de vacuolas en células
especializadas (idioblastos) denominadas «células de mirosina», y que los glucosinolatos (concentraciones tan altas
como 100 mM) y el ascorbato están contenidos en vacuolas de células de otro tipo, incluidas las células-S (ricas en
azufre), adyacentes a las células de mirosina [4,64]. Cuando el tejido se disgrega, el ascorbato se diluye hasta una
concentración de 1-2 mM que activa la enzima a medida que se mezcla con los sustratos glucosinolato. Las mirosinasas
están glucosiladas en un 10-20% y existen como isoformas múltiples con monómeros de 65-70 kDa y con estructuras
que se hallan estabilizadas por 3 puentes disulfuro y por Zn2+; pueden encontrarse como homooligómeros o formando
complejos con otras proteínas. Las mirosinasas muestran una actividad óptima en un rango de pH de 4-8 y de tempe-
ratura de 40-75°C, dependiendo de su origen. Existen proteínas en células diferentes a las «células de mirosina» que
incluyen la proteína epitioespecificadora (ESP), la proteína formadora de tiocianato (TFP) y la proteína nitrilo-
especificadora (NSP), que presentan homología en sus secuencias e influyen sobre la distribución de los productos
que se van generando tras la acción hidrolítica inicial de la mirosinasa sobre los glucosinolatos [64,67]. Las proteínas
ESP y NSP necesitan Fe2+ para actuar y su acción puede ser de naturaleza catalítica [15].
La mirosinasa es una enzima conservadora de la familia 1 de las glucosil hidrolasas (Sección 6.3.2) y es singu-
lar por dos razones. Hidroliza los β-D-tioglucósidos (pero no los O-glucósidos), y tiene solamente uno de los dos
residuos catalíticos habituales ASP/GLU [20]. La enzima tiene un bolsillo de unión hidrofóbico (en la enzima de la
semilla de mostaza, PHE331, 371, 473, ILE257, TYR330) para albergar los grupos R de los glucosinolatos, que son
mayoritariamente cadenas alqu(en)ilo que pueden ser ramificadas o sustituidas con grupos S, S=O, ceto o hidroxilo
[83]. Varios residuos (GLU464, GLN39, HIS141, ASN186) se unen mediante enlaces de hidrógeno a la glucosa, mien-
tras que TRP457 proporciona la plataforma hidrofóbica para acomodar el anillo piranosa [20]. GLN409 y ARG194, 259
se coordinan con los grupos sulfato del sustrato. GLU409 constituye el carboxilato nucleófilo de la enzima que
desplaza la S-aglicona (un grupo saliente adecuado) y forma un intermediario covalente enzima-glucosa (Fig. 6.50).
El paso limitante de la velocidad es la liberación de la glucosa. En otras glucosil hidrolasas un segundo GLU/ASP
conservado tiene esta función, activando al agua como nucleófilo. En la mirosinasa falta esta función y el estable-
cimiento de enlaces de H con GLN187 puede proporcionar alguna ayuda para activar el agua y desplazar la glucosa
(y conservar la configuración β). El conocido efecto activante del ascorbato sobre la mirosinasa (que aumenta entre
unos pocos y varios cientos de veces el valor de Vmáx) se cree en la actualidad que es debido a que el ascorbato actúa
como un cofactor «externo» [21]. El ascorbato se une a la enzima una vez ha sido liberada la aglicona (comparten el
mismo sitio de unión) y el ascorbato parece actuar activando el agua nucleofílica para desplazar la glucosa. La distan-
cia entre el GLU409 y el ascorbato es de ~7,0 Å, mayor que los 4,5 Å de distancia de los grupos catalíticos ASP/GLU
de la glucosil hidrolasa conservadora típica, pero esto puede ser necesario para acomodar el residuo de ascorbato que
es muy abultado. La activación máxima por el ascorbato se produce a 0,5-1,5 mM; un exceso de ascorbato compite
con la unión del glucosinolato e impide el ciclo de la enzima.
El destino del glucosinolato hidrolizado también depende de factores composicionales y de la naturaleza de las
estructuras de los glucosinolatos, algunas de las cuales se muestran en la Figura 6.51. En las condiciones de pH
normalmente imperantes en los tejidos vegetativos, los derivados del isotiocianato se forman de modo espontáneo
Enzimas 457
(Fig. 6.50). En presencia de Fe2+ y una ESP (proteína epitioespecificadora) se pueden acumular epitionitrilos y
nitrilos (también si está presente NSP –proteína nitrilo-especificadora–) a expensas de los isotiocianatos. Los pro-
ductos de la hidrólisis de los 2-hidroxialqu(en)il glucosinolatos (por ej., la progoitrina) son inestables como los
isotiocianatos y sufren una reorganización hasta oxazolidina-2-tionas. En condiciones ácidas en presencia de Fe2+
y cisteína, se pueden acumular nitrilos; en condiciones de neutras a ligeramente alcalinas, los indol (por ej.,
glucobrasicina) y benzil glucosinolatos se descomponen para formar los alcoholes correspondientes y cianato,
mientras que los derivados alil (sinigrina) y metiltio (deshidroerucina) dan lugar a los tiocianatos. Los tiocianatos
pueden formarse también a través de la acción de la TSP [67]. Algunos de estos productos tienen efectos
antinutricionales. Los cianatos interfieren en la absorción de yodo, los 2-hidroxi-3-butenil-glucosinolatos (progoitrina)
están asociados con el hipotiroidismo, y los nitrilos puede ser tóxicos. A pesar de estos problemas, existe una
asociación clara entre el consumo de vegetales del género Brassica y la reducción del riesgo de padecer cáncer, y
la mayor parte de este efecto beneficioso se atribuye a los glucosinolatos y a sus productos de transformación.
Se cree que el sulforafano, el derivado isotiocianato formado a partir de la glucorafanina, es uno de los agentes
de la dieta quimiopreventivos contra el cáncer más poderoso, derivado del brócoli (Capítulo 12). Sin embargo, el
derivado sulforafano nitrilo se forma en el brócoli en mayor cantidad que el sulforafano, y esta forma nitrilo tiene
una potencia en la quimioprevención del cáncer varios órdenes de magnitud menor que la forma isotiocianato [80].
Se ha estudiado la aplicación de un tratamiento térmico como medio de minimizar el sulforafano nitrilo, a la vez
que se maximiza la acumulación del sulforafano, en los cogollos de brócoli (Fig. 6.51). Un tratamiento térmico
suave de 60°C durante 10-20 min conserva la actividad mirosinasa y destruye la actividad epitioespecificadora;
esta inactivación preferencial de esta última proteína causa la reversión de la proporción «forma nitrilo-forma
isotiocianato» del sulforafano desde 10:1 hasta 1:10. El beneficio consiste, así pues, en aumentar los niveles del
más potente de los agentes anticarcinogénicos presentes en el brócoli.
Figura 6.50 Mecanismo de reacción de la mirosinasa. ESP, proteína epitioespecificadora; NSP, proteína nitrilo-especificadora;
TFP, proteína formadora de tiocianato. (Adaptada de Burmeister, W.P. et al., Structure, 5, 663, 1997; Burmeister, W.P. et al., J.
Biol. Chem., 275, 39385, 2000; Kissen, R. et al., Phytochem. Rev., 8, 69, 2009; Mithen, R.F. et al., J. Sci. Food Agric., 80, 967,
2000).
Figura 6.51 Glucosinolatos representativos y control de la formación de los productos finales de la acción de la mirosinasa.
ESP, proteína epitioespecificadora; QR, quinona reductasa. (Redibujado a partir de Matusheski, N.V. et al., Phytochemistry, 65,
1273, 2004).
6.5.3.4.2 Aliinasas y enzimas relacionadas [154]

