USP-NF 〈563〉 Identificación de Artículos de Origen Botánico

USP-NF 〈563〉 Identificación de Artículos de Origen Botánico 12/10/20, 5:56 p. m.
Impreso el: lun oct 12 2020, 17:56:17 pm

Impreso por: Diego Molina
O<cial Vigente al: 12-oct-2020
Fecha o<cial: O<cial desde 1-may-2020
Tipo de Documento: Capítulo General
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〈 563 〉 IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

INTRODUCCIÓN
La identi<cación de materias primas vegetales que se utilizan en la fabricación de medicamentos, excipientes, o suplementos
dietéticos se lleva a cabo examinando las características morfológicas e histológicas del artículo en análisis y realizando pruebas de
diagnóstico químicas. Las características botánicas y químicas obtenidas del examen del artículo de prueba se comparan luego con
las características botánicas y químicas conocidas de la especie vegetal. Se pueden especi<car artículos de referencia para ayudar a
la adecuada identi<cación botánica y química de la planta y de las partes de la planta. Un artículo de referencia puede ser un Material
de Referencia Autenticado USP, que se puede utilizar tanto para la identi<cación química como botánica, o un Estándar de Referencia
USP, que se usa solo para la identi<cación química.
MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP

Los Materiales de Referencia Autenticados USP son órganos o tejidos vegetales certi<cados por provenir de una planta
identi<cada adecuadamente como perteneciente a la especie declarada en la etiqueta. La autenticación es realizada por
especialistas en taxonomía botánica, anatomía vegetal, <toquímica u otros cientí<cos especialistas en plantas contratados por la
AL
USP. Un Material de Referencia Autenticado USP es habitualmente un órgano o tejido vegetal seco y pulverizado que se puede
obtener de la USP. Se archivan muestras de herbario de las plantas autenticadas, que pueden incluir raíces, tallos, hojas, aores, frutos
y semillas. Las muestras del archivo se pueden solicitar para su examen. Generalmente, una muestra de herbario estándar consiste
en la planta adulta entera. Los Materiales de Referencia Autenticados USP se someten a las mismas pruebas de diagnóstico
botánico y químico que se aplican en el análisis de materias primas. Un artículo de prueba debe tener todas las características
botánicas y químicas especi<cadas que se encuentran en el Material de Referencia Autenticado USP. Para que sirva al propósito al
CI
que está destinado, cada Material de Referencia Autenticado USP se debe almacenar, manipular y usar de manera apropiada. Por lo
general, los Materiales de Referencia Autenticados USP se almacenan en sus envases originales en un ambiente fresco, seco y
protegidos de la luz y de la infestación de insectos. Cuando se requieren condiciones de almacenamiento especiales, las
instrucciones se indican en la etiqueta. Por lo general, los principios activos y los compuestos marcadores se degradan con el
FI
tiempo; por lo tanto, se asignan fechas de caducidad a los Materiales de Referencia Autenticados USP para su uso en identi<cación
química. Los Materiales de Referencia Autenticados USP no están destinados para emplearse en la fabricación de productos
farmacéuticos, excipientes ni suplementos dietéticos.
O
IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
La identi<cación botánica de las materias primas vegetales que se emplean en la fabricación de productos farmacéuticos,
excipientes, o suplementos dietéticos consiste en determinar las características macroscópicas e histológicas (microscópicas) de la
parte de la planta, como por ejemplo, raíz, tallo, hoja, aor, fruto o semilla, que se utiliza en la fabricación del artículo. La identi<cación
puede incluir también la inspección de las características organolépticas del tejido vegetal, como la presencia o ausencia de un olor
característico. Las monografías o<ciales individuales pueden incluir información botánica de posibles especies adulterantes para
asegurar su ausencia en la materia prima. Para identi<car adecuadamente la planta, el órgano o el tejido vegetal, es necesario tener
un conocimiento básico de anatomía vegetal.
Morfología y Anatomía Vegetal Diagnóstica

Esta sección trata exclusivamente las características morfológicas y anatómicas diagnósticas de plantas vasculares y de las
diversas partes de las plantas, tales como raíces, tallos, hojas, aores, frutos y semillas, a partir de las que se obtienen productos
farmacéuticos, excipientes o suplementos dietéticos. Las plantas vasculares comprenden las Pterido<tas (helechos y plantas
relacionadas con los helechos; por ejemplo, los géneros Aspidium, Equisetum y Lycopodium), las Gimnospermas (plantas de semilla,
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en las que la semilla no está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Ephedra, Gingko y Pinus) y las Angiospermas
(plantas de semilla, donde la semilla está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Allium, Digitalis, Panax, Matricaria y
Rauwol>a). Algunas de las características anatómicas diagnósticas que se especi<can en una monografía individual (ver
Características botánicas en monografías individuales) pueden incluir, entre otras, la presencia de un tejido particular en un órgano; la
disposición y el tipo de células de un tejido; la presencia y el tipo de canal secretor, la presencia de aceite, resina o conductos
laticíferos dentro de un órgano; el número de células epiteliales que rodea un canal secretor; y la presencia y tipo de sustancias
ergásticas como por ejemplo almidón, inulina, glóbulos de grasa, aceites esenciales, cristales de oxalato de calcio, cistolitos,
polifenoles, líquidos u otros materiales que se producen en el citoplasma, organelos, vacuolas, cavidades o pared celular.
RAÍCES
Los tejidos presentes en raíces jóvenes, comenzando desde el tejido más externo, comprenden una epidermis con pelos
radiculares, corteza, endodermis, periciclo, aoema, xilema y, en algunas especies, médula. En algunas especies, la capa o capas
más externas de la corteza son diferentes de las capas internas, en cuyo caso se denominan hipodermis. En especies que
presentan crecimiento secundario de la raíz, es habitual que se desprendan todos los tejidos externos al periciclo. Las raíces que
presentan crecimiento secundario tienen un peridermo o corteza, compuesto de súber (tejido suberoso), felógeno (cámbium
suberoso) y felodermo como el tejido más externo. Debajo del peridermo se pueden encontrar restos de aoema primario, aoema
secundario, cámbium vascular, xilema primario y xilema secundario. Los tejidos vasculares secundarios tienen radios medulares
que separan en grupos a las principales células conductoras del aoema (elementos cribosos o células cribosas) y a las principales
células conductoras del xilema (vasos y traqueidas). La mayoría de las especies de plantas que presentan crecimiento secundario
carecen de médula en la raíz. El tipo y la disposición de las células conductoras principales de los tejidos vasculares puede permitir
el diagnóstico de la especie. Las raíces de muchas especies se desarrollan como órganos de almacenamiento alimenticio. Este tipo
de raíces se caracteriza por la presencia de abundante parénquima y grandes cantidades de almidón u otros polisacáridos. La
presencia, el tipo y la disposición de <bras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicación de material ergástico también
pueden ser características diagnósticas. Desde el punto de vista morfológico, las raíces se pueden distinguir de los rizomas (los
tallos subterráneos) principalmente por la ausencia de nodos e internodos, que están presentes en los rizomas.
TALLOS
Varias características macroscópicas externas de los tallos que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los
atributos de los nodos, internodos, cicatrices de las hojas, cicatrices de los haces vasculares, lenticelas y yemas; el patrón de
crecimiento de las yemas; la posición y disposición de las hojas a lo largo del tallo y la presencia de zarcillos, aguijones, púas o
espinas. Comenzando con el tejido más externo, la disposición interna de tejidos en los tallos jóvenes de la mayoría de las especies
es epidermis, corteza, un anillo concéntrico de haces vasculares separados entre sí por haces medulares parenquimatosos y
médula. Según la especie, en la epidermis puede haber estomas o tricomas, o ambas estructuras. La corteza de algunas especies
puede incluir una hipodermis o una endodermis, o ambas. En muchas monocotiledóneas, la disposición de los haces vasculares no
es concéntrica, sino que los haces están esparcidos a través de toda una masa de tejido parenquimatoso en la parte interior de la
epidermis. Debido a esta disposición, no se puede distinguir la corteza, los haces medulares, ni la médula. En los tallos de plantas
leñosas que presentan crecimiento secundario, es habitual que la epidermis se desprenda y se reemplace con un peridermo que
consta de súber, felógeno y felodermo. Algunas especies se caracterizan por presentar múltiples peridermos (ritidoma). En el
peridermo puede haber lenticelas y sus atributos pueden servir como características diagnósticas. Por debajo del peridermo están
los restos de la corteza, el aoema primario, el aoema secundario, el cámbium vascular, el xilema secundario, el xilema primario y la
médula. También hay haces medulares. Igual que en la raíz, el tipo y la disposición de las células conductoras principales de los
tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de <bras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicación de material
ergástico, también pueden ser características diagnósticas. Los rizomas pueden tener algunas características morfológicas
similares a las de las raíces y por lo tanto se pueden confundir con raíces. Sin embargo, los rizomas se pueden identi<car
correctamente como tallos porque tienen nodos e internodos evidentes.
HOJAS
Algunas características macroscópicas de las hojas que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los atributos
de las láminas foliares, el pecíolo, las estípulas y la <lotaxia. El tejido más externo de la lámina foliar es la epidermis, seguida por los
tejidos mesó<lo y vascular. Entre las características diagnósticas microscópicas de las células epidérmicas están el grosor y las
marcas de la cutícula, la forma y disposición de los estomas y las células guardianas, la disposición y tamaño de células
subsidiarias, el número de estomas (número de estomas por unidad de super<cie) y el índice estomático (número de estomas por
número de unidades de células epidérmicas). Otras características útiles en la identi<cación de material foliar consisten en los tipos
y la disposición de los tricomas (pelos de los vegetales) presentes; el tipo y la disposición de los tejidos mesó<lo y vascular; la
relación de mesó<lo en empalizada; la presencia y el aspecto de tejidos accesorios tales como vainas de haces parenquimatosos o
esclerenquimatosos, mesó<lo paraveinal, endodermis y tejido de transfusión; el tipo y la disposición de las células conductoras
principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de <bras, esclereidas y otros tejidos; y la presencia, la
ubicación y el aspecto físico del material ergástico.
FLORES
Las aores son las mejores características morfológicas diagnósticas de cualquier planta aoral y la estructura aoral es el criterio
principal que se usa en taxonomía vegetal. Las características diagnósticas de las aores comprenden el tipo de inaorescencia; la
presencia, el número y el aspecto de las partes aorales principales (sépalos, pétalos, estambres y carpelos); el tipo de simetría que
presentan las partes aorales; la posición relativa de los ovarios con respecto a las demás partes de la aor; el número de óvulos por
ovario; el tipo de placentación del ovario; el aspecto físico de los granos de polen; la presencia de nectarios, la presencia de
recubrimientos o tricomas glandulares; y características físicas de estructuras accesorias, como el receptáculo y las brácteas. Las
características histológicas y la presencia de materiales ergásticos en los tejidos de las partes aorales permiten también el
diagnóstico de la especie.
FRUTOS
La identi<cación de la especie vegetal a partir de la que se obtiene un fruto se puede determinar mediante la observación de
varios criterios macroscópicos. Estos criterios comprenden el número de pistilos que tiene el fruto; el número de carpelos dentro de
cada pistilo; el número de semillas dentro de cada carpelo, la placentación del fruto; y si el fruto es dehiscente, indehiscente o
carnoso. Algunas otras características diagnósticas son las referentes al número de suturas en un fruto dehiscente, la
determinación de si las semillas están unidas o no a la pared del pericarpio, las características físicas de las tres capas del
pericarpio de los frutos carnosos (epicarpio, mesocarpio y endocarpio) y la presencia y el aspecto físico de tejidos accesorios como
el receptáculo y las brácteas. Las características histológicas de los tejidos del fruto pueden ayudar a la identi<cación. Las
características de las semillas dentro del fruto también son caracteres distintivos que permiten diagnosticar la especie.
SEMILLAS
Las características macroscópicas de las semillas que se utilizan en la identi<cación comprenden la forma y el tamaño de la
semilla; el aspecto de la super<cie del recubrimiento de la semilla; la posición del hilio y del micrópilo; y la presencia de estructuras
accesorias del recubrimiento de la semilla, tales como los arilos, carúncula, o cuerpos oleosos. Las características físicas del
embrión, tales como su tamaño, forma, posición y el número y aspecto de los cotiledones, al igual que la presencia y el aspecto de
tejidos nutritivos accesorios como los restos de un megagameto<to (en Gimnospermas), perisperma (nucela) o endosperma,
permiten también diagnosticar la especie. Las características histológicas del recubrimiento de la semilla y otras estructuras y
tejidos de la semilla también se pueden utilizar para identi<car la especie.
Microtécnica
El análisis histológico de muestras botánicas se puede realizar en material vegetal entero o pulverizado. Puede ser necesario el
empleo de tinciones citológicas u otros reactivos para visualizar determinadas características histológicas. Se pueden emplear
polarizadores cruzados para detectar estructuras que rotan la luz polarizada plana. Estas estructuras comprenden granos de
almidón, cristales de oxalato de calcio, algunas <bras y granos de arena (presentes como un contaminante) que se pueden observar
como objetos brillantes contra un fondo oscuro. Generalmente se coloca un polarizador en el condensador o la fuente de iluminación
y el segundo polarizador se coloca en el ocular. La luz que entra al portaobjetos desde abajo es polarizada plana, lo que permite que
pasen solamente algunas ondas luminosas en un plano especí<co. El campo se torna brillante cuando los dos polarizadores se
alinean y cuando los dos polarizadores están cruzados, el campo se oscurece.
PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO

