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Evaluación de la competencia de los analistas en un laboratorio de enseñanza

de microbiología: aplicación del índice de dispersión de Poisson (D2) y el
coeficiente de ajuste logarí...

Conference Paper · January 2011

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Susana Carnevali María Claudia Degrossi

Instituto Universitario de Ciencias de la Salud Fundación H.A. Barceló Universidad de Belgrano
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EVALUACIÓN DE LA COMPETENCIA DE LOS ANALISTAS EN UN LABORATORIO DE ENSEÑANZA DE
MICROBIOLOGÍA: APLICACIÓN DEL ÍNDICE DE DISPERSIÓN DE POISSON (D2) Y EL COEFICIENTE DE
AJUSTE LOGARÍTMICO EQUIVALENTE (G2)
S. Carnevali de Falke1, M.Wachsman2, M. Martín Flesia2, A.Martín2, C. Degrossi2
1
Cátedra de Microbiología y Parasitología General y Alimentaria, Instituto Universitario de Ciencias de la Salud,
Fundación Barceló, Larrea 770, (C1030AAP) Buenos Aires, Argentina, ascarnevali@gmail.com
2
Cátedra de Microbiología, Universidad de Belgrano, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Villanueva 1324,
(C1426BMJ) Buenos Aires, Argentina, cdebal@gmail.com
ÁREA TEMÁTICA. (Marque una opción) REQUISITOS TÉCNICOS
RESUMEN. En este trabajo se utilizó el índice de
dispersión de Poisson (D2) y el coeficiente de ajuste
logarítmico equivalente (G2) para evaluar la competencia
técnica de los analistas de un laboratorio de microbiología
de enseñanza universitaria, mediante criterios objetivos. Se
aplicaron ambas herramientas a los resultados obtenidos en
distintos momentos por los tres analistas en la realización de
recuentos de microorganismos aerobios mesófilos en agua.
Los resultados permitieron realizar la calificación de 2 de de
ellos, así como verificar los progresos del tercero,
permitiendo además facilitar la detección de problemas que
ocurren en la práctica diaria en un laboratorio.
PALABRAS CLAVE. Índice de dispersión de Poisson,
Coeficiente de ajuste logarítmico equivalente, calificación
de analistas.
1.- Introducción
Los análisis microbiológicos se aplican diariamente en el
control de calidad de materias primas, de productos
semielaborados y finales; en el control de equipos,
utensilios y/ o ambientes de trabajo; en la verificación de la
eficacia de proceso y de los puntos críticos durante una
producción, entre otras posibilidades. En todo el mundo
crecen las exigencias para los laboratorios que efectúan
dichos análisis, incluyendo los públicos y los privados, ya
que sus resultados se utilizan para verificar el cumplimiento
de normas, tanto nacionales como internacionales,
identificar al agente causal de un brote de enfermedad
transmitida por alimentos o llevar adelante una evaluación
de riesgos microbiológicos, entre otros. En este sentido, el
mayor intercambio comercial entre distintos países, es un
factor importante.
Se plantea, entonces, la necesidad de que dichos análisis
sean llevados a cabo por laboratorios que cuenten con un
sistema de calidad basado en la ISO/IEC 17025:2005
“Requerimientos generales para la competencia de los
laboratorios de ensayo y calibración”. Esta Norma se ha
convertido en una referencia importante para lograr el
aseguramiento de la calidad, la demostración de la
competencia técnica, así como la seguridad y confiabilidad
de los resultados, facilitando el intercambio internacional de
los servicios laboratoriales.
Dado que ningún laboratorio puede estar ajeno a las
VI IBEROLAB
exigencias señaladas, en los últimos años se decidió
alinear todas las prácticas del laboratorio de enseñanza de
las asignaturas Microbiología I y II, de segundo año de las
carreras de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
con los requisitos de la norma ISO/IEC 17025. De esta
manera, además de mejorar la competencia técnica del
Laboratorio, se posibilitaría que tanto los estudiantes que
cada año cursan estas asignaturas así como los alumnos –
ayudantes que en ellas colaboran, desarrollasen
competencias que les permitieran una adecuada inserción
laboral en sus futuras vidas profesionales.