Las aliinasas (EC 4.4.1.4, aliin alquenil-sulfenato liasa, o aliin liasa) son las enzimas generadoras de flavor en
los miembros del género Allium, que incluyen a la cebolla, ajo, puerro y cebollino, y a las especies relacionadas
quimiotaxonómicamente tales como el repollo y otras plantas. Hace más de cuatro décadas se describió por prime-
ra vez una aliinasa en el hongo shiitake como responsable de la evolución de un compuesto singular responsable
del flavor, la lentionina. Sin embargo, un estudio molecular reciente indica que esta enzima presenta escasa homología
con las aliinasas prototipo y una elevada homología con las cisteín desulfurasas (EC 2.8.1.7) de los hongos; se
propuso que la enzima sea una nueva desulfurasa con especificidad amplia que incluye a los sustratos ACSO [75].
La arquitectura del sitio activo y el mecanismo de acción de la aliinasa se describieron con anterioridad en este
capítulo como ejemplo de una enzima que contiene piridoxal-fosfato, y la reacción implica la β-lisis de derivados
de aminoácidos no proteicos, los denominados ACSOs (Fig. 6.6). Los productos inmediatos de la reacción, los
ácidos sulfénicos (R-SOH), se condensan para formar tiosulfinatos. En la cebolla y en especies relacionadas (pue-
rro, chayote), la mayoría del ácido 1-propenil sulfénico se isomeriza a propanotial-S-óxido (el factor lacrimógeno,
LF) por acción de la LF sintasa [78], si bien durante décadas se creyó que este paso se trataba de una transforma-
ción química/espontánea en la naturaleza (Fig. 6.52). El mecanismo de actuación de la LF sintasa no se ha diluci-
dado, pero esta enzima presenta diversidad en su reorganización intramolecular y podría estar involucrada en
reacciones clásicas isomerasa o deshidrogenasa [55]. Esta reacción está condicionada a la rotura de los tejidos,
puesto que los sustratos ACSO están presentes en el citosol, mientras que la enzima es vacuolar. La mayoría de las
aliinasas tienen selectividades similares, con una preferencia de reacción entre las especies de ACSO en orden
descendente: Insaturados (1-propenil y 2-propenil) > propil- > metil derivados; las velocidades de reactividad
(basadas en los valores de Vmáx/KM) de ~10:2:1 [123] representan un término medio dentro del amplio rango de
valores de selectividad relativa descritos en la literatura para las aliinasas. Consecuentemente, los productos de
reacción y los flavores característicos que se generan en los tejidos de las especies de Allium vienen determinados
por los niveles relativos de los diferentes sustratos ACSO presentes (Fig. 6.52), más que por las propiedades de las
aliinasas específicas de cada especie vegetal.
Enzimas 459
Aliinasa
Figura 6.52 Ruta de las reacciones aliinasa y perfil de sustratos en varios tejidos vegetales. LF, factor lacrimógeno. (Recopila-
do de Masamura, N. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 447, 2012; Shen, C. and Parkin, K.L., J. Agric. Food Chem., 48,
6254, 2000; Whitaker, J.R., Voragen, A.G.J., and D.W.S. Wong (Eds.), Handbook of Food Enzymology, Marcel Dekker, New
York, 2003).
La enzima está glucosilada, existe en un número de isoformas limitado, y puede ser oligomérica con una masa
del monómero normalmente en el rango de 48-54 kDa. Un factor de diferenciación entre las aliinasas es su pH
óptimo, que está en el rango de pH 7-8 para las enzimas de la cebolla, puerro y brócoli, y en el rango de pH 5,5-6,5
para la del ajo y las enzimas relacionadas. Sin embargo, esta diferencia en el pH óptimo tiene una importancia
práctica limitada, dado que las aliinasas son bastante activas en un rango de pH de 4,5-8,5 [65,154]. Supone un 6%
y un 10% de la proteína tisular en la cebolla y el ajo, respectivamente; su actividad es abundante en tejidos disgre-
gados (en los que el valor de pH es de 5,2-6,0). En las células disgregadas de los tejidos de la cebolla, a temperatura
ambiente, en aproximadamente 1 min se transforman el 70-90% de los ACSO en productos organosulfurados por
