Método para concentración de aguas

Todos los pesos deben ser llenados en la hoja de cálculo de procesamiento de

aguas.

Día 1
Llenar en la hoja de cálculo
1. Para cada muestra, rotular 2 botellas de centrífuga de 250ml con los nº 1 y 2 y
registrar los pesos. Distribuir 0.5 litros de la muestra (por peso total para balancear en la
centrífuga) en las 2 botellas en campana de bioseguridad. Balancear cuando sea
necesario.
2. Centrifugar a 4000rpm durante 20 minutos 4ºC. Decantar el sobrenadante (S1) en un
recipiente limpio de 3 litros y mantener a 4ºC para usar más tarde.
3. Pesar las botellas con el pellet remanente y calcular el peso de cada pellet (nº 1 y 2)
(Peso de la botella con pellet – peso inicial de la botella).
4. Agregar 3 veces respecto al peso del pellet, solución de extracto de carne 3% en
nitrato de sodio 2M (pH 5.5) para dar una proporción 1:3 (ej agregar 3ml a 1g de pellet).
Homogeneizar y juntar los 2 volúmenes finales en una única botella de 250ml. Medir el
pH y registrarlo en la hoja de cálculo. Ajustar el pH a 5.5 (con HCl 1N).
5. Incubar por 1 hora a 4ºC con mezclado continuo en shaker a 180 rpm.
6. Centrifugar a 8300 rpm (10.000g) por 20 minutos y agregar el sobrenadante (S2)
resultante al sobrenadante 1 (S1).
7. Ajustar el pH del sobrenadante S1+S2 a 6,5-7,2 (con HCl concentrado). Medir el
volumen total.
8. Agregar al sobrenadante final (S1+S2) PEG 6000 10% (w/v) y NaCl 2% (w/v)
(precipitación de virus) (ej, agregar 100g PEG 6000 y 20g NaCl por litro de volumen
final). Homogeneizar durante unos pocos minutos a temperatura ambiente y dejar en
agitación (aproximadamente 120rpm) durante toda la noche (con 2 horas es suficiente) a
4ºC (Importante).

Día 2
9. Centrifugar a 8300rpm (modificable 9K o 10 K rpm) (10.000g) por 25 minutos a
4ºC.
10. Descartar el sobrenadante en una botella de 3 litros rotulada, teniendo la precaución
que en la botella no queden rastros de sobrenadante. Precaución: Antes de ser
descartado, el sobrenadante debe ser tratado con lavandina al 10% durante toda la
noche.
11. Resuspender el pellet en PBS 1/100 del volumen total de muestra original (pH 7.4)
(ej., 5ml por 0.5 litros). Cambiar el pH a 8.0 mediante el agregado de NaOH 0.1N.
Chequear el pH.
12. Incubar por 1 hora a temperatura ambiente con vortex ocasional.
13. Centrifugar a 8300 rpm (10.000g) por 20 minutos. El sobrenadante resultante es el
concentrado. El sobrenadante resultante es la muestra concentrada 100X.