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OCDE/OCDE 403
Adoptado:
7 de septiembre de 2009

DIRECTRICES DE LA OCDE PARA LAS PRUEBAS DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Toxicidad aguda por inhalación

INTRODUCCIÓN

Las Directrices de la OCDE se revisan periódicamente a la luz del progreso científico, 1. las necesidades
regulatorias cambiantes y las consideraciones de bienestar animal. La directriz de prueba 403 de inhalación aguda original
se adoptó en 1981. Esta directriz de prueba 403 revisada (TG 403) (1) se ha diseñado para ser más flexible, reducir el uso
de animales y satisfacer las necesidades reglamentarias. El TG 403 revisado presenta dos tipos de estudio: un protocolo
LC50 tradicional y un protocolo de concentración x tiempo (C xt). Las características principales de esta guía de prueba son
la capacidad de proporcionar una relación concentración­respuesta que va desde resultados no letales hasta resultados
letales para derivar una concentración letal media (LC50), una concentración umbral no letal (por ejemplo, LC01) y una
pendiente, y para identificar una posible susceptibilidad sexual. El protocolo C xt debe utilizarse cuando exista una
necesidad reglamentaria o científica específica que requiera la realización de pruebas en animales durante períodos de
tiempo múltiples, como por ejemplo para fines de planificación de respuesta a emergencias (por ejemplo , derivación de
niveles guía de exposición aguda (AEGL), planificación de respuesta a emergencias Directrices (ERPG), o valores de
niveles de umbral de exposición aguda (AETL), o para la planificación del uso del suelo.

2. Puede encontrar orientación sobre la realización e interpretación de los estudios TG 403 en la Guía
Documento sobre pruebas de toxicidad aguda por inhalación (GD 39) (2).

3. Las definiciones utilizadas en el contexto de esta Directriz se proporcionan en GD 39 (2).

4. Esta guía de prueba permite la caracterización de artículos de prueba y la evaluación cuantitativa de riesgos, y
permite que los artículos de prueba se clasifiquen de acuerdo con el Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y
Etiquetado de Productos Químicos (GHS) de las Naciones Unidas (ONU) (3). GD 39 (2) proporciona orientación en la
selección de la guía de prueba adecuada para pruebas agudas. Cuando solo se requiere información sobre clasificación y
etiquetado, generalmente se recomienda la Guía de prueba 436 (4) [ver GD 39 (2)]. La directriz de prueba 403 no está
destinada específicamente a la prueba de materiales especializados, como materiales isométricos o fibrosos poco solubles
o nanomateriales fabricados.

CONSIDERACIONES INICIALES

Antes de considerar la posibilidad de realizar pruebas de acuerdo con estas Directrices de prueba, el laboratorio
de pruebas debe considerar toda la información disponible 5. sobre el artículo de prueba, incluidos los estudios existentes
(por ejemplo, TG 436)(4) cuyos datos respaldarían no realizar pruebas adicionales para minimizar el riesgo de animales. uso.
La información que puede ayudar en la selección de la especie, cepa, sexo, modo de exposición y concentraciones de
prueba apropiadas más apropiadas incluye la identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas del artículo de
prueba; resultados de cualquier prueba de toxicidad in vitro o in vivo ; usos previstos y potencial de exposición humana;
datos (Q)SAR disponibles y datos toxicológicos sobre sustancias estructuralmente relacionadas [ver GD 39 (2)].

6. Se debe evitar en la medida de lo posible probar artículos de prueba corrosivos y/o irritantes en concentraciones
que se espera que causen dolor y/o malestar intenso. El potencial corrosivo/irritante debe evaluarse mediante el juicio de
expertos utilizando evidencia como la experiencia humana y animal (p. ej.

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Usted es libre de utilizar este material para fines personales y no comerciales sin solicitar el consentimiento previo
de la OCDE, siempre que se mencione debidamente la fuente. Cualquier uso comercial de este material está
sujeto a la autorización por escrito de la OCDE.
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de estudios de dosis repetidas realizados en concentraciones no corrosivas/irritantes), datos in vitro existentes (p. ej.
de las TG 430 (5), 431 (6) o 435 (7)), valores de pH, información de sustancias similares o cualquier otro dato pertinente, con
el fin de investigar si se pueden prescindir de realizar más pruebas. Para necesidades regulatorias específicas (por ejemplo,
para fines de planificación de emergencias), el TG 403 puede usarse para exponer animales a estos materiales porque
proporciona al director del estudio o al investigador principal control sobre la selección de las concentraciones objetivo. Sin
embargo, las concentraciones objetivo no deben inducir efectos corrosivos o de irritación graves, pero sí deben ser suficientes
para extender la curva de concentración­respuesta a niveles que alcancen el objetivo reglamentario y científico de la prueba.
Estas concentraciones deben seleccionarse caso por caso y se debe proporcionar una justificación para la selección de la
concentración [ver GD 39
(2)].

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

7. Este TG 403 revisado ha sido diseñado para obtener información suficiente sobre la toxicidad aguda de un
artículo de prueba para permitir su clasificación y proporcionar datos de letalidad (por ejemplo, LC50, LC01 y pendiente) para
uno o ambos sexos, según sea necesario para evaluaciones de riesgos cuantitativos. Esta Guía ofrece dos métodos de prueba.
El primer método es un protocolo tradicional en el que se exponen grupos de animales a una concentración límite (prueba
límite) o una serie de concentraciones en un procedimiento gradual durante una duración predeterminada de normalmente 4
horas. Pueden aplicarse otras duraciones de exposición para cumplir fines regulatorios específicos. El segundo método es
un protocolo (C xt) en el que grupos de animales se exponen a una (concentración límite) o una serie de concentraciones
múltiples durante múltiples duraciones.

8. Los animales moribundos o los animales que manifiestan dolor o que muestran signos de angustia grave y
duradera deben ser sacrificados compasivamente y se consideran en la interpretación del resultado de la prueba de la misma
manera que los animales que murieron en la prueba. Los criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o
que sufren gravemente, y las orientaciones sobre el reconocimiento de una muerte predecible o inminente, son el tema del
Documento de orientación nº 19 de la OCDE sobre criterios de valoración humanitarios (8).

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Selección de especies animales.

9. Se deben utilizar animales adultos jóvenes sanos de cepas de laboratorio comúnmente utilizadas. El
La especie preferida es la rata y se debe justificar el uso de otras especies.

Preparación de animales

Las hembras deben ser nulíparas y no estar embarazadas. El día de la exposición, los animales deben ser 10.
adultos jóvenes de 8 a 12 semanas de edad, y el peso corporal debe estar dentro de ±20% del peso medio para cada sexo
de cualquier animal de la misma edad previamente expuesto. Los animales se seleccionan al azar y se marcan para su
identificación individual. Los animales se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes del inicio de la prueba para
permitir la aclimatación a las condiciones del laboratorio. Los animales también deben aclimatarse al aparato de prueba
durante un breve período antes de la prueba, ya que esto reducirá el estrés causado por la introducción al nuevo entorno.

La cría de animales

11. La temperatura de la sala de mantenimiento de animales de experimentación debe ser de 22 ± 3 °C. Lo ideal es
mantener la humedad relativa entre el 30 y el 70%, aunque esto puede no ser posible cuando se utiliza agua como vehículo.
Antes y después de la exposición, los animales generalmente deben estar enjaulados.