acción de la aliinasa; la conversión de casi el 100% tiene lugar en las células disgregadas en una hora [70,110].
Aparte de los flavores deseables que se producen tras la rotura de los tejidos, hay otras características de las
reacciones aliinasa que afectan a la capacidad de control de la calidad de los alimentos. Las preparaciones de
tejidos de Allium picadas y almacenadas o acidificadas (encurtidas) pueden modificar su color y adoptar colores
rosado/rojo (en la cebolla) y azul-verde (en el ajo). Las especies de 1-propenil-S(O)S-R tiosulfinatos son los prin-
cipales responsables de tales cambios en el color [66]. El ajo almacenado (refrigerado) puede acumular niveles
pequeños de 1-propenil-ACSO; el alil-ACSO contribuye al cambio de color en el ajo picado.
La conservación de la actividad aliinasa es importante para permitir la potenciación de la reacción enzimática
en un momento determinado de la preparación de un tejido. Como se ha dicho antes, la congelación conserva la
actividad aliinasa, siempre que la descongelación sea suficientemente rápida para evitar una desnaturalización
excesiva [149]. Los crioprotectores, tales como el glicerol y el cofactor piridoxal-fosfato exógeno, se han añadido
de modo rutinario a las preparaciones de aliinasa para estabilizar la actividad enzimática. La liofilización permite
retener alrededor del 75% de la actividad original, mientras que la deshidratación a temperaturas bajas (55°C)
retiene el 50% de la actividad original [73]. Cualquiera de estos dos métodos resulta adecuado para preparar tejidos
de Allium a utilizar como suplementos dietéticos en los que es deseable que exista una actividad aliinasa residual
suficiente para generar tiosulfinatos in situ (en el intestino) en el organismo humano. Esto requiere de la inclusión
en cápsulas o en comprimidos recubiertos para proteger la enzima del efecto inactivante del ácido y las enzimas
gástricas. Por el contrario, las preparaciones de ajo y cebolla en polvo destinadas a su uso como especias sufren un
tratamiento térmico más severo y puede que sólo retengan ~5% de la actividad aliinasa.
En los tejidos de Allium, pueden existir algunos ACSO precursores del flavor en forma de péptidos γ-glutamil-
ACSO, y estos ACSO integrados en péptidos no son reconocidos como sustratos por la aliinasa. Una transpeptidasa
(EC 2.3.2.2) cataliza la transferencia del grupo γ-glutamil desde el ACSO hasta otro aminoácido y deja el ACSO en
estado libre, pudiendo ya entonces actuar sobre él la aliinasa y potenciar el flavor. Los bulbos de Allium que se
encuentran brotando y las semillas en germinación son particularmente ricos en actividad transpeptidasa, y se han
utilizado extractos de estos tejidos para movilizar una «segunda línea» de precursores del flavor en varias prepara-
ciones de Allium. Tales preparaciones son más útiles en forma deshidratada, de tal manera que la reconstitución
con un medio acuoso provoca la actuación de las actividades enzimáticas y proporciona un incremento del flavor
en el momento que se desee.
Las cistina liasas (EC 4.4.1.8), también conocidas como β-cistationasa, también existen en las plantas de Allium,
crucíferas y leguminosas, así como en algunas bacterias. Las cistina liasas son enzimas que contienen piridoxal y
catalizan la β-eliminación de la cistina para dar lugar a tiocisteína (Cys-SSH), y esta puede dar lugar a flavores
sulfurosos. En el brócoli existen múltiples isoformas que son solubles y tienen valores de pH óptimos de 8-9.
Dependiendo de su origen, las cistina liasas pueden reaccionar también con los ACSO, pero las aliinasas no reac-
cionan con la cistina. Una enzima similar que contiene también piridoxal, la metionina-γ-liasa (EC 4.4.1.11), da
lugar a metanotiol (CH3SH) como producto de reacción, y esta reacción ha sido implicada en el desarrollo del
flavor característico de algunos quesos, posiblemente conferido por cultivos estárter y adjuntos.
6.5.3.4.3 Otras actividades enzimáticas relacionadas con el flavor