La tarea se inició en el año 2008 con la implementación
de diversas herramientas que permitiesen asegurar la
calidad de los métodos microbiológicos utilizados y
pudiera concretarse su incorporación en los trabajos
prácticos de los alumnos. Entre ellas se incluyeron los
controles: ambientales (aire y superficies), calidad de agua
de reactivos, esterilidad de medios de cultivo y material de
plástico o vidrio, control de los ciclos del autoclave y
horno (físico y biológico), productividad y selectividad de
medios por el método ecométrico y cálculo de la precisión
en el recuento de coliformes totales por el Número Más
Probable, Degrossi et al (2010). Inicialmente, la mayor
parte de las actividades fueron realizadas por los docentes
de la asignatura, pero, a partir de mayo de 2010, se
incorporaron dos becarios (estudiantes de cuarto año de la
Lic. en Química) y en marzo de 2011 una estudiante de
tercer año de Farmacia, para colaborar en tiempo parcial
en las tareas rutinarias del Laboratorio de enseñanza y
preparación del material para los trabajos prácticos de
microbiología.
Se planteó como objetivo del presente trabajo la
utilización de herramientas sencillas para evaluar la
competencia técnica de los analistas que colaboran en el
laboratorio de enseñanza de microbiología, mediante
criterios objetivos, a lo largo de su entrenamiento.
2.- Materiales y métodos
2.1-Herramientas utilizadas
En una suspensión correctamente homogeneizada, la
distribución de partículas viables sigue la distribución de
Poisson. Sin embargo cuando se inoculan placas en
paralelo, la variabilidad encontrada en los resultados
puede ser que no siga una distribución de Poisson, es decir
estrictamente al azar, sino que se produzca una
1
sobredispersión. Esto indica que existen problemas en la
ejecución del procedimiento analítico, los que pueden
deberse a fallos en el desarrollo de las colonias o a
recuentos incorrectos, cuyas posibles causas, entre otros,
pueden ser: homogeneización incompleta de la muestra,
falta de experiencia del técnico, descuidos del analista,
imprecisión en la medición de volúmenes, interacción entre
especies microbianas, mal funcionamiento del medio de
cultivo, problemas con la estufa y otros equipos y también
contaminación. Utilizando el contraste de hipótesis y para
evaluar si existe sobredispersión, se puede calcular el índice
de dispersión de Poisson (D2) o el coeficiente de ajuste
logarítmico equivalente (G2). Estos índices, tienen en cuenta
la distribución aleatoria de los microorganismos entre los
replicados y siguen un patrón estadístico que es el de una
distribución chi-cuadrado ( 2), con n-1 grados de libertad.
Estos estadísticos están descriptos en las Normas ISO
14461-1 IDF 169:2005 e ISO/TR 13843:2000 y por varios
autores (Jarvis, 2008; Lightfoot y Maier, 2002) como muy
útiles para evaluar la dispersión de los resultados en los
recuentos de colonias.
C Ci
G2 2 C i ln i C i ln (1)
Vi Vi
2
Ci C 2
n n C i
D2 C i (2)
i 1
C Ci
Donde:
Ci es el número de colonias contadas en la placa i;
Vi es el volumen real utilizado en la placa i;
i es el número de la placa utilizada (i = 1, 2, ..., n);
n es el número total de placas utilizadas.
La comparación de los valores calculados para estos
estadísticos con la distribución teórica chi-cuadrado ( 2), a
una dada probabilidad y con n-1 grados de libertad, permite
aceptar o rechazar la hipótesis de la aleatoriedad, dado que
valores altos de estos índices indican que la variación es
mayor que la debida al azar, existiendo entonces
sobredispersión.
Estos estadísticos se aplicaron a los resultados obtenidos
en distintos momentos por los analistas en la realización de
recuentos de microorganismos aerobios mesófilos en agua,
para evaluar su competencia en la ejecución del
procedimiento analítico, en la realización de diluciones y en
el recuento, teniendo en cuenta que otros factores que
pudieran afectar la variabilidad de los resultados se
encontraban bajo control, ya que previamente se había
efectuado la evaluación de los medios de cultivo y reactivos
y el control de los equipos.
2.2-Esquema de trabajo, cálculo de los estadísticos y
criterios de aceptación.