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en grupos por sexo y concentración, pero el número de animales por jaula no debe interferir con la observación clara de
cada animal y debe minimizar las pérdidas por canibalismo y peleas. Cuando los animales van a estar expuestos sólo con
la nariz, puede ser necesario aclimatarlos a los tubos de sujeción. Los tubos de sujeción no deben imponer a los animales
un estrés físico, térmico o de inmovilización excesivo. La restricción puede afectar criterios de valoración fisiológicos como
la temperatura corporal (hipertermia) y/o el volumen respiratorio por minuto. Si se dispone de datos genéricos que
demuestren que no se producen tales cambios en un grado apreciable, entonces no es necesaria una adaptación previa a
los tubos de retención. Los animales expuestos con todo el cuerpo a un aerosol deben alojarse individualmente durante la
exposición para evitar que filtren el aerosol de prueba a través del pelaje de sus compañeros de jaula. Se pueden utilizar
dietas convencionales y certificadas de laboratorio, excepto durante la exposición, acompañadas de un suministro ilimitado
de agua potable municipal. La iluminación debe ser artificial, siendo la secuencia 12 horas de luz/12 horas de oscuridad.

Cámaras de inhalación

12. Se deben considerar la naturaleza del artículo de prueba y el objetivo de la prueba al seleccionar una
cámara de inhalación. El modo de exposición preferido es sólo la nariz (término que incluye sólo la cabeza, sólo la nariz o
sólo el hocico). Generalmente se prefiere la exposición sólo por la nariz para estudios de aerosoles líquidos o sólidos y
para vapores que pueden condensarse para formar aerosoles. Los objetivos especiales del estudio pueden lograrse mejor
utilizando un modo de exposición de todo el cuerpo, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para garantizar
la estabilidad de la atmósfera cuando se utiliza una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales de prueba
no debe exceder el 5% del volumen de la cámara. Los principios de las técnicas de exposición de la nariz y de todo el
cuerpo y sus ventajas y desventajas particulares se describen en GD 39 (2).

CONDICIONES DE EXPOSICIÓN

Administración de concentraciones

13. Las exposiciones solo de la nariz pueden durar hasta 6 horas en ratas. Si los ratones están expuestos sólo
por la nariz, las exposiciones generalmente no deben exceder las 4 horas. Se debe proporcionar una justificación si se
necesitan estudios de mayor duración [ver GD 39 (2)]. Los animales expuestos a aerosoles en cámaras de cuerpo entero
deben alojarse individualmente para evitar la ingestión del artículo de prueba debido al aseo de sus compañeros de jaula.
La alimentación debe suspenderse durante el período de exposición. Se puede proporcionar agua durante una exposición
de todo el cuerpo.

14. Los animales se exponen al artículo de prueba en forma de gas, vapor, aerosol o una mezcla de los mismos.
El estado físico a ensayar depende de las propiedades fisicoquímicas del artículo de prueba, la concentración seleccionada
y/o la forma física más probablemente presente durante la manipulación y uso del artículo de prueba. Los artículos de
prueba higroscópicos y químicamente reactivos deben probarse en condiciones de aire seco.
Se debe tener cuidado para evitar generar concentraciones explosivas.

Distribución de tamaño de partícula

15. La medición del tamaño de las partículas debe realizarse para todos los aerosoles y para los vapores que
pueden condensarse para formar aerosoles. Para permitir la exposición de todas las regiones relevantes del tracto
respiratorio, se recomiendan aerosoles con diámetros aerodinámicos medios de masa (MMAD) que oscilan entre 1 y 4 µm
con una desviación estándar geométrica (σg) en el rango de 1,5 a 3,0 (2) (9 ) (10). Aunque se debe hacer un esfuerzo
razonable para cumplir con este estándar, se debe brindar el juicio de expertos si no se puede lograr.
Por ejemplo, los vapores metálicos pueden ser más pequeños que este estándar y las partículas cargadas, fibras y

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Los materiales higroscópicos (que aumentan de tamaño en el ambiente húmedo del tracto respiratorio) pueden exceder este estándar.

Preparación del artículo de prueba en un vehículo.

dieciséis.
Puede usarse un vehículo para generar una concentración y un tamaño de partícula apropiados del artículo de prueba en la atmósfera.
Como regla general, se debe dar preferencia al agua. El material particulado puede someterse a procesos mecánicos para lograr la distribución de
tamaño de partícula requerida; sin embargo, se debe tener cuidado de no descomponer ni alterar el artículo de prueba. En los casos en los que se crea
que los procesos mecánicos han alterado la composición del artículo de prueba (por ejemplo , temperaturas extremas debido a una molienda excesiva
debido a la fricción), la composición del artículo de prueba debe verificarse analíticamente. Se debe tener el cuidado adecuado para no contaminar el
material de prueba. No es necesario probar materiales granulares no friables que estén formulados específicamente para que no sean inhalables. Se
debe utilizar una prueba de desgaste para demostrar que no se producen partículas respirables cuando se manipula el material granular. Si una prueba
de desgaste produce artículos respirables, se debe realizar una prueba de toxicidad por inhalación.

Controlar animales

17. No es necesario un grupo de control negativo (aire) concurrente. Cuando se utiliza un vehículo que no sea agua para ayudar a generar la
atmósfera de prueba, solo se debe utilizar un grupo de control de vehículos cuando no se dispone de datos históricos de toxicidad por inhalación. Si un
estudio de toxicidad de un artículo de prueba formulado en un vehículo no revela toxicidad, se deduce que el vehículo no es tóxico en la concentración
probada; por lo tanto, no hay necesidad de un control del vehículo.

SEGUIMIENTO DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN

Flujo de aire de la cámara

18. El flujo de aire a través de la cámara debe controlarse cuidadosamente, monitorearse continuamente y registrarse al menos cada hora
durante cada exposición. El monitoreo de la concentración (o estabilidad) de la atmósfera de prueba es una medición integral de todos los parámetros
dinámicos y proporciona un medio indirecto para controlar todos los parámetros relevantes de generación de atmósfera dinámica. Se debe prestar
especial atención a evitar la reinhalación en cámaras exclusivamente nasales en los casos en que el flujo de aire a través del sistema de exposición sea
inadecuado para proporcionar un flujo dinámico de la atmósfera del artículo de prueba. Existen metodologías prescritas que se pueden utilizar para
demostrar que no se produce una nueva respiración en las condiciones de operación seleccionadas (2) (11). La concentración de oxígeno debe ser al
menos del 19% y la concentración de dióxido de carbono no debe exceder el 1%. Si hay motivos para creer que no se pueden cumplir estos estándares,
se deben medir las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono.

Temperatura de la cámara y humedad relativa.

La temperatura de la cámara debe mantenerse a 22±3°C. 19. La humedad relativa en la zona de respiración de los animales, tanto para
exposiciones de la nariz como de todo el cuerpo, debe monitorearse y registrarse al menos tres veces durante períodos de hasta 4 horas, y cada hora
para períodos más cortos. Idealmente, la humedad relativa debería mantenerse en el rango del 30 al 70%, pero esto puede ser inalcanzable (por
ejemplo , cuando se prueban formulaciones a base de agua) o no mensurable debido a la interferencia del artículo de prueba con el método de prueba.