El endulzamiento, a través del incremento del contenido en maltosa, de los productos de boniato cocidos
domésticos y procesados térmicamente (enlatados, copos, puré) es un atributo de calidad positivo conferido por
las β-amilasas endógenas [136]. Las variedades de boniato con contenidos elevados de maltosa tienen una
actividad β-amilasa mayor y con una estabilidad térmica adecuada. Durante el tratamiento térmico moderado
(calentamiento progresivo a 70-90°C durante 2 h), el grado de gelatinización del almidón mayor y más rápido que
tiene lugar en estas mismas variedades permite una acción prolongada de la β-amilasa sobre el almidón, dando
lugar a unos niveles de maltosa hasta 5 veces mayores que los observados en las variedades con cantidades de
maltosa moderadas y bajas.
6.5.4 ENZIMAS QUE AFECTAN A LA CALIDAD DE LA TEXTURA EN LOS ALIMENTOS
Los cambios de textura y reológicos en los alimentos pueden estar provocados por enzimas que actúan sobre
componentes alimentarios de alto y bajo peso molecular. Ejemplos de algunas modificaciones de textura y reológicas
se han descrito ya en el contexto del uso de enzimas exógenas para licuar/diluir el almidón, reducir la viscosidad y
la turbidez en los zumos de frutas, hidrolizar o inducir la gelificación de las proteínas, modificar la viscoelasticidad
de la masa del pan, etc. Esta sección se centrará en el control de las enzimas endógenas que pueden tener un efecto
deseable o indeseable sobre la calidad de los alimentos.
6.5.4.1 Control de las enzimas que modifican los polímeros de carbohidratos