Procedimiento general: Las muestras vegetales se observan bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes medios de
montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta identi<cación del artículo de prueba. Si se dispone de un Material de
Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos medios de montaje o soluciones reactivo utilizados para el artículo
de prueba. Colocar 1 ó 2 gotas de agua, Solución de alcohol–glicerina, Solución de hidrato de cloral, u otra solución reactivo en el
centro de un portaobjetos limpio (ver Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y medios de montaje). Transferir
una pequeña sección de tejido vegetal o una porción de polvo de la planta al medio de montaje o solución reactivo y cubrirla con un
cubreobjetos limpio. (Para obtener más información sobre técnicas de preparación especí<cas, ver Preparación de montajes
temporales y cortes manuales, Maceración o Preparación de material pulverizado, según corresponda). Para evitar la formación de
burbujas de aire, el cubreobjetos se debe colocar cuidadosamente en un ángulo adecuado, de tal manera que su borde entre primero
en contacto con el portaobjetos y luego presionar hasta que cubra la muestra. Eliminar el exceso de líquido del extremo del
cubreobjetos con un trozo de papel de <ltro. Las burbujas de aire se pueden eliminar colocando el portaobjetos en un desecador de
vacío. Cuando se emplea hidrato de cloral, las burbujas de aire se pueden eliminar calentando la muestra a ebullición suave sobre
una llama pequeña, como la de una lámpara de alcohol. Para reemplazar el medio de montaje o solución reactivo, colocar gotas del
nuevo medio de montaje o solución reactivo en un borde del cubreobjetos. Colocar una tira de papel de <ltro en el extremo opuesto
del cubreobjetos para eliminar el medio de montaje o solución reactivo anterior y hacer que el nuevo medio de montaje o solución
reactivo corra sobre el tejido o material pulverizado. Los aceites vegetales también pueden ser arrastrados del tejido de esta
manera, lavando el portaobjetos con éter de petróleo o acetona seguido luego por agua, y si fuera necesario, por Solución de hidrato
de cloral. No usar Solución de hidrato de cloral inmediatamente después de tratar el tejido vegetal con disolventes inaamables sin
haber lavado minuciosamente el tejido con agua. De este modo se evita que el disolvente residual se inaame cuando el portaobjetos
se coloque sobre una llama pequeña para calentar el tejido a ebullición. Se debe tener cuidado al usar soluciones reactivo que sean
volátiles o corrosivas para el microscopio. Para evitar que las soluciones acuosas o de hidrato de cloral se sequen durante la
observación, agregar al portaobjetos una pequeña gota de glicerina. Observar la muestra montada bajo un microscopio óptico (ver
Microscopía Óptica 〈776〉) y examinar las características histológicas.
Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y medios de montaje: Los siguientes reactivos, dispositivos ópticos
y medios de montaje se emplean en la identi<cación de células, tejidos, características estructurales y sustancias ergásticas en el
tejido o material pulverizado (ver la Tabla 1 y la Tabla 2).
Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos
Detección Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos
Concreción de Carbonato de calcio Ácido acético diluido
Cristales de oxalato de calcio Polarizadores cruzados
Solución de carmín–alumbre–verde de metilo Ácido yodhídrico

Celulosa Solución de yodo–cloruro de cinc
Citoplasma Solución de ácido pícrico alcohólico
1,8-Dihidroxiantraquinonas Solución de hidróxido de potasio 1 M
Aceites esenciales Solución de tetróxido de osmio Solución de sudán III
Inulina Solución de naftol–ácido sulfúrico
Solución de carmín–alumbre–verde de metilo Solución de Toro-

Lignina glucinol–ácido clorhídrico Reactivo universal
Solución de carmín–alumbre–verde de metilo Solución de tetró-

Lípidos (cutina, ceras y suberina incluidas) xido de osmio Solución de sudán III Reactivo universal
Solución de rojo de rutenio Solución de tionina Solución de azul

Pectina y mucílago de toluidina
Fitoglicógeno Solución de rojo de rutenio
Solución de ácido pícrico alcohólico Solución de tetróxido de

Cuerpos proteicos osmio
Mezcla de sangre–gelatina Solución de yodo–glicerina (con<r-