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Artículo de prueba: concentración nominal

20. Siempre que sea posible, se debe calcular y registrar la concentración nominal de la cámara de exposición. La
concentración nominal es la masa del artículo de prueba generado dividida por el volumen total de aire que pasa a través
del sistema de cámara. La concentración nominal no se utiliza para caracterizar la exposición de los animales, pero una
comparación de la concentración nominal y la concentración real da una indicación de la eficiencia de generación del sistema
de prueba y, por lo tanto, puede usarse para descubrir problemas de generación.

Artículo de prueba: concentración real

21. La concentración real es la concentración del artículo de prueba en la zona de respiración de los animales en
una cámara de inhalación. Las concentraciones reales pueden obtenerse mediante métodos específicos (por ejemplo ,
muestreo directo, métodos de adsorción o reactivos químicos y posterior caracterización analítica) o mediante métodos no
específicos, como el análisis de filtro gravimétrico. El uso del análisis gravimétrico es aceptable sólo para aerosoles en polvo
de un solo componente o aerosoles de líquidos de baja volatilidad y debe estar respaldado por caracterizaciones específicas
del artículo de prueba previas al estudio. La concentración de aerosol en polvo multicomponente también se puede
determinar mediante análisis gravimétrico. Sin embargo, esto requiere datos analíticos que demuestren que la composición
del material en el aire es similar a la del material de partida. Si esta información no está disponible, puede ser necesario
volver a analizar el material de prueba (idealmente en su estado en el aire) a intervalos regulares durante el curso del estudio.
Para los agentes en aerosol que pueden evaporarse o sublimarse, se debe demostrar que todas las fases se recogieron
mediante el método elegido. Las concentraciones objetivo, nominal y real deben proporcionarse en el informe del estudio,
pero en los análisis estadísticos solo se utilizan las concentraciones reales para calcular los valores de concentración letal.

Si es posible, se debe utilizar un lote del artículo de prueba y la muestra de prueba se debe almacenar 22. en
condiciones que mantengan su pureza, homogeneidad y estabilidad. Antes de comenzar el estudio, debe realizarse una
caracterización del artículo de prueba, incluida su pureza y, si es técnicamente posible, la identidad y las cantidades de los
contaminantes e impurezas identificados. Esto puede demostrarse mediante, entre otros, los siguientes datos: tiempo de
retención y área relativa del pico, peso molecular de análisis de espectroscopia de masas o cromatografía de gases, u otras
estimaciones. Aunque la identidad de la muestra de prueba no es responsabilidad del laboratorio de prueba, puede ser
prudente que el laboratorio de prueba confirme la caracterización del patrocinador al menos de forma limitada (por ejemplo ,
color, naturaleza física, etc.).

La atmósfera de exposición se mantendrá tan constante como sea posible y se monitoreará 23. de manera
continua y/o intermitente dependiendo del método de análisis. Cuando se utiliza muestreo intermitente, se deben tomar
muestras de la atmósfera de la cámara al menos dos veces en un estudio de cuatro horas. Si no es posible debido a
caudales de aire limitados o bajas concentraciones, se puede recolectar una muestra durante todo el período de exposición.
Si se producen fluctuaciones marcadas entre muestras, las siguientes concentraciones analizadas deben utilizar cuatro
muestras por exposición. Las muestras de concentración de cámara individual no deben desviarse de la concentración
media en más de ±10% para gases y vapores o ±20% para aerosoles líquidos o sólidos. Se debe calcular y registrar el
tiempo hasta el equilibrio de la cámara (t95) . La duración de una exposición abarca el tiempo que se genera el artículo de
prueba y esto tiene en cuenta los tiempos necesarios para alcanzar t95. En GD 39 (2) se pueden encontrar orientaciones
para estimar t95 .

24. Para mezclas muy complejas que consisten en gases/vapores y aerosoles (por ejemplo , atmósferas de
combustión y artículos de prueba impulsados desde productos/dispositivos de uso final específicos), cada fase puede
comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación, de modo que al menos una sustancia indicadora (analito) ,
normalmente se debe seleccionar la sustancia activa principal en la formulación del producto probado, de cada fase (gas/
vapor y aerosol). Cuando el artículo de prueba es una mezcla (por ejemplo, una formulación), la concentración analítica

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debe informarse para la formulación total y no sólo para el ingrediente activo o el componente (analito). Puede encontrar
información adicional sobre las concentraciones reales en GD 39 (2).

Artículo de prueba: distribución del tamaño de partículas

25. La distribución del tamaño de las partículas de los aerosoles debería determinarse al menos dos veces durante cada
exposición de cuatro horas utilizando un impactador en cascada o un instrumento alternativo, como un medidor de partículas
aerodinámico. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obtenidos con un impactador en cascada o un instrumento
alternativo, entonces se podrá utilizar el instrumento alternativo durante todo el estudio. Se debe utilizar un segundo dispositivo,
como un filtro gravimétrico o un burbujeador/borboteador de gas, en paralelo al instrumento principal para confirmar la eficiencia
de recolección del instrumento principal. La concentración másica obtenida mediante análisis del tamaño de partículas debe
estar dentro de límites razonables de la concentración másica obtenida mediante análisis de filtro [ver GD 39 (2)]. Si se puede
demostrar la equivalencia en la fase inicial del estudio, se podrán omitir mediciones adicionales de confirmación. Por razones de
bienestar animal, se deben tomar medidas para minimizar los datos no concluyentes que puedan llevar a la necesidad de repetir
una exposición. La medición del tamaño de las partículas debe realizarse para los vapores si existe alguna posibilidad de que la
condensación del vapor pueda dar como resultado la formación de un aerosol, o si se detectan partículas en una atmósfera de
vapor con potencial para fases mixtas (ver párrafo 15).

PROCEDIMIENTO

26. A continuación se describen dos tipos de estudios: el protocolo tradicional y el protocolo C xt. Ambos protocolos
pueden incluir un estudio de observación, un estudio principal y/o una prueba límite (protocolo tradicional) o una prueba a una
concentración límite (C xt). Si se sabe que un sexo es más susceptible, el director del estudio puede optar por realizar estos
estudios utilizando únicamente el sexo susceptible. Si especies de roedores distintas de las ratas están expuestas solo por la
nariz, se pueden ajustar las duraciones máximas de exposición para minimizar la angustia específica de la especie. Antes de
comenzar, se deben considerar todos los datos disponibles para minimizar el uso de animales. Por ejemplo, los datos generados
utilizando TG 436 (4) pueden eliminar la necesidad de un estudio de avistamiento y también pueden demostrar si un sexo es
más susceptible [ver GD 39 (2)].

PR OT OCOLO TRADICIONAL:

Consideraciones generales: Protocolo tradicional

27. En un estudio tradicional, se exponen grupos de animales a un artículo de prueba durante un período de tiempo fijo
(generalmente 4 horas) en una cámara de exposición de la nariz o de todo el cuerpo. Los animales se exponen a una
concentración límite (prueba límite) o a al menos tres concentraciones en un procedimiento gradual (estudio principal). Un
estudio preliminar puede preceder a un estudio principal a menos que ya exista alguna información sobre el artículo de prueba,
como un estudio TG 436 realizado previamente [ver GD 39 (2)].