2.2.1- En el mes de julio de 2010 se realizaron las
siguientes actividades para evaluar el desempeño de los
becarios (analistas A y B):
2
a) Los analistas A y B realizaron 10 veces la siembra de
una muestra de agua de reactivos, siguiendo la técnica
descripta en el método de referencia (Bacteriologycal
Analytical Manual, 2001), para el recuento de aerobios
mesófilos. Luego de la incubación, cada analista procedió
a la lectura de sus placas. Posteriormente, y luego de un
corto tiempo el analista B realizó la lectura de las placas
del analista A, mediante un recuento doble ciego. Se
pretendía evaluar, la dispersión obtenida por cada analista
al realizar la siembra y lectura de sus placas, la dispersión
entre analistas para cada muestra analizada y la
consistencia en el recuento del analista B.
b) Los datos obtenidos se procesaron en una planilla de
cálculos elaborada en Excel para Windows XP,
calculándose el parámetro D2. Se adoptaron los siguientes
criterios de aceptación, que indican con una probabilidad
del 95% que se cumple con la distribución de Poisson:
 D2 3,84 ( 2 para 1 grado de libertad), para evaluar
la dispersión entre analistas y la consistencia del recuento
del analista B.
 D2 16,92 ( 2 para 9 grado de libertad), para evaluar
la dispersión obtenida por cada analista al realizar la
siembra y lectura de sus placas.
2.2.2- En abril del 2011, luego de la incorporación de un
ayudante-alumno (analista C), se evaluó su repetibilidad
en el conteo, participando en esta experiencia los analistas
A y B. Para ello, los 3 sembraron por duplicado una
muestra de agua de reactivos (tal cual y dilución -1),
previamente inoculada, siguiendo lo establecido en el
método de referencia. El analista A realizó el recuento de
todas las placas y preparó un recuento doble ciego, en el
cual no participó, de modo que los analistas B y C
realizaran dos veces las lecturas de las placas, en corto
tiempo. Se estimó la repetibilidad para cada analista que
participó en la prueba, siguiendo el procedimiento
descripto en la norma ISO/TR 13843:2000 (Anexo B),
expresada como la desviación estándar relativa de la
repetibilidad (RSDr), tomando como criterio de aceptación
el valor indicado en la norma para RSD que es igual o
menor a 0,02 (RSD 0,02). Para estimar la
reproducibilidad en los recuentos duplicados del analista
C en comparación con el analista B de mayor experiencia,
se utilizó el parámetro D2 con un criterio de aceptación de
D2 7,81 ( 2 para 3 grados de libertad). Además se
evaluó la dispersión de los resultados de cada analista al
duplicar los recuentos, utilizando el mismo estadístico
pero con un criterio de aceptación de D2 3,84 ( 2 para 1
grado de libertad).
También durante este mes, se realizó nuevamente una
evaluación de la competencia en la ejecución del
procedimiento analítico, para los analistas A y B, para lo
cual cada uno sembró una muestra de agua de reactivos,
previamente inoculada, por quintuplicado en las
diluciones 10-2 y 10-3. Los resultados obtenidos se
analizaron a través de la determinación del coeficiente de
ajuste logarítmico equivalente (G2), que permite evaluar
no sólo la dispersión total de los resultados, sino además la Como se aprecia de los resultados de la Tabla 2, la
contribución a ella debida a: la dispersión asociada a la variación obtenida en los resultados del analista B se
siembra de los quintuplicados (repetibilidad) y a la consideró conforme dado que era menor al criterio de
preparación de las diluciones utilizadas en la inoculación aceptación empleado, en este caso (D2 16,92). Sin
(proporcionalidad). embargo el valor del índice D2 calculado, muestra que el
analista A tenía dificultades en la ejecución del
2.2.3- En mayo del 2011, se volvió a repetir la experiencia,
procedimiento analítico, por lo cual necesitaba mayor
esta vez con los analistas A y C, los cuales sembraron 5
entrenamiento.
muestras de agua por duplicado en las diluciones 10 -2 y 10-3.
Los resultados obtenidos se utilizaron para evaluar la Por otra parte, se evaluó la capacidad del analista B de
competencia en la ejecución del procedimiento analítico a reproducir los recuentos, al reiterar el conteo de las placas
través del coeficiente de ajuste logarítmico equivalente (G2). del analista A, luego de corto tiempo. Los resultados se
muestran en la Tabla 3.
3.-Resultados y discusión
Tabla 3.Índice de dispersión de Poisson (D2) para evaluar la capacidad
3.1- Primera experiencia. de recuento del analista B en un ensayo doble ciego.
