Laboratorio de Microbiología
CONTROL DE MICROORGANISMOS
Margarita María Ángel Múnera
Manuel Alejandro Agudelo Tovar
Sara Valentina Gómez Orozco
Docente
Yesid Álvarez Maya
Universidad de Antioquia
Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias
Química Farmacéutica
Medellín
14 de diciembre de 2023
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son ubicuos, es decir, están presentes en todas partes;
muchos de estos pueden provocar efectos nocivos para la salud de los humanos y
animales, descomponer los alimentos, dañar cultivos y plantas, entre otros, por lo
cual, es necesario utilizar métodos de control físicos y químicos [1,2].
El control de los microorganismos se basa en conocer y modificar las condiciones
que favorecen su crecimiento óptimo. Los agentes físicos incluyen métodos de
control tales como temperatura alta o baja, desecación, presión osmótica, radiación
y filtración. El control por agentes químicos se refiere al uso de desinfectantes,
antisépticos y antibióticos [2].
El calentamiento es una de las formas más comunes y antiguas para el control de
los microorganismos, el calor puede destruirlos alterando sus membranas y
desnaturalizando las proteínas. Por otro lado, temperaturas entre 0 y 7 °C, inhibe el
metabolismo microbiano, ralentizando de manera significativa su crecimiento, y
temperaturas inferiores a -2 °C puede detener el crecimiento microbiano e incluso
destruir microorganismos susceptibles [2].
Por otra parte, la desecación o deshidratación controla el crecimiento de los
microorganismos, ya que, estos al igual que todas las células requieren agua para
su metabolismo y supervivencia. El contenido de agua también puede reducirse
mediante la adición de solutos como sales o azúcares; la cantidad de agua
disponible en las células microbianas se reduce drásticamente debido a que el agua
se extraerá de un área de baja concentración de soluto (dentro de la célula) a un
área de alta concentración de soluto (fuera de la célula); muchos microorganismos
no sobreviven a estas condiciones de alta presión osmótica [2].
Con respecto a la radiación, tanto la radiación ionizante (rayos X, rayos gamma y
haces de electrones de alta energía), como la radiación no ionizante (radiación
ultravioleta), alteran las estructuras moleculares y dañan los componentes celulares,
causando mutaciones que pueden provocar la muerte de los microorganismos [2].
Otro agente utilizado para el control de microorganismos es el pH. Variaciones del
rango en el que crece un determinado microorganismo, afecta la estructura de las
proteínas y de los ácidos nucleicos, la actividad enzimática y la permeabilidad de las
membranas [3].
En cuanto a los agentes químicos, los desinfectantes actúan reduciendo y matando
a las bacterias por desactivación de enzimas, hidrólisis y oxidación, funcionando de
forma más selectiva que los antisépticos. Debido a su alta toxicidad, sólo se pueden
aplicar sobre materia inerte [4].
Por otro lado, los antisépticos son agentes químicos que inhiben el crecimiento de
los microorganismos en tejidos vivos de forma no selectiva, sin causar efectos
lesivos importantes. Se usan principalmente para disminuir el riesgo de infección en
la piel intacta, mucosas y en heridas abiertas disminuyendo la colonización de la
zona [4].
Los antibióticos por su parte, pueden actuar como bactericidas (agentes que
destruyen las bacterias) o bacteriostáticos (agentes que inhiben el crecimiento y
reproducción de las bacterias). Su acción puede interferir con la síntesis de la pared
celular o de ácidos nucleicos, e inhibir la síntesis de proteínas o de rutas
metabólicas [5].
En esta práctica de laboratorio se analizó la acción de antibióticos, agentes
químicos, radiación con luz ultravioleta, variaciones en el pH, en la presión osmótica
y en la temperatura sobre algunas bacterias (Escherichia coli, Staphylococcus
aureus y Bacillus cereus).
OBJETIVOS
1. Identificar algunas técnicas de control de microorganismos con la utilización
de agentes tanto físicos como químicos.
2. Conocer la forma en que se maneja algunos de los equipos y materiales
utilizados en el control de microorganismos.
3. Aplicar adecuadamente estas técnicas en los procedimientos de control de
microorganismos.
METODOLOGÍA
Cambio en el pH
Para esta prueba se tomaron cinco tubos de ensayo con caldo nutritivo con pH 3.0,
5.0, 7.0, 9.0, 11.0. Se inoculó cada tubo con la cepa Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, se incubaron a 37°C, durante 48 horas y fueron
observadas.