Estudio de avistamiento: protocolo tradicional

28. Se utiliza un estudio de avistamiento para estimar la potencia del artículo de prueba, identificar diferencias de sexo
en la susceptibilidad y ayudar a seleccionar los niveles de concentración de exposición para el estudio principal o la prueba límite.
Al seleccionar los niveles de concentración para el estudio de observación, se debe utilizar toda la información disponible,
incluidos los datos (Q)SAR disponibles y los datos de sustancias químicas similares. No deben exponerse más de tres machos
y tres hembras en cada concentración (pueden ser necesarios tres animales por sexo para establecer una diferencia de sexo).
Un estudio de avistamiento puede consistir en una única concentración, pero se pueden probar más concentraciones si es
necesario. Un estudio de avistamiento no debería probar tantos animales y concentraciones que

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se parece a un estudio principal. Se puede utilizar un estudio TG 436 (4) realizado previamente en lugar de un estudio de
observación [ver GD 39 (2)].

Prueba de límite: protocolo tradicional

29. Se utiliza una prueba límite cuando se sabe o se espera que el artículo de prueba sea prácticamente no tóxico, es decir ,
provocando una respuesta tóxica sólo por encima del límite de concentración reglamentario. En una prueba límite, un solo
grupo de tres hombres y tres mujeres se expone al artículo de prueba en una concentración límite. Se puede obtener
información sobre la toxicidad del material de prueba a partir del conocimiento sobre compuestos probados similares o
mezclas o productos probados similares, tomando en consideración la identidad y el porcentaje de los componentes que se
sabe que tienen importancia toxicológica. En aquellas situaciones en las que hay poca o ninguna información sobre su
toxicidad, o se espera que el material de prueba sea tóxico, se debe realizar la prueba principal.

La selección de concentraciones límite suele depender de requisitos reglamentarios. Cuando los 30.
Cuando se utiliza el sistema de clasificación GHS, las concentraciones límite para gases, vapores y aerosoles son 20000
ppm, 20 mg/L y 5 mg/L, respectivamente (o la concentración máxima alcanzable) (3). Puede resultar técnicamente un
desafío generar concentraciones límite de algunos artículos de prueba, especialmente en forma de vapores y aerosoles. Al
probar aerosoles, el objetivo principal debe ser lograr un tamaño de partícula respirable (MMAD de 1 a 4 µm). Esto es posible
con la mayoría de los artículos de prueba a una concentración de 2 mg/L. Sólo se deben intentar pruebas de aerosoles a
más de 2 mg/L si se puede alcanzar un tamaño de partícula respirable.
[ver GD 39 (2)]. GHS desaconseja realizar pruebas que excedan una concentración límite por razones de bienestar animal
(3). La concentración límite solo debe considerarse cuando exista una gran probabilidad de que los resultados de dicha
prueba tengan relevancia directa para la protección de la salud humana (3), y se deberá proporcionar una justificación en el
informe del estudio. En el caso de artículos de prueba potencialmente explosivos, se debe tener cuidado para evitar
condiciones favorables para una explosión. Para evitar el uso innecesario de animales, se debe realizar una prueba sin
animales antes de la prueba límite para garantizar que se puedan alcanzar las condiciones de la cámara para una prueba
límite.

31. Si se observa mortalidad o moribundancia en la concentración límite, los resultados de la prueba límite pueden
servir como un estudio de observación para pruebas adicionales en otras concentraciones (ver estudio principal). Si las
propiedades físicas o químicas de un artículo de prueba hacen imposible alcanzar una concentración límite, se debe probar
la concentración máxima alcanzable. Si se produce menos del 50% de letalidad en la concentración máxima alcanzable, no
son necesarias más pruebas. Si no se pudo alcanzar la concentración límite, el informe del estudio debe proporcionar una
explicación y datos que lo respalden. Si la concentración máxima alcanzable de un vapor no provoca toxicidad, puede ser
necesario generar el artículo de prueba como un aerosol líquido.

Estudio principal: Protocolo tradicional

32. Normalmente, un estudio principal se realiza utilizando cinco machos y cinco hembras (o cinco animales del sexo
susceptible, si se conoce) por nivel de concentración, con al menos tres niveles de concentración. Deben utilizarse niveles
de concentración suficientes para obtener un análisis estadístico sólido. El intervalo de tiempo entre los grupos de exposición
está determinado por la aparición, duración y gravedad de los signos tóxicos. La exposición de los animales al siguiente
nivel de concentración debe retrasarse hasta que haya una confianza razonable en la supervivencia de los animales
previamente sometidos a pruebas. Esto permite al director del estudio ajustar la concentración objetivo para el siguiente
grupo de exposición. Debido a la dependencia de tecnologías sofisticadas, esto puede no siempre ser práctico en los
estudios de inhalación, por lo que la exposición de los animales al siguiente nivel de concentración debe basarse en la
experiencia previa y el juicio científico. Al ensayar mezclas se debe consultar la norma GD 39 (2).

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CONCE NT R ACIÓN X TIEMPO (CXT ) PR OT OCOLO

Consideraciones generales: protocolo C xt

33. Se puede considerar un estudio gradual de C xt como alternativa al protocolo tradicional al evaluar la toxicidad por inhalación
(12) (13) (14). Este enfoque permite que los animales estén expuestos a un artículo de prueba en varios niveles de concentración y
durante múltiples periodos de tiempo. Todas las pruebas se realizan en una cámara exclusiva para la nariz (las cámaras para todo
el cuerpo no son prácticas para este protocolo). Un diagrama de flujo en el Anexo 1 ilustra este protocolo. Un análisis de simulación
ha demostrado que el protocolo tradicional y el protocolo C xt son capaces de producir valores de LC50 sólidos , pero el protocolo
C xt generalmente es mejor para producir valores de LC01 y LC10 sólidos (15).

34. Un análisis de simulación ha demostrado que utilizar dos animales por intervalo C xt (uno por sexo utilizando ambos sexos, o
dos del sexo más susceptible) puede ser generalmente adecuado cuando se prueban 4 concentraciones y 5 duraciones de
exposición en un estudio principal. En algunas circunstancias, el director del estudio puede optar por utilizar dos ratas por sexo por
intervalo C xt (15). El uso de 2 animales por sexo por concentración y momento puede reducir el sesgo y la variabilidad de las
estimaciones, aumentar la tasa de éxito de las estimaciones y mejorar la cobertura del intervalo de confianza. Sin embargo, en caso
de que los datos para la estimación no se ajusten lo suficiente (cuando se utiliza un animal por sexo o dos animales del sexo más
susceptible), también puede ser suficiente una quinta concentración de exposición. En GD 39 (2) se pueden encontrar más
indicaciones sobre el número de animales y las concentraciones que se utilizarán en un estudio de C xt.