Quizás el ejemplo más antiguo de control de la actividad enzimática sobre los carbohidratos es el de los proce-
sos de triturado «caliente» y «frío» para preparar los productos del fruto del tomate. Estos términos son en parte
erróneos; un proceso de triturado en caliente incluye un calentamiento rápido del tejido del tomate hasta >85-90°C
en un intento claro de inactivar las actividades poligalacturonasa y pectín metil esterasa endógenas. Esto mantiene
los niveles de pectina, aumenta la viscosidad y la consistencia y estabiliza la turbidez de los zumos. En cambio, un
proceso de triturado en frío utiliza temperaturas <70°C, a las que estas enzimas resultan activadas térmicamente, lo
que se traduce en una despolimerización de la pectina con la correspondiente pérdida de viscosidad, en una
desesterificación de la pectina que conduce a una pérdida de la estabilidad de la turbidez, en una reducción de la
Enzimas 461
consistencia y en la separación de la fase líquida (suero) de la sólida. El proceso de triturado en frío puede provocar
una mayor calidad del flavor, quizás por permitir una mayor generación de los flavores mediada por las enzimas
lipooxigenasa/hidroperóxido liasa, pero este fenómeno no se ha observado de una manera consistente. Ambos
procesos de triturado, caliente y frío, se usan para la obtención de zumo y otros productos de la fruta, en función de
como se vayan a usar esos productos (bien como productos finales o como ingredientes para la elaboración de
otros). Las pastas de tomate se preparan mejor mediante procesos de triturado en caliente para mantener la consis-
tencia y la viscosidad. El procesado a temperatura elevada para la inactivación de la pectinasa se usa también en
otras frutas de zumo (naranja) para mantener estable la turbidez como un atributo de calidad.
Otra estrategia para controlar las enzimas pectinolíticas para regular la textura consiste en la aplicación de un
tratamiento térmico moderado e intermedio (denominado escaldado a baja temperatura) para atenuar el ablandamien-
to provocado por el procesado térmico de las frutas y verduras enteras (o en trozos). Los tratamientos en el rango de
55-80°C están destinados a estimular la acción de las pectín metil esterasas y dar «firmeza» a los tejidos al promo-
ver la adhesión entre la pared celular y los elementos de la laminilla media [144]. La hidrólisis de los grupos metoxi
de la pectina crea grupos carboxilato que pueden formar puentes de Ca2+ entre los polímeros de pectina adyacentes
(véase el modelo «caja de huevos» en el Capítulo 3). Esto puede aumentar la firmeza de la textura y evitar la
desintegración de los tejidos de las piezas («sloughing») durante un tratamiento térmico posterior como podría ser
una esterilización.
Uno de los primeros éxitos fue el observado en las patatas [9], en las que los pretratamientos de 30-120 min a
60-70°C antes de la cocción resultaron efectivos para evitar un ablandamiento excesivo y casi eliminar la desinte-
gración. Este trabajo se inició para dar respuesta a las necesidades de conservar mediante enlatado patatas de alto
contenido en almidón. Se necesita una temperatura mínima de 55-60°C para que el tejido se vuelva «poroso» y
permita la migración de los cationes, así como activar la pectín metil esterasa, mientras que las temperaturas del
escaldado tradicional inactivarían la enzima antes de que tuviera la suficiente oportunidad para actuar. Así pues, las
rodajas de patatas cocidas directamente (1-2 horas para simular una esterilización) sufren desintegración en un
80-100%, mientras que las sometidas a un pretratamiento de 60-70°C seguido de la cocción no se desintegran. La
misma estrategia ha resultado eficaz para los boniatos, judías verdes, pepinos (para encurtido), zanahorias, y frutos
de pimiento y tomate; en algunos casos el efecto endurecedor se aumenta utilizando salmueras que contengan Ca2+.
6.5.4.2 Control de las enzimas que modifican las proteínas