Cambio en la presión osmótica
Se tomaron cinco tubos de ensayo con caldo nutritivo, ajustados a concentraciones
de glucosa de 10%, 15%, 20% y 25%. Se inocularon cada uno de los tubos con la
cepa de E. Coli y S. aureus y se incubó a 37°C durante 48 horas.
Cambio en la temperatura y tiempo de exposición
Se tomaron cuatro tubos de ensayo con caldo nutritivo y se hizo una suspensión
concentrada de Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis. Se prepararon baños de
Maria a temperatura de 50°C, 60°C, 70°C y 80°C y se prepararon cuatro cajas de
petri para cada cepa con agar nutritivo y dividirla en sectores. Con el asa se sembró
un sector marcado C (control) para las dos cepas. Los tubos fueron colocados en
los respectivos Baño María y cada 5 minutos se saca una asada para su siembra en
el sector que le corresponde. Se incubaron las cajas a 37°C durante 48 horas.
Acción de los antibióticos
Se usó el método del antibiograma, dónde se pusieron discos de papel filtro
impregnados con distintos antibióticos en una caja de petri ya inoculadas con las
cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Se incubaron a 37°C durante 48
horas.
Acción de los agentes químicos
Se tomaron dos cajas de petri con agar nutritivo y se inocularon con las cepas
Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Se dividieron las cajas de petri en 6
espacios donde se pusieron a prueba el Merthiolate, peróxido de hidrógeno,
hipoclorito de sodio, jabón, enjuague bucal y alcohol. Se incubaron a 37°C durante
48 horas. Se realizó el mismo procedimiento usando los mismos compuestos pero
con agar nutritivo más peptona.
Acción de la radiación con Luz ultravioleta
Se sembraron en dos cajas de petri, con agar nutritivo, Escherichia coli y
Staphylococcus aureus. En el centro de una pedazo de papel se recortó una figura
de hongo para E. coli y una estrella para S. aureus y en lugar de haber puesto la
tapa a la caja de petri, se colocó el papel, con el recorte centrado y se expuso bajo
la luz ultravioleta durante 10 min.
.
RESULTADOS
Acción de los antibióticos
Escherichia coli Staphylococcus aureus
P: penicilina
CN: gentamicina
TE: tetraciclina
C: cloranfenicol
Cambio en el pH
Escherichia coli
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
Staphylococcus aureus
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11
Cambio en la presión osmótica
S Aureus 10% E Coli 10% S Aureus 15% E Coli 15%
S Aureus 20% E Coli 20% S Aureus 25% E Coli 25%
Acción de los agente químicos
Escherichia coli Staphylococcus aureus
En agar nutritivo:
En agar nutritivo + Peptona:
Acción de la radiación ultravioleta
Escherichia coli Staphylococcus aureus
Cambio en la temperatura y el tiempo de exposición
B Cereus
50 60 70 80
S Aureus
50 60 70 80
S Aureus
50 60 70 80
B Cereus
50 60 70 80
Contaminación de S aureus
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Agentes Químicos
En la prueba de la acción de agentes químicos en medio agar nutritivo, para E. coli y
S. aureus se obtuvieron resultados muy similares. Con el merthiolate, que es un
antiséptico de uso tópico para heridas superficiales de la piel, se evidenció el halo
de inhibición más amplio para ambos microorganismos. Con el hipoclorito, que es
muy potente como desinfectante para uso externo, también hubo un halo de
inhibición importante. Con el jabón se observó una inhibición más notable en la E.
coli, en S. aureus se observa una inhibición muy opaca. Para los agentes químicos
anteriores pudieron ser visibles sus propiedades antimicrobianas de manera
efectiva. En el alcohol se ve una leve mancha opaca, pero nada que resulte
relevante. Por otro lado, en el peróxido de hidrógeno y en el enjuague bucal, no
hubo ninguna diferencia y los microorganismos crecieron de forma normal en la caja
de petri, a pesar de que ambas sustancias son antimicrobianas no mostraron acción
en estas bacterias.
Para evaluar la acción antimicrobiana de las mismas sustancias en presencia de
materia orgánica, se tiene un medio de agar nutritivo más peptona. El resultado fue
bastante similar al anterior. La diferencia más significativa fue con el halo de
inhibición formado con el jabón, que fue mucho más evidente y potente en este
medio. Para el alcohol en E.coli se observa un intento de inhibición, pero muy
pequeño.
A pesar de que todos son agentes químicos con propiedades antimicrobianas
relativamente altas, durante la práctica no se observó diferencia importante en
relación al microorganismo inoculado.
