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Desarrollo y Validación de Un Dispositivo Portátil para La Detección Rápida de Metformina en Muestras Biológicas: Una Aplicación Forense
Desarrollo y Validación de Un Dispositivo Portátil para La Detección Rápida de Metformina en Muestras Biológicas: Una Aplicación Forense
ABSTRACTO
La metformina es un fármaco antidiabético ampliamente utilizado que mejora el control glucémico al promover la disminución de la sensibilidad a la insulina de la
absorción intestinal de glucosa. Debido a su versatilidad, también se está convirtiendo en una droga de abuso que provoca toxicidad y enfermedades mortales. La
detección de metformina con los enfoques cualitativos y cuantitativos existentes requiere instrumentación compleja e intrincada, laboratorios totalmente equipados y
científicos y técnicos capacitados. De ahora en adelante, en el estudio actual, hemos desarrollado un sistema de detección de metformina basado en un dispositivo
electrónico portátil utilizando los principios básicos de la espectrofotometría. Se basa en la formación de un complejo de color verde amarillento (longitud de onda 680
nm) que implica el acoplamiento oxidativo de 3metil 2benzotiozolina hidrazona (MBTH) catalizado por hierro. El método desarrollado se ha optimizado a diferentes
pH, temperatura de reacción y tiempo de reacción y se ha demostrado que es específico, sensible y lineal en el rango de concentración de 100 a 1000 µg/ml con un
límite de detección (LOD) de 120,5 µg/ml. .
Palabras clave: Metformina, dispositivo de mano, espectrofotometría UVVisible, MBTH, detección rápida
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complicados y costosos, y generalmente requieren un entorno de laboratorio λmax para el complejo coloreado resultante se observó a 680 nm.
específico, personal capacitado especializado y equipo auxiliar para operar los Los espectros obtenidos se volvieron a trazar utilizando MS Excel para la interpretación
instrumentos. Por lo tanto, se deben desarrollar técnicas y métodos de detección de los datos.
modernos que sean convenientes de usar, rentables, prácticos, que puedan usarse Selección de longitud de onda y mecanismo de reacción.
en el campo y que den resultados sobre el terreno.29,30 Se encontró que la longitud de onda de máxima absorción (λ max) del complejo
coloreado era estable con las diferentes concentraciones de metformina y MBTH.
Este estudio pretende desarrollar un dispositivo sensible y práctico para la Este método espectrofotométrico se basa en la reacción entre los grupos amino del
detección in situ de metformina en preparados farmacéuticos y matrices biológicas clorhidrato de metformina con MBTH en presencia de eth. FeCl3 donde se observó λ
(después de tratamientos previos). El procedimiento de extracción fue investigado a 680 nm.
para el aislamiento de máximo
metformina a partir de muestras biológicas, incluidas sangre y orina. En el estudio Estabilidad del complejo de color.
actual, se ha desarrollado un dispositivo portátil rentable y cómodo de usar basado La estabilidad del producto coloreado se evaluó bajo diferentes parámetros, es
en el ensayo colorimétrico. decir, variación de temperatura, tiempo de reacción y pH.
La detección colorimétrica es una manera mejor y más fácil de evaluar los resultados
porque el cambio se puede notar fácilmente a simple vista. Optimización de los parámetros de reacción para el ensayo colorimétrico.
Por ello, se adaptó el método colorimétrico para desarrollar un dispositivo ya que Optimización de la temperatura de reacción
además ofrece otras ventajas al ser expedito e integral. Hemos utilizado un ensayo La reacción se ha optimizado a diferentes temperaturas que van desde 5 C. La
basado en colorantes que emplea 3metil 2 C en
reacción se ha realizado a 35
0 0
estos rangos de temperatura y se ha estudiado la
reactivo de benzotiozolina hidrazona (MBTH).31 Este método colorimétrico ha absorbancia y estabilidad del complejo de color.
colaborado con un dispositivo electrónico con una batería recargable incorporada. El
dispositivo consta de una cubeta de muestra, un interruptor, un detector de fotodiodo, optimización del pH
un láser, una batería, cables y algunos elementos de plástico. Se ha desarrollado un La reacción se ha optimizado a diferentes pH que van de 2 a 8 utilizando HCl 0,1
dispositivo electrónico portátil basado en colorimetría para la detección de metformina. N y NaOH. La reacción se realizó bajo estos rangos de pH mencionados y se notaron
la absorbancia y estabilidad del complejo coloreado desarrollado. Los demás
parámetros de reacción permanecen constantes.
MATERIALES Y MÉTODOS
dimetilimidodicarbonimídica) y 3 0,5 min a 4 min. La reacción se realizó en estos intervalos de tiempo de reacción
El reactivo de metil 2benzotiozolina hidrazona [MBTH] era de grado analítico y fue mencionados y se notaron la absorbancia y estabilidad del complejo coloreado
suministrado por Sisco Research Laboratories Pvt. Limitado. Ltd. Otros productos desarrollado. Los demás parámetros de reacción permanecen constantes.
químicos y reactivos eran de calidad analítica.