Placas D2 Evaluación
Los analistas A y B, ambos becarios de la Universidad,
1 0 Conforme
colaboran en distintas actividades de la Facultad cada tarde, 2 0,76 Conforme
por lo cual sólo dedican una parte de su tiempo al 3 0,01 Conforme
laboratorio de microbiología. Sus tareas son supervisadas 4 0,02 Conforme
por una de las docentes de la asignatura, pudiendo 5 0,00 Conforme
6 0,06 Conforme
comprobar desde el comienzo una mayor motivación del 7 0,51 Conforme
analista B, respecto del analista A. Por esta causa, se 8 0,11 Conforme
desarrollaron actividades de control interno utilizando el 9 0 Conforme
índice de dispersión de Poisson (D2), de modo de evaluar si 10 0,01 Conforme
ambos analistas eran competentes en la ejecución del No se encontraron diferencias significativas, dado que el
procedimiento analítico o si necesitaban mayor índice de dispersión calculado (D2) resultó menor al
entrenamiento. Para ello se analizaron los datos de la criterio de aceptación empleado, en este caso (D2 3.84),
primera experiencia llevada a cabo en julio de 2010, de los por lo que el analista B demostró su idoneidad en ello, al
cuales se obtuvieron los resultados que se muestran en las contar de forma equivalente al analista A.
Tablas 1, 2 y 3.
3.2- Segunda experiencia.
Tabla 1.Índice de dispersión de Poisson (D2) para evaluar la variación
obtenida entre los dos analistas al analizar la misma muestra de agua para En esta ocasión se evaluaron los avances en el
el recuento de aerobios mesófilos.
entrenamiento del analista A y la competencia del analista
C en efectuar recuentos, incorporado recientemente como
Muestras D2 (entre analistas) Evaluación
alumno- ayudante en la Cátedra, comparándolo con el
1 9,00 No Conforme
2 4,89 No Conforme analista B. Los resultados se muestran en las Tablas 4, 5 y
3 7,92 No Conforme 6.
4 9,38 No Conforme
Tabla 4. Coeficiente de ajuste logarítmico equivalente (G2) para evaluar
5 16,46 No Conforme
la ejecución del procedimiento analítico y la proporcionalidad en las
6 2,78 Conforme
7 10,29 No Conforme diluciones de los analistas A y B.
8 0,03 Conforme G2 Dilución G2 Dilución G2 entre
Analista G2 Total
9 0,12 Conforme 10-2 10-3 diluciones
10 0,09 Conforme A 4.18 1.53 0.73 1.92
B 3.02 0.41 0.49 2.12
Dado que se observaron 6 resultados no conformes de Como se aprecia de los resultados obtenidos, el analista
acuerdo al criterio de aceptación empleado (D2 3,84), se B mantiene su buen desempeño y el analista A, lo mejoró
calculó el D2 , pero esta vez de cada analista, de modo de notablemente. Si bien el G2 total resultó menor al criterio
evaluar cuál de los dos tenía problemas en la siembra y establecido (G2 total 16,92) y no era necesario
recuento de colonias. De este modo se midió la dispersion descomponer la variación total en sus tres componentes:
total de los resultados obtenidos al ejecutar el procedimiento las diferencias entre las placas paralelas de las diluciones
analítico. 10-2 y 10-3 y la diferencia entre los niveles de dilución,
Tabla 2.Índice de dispersión de Poisson (D2) para evaluar la variación favoreció la evaluación del avance logrado, mediante la
obtenida por cada uno de los analistas al analizar la misma muestra de agua observación que el analista podía realizar correctamente la
para el recuento de aerobios mesófilos.
siembra, diluciones y recuento de las colonias en la
Analista D2 Evaluación muestra analizada.
A 53,02 No Conforme
B 11,82 Conforme

3
Tabla 5.Estimación de la repetibilidad (RSDr) alcanzada por los analistas entrenamiento, calificar al analista A y a su vez mostrar
B y C al repetir los recuentos en un ensayo doble ciego.
los avances del analista C, luego de su entrenamiento. Los
Analista RSDr Evaluación resultados se muestran en la Tabla 7.
B 0,02 Conforme Tabla 7. Coeficiente de ajuste logarítmico equivalente (G2) para evaluar
la ejecución del procedimiento analítico y la proporcionalidad en las
C 0,14 No Conforme diluciones de los analistaa A y C.