Estudio de avistamiento: protocolo C xt

35. Se utiliza un estudio de observación para estimar la potencia del artículo de prueba y ayudar a seleccionar los niveles de
concentración de exposición para el estudio principal. Puede ser necesario realizar un estudio de avistamiento con hasta tres
animales/sexo/concentración [para más detalles, consulte el Apéndice III del GD 39 (2)] para elegir una concentración inicial
adecuada para el estudio principal y minimizar el número de animales utilizados. Puede ser necesario utilizar tres animales por sexo
para establecer una diferencia de sexo. Estos animales deben estar expuestos durante un tiempo único, generalmente 240 min. La
viabilidad de generar atmósferas de prueba adecuadas debe evaluarse durante pruebas técnicas previas sin animales. Generalmente
no es necesario realizar un estudio de avistamiento si se dispone de datos de mortalidad procedentes de un estudio TG 436 (4). Al
seleccionar la concentración objetivo inicial en un estudio de TG 403, el director del estudio debe considerar los patrones de
mortalidad observados en cualquier estudio de TG 436 disponible (4) para ambos sexos y para todas las concentraciones analizadas
[ver GD 39 (2)].

Concentración inicial: protocolo C xt

36. La concentración inicial (Sesión de exposición I) (Anexo 1) será una concentración límite o una concentración
seleccionada por el director del estudio con base en el estudio de avistamiento. Grupos de 1 animal/sexo
están expuestos a esta concentración durante períodos múltiples (por ejemplo , 15, 30, 60, 120 o 240 minutos), lo que da como
resultado un número total de 10 animales (llamado Sesión de Exposición I) (Anexo 1).

37. La selección de concentraciones límite suele depender de requisitos reglamentarios. Cuando se utiliza el sistema de
clasificación GHS, las concentraciones límite para gases, vapores y aerosoles son 20000 ppm, 20 mg/L y 5 mg/L, respectivamente
(o la concentración máxima alcanzable) (3). Puede resultar técnicamente un desafío generar concentraciones límite de algunos
artículos de prueba, especialmente en forma de vapores y aerosoles. Al probar aerosoles, el objetivo debe ser lograr un tamaño de
partícula respirable (es decir, un MMAD de 1 a 4 µm) a una concentración límite de 2 mg/L. Esto es posible con la mayoría de los
artículos de prueba. Pruebas de aerosoles

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OCDE/OCDE 403

a más de 2 mg/L sólo debe intentarse si se puede alcanzar un tamaño de partícula respirable [ver GD 39 (2)]. El GHS
desaconseja realizar pruebas que superen una concentración límite por razones de bienestar animal (3).
La realización de pruebas por encima de la concentración límite solo debe considerarse cuando exista una gran
probabilidad de que los resultados de dicha prueba tengan relevancia directa para la protección de la salud humana
(3); la justificación debe incluirse en el informe del estudio. En el caso de artículos de prueba potencialmente explosivos,
se debe tener cuidado para evitar condiciones favorables para una explosión. Para evitar el uso innecesario de
animales, se debe realizar una prueba sin animales antes de realizar la prueba con la concentración inicial para
garantizar que se puedan alcanzar las condiciones de la cámara para esta concentración.

38. Si se observa mortalidad o moribundancia en la concentración inicial, los resultados en esta concentración
pueden servir como punto de partida para pruebas adicionales en otras concentraciones (ver estudio principal).
Cuando las propiedades físicas o químicas de un artículo de prueba hagan imposible alcanzar una concentración límite,
se debe probar la concentración máxima alcanzable. Si se produce menos del 50% de letalidad en la concentración
máxima alcanzable, no son necesarias más pruebas. Si no se pudo alcanzar la concentración límite, el informe del
estudio debe proporcionar una explicación y datos que lo respalden. Si la concentración máxima alcanzable de un
vapor no provoca toxicidad, puede ser necesario generar el artículo de prueba como un aerosol líquido.

Estudio principal: protocolo C xt

39. La concentración inicial (Sesión de exposición I) (Anexo 1) probada en el estudio principal será una
concentración límite o una concentración seleccionada por el director del estudio con base en el estudio de avistamiento.
Si se ha observado mortalidad durante o después de la Sesión de Exposición I, la exposición mínima (C xt) que resulta
en mortalidad se tomará como guía para establecer la concentración y los períodos de exposición para la Sesión de
Exposición II. Cada sesión de exposición posterior dependerá de la sesión anterior (ver Anexo 1).

40. Para muchos artículos de prueba, los resultados obtenidos en la concentración inicial, junto con tres sesiones
de exposición adicionales con una cuadrícula de tiempo más pequeña (es decir, el espaciado geométrico de los
períodos de exposición indicado por el factor entre períodos sucesivos, generalmente √2), serán suficientes para
establecer la relación C xt mortalidad (16), pero puede haber algún beneficio al usar una quinta concentración de
exposición [ver Anexo 1 y GD 39 (2)]. Para el tratamiento matemático de los resultados del protocolo C xt, ver Anexo
1.

OBSERVACIONES

Los animales deben ser observados clínicamente con frecuencia durante el período de exposición. 41.
Después de la exposición, se deberán realizar observaciones clínicas al menos dos veces el día de la exposición, o
con mayor frecuencia cuando lo indique la respuesta de los animales al tratamiento, y al menos una vez al día
posteriormente durante un total de 14 días. La duración del período de observación no es fija, pero debe estar
determinada por la naturaleza y el momento de aparición de los signos clínicos y la duración del período de
recuperación. Los momentos en que aparecen y desaparecen los signos de toxicidad son importantes, especialmente
si existe una tendencia a que los signos de toxicidad se retrasen. Todas las observaciones se registran sistemáticamente
y se mantienen registros individuales para cada animal. Los animales que se encuentren en estado moribundo y los
animales que muestren dolor intenso y/o signos duraderos de angustia grave deben sacrificarse de forma compasiva
por razones de bienestar animal. Al realizar exámenes de signos clínicos de toxicidad, se debe tener cuidado de que la
mala apariencia inicial y los cambios respiratorios transitorios, resultantes del procedimiento de exposición, no se
confundan con la toxicidad relacionada con el artículo de prueba que requeriría la matanza prematura de los animales.
Los principios y criterios resumidos en el Documento de orientación sobre criterios de valoración humanitarios (GD 19) deben

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403 OCDE/OCDE

tenerse en cuenta (8). Cuando se sacrifican animales por razones humanitarias o se encuentran muertos, la hora de la muerte
debe registrarse con la mayor precisión posible.

42. Las observaciones desde el lado de la jaula deben incluir cambios en la piel y el pelaje, los ojos y las membranas
mucosas, y también los sistemas respiratorio, circulatorio, autónomo y nervioso central, y la actividad somatomotora y los
patrones de comportamiento. Cuando sea posible, se debe anotar cualquier diferenciación entre efectos locales y sistémicos. Se
debe prestar atención a las observaciones de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. La medición
de la temperatura rectal puede proporcionar evidencia de bradipnea refleja o hipo/hipertermia relacionada con el tratamiento o el
confinamiento.

Pesos corporales

43 Los pesos individuales de los animales deben registrarse una vez durante el período de aclimatación, el día de la exposición
anterior a la exposición (día 0), y al menos los días 1, 3 y 7 (y semanalmente a partir de entonces), y en el momento de la muerte
o la eutanasia. si se excede el día 1. El peso corporal se reconoce como un indicador crítico de toxicidad, por lo que los animales
que exhiben una disminución sostenida de >20%, en comparación con los valores previos al estudio, deben ser monitoreados
de cerca. Los animales supervivientes se pesan y se matan humanamente al final del período posterior a la exposición.