Procedimiento de extracción
Preparación de soluciones estándar y de trabajo. Se tomaron 300 µl de la muestra de orina/300 µg de muestra de tejido sanguíneo
Solución madre estándar de clorhidrato de metformina enriquecido en un tubo de centrifugación y se añadieron 5 ml de 1butanol:hexano
Se preparó una solución madre estándar de 1,0 mg/ml añadiendo 100 mg de (50:50, v/v) en un medio alcalino (NaOH 0,1 M).
clorhidrato de metformina en 100 ml de agua desionizada. La mezcla se agitó durante 5 minutos y luego se centrifugó durante 7 minutos a 3000
La solución se almacenó a 4o C en botellas herméticas de color ámbar. rpm seguido de retroextracción en 5 ml de ácido acético. El sobrenadante resultante
La solución de trabajo de metformina se preparó en el rango de concentración de se llevó a evaporación hasta sequedad.32
1001300 µg/ml mediante diluciones en serie.
Solución madre estándar MBTH
Protocolo de prueba
Se preparó MBTH al 0,2% (p/v) añadiendo 0,2 g de MBTH en 100 ml de agua Se tomó 1 ml de la muestra extraída que contenía el fármaco en un tubo de
desionizada. La solución se almacenó en botellas herméticas de color ámbar. ensayo, seguido de la adición de 1 ml de FeCl3 etanólico al 0,5% (p/v), luego la
mezcla se incubó durante 5 minutos. Se añadió 1 ml de MBTH al 0,2 % (p/v) a la
Cloruro férrico etanólico [eth. FeCl3] solución madre estándar al 0,5% (p/v) de solución resultante y se incubó nuevamente durante 3 minutos y se registró la
FeCl3 se preparó añadiendo 0,5 g de FeCl3 en 100 ml de etanol. La solución se absorbancia a 680 nm.
almacenó en botellas herméticas de color ámbar. estudio de interferencia
Se estudió el efecto de otros ingredientes presentes en las preparaciones
Parámetros de instrumentación y espectrofotómetro UVVisible farmacéuticas. También se prueban con el mismo método diferentes compuestos con
estructuras similares, grupos funcionales y otras categorías de fármacos
El análisis de la investigación se realizó en un espectrofotómetro UVVisible, antidiabéticos similares para comprobar la especificidad del ensayo colorimétrico.
ejecutado en un espectrofotómetro UVVisible (modelo no. Espectrofotómetro UV Diferentes compuestos con estructuras similares, grupos funcionales (como anilina y
Visible UV2600, Shimadzu, Tokio, Japón) con un rango espectral de 400 nm a 700 cisteína) y otras categorías de fármacos antidiabéticos similares (como Metco,
nm. Se utilizó para registrar el rango de espectros de 400 nm a 700 nm. Metform 500 y Galpride M1) también han experimentado con el mismo método para
comprobar la especificidad del ensayo colorimétrico. .
Se utilizó agua destilada como blanco para la corrección de la línea base.
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Precisión y exactitud
La precisión y exactitud del dispositivo desarrollado se probaron en dos
dominios distintos, es decir, evaluación "entre lotes" y "dentro de lotes".
La concentración variante de metformina se añadió a la muestra biológica
para el análisis in vitro (200 µg/ml, 400 µg/ml, 600 µg/ml, 800 µg/ml y 1000
µg/ml) y se evaluó el mismo día y después del intervalo de 1 semana. El
proceso se repitió cinco veces.
RESULTADO Y DISCUSIÓN
Figura 1. Mecanismo de reacción del ensayo colorimétrico. Espectro UVVis de diferente concentración de
Metformina metformina
2
La muestra se colocó en la cubeta (portamuestras) y luego se colocó 100 µg/ml
1.8 metformina
en la cámara formulada en el dispositivo. El LED como fuente de luz que
tiene un perfil de emisión monocromático excita los átomos del estado 1.6 500 µg/ml
metformina
fundamental al estado excitado.33,34 Emite la luz o la longitud de onda 1.4
700 µg/ml
de absorción correspondiente de la solución en cuestión. El funcionamiento 1.2
metformina
de la fuente de luz está controlado por una unidad de procesamiento de 1 800 µg/ml
aicnabrosbA
muestra horizontalmente en el plano perpendicular. Una fracción de la luz 0,6 900 µg/ml
metformina
se absorbe y el resto se transmite a través de ella.35 Un fotodiodo detecta 0,4
1100 µg/ml
la luz transmitida y la señal resultante luego se filtra y amplifica. La señal 0,2 metformina
filtrada y amplificada luego se transmite a la unidad de circuito para la 0 1200 µg/ml
conversión de analógico a digital.36 Luego, la unidad de procesamiento metformina
400 500 600 700
procesa la señal usando valores calibrados estándar para responder al 1300 µg/ml
Longitud de onda (nm)
nivel de concentración.35,37 Los resultados finales luego se muestran en
el Unidad LCD gráfica de 128×64 (ver Figura 2 y 3). Figura 4. Espectro del espectrofotómetro UVVisible a diferentes concentraciones
de metformina que muestra la formación de complejos de color.