G2 G2 G2 entre
El resultado del analista C no cumple con el criterio de G2
Analista Muestra Dilución Dilución diluciones
Total
aceptación para la repetibilidad en los recuentos (RSDr 10-2 10-3
0,02). Se prosiguió con el análisis a través del índice de 1 0,39 0,02 0,07 0,30
2 0,08 0,01 0,02 0,05
dispersión de Poisson (D2), para evaluar la reproducibilidad A 3 0,33 0,02 0,13 0,18
en los recuentos obtenidos por el analista C comparado con 4 0,06 0,01 0,01 0,04
el analista B de mayor experiencia y buen desempeño, 5 0,38 0,01 0,06 0,30
cuyos resultados se muestran a continuación. 1 2,17 0,17 1,86 0,68
2 5,87 0,12 0,11 5,65
Tabla 6.Índice de dispersión de Poisson (D2) para evaluar la
C 3 0,39 0,01 0,37 0,01
reproducibilidad en el recuento del analista C respecto al analista B.
4 4,47 0,01 0,07 4,39
Placa leída Valor D2 Evaluación 5 0,49 0,25 0,14 0,10
1 0,89 Conforme Ambos analistas mostraron un buen desempeño en la
2 11,78 No Conforme
3 1,50 Conforme
ejecución de la siembra de las cinco muestras.
4 0,00 Conforme
Conclusiones
5 0,03 Conforme
6 2,16 Conforme La incorporación de estas herramientas permite calificar
7 0,18 Conforme
8 1,27 Conforme o demostrar la competencia técnica de los analistas en la
9 17,32 No Conforme ejecución de un método de ensayo, y detectar problemas
10 5,47 Conforme que ocurren en la práctica diaria. Su aplicación en el
11 1,50 Conforme laboratorio, no solo forma parte del proceso de
12 2,07 Conforme
entrenamiento, aprobación del personal de nueva
De acuerdo a los resultados obtenidos, el analista C no incorporación, y evaluación constante del ya calificado,
recuenta de forma equivalente al analista B dado que para sino que empleadas periódicamente, como actividades del
las placas 2 y 9 el índice de dispersión D2 calculado es aseguramiento de calidad, permiten construir cartas de
mayor que el criterio de aceptación empleado (D2 7,81, control y brindar información útil sobre el desempeño del
para 3 grados de libertad). Por otro lado al calcular los método.
índices de dispersión individuales para cada analista el Bibliografía
analista B muestra un buen desempeño con resultados
conformes en las doce placas leídas por duplicado, mientras
que el analista C obtuvo resultados no conformes en 3 de las FDA.U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical
Manual. Chapter 3. Aerobic Plate Count.Edition 8, Revision A.
placas leídas (2, 9 y 10) observándose que tiene dificultades January 2001.
en los recuentos altos, correspondiente a dichas placas. Esto Degrossi, C., Di Risio, C., Carnevali de Falke, S., Wachsman, S.
podría deberse, según lo expresado por Lightfoot y Maier Romano, C., Domanski, A y Crubellati, R. “Estadística aplicada en
(Lightfoot y Maier, 2002) y, demostrado experimentalmente forma coordinada en la enseñanza universitaria de Química
Analítica y Microbiología” XXVIII Congreso Argentino de
según indican estos autores, a la gran variabilidad en los Química.4to.Workshop–2da.Reunión Latinoamericana de Química
recuentos que se produce cuanto mayor es el número de Medicinal, Bs. As., Argentina, 2010.
colonias en las placas, especialmente cuando se requiere una Jarvis B. Statistical Aspects of the Microbiological Examination of
interpretación subjetiva en el color o tamaño de las mismas, Foods.Academic Press; 2 ed. 2008.
y donde los analistas poco entrenados, tienden a omitir
Lightfoot, N.F; Maier, E.A. Análisis microbiológicos de alimentos y
valores extremos, repitiendo observaciones. En la muestra aguas. Directrices para el Aseguramiento de la Calidad. Editorial
analizada se observaron colonias de tamaño variable, Acribia. Zaragoza, España. 2002.
predominando las colonias muy pequeñas. Por otro lado
IRAM 301:2005 (ISO/IEC 17025:2005). Requisitos generales para la
este analista obtuvo un coeficiente de de ajuste logarítmico competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración.
equivalente total (G2) al realizar su siembra de 16,13 mucho
ISO/TR 13843:2000. Water quality-Guidance on validation of
mayor que el criterio de aceptación empleado (G2 7,81, microbiological methods.
para 3 grados de libertad). Es evidente que era necesario
ISO 14461-1/IDF 169-1:2005. Milk and milk products - Quality control
tomar acciones correctivas, reforzando su entrenamiento en in microbiological laboratories - Part 1: Analyst performance
la siembra y el recuento. assessment for colony counts.
3.3- Tercera experiencia.
El objetivo de esta experiencia fue, luego del

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