Saponina mar mediante prueba con Mezcla de sangre–gelatina)
Almidón Polarizadores cruzados Solución de yodo Reactivo universal
Taninos y otros polifenoles Solución de cloruro férrico Solución de tetróxido de osmio
Tabla 2. Agentes Blanqueadores y ClariWcantes y Medios de Montaje
Usar Medios de Montaje y Agentes
Agentes Blanqueadores Solución de hipoclorito de sodio
Solución de hidrato de cloral Solución de lactocloral Solución de

Agentes Clari<cantes lactofenol
Glicerina Solución de glicerina–alcohol Mezcla de glicerina–ge-

Medios de Montaje latina Agua
Solución de ácido pícrico alcohólico—Preparar una solución de ácido pícrico al 1% en alcohol. El ácido pícrico es útil para teñir células
que tienen un citoplasma denso, como las células de aleurona en semillas. Colocar una pequeña cantidad del material vegetal
pulverizado en un tubo de ensayo y agitarla con aproximadamente 1 mL de éter de petróleo para eliminar aceites vegetales que
interferirían con la reacción. Centrifugar y desechar el éter de petróleo. Empapar el polvo vegetal en Solución de ácido pícrico
alcohólico durante aproximadamente 30 minutos. Transferir una porción del polvo a un portaobjetos y observar al microscopio. El
citoplasma y los cuerpos proteicos se tornan de un color amarillo brillante. [ PRECAUCIÓN— El ácido pícrico es explosivo cuando
se seca. Manipular de manera adecuada.]
Mezcla de sangre–gelatina—Agregar 4,5 g de gelatina en polvo a 100 mL de una solución de cloruro de sodio al 0,9% y dejar hinchar
durante 30 minutos. Calentar el gel mezclándolo hasta aproximadamente 80°, en un baño de agua. Enfriar a 40° y agregar 6 mL de
sangre bovina des<brinada. Calentar a 45°–50° y verter sobre un portaobjetos para microscopio en una capa delgada de
aproximadamente 1 mm manteniendo el portaobjetos en posición horizontal. Para evitar pérdidas de la mezcla de sangre–gelatina
por los lados del portaobjetos, sellar los bordes con cinta adhesiva de 1 cm de ancho para formar una bandeja. Después de
enfriarse y solidi<carse, la mezcla está lista para usar. [ NOTA— Almacenar en una cámara húmeda durante no más de 1–2 días, a
3°–4°.] Para realizar la prueba de saponinas, colocar grupos pequeños del material vegetal en polvo sobre la capa de sangre-
gelatina, dejando una separación de algunos mm entre ellos, transferir a un humidi<cador durante algunas horas y observar. Las
partículas que contengan saponinas originarán zonas claras transparentes en la sangre–gelatina.
Solución de carmín–alumbre–verde de metilo—Calentar a ebullición 1,5 g de carmín durante 30 minutos en una solución de sulfato de
potasio y aluminio al 15%. Enfriar, <ltrar y agregar mezclando 10 mL de una solución de verde de metilo al 0,75%. Agregar de 1–2
gotas al material vegetal. La lignina y la suberina se tornan de color verde y la celulosa se torna de color violeta rojizo.
Solución de hidrato de cloral—Usar hidrato de cloral SR. Cuando se use la solución como agente clari<cante, agregar algunas gotas al
material vegetal y calentar a ebullición brevemente sobre una llama pequeña. El hidrato de cloral disuelve el contenido celular y las
sustancias intercelulares, y permite observar fácilmente las paredes y las formas celulares. Se puede utilizar para ayudar a la
identi<cación de súber, <bras, vasos, cristales de oxalato de calcio (con ayuda de polarizadores cruzados), tricomas, estomas y
polen.
Polarizadores cruzados—Este dispositivo óptico se emplea para detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidón
(amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de calcio y los granos de almidón aparecen como objetos brillantes,
birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidón observados bajo la luz polarizada también presentan el efecto de la
cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los cristales de oxalato de calcio se ven mejor después de clari<car la
muestra con Solución de hidrato de cloral u otro agente clari<cante.
Ácido acético diluido—Agregar de 1–2 gotas al material vegetal y observar inmediatamente al microscopio. Los depósitos de
carbonato de calcio se disuelven con efervescencia.
Solución de cloruro férrico—Diluir 1 mL de cloruro férrico SR con 9 mL de agua. Para la detección de grupos hidroxilo fenólicos, como
taninos y aavonoides, agregar la solución a la muestra acuosa desde la parte lateral del cubreobjetos. Los taninos y otros
polifenoles se tornan de color de negro azulado a verde.
Glicerina—Usar como medio de montaje para evitar que las soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen.
Solución de glicerina–alcohol—Mezclar volúmenes iguales de glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje.
Mezcla de glicerina–gelatina—Agregar 10,0 g de gelatina en polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y agregar 70 mL
de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un baño de agua y <ltrar a través de un embudo precalentado que
contenga lana de vidrio. La mezcla <ltrada se licúa antes de usar y sirve como medio de montaje. Agregar algunas gotas al
material vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos calentado. Esta preparación se utiliza para el almacenamiento
a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del cubreobjetos se pueden sellar con bálsamo de Canadá después de
algunos meses de secado.
Ácido yodhídrico—Agregar de 1–2 gotas al material vegetal. Las paredes celulares de celulosa se tornan de color azul a violeta
azulado.
Solución de yodo—Agregar de 1–2 gotas de yodo 0,1 N SV al material vegetal. Las partículas de almidón se tornan de color azul
oscuro a violeta azulado; esta reacción es reversible si se calienta. [ NOTA— Las proteínas, los lípidos y la celulosa se tornan de
amarillo a marrón. Las partículas de polvo de guayaco se tornan de verde a azul, pero este reactivo no se usa para la identi<cación
diagnóstica de estas características.]
Solución de yodo–glicerina—Disolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de yoduro de potasio en una pequeña cantidad de agua y agregar 10 mL de
una mezcla de glicerina y agua (1:1). Agregar 1–2 gotas al material vegetal en polvo. Las muestras que contienen saponinas
forman grumos o agregados de color amarillo. Si la prueba de una muestra diera un resultado positivo para saponina, el resultado
se debe con<rmar realizando también una prueba a la muestra con la Mezcla de sangre–gelatina.
Solución de lactocloral—Disolver 50,0 g de hidrato de cloral en 50 mL de ácido láctico, calentando suavemente. Agregar algunas
gotas al material vegetal. Si fuera necesario, colocar el portaobjetos del microscopio en un pequeño desecador al vacío para
eliminar las burbujas de aire. La Solución de hidrato de cloral y la Solución de lactocloral se usan para el mismo tipo de
identi<cación, excepto que la Solución de lactocloral es un agente clari<cante más fuerte y se usa para el material vegetal que es
más difícil de clari<car.
Solución de lactofenol—Mezclar 20 g de ácido láctico, 40 g de glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar. Éste es un
agente clari<cante fuerte adecuado para el examen de granos de polen.
Solución de naftol–ácido sulfúrico—Preparar una solución al 20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota de
solución de 1-naftol y 1 gota de ácido sulfúrico. Los cristales de inulina se tornan de color rojo amarronado y luego se disuelven.
Solución de tetróxido de osmio—Disolver 0,1 g de tetróxido de osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar 1–2 gotas de la solución así
obtenida al material vegetal. Los aceites esenciales, los aceites grasos y otros lípidos, los taninos y los cuerpos proteicos se
tornan de color marrón a negro.
Solución de Toroglucinol–ácido clorhídrico—Esta solución se utiliza para la identi<cación de la lignina y otros derivados de
hidroxifenilpropano; tejidos ligni<cados como esclereidas, vasos, <bras y células pétreas; y parénquima ligni<cado. Humedecer el
polvo o la muestra cortada con aoroglucinol SR y dejar que se seque durante 2–3 minutos antes de colocar el cubreobjetos.
Agregar algunas gotas de solución de ácido clorhídrico al 25% y cubrir con el cubreobjetos. Las paredes de las células ligni<cadas
se tornan de color rojo carmín. [ NOTA— Este colorante no es estable.] Las células que presentan derivados de hidroxifenilpropano,
como vainillina y ácido ferúlico, también se tornan de color rojo. Alternativamente, los derivados del hidroxifenilpropano se pueden
extraer del material vegetal y luego éste puede ser examinado. Para extraer los derivados del hidroxifenilpropano, sumergir
repetidamente en alcohol el material sin tratar, mezclar en un mezclador de vórtice, centrifugar y desechar el alcohol entre los
lavados. A continuación tratar el material vegetal según la especi<cación provista anteriormente, comenzando con el agregado de
aoroglucinol SR.
Solución de hidróxido de potasio 1 M—Agregar 1 gota al material vegetal. Las células que contienen 1,8-dihidroxiantraquinonas se
tiñen de rojo.
Solución de rojo de rutenio—Agregar algunas gotas de hidróxido de amonio a rojo de rutenio SR. [ NOTA— Almacenar esta solución
protegiéndola de la luz.] Agregar 1–2 gotas al material vegetal. Las membranas celulares que contienen pectina, el mucílago ácido
y el <toglicógeno se tornan de color rojo.
Solución de hipoclorito de sodio—Esta solución se usa para blanquear cortes con una coloración intensa. Sumergir el material vegetal
en la solución durante algunos minutos hasta que esté su<cientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua y montar con un
agente de montaje adecuado. [ NOTA— El hipoclorito de sodio extraerá la lignina; el tejido vegetal tratado de esta manera dará un
resultado negativo para lignina.]
Solución de sudán III—Disolver 0,5 g de sudán III en 50 mL de alcohol o alcohol isopropílico con ebullición a reaujo. Enfriar, <ltrar y
agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 1–2 gotas de esta solución al polvo vegetal. Los aceites esenciales, las ceras, la cutina, la
suberina, los aceites grasos y otros lípidos se combinan con este colorante lipofílico y se tornan de un color rojo anaranjado a un
color rojo después de un período corto.
Solución de tionina—Preparar una solución de acetato de tionina al 0,2% en alcohol al 25%. Sumergir la muestra seca en esta
solución. Después de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso de colorante con alcohol al 25%. El mucílago se habrá
hinchado formando glóbulos esféricos y se habrá tornado de color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la pectina y los tabiques
ligni<cados se tornarán de color azul o violeta azulado.
Solución de azul de toluidina—Utilizando azul de toluidina, proceder según se indica en Solución de tionina.
Reactivo universal
SOLUCIÓN A: Diluir 20 mL de una solución de sudán III saturada con ácido láctico con 30 mL de ácido láctico.
SOLUCIÓN B: Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua.
SOLUCIÓN C: Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol.
PROCEDIMIENTO: Combinar la Solución A, la Solución B y la Solución C y agregar mezclando 2,5 mL de ácido clorhídrico. [ NOTA— La
solución se usa sin <ltrar.] Para identi<cación, agregar 2–3 gotas a la muestra y calentar a ebullición suave sobre una llama
pequeña. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades pequeñas de Reactivo universal durante la ebullición. Cubrir con el
cubreobjetos. Los elementos ligni<cados se tornan de color amarillo, la suberina de color marrón rojizo, los lípidos de color rojo
y el almidón de color violeta azulado.
Agua—Usar como medio de montaje. [ NOTA— Todos los grados de agua son aceptables para este propósito.]
Solución de cloruro de cinc–yodo—Disolver 20,0 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua. Agregar 0,5 g
de yodo 0,1 N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con protección actínica.
Agregar 1–2 gotas al material vegetal y dejar en reposo durante algunos minutos. Las paredes celulares de celulosa se tiñen de
color azul a violeta azulado.
Preparación de montajes temporales y cortes manuales: Cuando se use tejido vegetal seco, empapar o calentar a ebullición suave
en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande demasiado. El material se puede tratar entonces como material vegetal
fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje o soluciones reactivo indicadas para usar con plantas en polvo para
ayudar a visualizar las características del tejido (ver Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticosy medios de
montaje).
Para sacar una película epidérmica de la hoja, pétalo, sépalo, bráctea u otro apéndice similar a la hoja, enrollar el tejido formando
un cilindro y hacer una muesca con una cuchilla a<lada, revestida de teaón, que haya sido humedecida con agua. Con una pinza
tomar el trozo de tejido cortado y tirando hacia atrás, remover un corte transparente de la epidermis. Montar en agua sobre un
portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio
Si resulta difícil obtener una película epidérmica mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. Empapar el
tejido en una solución de ácido nítrico al 40%– 60%, a 60° durante 3–4 minutos, o hasta que la epidermis se pueda pelar con
facilidad. La película epidérmica después se lava en agua de 3–5 veces para eliminar el exceso de ácido nítrico. Neutralizar el tejido
en una solución de hidróxido de potasio al 1% o una solución de hidróxido de sodio al 1%. Lavar nuevamente el tejido con agua,
montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio.
Un método alternativo para preparar tejido foliar para el examen de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja
(aproximadamente 5 mm × 5 mm) durante 15 minutos en Solución de hidrato de cloral en un baño de agua. Transferir el tejido a un
portaobjetos, agregar una gota de agua y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden emplear estos procedimientos para determinar el
tipo, la distribución y el número de estomas, al igual que el índice estomático.
El número de estomas se determina contando el número de estomas por unidad de super<cie de un campo microscópico.
Determinar el número de estomas en al menos 10 sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Registrar la super<cie
foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia el número de estomas de las distintas super<cies es
muy diferente.
Para calcular el índice estomático, la muestra se observa al microscopio con poco aumento. El tamaño de la super<cie se de<ne
con un micrómetro ocular calibrado y se determina el número de estomas y el número de células epidérmicas para esa super<cie. El
índice estomático se calcula:
Resultado = (100 × S)/(E + S)