La degradación proteica es un determinante principal del ablandamiento de la carne durante la maduración. Las
catepsinas que se liberan de los lisosomas y/o las calpaínas son las proteasas endógenas del músculo que parecen
tener el mayor protagonismo en el ablandamiento. Aparte de la temperatura y la duración de la maduración, y la
velocidad de descenso del pH en los primeros momentos post mortem, existen pocos modos de influir sobre la
proteolisis endógena. Uno de los procesos que ha atraído un interés prolongado es la estimulación eléctrica
post mortem de las canales, que puede producir ablandamiento reduciendo el acortamiento por el frío, rompiendo
los elementos estructurales del músculo y estimulando a las proteasas endógenas, en parte por la liberación de Ca2+
hacia el sarcoplasma [60]. El sistema calpaína muscular, formado por CYS-proteasas activadas por Ca2+, ha sido
señalado como poseedor de un papel en la hidrólisis inicial post mortem que produce ablandamiento. Las proteasas
musculares son sólo uno de los diversos factores que provocan ablandamiento de la carne (véase el Capítulo 15).
Las proteasas endógenas del músculo del pescado pueden reducir la calidad de los geles manufacturados (pro-
ductos de surimi). Las proteasas en el tejido muscular de pescado, que forma geles débiles, son sensibles a los
reactivos que reaccionan con la CYS. Se ha demostrado que una manera eficaz de controlar este problema es la
adición de inhibidores de proteasas tipo «cistatina». Tales inhibidores se encuentran en el plasma bovino, en la
clara de huevo de gallina y en la patata, y pueden añadirse a los productos de surimi para inhibir la actividad de la
proteasa endógena y ayudar a mantener la fuerza del gel.
También existen proteasas endógenas en la leche; la principal es el sistema plasmina (proveniente de la sangre).
La plasmina (EC 3.4.21.7) es una serín proteasa con una masa de 81 kDa, que reacciona de modo óptimo a pH
7,5-8,0 y 37°C [154]. Sin embargo, la enzima es estable en un rango amplio de pH de 4-9 y muestra un 20% de su
actividad máxima a 5°C. La plasmina sobrevive a la pasteurización, en parte debido a sus múltiples enlaces disulfuro,
y también conserva actividad tras una ultrapasteurización. El plasminógeno (su proenzima) es abundante en la
leche y es transformado por activadores (incluida otra serín proteasa) para dar lugar a la plasmina activa. Tanto la
plasmina como el plasminógeno y sus activadores están asociados a las micelas de caseína. Los inhibidores y los
activadores de la plasmina están es el suero y evitan su activación espontánea y la proteólisis en la leche fresca y en
la pasteurizada. Durante la elaboración de queso, la plasmina permanece en las micelas de caseína y contribuye a la
proteólisis, particularmente de las caseínas αs2 y β, que tiene lugar en el queso durante la maduración. En el queso
elaborado con leche ultrafiltrada, la plasmina puede ser menos activa debido a una mayor retención de sólidos del
suero (la fuente de los inhibidores de la plasmina) en la cuajada obtenida. Debido a la resistencia al calor de la
plasmina, esta proteasa es un contribuyente principal a la proteólisis en el queso sometido a temperaturas elevadas
(de pasta cocida), que pueden además inactivar a los inhibidores de la plasmina. También debido a su elevada
resistencia al calor, la plasmina ha sido señalada asimismo como poseedora de algún papel en los procesos de
gelificación de las leches y natas sometidas a procesos de pasteurización ultraalta.
6.5.4.3 Atenuación de los defectos de textura usando moléculas pequeñas para controlar enzimas
En los dátiles, se produce un defecto conocido como «pared de azúcar» cuando la proporción sacarosa:azúcar
reductor es suficientemente elevada (2:1) para causar la cristalización de la sacarosa por todo el fruto, lo que le
confiere una textura arenosa y dura. Comparativamente, los dátiles naturales y los deshidratados de calidad premium
tienen valores de las relaciones entre los azúcares en el rango de 1,1-1,6:1, y los dátiles propensos a experimentar
el defecto de la pared de azúcar tienden a poseer niveles de invertasa endógena bajos. Para reducir la incidencia de
este defecto, los dátiles que lo presentan se sometieron a un tratamiento de infusión a vacío con una solución de
invertasa comercial al 0,01-0,10%, utilizando como control dátiles rociados con una cantidad equivalente de agua
sola. Tras el tratamiento, que supuso un incremento de los contenidos de humedad de hasta un 20-22% (y un
incremento de la aw), los dátiles se empaquetaron y se almacenaron durante 60 días a ~27°C. Como se presumía, los
dátiles infundidos con la enzima mostraron una «inversión» de un 54-76% de la sacarosa, descendiendo la propor-
ción sacarosa:azúcar reductor hasta 0,22-0,44:1. Sorprendentemente, incluso en los dátiles infundidos sólo con