Patología

44. Todos los animales de prueba, incluidos los que mueren durante la prueba o los que son sacrificados y retirados del
estudio por razones de bienestar animal, deben ser sometidos a una necropsia macroscópica. Si no se puede realizar la
necropsia inmediatamente después de que se descubre un animal muerto, el animal debe refrigerarse (no congelarse) a
temperaturas lo suficientemente bajas para minimizar la autólisis. Las necropsias deben realizarse lo antes posible, normalmente
en uno o dos días. Todos los cambios patológicos importantes deben registrarse para cada animal, con especial atención a
cualquier cambio en el tracto respiratorio.

45. Se pueden considerar exámenes adicionales incluidos a priori por diseño para ampliar el valor interpretativo del
estudio, como medir el peso pulmonar de las ratas supervivientes y/o proporcionar evidencia de irritación mediante un examen
microscópico del tracto respiratorio. Los órganos examinados también pueden incluir aquellos que muestran evidencia de
patología grave en animales que sobreviven 24 horas o más, y órganos que se sabe o se espera que estén afectados. El examen
microscópico de todo el tracto respiratorio puede proporcionar información útil para artículos de prueba que reaccionan con el
agua, como ácidos y artículos de prueba higroscópicos.

DATOS E INFORMES

Datos

46. Se deben proporcionar datos individuales de los animales sobre el peso corporal y los resultados de la necropsia.
Los datos de observación clínica deben resumirse en forma de tabla, mostrando para cada grupo de prueba el número de
animales utilizados, el número de animales que presentan signos específicos de toxicidad, el número de animales encontrados
muertos durante la prueba o sacrificados por razones humanitarias, el momento de la muerte de animales individuales, una
descripción y evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad, y hallazgos de necropsia.

Informe de prueba

47. El informe de prueba debe incluir la siguiente información, según corresponda:

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Animales de prueba y cría.

­ Descripción de las condiciones de enjaulamiento, incluyendo: número (o cambio en el número) de animales por jaula,
material de cama, temperatura ambiente y humedad relativa, fotoperiodo e identificación de la dieta;

­ Especie/cepa utilizada y justificación del uso de una especie distinta de la rata;

­ Número, edad y sexo de los animales;

­ Método de aleatorización;

­ Detalles sobre la calidad de los alimentos y el agua (incluido el tipo/fuente de dieta y la fuente de agua);

­ Descripción de cualquier acondicionamiento previo a la prueba, incluida la dieta, la cuarentena y el tratamiento para
enfermedad;

Artículo de prueba

­ Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (incluidas

isomerización);

­ Datos de identificación y número de registro del Chemical Abstract Services (CAS), si se conoce;

Vehículo

­ Justificación del uso del vehículo y justificación de la elección del vehículo (si no es agua);

­ Datos históricos o concurrentes que demuestren que el vehículo no interfiere con el

resultado del estudio;

Cámara de inhalación

­ Descripción de la cámara de inhalación, incluidas dimensiones y volumen;

­ Fuente y descripción de los equipos utilizados para la exposición de los animales así como para la generación de atmósfera;

­ Equipos para medir temperatura, humedad, tamaño de partículas y concentración real;

­ Fuente de aire y tratamiento de aire suministrado/extraído y sistema utilizado para acondicionamiento;

­ Métodos utilizados para la calibración de equipos para garantizar una atmósfera de prueba homogénea;

­ Diferencia de presión (positiva o negativa);

­ Puertos de exposición por cámara (solo nariz); ubicación de los animales en el sistema (cuerpo entero);

­ Homogeneidad/estabilidad temporal de la atmósfera de prueba;

­ Ubicación de sensores de temperatura y humedad y muestreo de atmósfera de prueba en el

cámara;

­ Tasas de flujo de aire, tasa de flujo de aire/puerto de exposición (sólo la nariz) o carga/cámara de animales (entera).
cuerpo);

­ Información sobre el equipo utilizado para medir oxígeno y dióxido de carbono, si

aplicable;

­ Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de la cámara de inhalación (t95)

­ Número de cambios de volumen por hora;

­ Dispositivos de medición (si corresponde);

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403 OCDE/OCDE

Datos de exposición

­ Justificación de la selección de la concentración objetivo en el estudio principal;

­ concentraciones nominales (masa total del artículo de prueba generado en la cámara de inhalación dividida por el volumen de
aire que pasa a través de la cámara);

­ concentraciones reales del artículo de prueba recogidas en la zona de respiración de los animales; en el caso de mezclas de
ensayo que produzcan formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), cada una podrá analizarse por separado;

­ Todas las concentraciones en el aire deben informarse en unidades de masa (por ejemplo, mg/L, mg/m3 , etc.); unidades de
el volumen (por ejemplo, ppm, ppb, etc.) también puede indicarse entre paréntesis;

­ Distribución del tamaño de partículas, diámetro aerodinámico medio de masa (MMAD) y desviación estándar geométrica (σg),
incluidos sus métodos de cálculo. Se deben informar los análisis del tamaño de partículas individuales;

Condiciónes de la prueba

­ Detalles de la preparación del artículo de prueba, incluidos detalles de cualquier procedimiento utilizado para reducir el tamaño
de las partículas de materiales sólidos o para preparar soluciones del artículo de prueba. En los casos en que los procesos
mecánicos puedan haber alterado la composición del artículo de prueba, incluir los resultados de los análisis para verificar la
composición del artículo de prueba;

­ Una descripción (preferiblemente incluyendo un diagrama) del equipo utilizado para generar la prueba.
atmósfera y exponer a los animales a la atmósfera de prueba;

­ Detalles del método analítico químico utilizado y validación del método (incluido
eficiencia de recuperación del artículo de prueba del medio de muestreo);

­ la justificación de la selección de las concentraciones de prueba;

Resultados

­ Tabulación de temperatura, humedad y flujo de aire de la cámara;

­ Tabulación de datos de concentración nominal y real de la cámara;

­ Tabulación de datos de tamaño de partículas, incluidos datos de recolección de muestras analíticas, tamaño de partículas
distribución y cálculos del MMAD y σg;

­ Tabulación de los datos de respuesta y nivel de concentración para cada animal (es decir, animales que muestran signos de
toxicidad, incluida la mortalidad, la naturaleza, la gravedad, el momento de aparición y la duración de los efectos);

­ Pesos corporales individuales de los animales recogidos en el estudio; fecha y hora de la muerte, si fue anterior a la eutanasia
programada, tiempo de aparición de los signos de toxicidad y si fueron reversibles para cada animal;

­ Hallazgos de necropsia e histopatológicos de cada animal, si están disponibles;

­ Estimaciones de letalidad (por ejemplo, LC50, LD01) , incluidos límites de confianza del 95 % y pendiente (si
proporcionado por el método de evaluación);

­ Relación estadística, incluida la estimación del exponente n (protocolo C xt). Se debe proporcionar el nombre del software
estadístico utilizado;

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Discusión e interpretación de resultados.