S = número de estomas para una super<cie determinada
E = número de células epidérmicas de la misma super<cie
Determinar el índice estomático en al menos 10 sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Nuevamente registrar la
super<cie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia los índices estomáticos de las distintas
super<cies son muy diferentes
Para hacer un corte transversal de una hoja o raíces delgadas, tallos u otros apéndices delgados, poner el apéndice que se va a
cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el apéndice con una porción del tejido expuesto. Con una cuchilla
a<lada, revestida de teaón, humedecida, cortar derecho hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin mover el
portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la cuchilla en ángulo. Se puede necesitar cierta práctica para poder
obtener cortes lo su<cientemente delgados, de modo que cuando se monten y se cubran con un cubreobjetos, estos cortes se
puedan utilizar para determinar la organización del tejido (por ejemplo, el número de capas en empalizada en la hoja, el grosor de la
cutícula, los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares). Debido a que las cuchillas se desa<lan rápidamente,
se deben reemplazar con frecuencia.
Usar el corte transversal del tejido foliar así obtenido para determinar la relación de mesó<lo en empalizada. Alternativamente,
calentar a ebullición fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm2 en Solución de hidrato de cloral, montar, cubrir con un
cubreobjetos y observar al microscopio. Identi<car grupos de cuatro células epidérmicas adaxiales y contar las células de mesó<lo
en empalizada que se extiendan por debajo y estén cubiertas al menos en el 50% por las células epidérmicas. Este valor dividido
entre 4 es la relación de mesó<lo en empalizada. Determinar la relación de mesó<lo en empalizada de al menos 10 grupos de
células epidérmicas y calcular el valor medio. La relación de mesó<lo en empalizada también se puede determinar en material foliar
en polvo.
Para hacer un corte transversal de tallos o raíces gruesas, u otras partes de la planta, incluidos los tejidos leñosos, sostener el
tejido con una mano y utilizando una cuchilla a<lada revestida de teaón, previamente humedecida con agua, rebanar un corte
transversal del apéndice. Montar en agua, otro medio o solución reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y examinar al
microscopio. En general, con un poco de práctica se pueden hacer cortes que sean lo su<cientemente delgados como para
determinar la organización del tejido vascular, el tipo de rayos, la distribución del parénquima, la presencia de cristales y similares.
Maceración: Para la adecuada identi<cación del material vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus células
individuales antes del examen microscópico. Esta técnica puede ser particularmente útil para tejidos leñosos u otros tejidos duros.
El material se corta en pequeños trozos de aproximadamente 2 mm de grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos de
aproximadamente 1 mm de grosor. Según la naturaleza de la pared celular, se emplea uno de los métodos siguientes. Para tejidos
duros o muy ligni<cados, usar el Método I. Para tejidos que no están muy ligni<cados, usar el Método II.
Método I
SOLUCIÓN A: Usar solución de ácido nítrico 4 N.
SOLUCIÓN B: Preparar una mezcla de solución de trióxido de cromo 1,2 M y ácido sulfúrico (7:4).
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de la
Solución A y de la Solución B (1:1). Calentar en un baño de agua durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y
transferir a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de disección, agregar 1–2 gotas de medio de montaje, cubrir
con un cubreobjetos y examinar al microscopio. Si fuera necesario, las células se pueden separar más entre sí al presionar el
cubreobjetos con un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina.
Método II
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solución de hidróxido
de potasio 2 M. Calentar en un baño de agua durante 30 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir a un
portaobjetos. Agregar 1–2 gotas de medio de montaje. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo,
aplastando el tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina.
Preparación de materiales en polvo: Colocar 1 ó 2 gotas de agua, otro medio de montaje o una solución reactivo en el centro de un
portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de disección con agua y sumergir en el polvo en análisis. Transferir una
pequeña cantidad de material que se adhiera a la aguja al líquido en el portaobjetos y mezclar minuciosamente y con cuidado.
Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la organización de las estructuras del tejido dentro del tejido
vegetal, las características importantes a observar del material vegetal en polvo son las características físicas y químicas de los
tejidos y los tipos celulares, al igual que la presencia y las características químicas y físicas de sustancias ergásticas. Los tejidos,
células y sustancias ergásticas especí<cas que se van a examinar se especi<can en la monografía individual.
PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS

Cuando sea necesario revelar características histológicas detalladas de una muestra vegetal, se deben obtener cortes delgados
del tejido. Los cortes deben ser lo su<cientemente delgados para transmitir luz y se deben cortar en un plano que permita exponer
las características deseadas. El material vegetal se mata, <ja y deshidrata en forma adecuada y se incluye en para<na u otro medio
de inclusión. El medio de inclusión se usa como una matriz de soporte sólido durante el corte del tejido. Después de efectuar el
corte y el montaje, frecuentemente se realiza la tinción de la muestra para ayudar a la diferenciación de determinadas estructuras. [
NOTA— El proceso de <jación, deshidratación, inclusión y tinción se puede acelerar signi<cativamente si se utiliza un horno de
microondas diseñado especí<camente para trabajo histológico.]
Muerte y Wjación: El primer paso en la preparación de material vegetal para corte es matar las células vivas y conservar el tejido.
Con mucha frecuencia, esto se hace mediante el empleo de un <jador químico. Un buen <jador de uso general para material vegetal
es una mezcla de formaldehído, ácido acético y alcohol (FAA).
Solución FAA—Mezclar 50 mL de alcohol, 5 mL de ácido acético glacial, 10 mL de solución de formaldehído y 35 mL de agua. [ NOTA—
Preparar periódicamente una solución nueva, ya que con el almacenamiento pierde su e<cacia.]
Procedimiento—Sumergir completamente el material vegetal en la Solución FAA. Dejar el material sumergido durante 18–24 horas a
temperatura ambiente. El material vegetal se puede conservar inde<nidamente en Solución FAA, siempre que el mismo
permanezca completamente sumergido y no se deje secar. Determinados tejidos pueden requerir in<ltración al vacío para facilitar
la penetración del <jador. La in<ltración al vacío es necesaria si el tejido tuviera abundantes espacios de aire o pelos epidérmicos,
o si aotara en la super<cie de la solución de <jación. Colocar el tejido en un vial pequeño que contenga el <jador. Colocar el vial sin
tapar en una campana de cristal o desecador que esté conectado a una fuente de vacío, preferentemente una bomba de vacío con
sello de aceite. Conectar la salida del sistema de vacío a una campana de extracción para evitar que los vapores de <jación llenen
la habitación. Encender lentamente el vacío. No usar un vacío fuerte porque el <jador puede comenzar a hervir y dañar el tejido. A
medida que el aire residual es extraído del tejido, éste subirá a la super<cie. Encender y apagar durante varios ciclos de vacío hasta
que el tejido quede en el fondo del recipiente durante un ciclo “encendido”.
Deshidratación del tejido: La para<na y otros medios de inclusión son hidrófobos. Por lo tanto, se debe eliminar el agua del tejido
vegetal después de la <jación. Esto se lleva a cabo sumergiendo el tejido <jado en soluciones de deshidratación, siendo estas
soluciones una serie de mezclas de alcohol y agua con concentraciones de alcohol en aumento. La solución <nal de la serie es
alcohol deshidratado. Comenzar lavando el tejido <jado una o dos veces con alcohol nuevo al 50% para eliminar trazas de FAA.
Eliminar esta solución y eliminar a continuación cualquier otra solución de deshidratación decantando la solución o eliminándola
con ayuda de una pipeta de vidrio. Agregar la primera solución de deshidratación (alcohol al 70%) al vial, sumergiendo el tejido
completamente. La serie graduada alcohol–agua y los tiempos sugeridos para la inmersión del tejido se listan en la Tabla 3.
Tabla 3
Solución de Deshidratación Tiempo (h)
Alcohol al 50% 1–2
Alcohol deshidratado con 0,1% de safranina O 2–4
Alcohol deshidratado 1
Se agrega safranina O a la penúltima solución de deshidratación de la serie para visualizar el tejido cuando ha quedado incluido
en para<na. Si el tejido que se va a cortar es duro o leñoso, es posible que el tiempo de cada uno de los pasos de la serie se deba
aumentar hasta 24 horas. Si fuera necesario, el tejido se puede almacenar durante varios días en alcohol al 70% o en soluciones con
concentraciones de alcohol aún más altas.
Inclusión
Preparación para inclusión

REMOCIÓN DE ALCOHOL: La para<na es el medio de inclusión más común, aunque se dispone de otros medios de inclusión. Después
de la deshidratación, el alcohol se elimina del tejido por medio de una serie graduada de soluciones de alcohol deshidratado–
xileno, debido a que la para<na no es soluble en alcohol. La serie graduada de alcohol deshidratado–xileno y los tiempos
sugeridos para la inmersión del tejido se listan en la Tabla 4.
Tabla 4
Solución de Remoción de Alcohol Tiempo (h)
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (3:1) 1
Xileno 1
Xileno 1
REMOCIÓN DE XILENO: Una vez que el xileno haya reemplazado completamente al alcohol, agregar lentamente para<na para in<ltrar el
tejido y eliminar el xileno. Proceder del siguiente modo:
1. Por cada mL de xileno, agregar aproximadamente 1 perla de para<na al vial del tejido, tapar y dejar en reposo a
temperatura ambiente durante 4 horas. Agregar más perlas de para<na hasta que no se disuelvan más perlas.
2. Colocar el tejido en un horno mantenido a 42°–45°. Agregar 2–3 perlas de para<na cada hora hasta que a esa
temperatura no se disuelvan más perlas.
3. Verter un tercio del volumen y reemplazar con un volumen igual de para<na fundida. No tapar y transferir el vial a un
horno mantenido a 58°–60°.
4. Después que la para<na se vuelva a fundir (aproximadamente 4 horas más tarde), verter la mitad del volumen y
reemplazar con un volumen igual de para<na fundida. Transferir el vial al horno mantenido a 58°–60° si la para<na
comienza a solidi<carse.
5. Repetir el cuarto paso dos veces más, después verter todo el volumen de para<na–xileno. Reemplazar con para<na pura
fundida. Aproximadamente 4 horas más tarde, verter la para<na y reemplazarla con para<na pura fundida nueva. Volver a
verter y reemplazar 4 horas más tarde, y dejar en reposo durante toda la noche. [ NOTA— Transferir el vial al horno
mantenido a 58°–60° si la para<na comienza a solidi<carse en algún momento.]
Procedimiento de inclusión—Verter el tejido con la para<na en un molde de inclusión. La para<na debe cubrir el tejido por completo
aproximadamente 3–5 mm. Colocar el molde de inclusión en una plataforma de calentamiento precalentada, diseñada para
trabajo histológico. Ajustar el tejido en el molde con la orientación adecuada para realizar el corte. Lentamente, enfriar la para<na
deslizando el molde hacia abajo, hacia el lado frío de la plataforma, hasta que la para<na se solidi<que. Sumergir el bloque de
para<na en agua helada para enfriarlo rápidamente y evitar que se formen cristales de para<na. Almacenar el bloque de para<na a
4°.
Corte y montaje: Cortar el bloque de para<na en trozos, cada uno de los cuales debe contener una muestra de tejido. Recortar el
bloque de para<na lo más cerca posible de la masa de tejido, para formar un rectángulo o una forma casi trapezoidal. Este recorte
evitará problemas de corte debidos al exceso de para<na alrededor del tejido. Para hacer cortes transversales, orientar el tejido en
https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-C265E70B-F143-4…1B-3C74F9986762_3_es-ES?source=Search%20Results&highlight=563 Página 10 de 16
un ángulo recto respecto a un bloque de tejido de madera cuya super<cie se haya empapado en para<na fundida. Fijar el bloque de
para<na a la super<cie del bloque de tejido. Agregar una pequeña cantidad de para<na fundida a la base del bloque de para<na para
facilitar la formación de un sello más impermeable. Enfriar el bloque a 4°.
Montar y ajustar en forma apropiada el tejido y el bloque de para<na en un micrótomo. Usar una cuchilla de micrótomo de acero
inoxidable adecuadamente a<lada. Ajustar el micrótomo para hacer cortes de 8–15 μm de grosor (10 μm es el grosor óptimo para la
mayoría de los tejidos). Hacer cortes individuales o en serie. Preparar un portaobjetos para microscopio del siguiente modo. Se
puede preparar un adhesivo en forma de solución con 1% de gelatina y 0,5% de benzoato de sodio que se calienta a 30°–35° para
disolver la gelatina. Hacer un frotis de una película delgada del adhesivo así obtenido sobre el portaobjetos, dejar que se seque,
enjuagar con una solución de formaldehído SR al 4% y agregar una pequeña cantidad de agua. Colocar al revés las secciones
cortadas sobre el portaobjetos, de modo que aoten en agua e inundar con una solución de formaldehído SR al 4%. Los cortes se
extienden inmediatamente y desaparecen las arrugas.
Colocar el portaobjetos sobre una plataforma de calentamiento, mantenida a 42°, para que los cortes se expandan. Pipetear y
secar el exceso de agua y solución de formaldehído. Secar durante toda la noche en un horno a 42° para asegurar la adherencia del
corte de tejido al portaobjetos.
Tinción
Preparación para tinción—Sumergir dos veces en xileno el portaobjetos con el tejido <jado, durante 10–15 minutos cada vez para
eliminar la para<na. Luego sumergir el portaobjetos en la siguiente secuencia de soluciones, dejándolo durante 5 minutos en cada
solución y teniendo cuidado de no sacar el tejido: una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1:1), alcohol deshidratado, alcohol
y una solución de alcohol al 70%. El tejido se blanquea antes de la tinción si está opaco debido a la presencia de taninos u otros
materiales ergásticos. Para blanquear, sumergir el portaobjetos en una solución de permanganato de potasio al 1% durante 1
minuto, enjuagar con agua, sumergir en una solución de ácido oxálico al 5% durante 1 minuto y enjuagar minuciosamente con
agua. El material está ya listo para la tinción. Para la mayoría de los trabajos de identi<cación botánica se recomienda usar uno de
los dos procedimientos de tinción siguientes. El primer procedimiento de tinción emplea safranina O contrastada con fast green.
Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada con anaranjado G.
Tinción de safranina O–fast green

SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solución de formaldehído
(50:25:25:2). Agregar una cantidad su<ciente de acetato de sodio para obtener una solución que contenga 1% de acetato de
sodio y mezclar. Agregar una cantidad su<ciente de safranina O para obtener una solución que contenga 1% de safranina O y
mezclar.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE FAST GREEN: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo (1:1:1) que
contenga 0,05% de fast green FCF.
PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70% según se describe en Preparación para tinción,
sumergir durante 2–24 horas, dependiendo del tejido, en Solución de tinción de safranina O. Eliminar el exceso de colorante
sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el portaobjetos a una solución de alcohol que contenga 0,5% de
ácido pícrico durante 2–10 segundos para eliminar aún más el exceso de colorante del corte y ayudar a la diferenciación de las
estructuras del tejido. Para detener la acción del ácido pícrico, transferir el portaobjetos durante 10 segundos a 1 minuto a una
solución de alcohol que contenga 4 gotas de hidróxido de amonio por cada 100 mL de alcohol. Transferir el portaobjetos al
alcohol deshidratado durante 10 segundos. Inspeccionar visualmente al microscopio el tejido teñido para comprobar si es
necesaria una mayor decoloración con ácido pícrico. Contrastar durante 10–15 segundos en Solución de tinción de fast green.
Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2:1:1); cada cambio
dura 5–10 segundos. Luego transferir el portaobjetos a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95:5) durante 1 minuto.
Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno hasta que esté listo para montar el cubreobjetos. Los cromosomas, los
núcleos y las paredes celulares ligni<cadas, cutinizadas o suberizadas, se teñirán de color rojo. El citoplasma y las paredes
celulares de celulosa se teñirán de color verde a azul, dependiendo del pH del tejido.
Tinción de anaranjado G–safranina O

SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O: Preparar una solución de safranina O al 0,004%.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE ANARANJADO G: Disolver 2 g de anaranjado G, 5 g de ácido tánico y 4 gotas de ácido clorhídrico en agua y
diluir con agua hasta 100 mL.
PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70%, según se describe en Preparación para Tinción,
transferir en forma secuencial el portaobjetos por la serie de soluciones en la Tabla 5.
Tabla 5
Solución Tiempo
Alcohol al 35% 5 min
Una solución <ltrada de cloruro de cinc al 2% 1 min
Agua 5s
Solución de tinción de safranina O 5 min
Agua 5s
Solución de tinción de anaranjado G 1 min
Agua 5s
Una solución <ltrada de ácido tánico al 5% 5 min
Agua 3s
Una solución de sulfato férrico amónico al 1% 2 min
Agua 15 s
Alcohol al 45% 10 s
Alcohol al 90% 10 s
Alcohol deshidratado 10 s
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1:1) 1–2 min
Finalmente, almacenar en xileno hasta que esté listo para colocar el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se
teñirán de negro azulado, los núcleos de color amarillo, los granos de almidón de color negro y las paredes celulares ligni<cadas
de color rojo.
Montaje del cubreobjetos: El montaje del cubreobjetos sobre el tejido completa la preparación del portaobjetos. Como adhesivo se
puede usar bálsamo de Canadá, diluido con una pequeña porción de xileno. En el mercado existen otros medios de montaje
disponibles. Cuando se seca el medio de montaje, el portaobjetos puede examinarse al microscopio. Todo el proceso de
preparación de extensiones permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 días o más.
Microscopía electrónica de barrido: Los productos botánicos comercializados por lo general se encuentran en forma de polvo o en
trozos, lo que di<culta y generalmente imposibilita la autenticación mediante un método rutinario de corte transversal del artículo.
Las estructuras tales como los vasos del xilema y las traqueidas se pueden partir en trozos más pequeños, lo que di<culta y en
ocasiones imposibilita la detección de puntuaciones y ligni<caciones en las paredes usando un microscopio óptico. Las estructuras
que son resistentes a estos procesos son más útiles en la identi<cación. La microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas
en inglés) es útil para caracterizar el tamaño y la morfología de muestras microscópicas. Mediante la SEM es posible observar e
identi<car las características diferenciales más detalladas en la estructura de los tricomas, elementos peculiares en la epidermis,
junto con material granular super<cial que contenga compuestos especí<cos, lo cual ayuda en la identi<cación de especies
particulares. La SEM se ha usado ampliamente para investigar la topología super<cial de una extensa variedad de materiales
vegetales y puede desempeñar un papel vital en la autenticación de un producto botánico completo, aquéllos en forma de polvo,
distinguiendo entre especies estrechamente relacionadas, y se puede usar para examinar una mezcla de polvos.
El capítulo general de USP Microscopía Electrónica de Barrido 〈1181〉 proporciona una introducción e información general
acerca de la SEM con respecto a su aplicación a artículos farmacopeicos.
La SEM produce una resolución más alta en comparación con la resolución obtenible usando un microscopio óptico y las
imágenes obtenidas son tridimensionales. La SEM tiene la ventaja de proporcionar imágenes con una gran profundidad de campo,
lo cual premite enfocar un espesor importante de la muestra de una sola vez. Asimismo, permite el análisis de muestras de
tamaños tan grandes como 50 mm, lo que permite producir micrografías electrónicas con los detalles topográ<cos de un objeto
claramente visibles para el ojo humano. La resolución máxima para la SEM (la distancia mínima por la cual se pueden separar y
observar los dos objetos como objetos distintos) es de 10–20 nm en comparación con 200–300 nm para la microscopía óptica. El
aumento típico de la SEM varía de ×10 a ×300 000. Los instrumentos comerciales SEM también están disponibles con aumentos tan
bajos como ×5 y tan altos como ×2 000 000. En comparación, los microscopios ópticos modernos típicos tienen un intervalo de
aumento de ×10 a ×2000. A un aumento bajo, las imágenes obtenidas con la SEM proporcionan más información que aquéllas
obtenidas mediante microscopía óptica. La SEM puede producir imágenes cuyos constrastes se basan en variaciones
composicionales de las muestras.
Cambio en la redacción:
IDENTIFICACIÓN QUÍMICA
Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artículo, se realiza la identi<cación química junto con la identi<cación
botánica descrita anteriormente. La identi<cación química generalmente emplea procedimientos cromatográ<cos para detectar la
presencia de compuestos indicadores o marcadores especi<cados en la monografía individual. Se pueden emplear per<les
espectroscópicos o cromatográ<cos para obtener la identi<cación química mediante la comparación de huellas dactilares o
caracterizaciones con un estándar o muestra de referencia. Algunos ejemplos de métodos espectroscópicos son ultravioleta (UV, por
sus siglas en inglés), infrarrojo (IR) e IR por transformada de Fourier (ver ▲Pruebas Espectroscópicas de Identi>cación 〈197〉▲ (AF 1-
may-2020)). Algunos ejemplos de métodos cromatográ<cos son cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés),
cromatografía en capa delgada (TLC, por sus siglas en inglés), TLC bidimensional y cromatografía de gases (GC, por sus siglas en
inglés) (ver Cromatografía 〈621〉). Los métodos analíticos utilizados para producir huellas dactilares deben ser capaces de detectar
tantos componentes químicos como sea posible. Puede resultar útil emplear huellas dactilares múltiples, tales como una
combinación de métodos analíticos con principios de separación y condiciones de prueba diferentes. Además de los métodos
cromatográ<cos espectroscópicos, en la monografía individual también se pueden especi<car métodos cualitativos de química
húmeda.
Quimiotaxonomía
La quimiotaxonomía es la clasi<cación de las plantas, basada en sus componentes químicos, y la misma puede resultar útil para la
identi<cación de artículos botánicos. Los compuestos metabólicos que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden dividir en
dos amplias categorías, en base a sus funciones. La primera categoría comprende los metabolitos primarios—metabolitos que
participan en los procesos <siológicos vegetales, que son absolutamente necesarios para la vida y están presentes en todo el reino
vegetal. Estos procesos comprenden la fotosíntesis, la respiración y el metabolismo de los ácidos nucleicos, las proteínas, los
carbohidratos y los lípidos. La segunda categoría comprende metabolitos secundarios—compuestos que no se consideran
absolutamente necesarios para los procesos vegetales, aunque pueden tener funciones importantes en las interacciones de las
plantas con otros organismos, como interacciones alelopáticas; en la defensa química contra herbívoros y patógenos vegetales, y en
las señales para atraer animales que polinizan y propagan las semillas. Se sabe que muchos metabolitos secundarios tienen
actividad farmacológica. También representan la base de la quimiotaxonomía vegetal. Los metabolitos secundarios pertenecen a
varias clases químicas diferentes, tales como aminoácidos no proteicos, aavonoides, xantonas, cumarinas, poliacetilenos,
policétidos cíclicos, monoterpenos, sesquiterpenos, iridoides, triterpenos, esteroles, terpenos que contienen nitrógeno y alcaloides.
Estas clases químicas no se encuentran en todo el reino vegetal, sino que tienden a ser especí<cas para determinadas clases,
órdenes y familias botánicas. Por otra parte, muchas subclases químicas y compuestos secundarios particulares son especí<cos
para determinadas subfamilias, géneros o especies. Estas subclases químicas y compuestos particulares son los que se pueden
usar como compuestos marcadores para ayudar a la identi<cación adecuada del material vegetal.
Principios Activos y Compuestos Marcadores