agua la inversión de la sacarosa alcanzó el 53% con una reducción de la proporción sacarosa:azúcar reductor hasta
0,56:1. El defecto de la pared de azúcar ya no fue detectable 60 días después del tratamiento, tanto en las muestras
tratadas con enzima como en las que lo fueron sólo con agua. Esto ilustra lo fácil que puede resultar a veces la
potenciación de la actividad endógena, en este caso simplemente con la adición de agua. Al final del período de
almacenamiento de 60 días, tanto los dátiles tratados como los control se deshidrataron hasta su contenido de
humedad original de 16-18% y se estudiaron durante otro mes. Todos los dátiles infundidos con agua volvieron a
presentar el defecto de la pared de azúcar, mientras que los infundidos con la enzima mostraron un 0-10% de
incidencia del defecto, y con una relación inversa con la cantidad de enzima utilizada. Así pues, la eliminación
permanente del defecto exige el tratamiento con invertasa exógena.
El último ejemplo de control de la acción enzimática en los alimentos trata sobre la TMAO demetilasa (EC
4.1.2.32), que ocasiona una reacción en el músculo, particularmente en el pescado de la familia de los Gádidos
(bacalao):
(CH3)3N → O → (CH3)2NH + HCHO (6.59)
El formaldehído (HCHO) producido provoca la formación de enlaces cruzados en las proteínas, lo que hace que
el tejido muscular se vuelva más duro y fibroso cuando se almacena congelado en filetes o en bloques/porciones.
La rotura del tejido, mediante congelación o simple picado, hace que tenga lugar la reacción, motivada por un
proceso de descompartimentalización (el TMAO puede alcanzar hasta >100 mM en el músculo). La TMAO
demetilasa no tiene una distribución amplia, pero se halla en algunas bacterias. En el músculo del pescado y en los
tejidos orgánicos, parece estar asociada a la membrana celular, pero se puede solubilizar. Se ha observado que la
reactividad de la enzima aislada de la membrana está mediada por dos sistemas de cofactores o de cosustratos [97].
Uno necesita NAD(P)H y FMN y sólo funciona enaeróbicamente, mientras que el otro implica el concurso de Fe2+,
Enzimas 463
ascorbato y/o cisteína y funciona con independencia de la tensión de oxígeno, pero su acción estimulante es sólo el
20% de la observada para el sistema NAD(P)H/FMN.
Desde el punto de vista comercial es importante evitar esta reacción en los bloques de pescado congelado (~7 kg
y con forma rectangular) que después se transforman en filetes de pescado y porciones. Se evaluó como solución
práctica la permanencia del pescado refrigerado con hielo durante un período de hasta 10 días antes de la congelación
[109]. Las velocidades de formación de HCHO oscilaron entre 10-25 μmol/100 g día–1 en los bloques preparados a
partir de filetes de pescado fresco (0 días de almacenamiento en hielo) con velocidades mayores a medida que aumen-
taba la anaerobiosis interior, condiciones en las que el sistema cofactor NAD(P)H/FMN es más activo. Sin embargo,
este efecto en la profundidad del pescado disminuyó rápidamente tras sólo un día de almacenamiento refrigerado con
hielo antes de la preparación y congelación de los bloques, y las velocidades de formación de HCHO oscilaron entre
7-12 μmol/100 g día–1 (desde el exterior hacia el interior del bloque). Tras 10 días de almacenamiento a refrigeración
con hielo, las velocidades de formación de HCHO oscilaron entre 2,1-2,4 μmol/100 g día–1 en todas las localizaciones
en el seno de los bloques. Una explicación para lo observado es que los cofactores que más aceleran la velocidad y que
actúan preferentemente en anaerobiosis (NAD(P)H y FMN) disminuirían rápidamente en el músculo del pescado
almacenado a refrigeración con hielo y podrían no ser repuestos [100]. El potencial de formación de HCHO que se
conservaba tras los períodos mayores de almacenamiento a refrigeración con hielo sería aportado por el sistema de
cofactores menos reactivos (hierro, ascorbato, cisteína), que también disminuyó con el tiempo, resultando en una
inhibición del 80-90% del HCHO formado tras 10 días de almacenamiento a refrigeración en hielo. Este ejemplo
ilustra un modo simple de controlar la acción enzimática mediante estrategias que se centran en controlar la disponi-
bilidad de los (co-)reactantes de las reacciones enzimáticas. Una estrategia alternativa para controlar esta reacción
específica, y el problema de textura asociado con ella, se basó en la sugerencia que hicieron los pescadores de Maine
de remojar/congelar los filetes en agua de mar como paso intermedio [71]. Esto permite que una proporción de
constituyentes de bajo peso molecular, que incluye sustratos y cofactores, sean lixiviados osmóticamente hacia el
exterior del músculo, lo que se traduce en una disminución de un ~80% de la velocidad de formación y de la cantidad
de HCHO formado y en una alteración menor de la textura al congelar con posterioridad.
REFERENCIAS