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de metformina y MBTH se caracteriza por una banda de resonancia típica a 680 Optimización del tiempo de reacción
nm. Se observaron dos picos que explican la La reacción se ha optimizado en diferentes tiempos de reacción que van desde
formación de un producto intermedio a 630 nm como resultado de la reacción entre 0,5 min a 4 min. Se llevaron a cabo experimentos en estos intervalos de tiempo de
metformina y FeCl3 etanólico y el complejo de color final del producto intermedio y reacción mencionados y se observaron la absorbancia y estabilidad del complejo
MBTH a 680 nm (ver Figura 4). coloreado desarrollado. Los demás parámetros de reacción permanecen fijos. Se
observó que 3 minutos era el tiempo de reacción óptimo (ver Figura 5c).
permanecen fijos. Se observó que el complejo de color era estable a pH neutro, es 0,8
aicnabrosbA
decir, pH = 7 (ver Figura 5a). En el medio ácido, el color del complejo cambió
0,6
mientras que, en el medio alcalino, la mezcla se agregó y formó un precipitado de
0,4
color rojo.
0,2
0
0,5 1 2 3 4 5
pH frente a absorbancia
Tiempo de reacción (min)
C
1
Figura 5c. Optimización de los parámetros de reacción: gráfico de tiempo de reacción
0,8
versus absorbancia
0,6
aicnabrosbA
0,4
Efecto de la concentración de metformina.
0,2 La concentración de metformina se varió para observar la interacción de
0 metformina con MBTH en el rango de 100 µg/ml a 1000 µg/ml. Se observó que la
2 4 6 7 8
absorción aumenta simultáneamente con el aumento de la concentración de
pH metformina siguiendo la linealidad (Ver Figura 5d).
a
Figura 5a. Optimización de los parámetros de reacción: gráfico de pH versus
absorbancia Concentración versus absorbancia
1
Optimización de la temperatura de reacción
La reacción se ha optimizado a diferentes temperaturas que van desde 5 C. Se y = 0,0008x + 0,0259
0,8 R² = 0,9762
0 0
realizan experimentos C
enaestos
35 rangos de temperatura y se observa la absorbancia.
0
Temperatura versus absorbancia 0 500 1000 1500
1
Concentración (μg/ml)
d
0,8 Figura 5d. Optimización de los parámetros de reacción: concentración de metformina
versus absorbancia.
0,6
Estabilidad del complejo de color.
aicnabrosbA
0,4
El complejo de color verde amarillento se formó en condiciones óptimas en
presencia de metformina al reaccionar con el reactivo MBTH. Se encontró que el
0,2
color era estable en condiciones optimizadas.
0
5 10 15 20 25 30 35 estudio de interferencia
Temperatura (0°C) b Se estudió el efecto de otros ingredientes presentes en las preparaciones
farmacéuticas. Se observó que ninguno de los otros compuestos con estructura y
Figura 5b. Optimización de los parámetros de reacción: gráfico de temperatura de
grupo funcional similar podía
reacción versus absorbancia
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producir el complejo del mismo color empleando este ensayo Tabla 1 Resultados de precisión interdiaria e intradiaria para el método desarrollado
colorimétrico. También se probó metformina de diferentes
Concentración Dentro del lote Entre lotes
marcas y compañías para comprobar la interferencia (si se
(μg/ml) (n=5) (n=5)
produjo debido a diferentes ingredientes, agentes
Precisión Precisión
aglutinantes, etc.). No se observó ninguna interferencia de Media Significar
X + DE (RSD) X + DE (RSD)
los ingredientes y aglutinantes en la formación del complejo (x) (X)
(%) (%)
colorante. 0.2168 + 0.2166 +
200 0.2168 0,385 0,2166 0.526
Linealidad 0.000837 0.00114
200 0.217 4890000 921 0,9866, mientras que 'r' entre el dispositivo
portátil y la cromatografía de gases es 0,9853
300 0.261 8132400 914
(Tabla 3). Se observó que el método
400 0,31 9780000 902
desarrollado muestra un enfoque sustituto
500 0.388 12067200 895 prometedor para detectar y cuantificar la
600 0,488 12225000 886 metformina en las muestras biológicas
(después de la extracción) (Tabla 4).
700 0.524 14078400 872
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metil2benzotiozolinahidrazona.
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