Para la identi<cación química de artículos botánicos se preparan extractos. Dichos extractos son generalmente mezclas complejas
de varios componentes químicos. En la gran mayoría de los extractos botánicos no se conoce con certeza cuál de los diferentes
componentes es responsable del efecto farmacológico informado. En general, se cree que los distintos componentes actúan en
forma sinérgica para proporcionar el efecto informado. En el caso de artículos para los que existen monografías o<ciales, se eligen
determinados componentes químicos del artículo y se proporcionan procedimientos de pruebas cuantitativas para determinar su
contenido. La elección de dichos componentes, generalmente conocidos como compuestos marcadores, se basa en ciertas
consideraciones. Actualmente, en las monografías o<ciales se especi<can los siguientes tipos de compuestos marcadores y pueden
ser identi<cados en materias primas:
PRINCIPIOS ACTIVOS: Estos son componentes que han demostrado ser los responsables de la actividad clínica. Generalmente, en la
monografía individual se especi<ca un intervalo o contenido mínimo de los principios activos. Una determinación cuantitativa de los
principios activos durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para
determinar fechas de caducidad apropiadas.
MARCADORES ACTIVOS: Estos componentes tienen actividad farmacológica conocida que contribuye en cierto grado a la e<cacia.
Sin embargo, la e<cacia clínica de estos componentes puede no estar demostrada. Generalmente, en las monografías individuales se
especi<ca un contenido o intervalo mínimo de los marcadores activos. Una determinación cuantitativa de los marcadores activos
durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para determinar fechas de
caducidad apropiadas.
MARCADORES ANALÍTICOS: Cuando no se conocen ni los principios activos ni los marcadores activos, se eligen otros componentes
del extracto botánico a los que se les puedan realizar determinaciones cuantitativas. Estos marcadores ayudan a la identi<cación
positiva del artículo en análisis. Además, mantener un contenido mínimo o un intervalo especí<co de los marcadores analíticos ayuda
a lograr la normalización del extracto vegetal y a determinar una fecha de caducidad apropiada durante los estudios de estabilidad.
MARCADORES NEGATIVOS: Estos componentes pueden tener propiedades alergénicas o tóxicas. La presencia de estos
componentes resulta indeseable en el extracto botánico. Por ejemplo, los ácidos ginkgólicos del ginkgo pertenecen a esta categoría.
Las monografías individuales pueden tener especi<cado un límite estricto para estos marcadores negativos.
Uso de Artículos de Referencia USP

Se usan artículos de referencia para ayudar a la identi<cación de compuestos marcadores dentro del artículo de prueba. Los
artículos de referencia son Materiales de Referencia Autenticados USP o Estándares de Referencia USP (ver Estándares de Referencia
USP 〈11〉), según lo que especi<que en la monografía individual. Los Estándares de Referencia USP utilizados para identi<car
compuestos indicadores o marcadores en los artículos de prueba pueden ser una entidad química puri<cada única, una mezcla de
entidades químicas puri<cadas o un extracto estandarizado preparado a partir del artículo vegetal autenticado. Además se pueden
utilizar Estándares de Referencia USP para cuanti<car compuestos marcadores, según se especi<que en la monografía individual.
Se somete un artículo de prueba pulverizado a un procedimiento de extracción especi<cado (ver Métodos de Extracción en
Extractos Botánicos 〈565〉) y se prepara para el análisis cromatográ<co o de química húmeda. Cuando se dispone de un Material
de Referencia Autenticado USP, se somete al mismo procedimiento de extracción que al artículo de prueba. Luego se someten la
preparación de prueba y los artículos de referencia al mismo procedimiento cromatográ<co o de química húmeda especi<cado en la
monografía individual. Se compara la respuesta de la preparación de prueba con la respuesta de los artículos de referencia para
determinar la presencia de los compuestos indicadores o marcadores en el artículo de prueba.
MÉTODOS BASADOS EN ADN PARA LA AUTENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

Debido a que a menudo resulta imposible la identi<cación morfológica cuando el material vegetal original consta de partes de la
planta secas, cortadas y modi<cadas o procesadas, o cuando el material consiste únicamente en una sola parte entera de la planta
sin caracteres taxonómicos, estos tipos de muestras por lo regular requieren métodos de identi<cación adicionales, tales como
identi<cación basada en ADN. Los métodos basados en ADN han demostrado ser e<cientes para distinguir materiales vegetales
genuinos de materiales adulterantes en matrices botánicas complejas y pueden complementar a los métodos de identi<cación
botánica tradicionales que se basan en características morfológicas o químicas. Además, los métodos basados en ADN a menudo
son más con<ables que los métodos tradicionales, en especial cuando se aplican a muestras de un solo órgano que carecen de
caracteres taxonómicos de diagnóstico, a materiales en polvo en los que ya no son apreciables las características que los distinguen
o cuando es difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas o morfológicamente similares.
Código de Barras de ADN (DNA Barcoding)

El código de barras de ADN es un método de identi<cación particular basado en secuenciación de ADN que emplea secuencias
especí<cas cortas de loci de ADN nuclear o de plástidos para la identi<cación de especies de plantas. Las pruebas se basan en la
comparación de las secuencias de nucleótidos de un tramo especí<co de ADN (secuencias de ADN o código de barras de ADN) para
realizar una identi<cación basada en secuencias del ADN. Asimismo, los métodos basados en ADN, tales como las tecnologías de
secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés), son capaces de identi<car múltiples especies en una mezcla,
incluyendo especies esperadas e inesperadas.
IdentiWcación de Productos Botánicos Usando Secuenciación del ADN (Sanger)

El proceso de identi<cación de productos botánicos que usa secuenciación del ADN (Sanger) incluye selección de marcadores,
extracción del ADN, cebadores y ampli<cación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación del ADN y comparación
con materiales de referencia, tal como se describe en las secciones siguientes. Ver Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos
—Extracción, Detección y Secuenciación 〈1126〉, Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos—Ampli>cación 〈1127〉 y Técnicas
Basadas en Ácidos Nucleicos—Genotipi>cación 〈1129〉 para información adicional.
SELECCIÓN DE MARCADORES
La secuencia seleccionada debe ser lo su<cientemente especí<ca para capturar cualquier especie primaria adulterante y
potencial en la muestra, pero también lo su<cientemente universal para evitar reacciones de falsos negativos para especies
estrechamente relacionadas. Por ejemplo, un cebador especí<co para una especie no es apropiado para la mayoría de los
procedimientos de identi<cación, debido a que no pueden detectarse los adulterantes y porque una falla en la ampli<cación puede
ser el resultado tanto de la ausencia de las especies o de la degradación del ADN. En muchos casos, un solo marcador puede ser
su<ciente para la identi<cación, pero múltiples marcadores de diversas partes del genoma (p.ej. material nuclear o de los plástidos)
aseguran la detección de los híbridos. Por lo regular, las regiones usadas para la identi<cación de secuencias de ADN tienen una
longitud de 100 a 1500 pares de bases. Los fragmentos de ADN más pequeños pueden ser menos susceptibles a la degradación del
ADN.
EXTRACCIÓN DEL ADN