­ Debería hacerse especial hincapié en la descripción de los métodos utilizados para cumplir los criterios de estas
Directrices de ensayo, por ejemplo , la concentración límite o el tamaño de partícula;

­ Se debe abordar la respirabilidad de las partículas a la luz de los hallazgos generales, especialmente si no se pueden
cumplir los criterios de tamaño de las partículas;

­ Se debería proporcionar una explicación si fuera necesario sacrificar humanamente animales que sufrieran dolor o
mostraran signos de angustia grave y duradera, según los criterios del Documento de orientación de la OCDE sobre
criterios de valoración humanitarios (8);

­ Si se suspendieron las pruebas con TG 436 (4) en favor de TG 403, se deben justificar
proporcionó;

­ la coherencia de los métodos utilizados para determinar las concentraciones nominales y reales, y la relación entre la
concentración real y la concentración nominal deberían incluirse en la evaluación general del estudio;

­ Se debe determinar la causa probable de muerte y el modo de acción predominante (sistémico versus local).
Ser dirigido.

13 © OCDE, (2009)
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403 OCDE/OCDE

LITERATURA

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pruebas y evaluación sobre seguridad y salud ambiental N° 39, OCDE, París.
Disponible en: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

3. ONU (2007), Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS) de las
Naciones Unidas, ST/SG/AC.10/30, ONU Nueva York y Ginebra. Disponible en: [http://
www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]

4. OCDE (2009), Toxicidad aguda por inhalación – Método de clase tóxica aguda. Directriz de la OCDE para pruebas de
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Directriz de la OCDE para pruebas de productos químicos No. 430, OCDE, París. Disponible en: [http://www.oecd.org/
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6. OCDE (2004), Corrosión cutánea in vitro – Prueba de modelo de piel humana. Directriz de la OCDE para pruebas de
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7. OCDE (2005), Método de prueba de barrera de membrana in vitro para corrosión cutánea. Directriz de la OCDE en:
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8. OCDE (2000), Documento de orientación sobre el reconocimiento, evaluación y uso de signos clínicos como criterios de
valoración humanitarios para animales de experimentación utilizados en la evaluación de seguridad. Serie de
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9. SOT (1992), Comité Técnico de la Sección de Especialidad en Inhalación, Sociedad de Toxicología

(BORRACHÍN). Recomendaciones para la realización de pruebas de límite de inhalación aguda. Fondo. Aplica.
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10. Phalen RF (2009), Estudios de inhalación: fundamentos y técnicas. (2da edición) Información
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11. Pauluhn, J. y Thiel, A. (2007), Un enfoque simple para la validación de cámaras de inhalación de flujo dirigido únicamente
por la nariz. J. Aplica. Toxico. 27, 160­167.

12. Zwart, JHE, Arts, JM, ten Berge, WF y Appelman, LM (1992), Pruebas alternativas de toxicidad por inhalación aguda
mediante la determinación de la relación concentración­tiempo­mortalidad: comparación experimental con la prueba
estándar LC50. Reg. Toxico. Farmacéutico. 15, 278­290.

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OCDE/OCDE 403

13. Zwart, JHE, Arts, JM, Klokman­Houweling, ED y Schoen, ED (1990), Determinación de las relaciones
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16. Finney DJ (1977), Análisis Probit, 3ª ed. Cambridge University Press, Londres/Nueva York.

15 © OCDE, (2009)
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403 OCDE/OCDE

ANEXO 1

PROTOCOLO Cxt

1. Se puede considerar un estudio gradual de concentración x tiempo (C xt) como alternativa al protocolo
tradicional para evaluar la toxicidad por inhalación (12) (13) (14). Debe realizarse preferentemente cuando existe una
necesidad regulatoria o científica específica que requiere la realización de pruebas con animales durante múltiples
períodos de tiempo, como por ejemplo para la planificación de respuesta a emergencias o la planificación del uso de la
tierra. Este enfoque generalmente comienza con pruebas a una concentración límite (Sesión de exposición I) en la que
los animales se exponen a un artículo de prueba durante cinco períodos de tiempo (por ejemplo, 15, 30, 60, 120 y 240
minutos) de modo que se obtengan múltiples duraciones de tiempo. dentro de una sesión de exposición (ver Figura 1).
Cuando se utiliza el sistema de clasificación GHS, las concentraciones límite para gases, vapores y aerosoles son 20000
ppm, 20 mg/L y 5 mg/L, respectivamente. Estos niveles sólo podrán superarse si existe una necesidad reglamentaria o
científica de realizar pruebas a estos niveles (véase el párrafo 37 del texto principal del TG 403).

2. En situaciones en las que hay poca o ninguna información sobre la toxicidad de un artículo de prueba, se
debe realizar un estudio de avistamiento en el que se expongan grupos de no más de 3 animales por sexo a
concentraciones objetivo seleccionadas por el director del estudio, generalmente durante 240 min.

Si se prueba una concentración límite durante la Sesión de Exposición I y se observa menos del 50% de
mortalidad, no se necesitan pruebas adicionales. Si existe una necesidad reglamentaria o científica de establecer la
relación concentración/tiempo/respuesta a niveles superiores a la concentración límite indicada, la siguiente exposición
debe llevarse a cabo a un nivel superior, como por ejemplo al doble de la concentración límite (es decir ,
2L en la figura 1).

4. Si se observa toxicidad a la concentración límite, se necesitan pruebas adicionales (estudio principal).

Estas exposiciones adicionales se llevan a cabo a concentraciones más bajas (en la Figura 1: Sesiones de exposición
II, III o IV) o a concentraciones más altas usando duraciones más cortas (en la Figura 1: Sesiones de exposición IV)
usando duraciones que están adaptadas y no tan espaciadas.

La prueba (concentración inicial y concentraciones adicionales) se lleva a cabo utilizando 15. animal/sexo
por concentración/tiempo o con 2 animales del sexo más susceptible por concentración/tiempo. En algunas circunstancias,
el director del estudio puede optar por utilizar 2 ratas por sexo por concentración/punto de tiempo (o 4 animales del sexo
susceptible por concentración/punto de tiempo)
(15). El uso de 2 animales por sexo por concentración/punto de tiempo generalmente reduce el sesgo y la variabilidad
de las estimaciones, aumenta la tasa de éxito de la estimación y mejora la cobertura del intervalo de confianza en
relación con el protocolo como se describe aquí. Se proporcionan más detalles en GD 39 (2).

6. Lo ideal es que cada sesión de exposición se realice en un día. Esto brinda la oportunidad de retrasar la
siguiente exposición hasta que haya una confianza razonable en la supervivencia y permite al director del estudio ajustar
la concentración objetivo y las duraciones para la siguiente sesión de exposición. Se recomienda comenzar cada sesión
de exposición con el grupo que estará expuesto por más tiempo, por ejemplo, el grupo de exposición de 240 minutos,
seguido por el grupo de exposición de 120 minutos, y así sucesivamente. Si, por ejemplo, los animales del grupo de 240
minutos mueren después de 90 minutos o muestran signos graves de toxicidad (por ejemplo, cambios extremos en el
patrón respiratorio, como dificultad para respirar), no tendría sentido exponer a un grupo durante 120 minutos.