Acción de la radiación ultravioleta
Se puede observar que para ambos microorganismos, tanto E. coli como S. aureus,
el diseño del papel con la figura para ser expuestos a la luz ultravioleta, quedó
bastante delimitado, observando la acción de la luz ultravioleta sobre las bacterias,
lo que concuerda con la literatura, pues se sabe que la luz ultravioleta posee un
efecto germicida muy potente capaz de inactivar un amplio espectro de
microorganismos, como virus, bacterias, protozoos, hongos, levaduras y algas [15].
Cambio en la presión osmótica
Generalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente
superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. Para esta
prueba se usaron E.coli y S. Aureus. Una gram negativa y la otra gram positiva,
el aumento en la presión osmótica tiene una gran influencia sobre la cepa de S.
Aureus y su crecimiento se ve afectado. Esto, dado que esta cepa es menos
resistente que E,coli a los cambios de concentración de su entorno afectando su
crecimiento,en cambio en E.coli si se puede observar un mayor crecimiento
cuando la concentración de glucosa cambia. Esto fue observado a las 96 horas de
realizada la siembra. Además E. Coli soportó una presión solo hasta el 10%, de
resto su crecimiento se ve impedido. [14]
Temperatura
Para determinar el efecto que causó el cambio de temperatura en el crecimiento
bacteriano se usaron dos cepas, B cereus y Staphylococcus aureus donde
estas se expusieron a temperaturas húmedas de 50°c.70°c y 80°c debido a que
en el laboratorio no se contaba con el de 60°c, durante un tiempo determinado de 5
min, 10 min y 15 min de exposición. Se pudo observar un cambio en el
crecimiento tanto de E. Coli como de S Aureus, con los cambios de temperatura a
las que se expuso los cultivos, y también en el tiempo de exposición su crecimiento
disminuye en las dos cepas a mayor temperatura, pero la reducción de crecimiento
es poca. Por otro lado también se evidencio que los cultivos tuvieron resistencia a la
temperatura, con este fenómeno se dio puesto que la e-coli es una gram negativa
Y S-aureus es una gram positiva por lo tanto , tienen diferentes componentes en la
pared celular lo cual les confiere resistencia a altas temperaturas, en este caso,
también se observó que la temperatura de 80°C no fue lo suficiente alta para
eliminar en totalidad a los microorganismos, puede ser debido al tiempo de
exposición o falta de aumentar la temperatura, para ello se debe aumentar la
temperatura y tiempo de exposición para lograr una erradicación completa de los
microorganismos. La observación se determinó a las 96 horas.
En los cultivos podemos observar que solo creció B cereus y no Aureus, sin
embargo, al analizar la placa de petri se puede observar que sí creció, fue una
contaminación en el agar con B cereus, esto se pudo presentar por el mal uso de un
hisopo, o alguna contaminante en el baño maría o muchos más factores que
pudieron haber influido en esta contaminación incluso pudo ser ocasionado por un
mal protocolo. [14]
Cambio en el pH
En la prueba de cambios en el pH, se puede observar el crecimiento en caldo
nutritivo de Escherichia coli a diferentes valores de pH, indicado por la turbidez en
los tubos de ensayo. A pH 5, 7 y 9, valores cercanos a la neutralidad, se evidenció
turbidez en los tubos de ensayo, lo cual indica crecimiento bacteriano, por el
contrario, a pH 3 y 11, no se observó crecimiento. Esto se debe a que esta bacteria
crece en un amplio rango de pH (4.4 - 10.0), por lo cual, valores de pH muy ácidos o
básicos como 3 y 11, respectivamente, no son favorables para su proliferación [6].
Por otra parte, el crecimiento de Staphylococcus aureus se observó a pH 5 y 7
principalmente, ya que, a pH 9 también hubo crecimiento, pero no tan evidente. Esta
bacteria crece a rangos de pH entre 4,2 y 9,3, lo cual explica porqué no creció a pH
3 y 11 [7].
Las modificaciones en el pH son una técnica de control de microorganismos, en este
caso, de bacterias; la mayoría de las bacterias son neutrófilos, es decir, crecen
óptimamente a un pH cercano a 7. El pH extremo afecta la estructura de todas las
macromoléculas, siendo las proteínas los componentes más sensibles a estas
variaciones. Cambios moderados en el pH modifican la ionización de los grupos
funcionales de aminoácidos e interrumpen los enlaces de hidrógeno, lo que a su vez
promueve cambios en el plegamiento de la molécula, promoviendo la
desnaturalización y destruyendo la actividad. Además, a pH alto los enlaces de
hidrógeno que mantienen unidas las cadenas de ADN se rompen y los lípidos son
hidrolizados [3].