Antes de que se pueda llevar a cabo la ampli<cación del marcador deseado, se debe extraer el ADN genómico en su totalidad. La
aptitud de un procedimiento de extracción genómica depende del material inicial y de la pureza del ADN requerido para las
aplicaciones posteriores. Los procedimientos principales se describen a continuación, además de que se encuentran disponibles
diversos kits comerciales para ajustarse a diferentes tipos de muestras y aplicaciones.
Se debe extraer del material vegetal molido todo el ADN genómico. Los materiales vegetales pueden homogeneizarse
manualmente usando un mortero y una mano de mortero, una moledora mecánica u otro aparato, dependiendo de la naturaleza del
material. La extracción y puri<cación de la totalidad del ADN genómico puede ser complicada debido a la abundancia de
metabolitos secundarios (polisacáridos, taninos, aceites esenciales, fenoles, alcaloides y ceras) en muchas especies de plantas
medicinales. Algunos metabolitos secundarios pueden coprecipitar con el ADN durante la extracción y pueden inhibir otras
reacciones enzimáticas, incluyendo la digestión por restricción y la PCR. En particular, grandes cantidades de polisacáridos
complejos pueden imposibilitar la extracción de ADN utilizable, volviendo la porción acuosa del extracto demasiado viscosa como
para permitir que el ADN se separe e<cientemente de los polisacáridos contaminantes. Este tipo de contaminación puede llevar a
una escasa extracción de ADN y puede evitar el acceso de enzimas modi<cadoras.
Resultan apropiados numerosos métodos de extracción de ADN usados comúnmente para una amplia variedad de materiales
vegetales frescos y secos, incluyendo bromuro de cetiltrimetilamonio, métodos basados en sílice y una variedad de kits disponibles
comercialmente que emplean columnas de sílice o perlas magnéticas recubiertas con vidrio. Aunque muchos de estos métodos
funcionan bien en materiales frescos y secos y en cualquier parte de la planta, aquéllos que se degradan o que contienen niveles
signi<cativos de compuestos secundarios u otros inhibidores de la PCR pueden requerir ajustes menores en los protocolos
estándar de extracción.
CEBADORES Y AMPLIFICACIÓN POR PCR

Por lo regular, los cebadores para PCR tienen una longitud de 18 a 30 bases y ampli<can una región con una longitud de 100 a
1500 pares de bases. Como se indicó anteriormente, los cebadores para PCR pueden ser universales, es decir, capaces de
ampli<car cualquier organismo potencial presente en una muestra de prueba (incluyendo hongos, plantas y animales o un
subconjunto importante y predecible) o pueden ser especí<cos de taxón, lo que signi<ca que han sido diseñados para ampli<car
solo organismos de un conjunto determinado (es decir, familia, géneros, especies o subespecies). Para la ampli<cación universal, se
utilizan diversas regiones génicas nucleares, mitocondriales y de plástidos, incluyendo nrITS, nrITS1, nrITS2, matK, rbcL, espaciador
intergénico psbA–trnH, cox3, COI (también conocido como cox1), espaciador externo transcrito, 18S, 5S, espaciador intergénico
trnL–trnF e intrón trnL. Los cebadores especí<cos de taxón pueden estar diseñados basándose en las proteínas encontradas en
grupos vegetales especí<cos (p. ej., el gen de lecitina de soja encontrado en la soja) u obteniendo secuencias de cualquier región
variable de ADN para el taxón determinado y cebadores diseñados para unirse única y especí<camente a las secuencias del taxón
de interés.
SECUENCIACIÓN DEL ADN

Resulta más común llevar a cabo la secuenciación del ADN usando el protocolo de Sanger, que se ha modi<cado para usar
terminadores colorantes auorescentes en un aparato de electroforesis capilar, aunque en este momento, se están abriendo paso
diversas tecnologías emergentes de secuenciación [p. ej., secuenciación de nueva generación (NGS)]. Una vez que el colorante
auorescente se ha incorporado en el ADN ampli<cado, se identi<can las bases mediante su emisión de luz a diferentes longitudes
de onda. Los datos resultantes son un cromatograma que se puede visualizar y analizar usando diversos programas
computarizados de análisis de secuencias.
COMPARACIÓN CON MATERIALES DE REFERENCIA

Las secuencias de ADN de los artículos de prueba se comparan con secuencias obtenidas de diversos materiales de referencia
en una matriz alineada (proceso comúnmente referido como alineación), lo cual permite examinar visualmente las secuencias para
identi<car posiciones de nucleótidos diagnósticas. Aunque una buena cantidad de programas computarizados son capaces de
automatizar las comparaciones entre secuencias derivadas de artículos de prueba y secuencias de referencia, el desempeño varía
considerablemente. Se recomienda que los investigadores veri<quen siempre de forma manual los resultados sugeridos por los
programas computarizados para con<rmar la identidad. Las identi<caciones positivas no son posibles cuando las secuencias de
los artículos de prueba caen fuera del intervalo de variación conocido representado en las secuencias de referencia. Si se ha
utilizado un número su<cientemente grande de materiales de referencia para desarrollar la prueba, la mayoría de los materiales de
prueba deberían identi<carse sin ambigüedad basándose en los datos de secuencias de ADN.
Información auxiliar- Por favor visite la sección de preguntas más frecuentes antes de comunicarse con la USP.
Tema/Pregunta Persona de contacto Comité de expertos
< 563 > IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS Maria Monagas BDSHM2020 Botanical Dietary Supple-
DE ORIGEN BOTÁNICO Scienti<c Liaison ments and Herbal Medicines
Consultas cientí<cas en español:

uspespanol@usp.org
Publicado más recientemente en:

Foro Farmacopeico: No. de Volumen 39(5)
DocID vigente: GUID-C265E70B-F143-40B5-BE1B-3C74F9986762_3_es-ES

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USP-NF 〈563〉 Identificación de Artículos de Origen Botánico 12/10/20, 5:56 p. m.

Impreso el: lun oct 12 2020, 17:56:17 pm

〈 563 〉 IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP

Morfología y Anatomía Vegetal Diagnóstica

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO

Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos

Detección Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos

Concreción de Carbonato de calcio Ácido acético diluido

Cristales de oxalato de calcio Polarizadores cruzados

Solución de carmín–alumbre–verde de metilo Ácido yodhídrico

Citoplasma Solución de ácido pícrico alcohólico

1,8-Dihidroxiantraquinonas Solución de hidróxido de potasio 1 M

Aceites esenciales Solución de tetróxido de osmio Solución de sudán III

Inulina Solución de naftol–ácido sulfúrico

Solución de carmín–alumbre–verde de metilo Solución de Toro-

Solución de carmín–alumbre–verde de metilo Solución de tetró-

Solución de rojo de rutenio Solución de tionina Solución de azul

Fitoglicógeno Solución de rojo de rutenio

Solución de ácido pícrico alcohólico Solución de tetróxido de

Mezcla de sangre–gelatina Solución de yodo–glicerina (con<r-

Almidón Polarizadores cruzados Solución de yodo Reactivo universal

Taninos y otros polifenoles Solución de cloruro férrico Solución de tetróxido de osmio

Tabla 2. Agentes Blanqueadores y ClariWcantes y Medios de Montaje

Usar Medios de Montaje y Agentes

Agentes Blanqueadores Solución de hipoclorito de sodio

Solución de hidrato de cloral Solución de lactocloral Solución de

Glicerina Solución de glicerina–alcohol Mezcla de glicerina–ge-

Resultado = (100 × S)/(E + S)

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS

Solución de Deshidratación Tiempo (h)

Alcohol al 50% 1–2

Alcohol al 70% 1–2

Alcohol al 90% 1–2

Alcohol al 95% 1–2

Alcohol deshidratado con 0,1% de safranina O 2–4

Preparación para inclusión

Solución de Remoción de Alcohol Tiempo (h)

Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (3:1) 1

Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1:1) 1

Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1:3) 1

Tinción de safranina O–fast green

Tinción de anaranjado G–safranina O

transferir en forma secuencial el portaobjetos por la serie de soluciones en la Tabla 5.

Alcohol al 35% 5 min

Una solución <ltrada de cloruro de cinc al 2% 1 min

Solución de tinción de safranina O 5 min

Solución de tinción de anaranjado G 1 min

Una solución <ltrada de ácido tánico al 5% 5 min

Una solución de sulfato férrico amónico al 1% 2 min

Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1:1) 1–2 min

Principios Activos y Compuestos Marcadores

Uso de Artículos de Referencia USP

MÉTODOS BASADOS EN ADN PARA LA AUTENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

o cuando es difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas o morfológicamente similares.

Código de Barras de ADN (DNA Barcoding)

IdentiWcación de Productos Botánicos Usando Secuenciación del ADN (Sanger)

EXTRACCIÓN DEL ADN

CEBADORES Y AMPLIFICACIÓN POR PCR

SECUENCIACIÓN DEL ADN

COMPARACIÓN CON MATERIALES DE REFERENCIA

Tema/Pregunta Persona de contacto Comité de expertos

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