© OCDE, (2009) dieciséis

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OCDE/OCDE 403

minutos porque la mortalidad probablemente sería del 100%. Por tanto, el director del estudio debería seleccionar duraciones de
exposición más cortas para esa concentración (por ejemplo , 90, 65, 45, 33 y 25 minutos).

7. La concentración de la cámara debe medirse con frecuencia para determinar la concentración promedio ponderada
en el tiempo para cada duración de exposición. Siempre que sea posible, en el análisis estadístico se debe utilizar el momento de
la muerte de cada animal (en lugar de la duración de la exposición).

8. Se deben examinar los resultados de las primeras cuatro sesiones de exposición para identificar una brecha de datos
en la curva de concentración­tiempo (ver Figura 1). En caso de ajuste insuficiente, una exposición adicional (5º
concentración) se puede realizar. La concentración y la duración de la exposición para la quinta exposición deben elegirse para
cubrir esta brecha.

Todas las sesiones de exposición (incluida la primera sesión de exposición) se utilizarán para calcular la relación
concentración­tiempo­respuesta utilizando el análisis estadístico (16). Si es posible, para cada intervalo C xt, se debe utilizar la
concentración promedio ponderada en el tiempo y la duración de la exposición hasta la muerte (si la muerte ocurre durante la
exposición).

Figura 1: Ilustración hipotética de una relación concentración­tiempo­mortalidad en ratas.

Símbolos abiertos = supervivientes; símbolos cerrados = animales muertos

Triángulos = hembras; círculos = machos
Línea continua = valores de LC50 (rango 7,5­240 min) para hombres con n=1
Línea discontinua = valores de LC50 (rango 7,5­240 min) para mujeres con n=1 Líneas
de puntos = línea de valores hipotéticos de LC50 para hombres y mujeres si n hubiera sido igual a 2 (12).

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403 OCDE/OCDE

10. A continuación se muestra un ejemplo del procedimiento paso a paso:

Sesión de exposición I: prueba a la concentración límite (ver Figura 1)

a
• 1 animal/sexo por concentración/punto temporal; 10 animales en total •
Concentración objetivob = concentración límite. • Exponga
cinco grupos de animales a esta concentración objetivo durante períodos de 15, 30, 60, 120 y 240
minutos, respectivamente.

↓ Sesión de Exposición IIc – Estudio Principal

• 1 animal/sexo por concentración/punto temporal; 10 animales en total. • Exponer
d
cinco grupos de animales a una concentración más baja. (1/2L) con
duraciones de exposición ligeramente más largas (factor √2 espaciado; consulte la Figura 1).

↓ Sesión de Exposición III – Estudio Principal

• 1 animal/sexo por concentración/punto temporal; 10 animales en total. •
d
Exponer cinco grupos de animales a una concentración más baja. (1/4L) con
duraciones de exposición ligeramente más largas (factor √2 espaciado; consulte la Figura 1).

↓ Sesión de Exposición IV′ – Estudio Principal

• 1 animal/sexo por concentración/punto temporal; 10 animales en total. •
d
Exponer cinco grupos de animales a una concentración más baja. (1/8L) con
duraciones de exposición ligeramente más largas (factor √2 espaciado; consulte la Figura 1).

↓o
Sesión de Exposición IV – Estudio Principal
• 1 animal/sexo por concentración/punto temporal; 10 animales en total. •
mi
Exponer cinco grupos de animales a una concentración más alta. (2L) con
duraciones de exposición ligeramente más cortas (factor √2 espaciado; ver Figura 1).

a
Si no se dispone de información sobre la susceptibilidad sexual, se utilizarán ratas de ambos sexos, es
decir , 1 animal/sexo por concentración. Según la información existente, o si durante esta sesión de
exposición resulta evidente que un sexo es más susceptible, se utilizarán 10 animales del sexo susceptible
(2 animales por concentración/punto de tiempo) en cada nivel de concentración durante las pruebas
posteriores.

b
Cuando se utiliza el sistema de clasificación GHS, las concentraciones límite para gases, vapores y
aerosoles son 20000 ppm, 20 mg/L y 5 mg/L, respectivamente. En caso de toxicidad esperada o en base a
los resultados del estudio preliminar, se deben elegir concentraciones iniciales más bajas. En caso de
necesidades reglamentarias o científicas, se pueden utilizar concentraciones más altas.

C
Idealmente, la exposición de los animales al siguiente nivel de concentración debería retrasarse hasta que
haya una confianza razonable en la supervivencia de los animales previamente tratados.

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OCDE/OCDE 403

Esto permite al director del estudio ajustar la concentración objetivo y las duraciones para la siguiente sesión
de exposición.

d
La dosis mínima (concentración x tiempo) que provocó la mortalidad durante la prueba en la concentración
inicial (primera sesión de exposición) se tomará como guía para establecer la siguiente combinación de
concentración y duración de la exposición.
Normalmente, la concentración se reducirá dos veces (1/2 L) y los animales serán expuestos durante un nuevo
rango de tiempo con una cuadrícula más fina usando una división geométrica de los períodos de exposición
con un factor 1,4 (√2; ver referencia 12) alrededor del tiempo según el nivel mínimo de dosis letal (tiempo x
concentración) observado durante la primera exposición. En esta figura (figura 1), la mortalidad en la sesión de
Exposición I se observó por primera vez a los 15 min; las duraciones durante la sesión II se centran, por tanto,
en unos 30 min, siendo 15, 21, 30, 42 y 60 min. Después de las dos primeras exposiciones, se recomienda
encarecidamente representar los datos en una figura similar a la indicada anteriormente y comprobar si la
relación entre concentración y tiempo tiene un ángulo de 45 grados (n=1) o si la relación concentración­tiempo­
la relación de respuesta es menos pronunciada (p. ej.

n=2) o más pronunciado (por ejemplo, n =0,8). En estos últimos casos se recomienda encarecidamente adaptar
en consecuencia las siguientes concentraciones y duraciones.

mi
En ciertos casos puede ser necesario aumentar la concentración (2L) en un nuevo rango de tiempo con una
cuadrícula aún más fina utilizando una división geométrica de los períodos de exposición con un factor 1,4 (√2)
alrededor del tiempo según el nivel mínimo de concentración letal observado. durante la primera exposición.
La duración mínima de exposición debe exceder preferentemente los 5 minutos; la duración máxima de
exposición no debe exceder las 8 horas.

Tratamiento matemático de resultados para el protocolo C xt.

11. El procedimiento AC xt con 4 o 5 concentraciones de exposición y cinco duraciones producirá 20 o 25 puntos de datos, respectivamente.
Con estos puntos de datos, la relación C xt se puede calcular mediante análisis estadístico (16):

Probit (P) b ++= b En antes de Cristo En t 0 1

2 1Ecuación

donde C = concentración; t = duración de la exposición, o

norte

Respuesta = f(C t) 2Ecuación

donde norte = b1 / b2.

Usando la ecuación 1, el valor LC50 se puede calcular para un período de tiempo determinado (por ejemplo, 4 horas, 1 hora, 30 minutos o
cualquier período de tiempo dentro del rango de períodos de tiempo probados) usando P = 5 (respuesta del 50%). Tenga en cuenta que la
regla de Haber sólo es aplicable cuando n = 1. La LC01 se puede calcular usando P = 2,67.

19 © OCDE, (2009)