Variaciones en el pH también afectan la producción de energía, ya que, la fuerza
motriz protónica responsable de la producción de ATP en la respiración celular
depende del gradiente de concentración de H+ a través de la membrana plasmática,
y si los iones H+ son neutralizados por iones hidróxido, el gradiente de concentración
colapsa y perjudica la producción de energía [3].
Acción de los antibióticos
Para probar la acción de los antibióticos se realizó un antibiograma, el cual es una
prueba microbiológica para determinar, en este caso de manera cualitativa, la
susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria (Escherichia coli y
Staphylococcus aureus) a un grupo de antibióticos (penicilina, gentamicina,
tetraciclina y cloranfenicol). La formación del halo de inhibición alrededor del disco
impregnado con el antibiótico indica sensibilidad de la bacteria; cada antibiótico
tiene su halo de inhibición específico y este depende del tamaño de la molécula del
antibiótico y su polaridad [8].
Para la gentamicina, tanto Staphylococcus aureus como Escherichia formaron halo
de inhibición alrededor del disco, lo cual indica que son sensibles a este antibiótico.
Mediante transporte activo, la gentamicina atraviesa la membrana celular de las
bacterias susceptibles y se une de manera irreversible a las subunidades
ribosomales 30S, impidiendo el inicio de la síntesis proteica y provocando la muerte
celular [9].
Asimismo, ambas bacterias son sensibles a cloranfenicol, ya que ambas formaron
halo de inhibición, sin embargo, el halo formado por Staphylococcus aureus es de
mayor tamaño que el de Escherichia coli, lo cual permite deducir que S. aureus es
más sensible a este antibiótico. El cloranfenicol es bacteriostático, sin embargo, a
altas concentraciones o en casos de cepas muy susceptibles, puede ser bactericida.
Se difunde a través de la membrana celular de las bacterias, se une a la subunidad
50S del ribosoma 70S, inhibe la peptidiltransferasa y la unión del RNA de
transferencia completo al ribosoma, impidiendo la formación de péptidos y la
síntesis proteica [10].
Al igual que para cloranfenicol, Escherichia coli y Staphylococcus aureus son
sensibles a tetraciclina, siendo más susceptible esta última, ya que, el halo de
inhibición formado alrededor del disco impregnado con el antibiótico es de mayor
tamaño. Este grupo de antibióticos (tetraciclinas) tiene acción bacteriostática;
inhiben la síntesis de proteínas mediante la unión a la subunidad 30S del ribosoma,
lo que bloquea la adherencia del RNA de transferencia (tRNA), evitando que se
puedan agregar más aminoácidos a la cadena proteica que se está sintetizando [5].
En la prueba con penicilina, Staphylococcus aureus formó halo de inhibición,
indicando sensibilidad a este antibiótico, por el contrario, Escherichia coli fue
resistente. Este antibiótico hace parte del grupo de los betalactámicos, compuestos
bactericidas que interfieren en las fases finales de la síntesis del peptidoglicano,
componente esencial en la formación de la pared bacteriana [11]. Se ha demostrado
que algunas cepas bacterianas de Escherichia coli son resistentes a este grupo de
antibióticos [12,13]. Uno de los principales mecanismos de resistencia es la
hidrólisis enzimática producida por enzimas llamadas betalactamasas, las cuales
hidrolizan el enlace amida del núcleo betalactámico, inactivando de esta manera el
antibiótico antes de que genere cualquier efecto [11].
CONCLUSIONES
1. Para el control de microorganismos se dispone con diferentes técnicas, cada una
de ellas aplicable en la industria farmacéutica, ya que resultan efectivas frente a los
microorganismos que más presentan inconvenientes para la salud humana.
2. Se evidenciaron pruebas como de agentes químicos, antibióticos y luz ultravioleta
donde el control de microorganismo y su inhibición fue muy efectivo, pero así mismo
se puede identificar que los microorganismo en otras pruebas de control se
mostraron muy resistentes a distintos cambios.
3. En la prueba de acción antibióticos se puede observar la eficacia de
diferentes antibióticos sobre algún microorganismo en específico lo que va
permitir realizar un tratamiento adecuado y oportuno, con el fin de mitigar el
crecimiento y no generar posibles resistencias.
4. El efecto de la luz ultravioleta sobre el crecimiento de los
microorganismos, fue uno de los más efectivos observándose que en las bacterias
puestas a prueba se presentó alta vulnerabilidad para ser inhibidos por este
método.
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