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6 Enzimas

6.1 Introducción ................................................................................................................................................................ 358

6.4 Influencia del ambiente sobre la acción enzimática .................................................................................................. 420

6.2 NATURALEZA GENERAL DE LAS ENZIMAS

6.2.1 LAS ENZIMAS COMO BIOCATALIZADORES

6.2.2 NATURALEZA PROTEICA Y NO PROTEICA DE LAS ENZIMAS [30,43,94]

6.2.3 PODER CATALÍTICO DE LAS ENZIMAS [30,43,54,151]

Figura 6.1 Coordenadas de reac-

Reacción Catalizador Energía libre Velocidad de

H2O2 → ½O2 + H2O Ninguno (acuoso) 18,0 1,0

6.2.3.1 La teoría de la colisión para la catálisis de las reacciones

6.2.3.2 La teoría del estado de transición de la catálisis enzimática

y la velocidad de reacción o descomposición de S‡ en P viene dada por la expresión

donde kd es la constante de velocidad de primer orden para la descomposición de S‡ en P. El parámetro termodiná-

Combinando las equivalencias de las Ecuaciones 6.2 y 6.4 nos resulta:

6.2.4 MECANISMOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA [30,43,151]

6.2.4.1 Naturaleza general de los sitios activos de las enzimas

6.2.4.2 Mecanismos catalíticos específicos

Mecanismo Fuerzas involucradas Residuos y cofactores

Aproximación Modelizada como catálisis Residuos del sitio activo y residuos

6.2.4.2.1 Papel de la energía de unión

6.2.4.2.3 Catálisis covalente

En la formación de un intermediario covalente es implícita la existencia de al menos dos pasos a lo largo de la

Enzima kcat (s–1) μM)

Tipo salvaje 6,3 × 101 440 6,3 × 105

6.2.4.2.4 Catálisis general ácido-base

Figura 6.6 Sitio activo de las aliinasas del ajo. El esqueleto

Se consiguen generalmente aumentos de la velocidad de reacción de 102-103 a través de la catálisis ácido-base

6.2.4.2.5 Deformación y distorsión

6.2.4.2.6 Otros mecanismos enzimáticos

6.2.4.2.7 Efectos netos de la catálisis enzimática

6.2.5 CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

6.2.5.1 Modelos simples para las reacciones enzimáticas [31,122]

Así pues, la velocidad de formación de ES es equivalente a la de su desaparición. Puesto que la formación de ES

Esta ecuación puede reescribirse como si se tratase de un proceso de disociación de la forma:

la constante de Michaelis (6.14)

6.2.5.2 Expresiones de la velocidad de las reacciones enzimáticas

La Ecuación 6.15 entonces se simplifica y queda de la manera siguiente:

6.2.5.3 Análisis gráfico de las reacciones enzimáticas

Figura 6.10 Curvas de progreso de las reacciones enzimáticas

6.2.5.3.1 Características críticas de los ensayos enzimáticos

6.2.5.3.2 Estimación de KM y Vmáx

6.2.6 ESPECIFICIDAD Y SELECTIVIDAD DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA [43]

Figura 6.12 Modelo para las inhibiciones

6.2.6.1 Patrones de especificidad de determinadas enzimas alimentarias

Figura 6.13 Mapeo a través de sustratos del sitio activo de la

Quimotripsina Tripsina Elastasa

κ-caseína 100 Péptido 110 kcat kM kcat/KM

Fuente: Visser, S., Neth. Milk Dairy J. 35, 65, 1981.

6.2.6.1.2 Glucosil hidrolasas (Glucosidasas) [126,154,159]

6.2.6.1.3 Enzimas que transforman lípidos

6.2.6.2 Nomenclatura y clasificación de las enzimas

* El día 1 de enero de 2016 estaban incluidas en la lista 5.684 enzimas: http://www.enzyme-database.org/stats.php.

1. Oxidorreductasa Grupo en el donador oxidado Aceptor reducido Donador-aceptor

2. Transferasa Grupo transferido Grupo caracterizado en detalle Donador-aceptor

3. Hidrolasa Enlace hidrolizado Clase de sustrato Hidrolasa

4. Liasa (eliminación) Enlace escindido Grupo eliminado Sustrato grupo liasa

5. Isomerasa Tipo de reacción Sustrato, posición, quiralidad Racemasa, epimerasa

6. Ligasa Enlace sintetizado Sustrato, cosustrato(s) X-Y ligasa (sintetasa)

6.3 USOS DE ENZIMAS EXÓGENAS EN LOS ALIMENTOS [3,50,139,155]

6.3.1 CONSIDERACIONES GENERALES

6.3.2 ENZIMAS QUE TRANSFORMAN LOS CARBOHIDRATOS [126,155,159]

6.3.2.1 Enzimas que transforman el almidón

6.3.2.1.1 α-Amilasa [126,143,154,159]