Técnicas generales de laboratorio

cfgs de laboratorio clínico y biomédico

PROF:: Pilar Martínez

UT.6. Técnicas de separación e

identificación

6.1. Separación e identificación

distintas sustancias

Técnicas de identificación
Técnicas de separación

Estudiar una o varias sustancias

Permiten obtener separadamente
presentes en la muestra (analitos), con
todos o algunos de los componentes
objetivo de:
de una muestra, con objetivo de:
Identificar la presencia de la
Purificar la muestra
sustancia
Obtener una sustancia presente
Cuantificar la concentración

6.2. Técnicas de separación

Técnicas mecánicas de separación

Fase externa: componente en mayor proporción

Fase interna: componente en menor proporción

Dentro de estos sistemas distinguimos hay dos que tienen especial importancia:
suspensiones: fase externa líquida e interna sólida
emulsiones: dos líquidos inmiscibles

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Las fases de los sistemas heterogéneos se pueden separar mediante técnicas

mecánicas, como la filtración, la decantación y la centrifugación.

filtración

Torta o residuo: formado por las

partículas sólidas de mayor tamaño.

La filtración es un
método mecánico de
separación de
suspensión en función
del tamaño de las
partículas. Filtrado: que es el fluido que ha
atravesado el filtro.

El filtro es un dispositivo de material poroso que

permite el paso del líquido y retiene las partículas
cuyo diámetro es superior al del poro del filtro.

Los materiales que se emplean para filtrar son muy

variados. Podemos encontrar, entre otros, filtros de
papel, de membrana o de vidrio molido.

Filtro de papel liso y de pliegues

Los filtros de papel son muy usados porque son baratos y cómodos de usar. Como
inconvenientes podemos destacar que en ocasiones ceden fibras al filtrado. Se usan con
un embudo. Debajo del embudo se coloca un recipiente de recogida para el filtrado.

Los filtros de membrana se usan para hacer filtraciones esterilizantes. Tienen forma de
disco, están compuestos de acetato o nitrato de celulosa y se comercializan con
diferentes tamaño de poro.

Los filtros de vidrio molido o placas filtrantes están constituidas por polvo de vidrio
molido, tamizado y aglomerado, que se montan en un crisol o en un embudo filtrante. Se
presentan en una numeración referida al diámetro medio de los poros.

Con respecto a los métodos de filtración, existen distintos tipos, filtración por gravedad,
filtración a vacío y filtración esterilizante. El uso de una u otra dependerá de que
sustancia tenemos y cual queremos obtener.

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La filtración a vacío permite facilitar y acelerar la filtración con

ayuda de aplicar un vació al extremo final del embudo para obtener
un efecto de succión.

La filtración esterilizante elimina los microorganismos de líquidos

sensibles al calor y que, por tanto, no pueden esterilizante en
autoclave.

Se utilizan un tipo especial de filtros, los filtros de membrana, cuyos poros son
suficientemente pequeños para que pase el líquido pero no para los microorganismos.

La filtración se puede hacer por gravedad o con ayuda de una jeringa o con una bomba
de vacío. Dependiendo de las partículas que se deban separar, se aplica uno u otro tipo
de filtración esterilizante.

decantación

La decantación es un
método mecánico de
separación de
suspensiones o emulsiones
en función de la densidad
de sus componentes, por
acción de la gravedad

Centrifugación

La centrifugación es un
método mecánico de
separación de
suspensiones o emulsiones
gracias a la acción de la
fuerza centrífuga.

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El coeficiente de sedimentación de una partícula se calcula dividiendo su velocidad de

sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2). El resultado tiene unidades
de tiempo y se suele expresar en svedbergs (S).

Los equipos que se usan para centrifugar se llaman centrífugas o centrifugadoras.

Las centrífugas que existen en el mercado tienen

diferentes diseños: por ello es importante
conocer la fórmula que relaciona el valor de la
fuerza centrífuga relativa que se desea obtener
con la velocidad angular y el radio de giro de la
centrífuga que estamos usando.

La fórmula anterior nos permite calcular la

velocidad de rotación que se necesita para
separar componentes de una muestra en
diferentes centrífugas. Así, conociendo la FCR y el
radio de giro podemos calcular las rpm, y
conociendo el radio de giro y las rpm, la FCR.

Existen normogramas que facilitan estos

cálculos, ya que relacionan los tres parámetros.

El uso de la centrífuga

Existen distintos tipos de centrífugas,

como veremos a continuación, y cada
una tiene sus características de
funcionamiento. Pero todas ellas
disponen, al menos, de unos mandos
que nos permiten programar los
parámetros básicos de la
centrifugación:

• El tiempo de centrifugación.

• La velocidad de giro de la centrífuga

(en rpm).

Al colocar los tubos para una

centrifugación es condición
indispensable equilibrar el peso dentro
del rotor de la centrífuga.

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Sobrenadante

Pellet o
precipitado

Dependiendo del objetivo de la centrifugación, recuperamos el sobrenadante (decantándolo

o recogiéndolo con una pipeta Pasteur), el precipitado (tras separar el sobrenadante) o
ambos.

Tipos de centrífugas

Las centrífugas son un equipo estándar en la mayoría de los laboratorios biológicos, químicos
o médicos. Hay diferentes variedades, según el tipo de muestra que se quiere separar y la
velocidad de rotación. Algunas tienen sistemas de refrigeración porque la rotación produce
calentamiento y este podría alterar las muestras. Se pueden establecer distintas
clasificaciones, a partir de varios criterios.

Según la velocidad de centrifugación

Centrífugas de baja velocidad o de sobremesa

Centrífugas de alta velocidad
Ultracentrífugas.

Según el tipo de rotor

Angular o de ángulo fijo. El rotor es un bloque en el que se colocan los tubos en un ángulo
fijo. Las centrífugas con estos rotores se usan para volúmenes grandes de muestra. La
separación se produce con un doble componente, hacia el fondo y hacia el lateral del
tubo.
Flotante o basculante. El rotor, al comenzar a girar, coloca los tubos en una posición de
90º respecto del eje. Las centrífugas con estos rotores se usan para volúmenes pequeños
de muestra, puesto que el peso de los tubos aumenta mucho al girar. Existen multitud de
diseños de rotores flotantes y portatubos. La separación se produce según la altura del
tubo, es decir, los componentes más pesados se depositan en el fondo del tubo.
Vertical. El rotor es un cilindro donde se colocan los tubos en vertical. Las centrífugas con
estos rotores se usan para volúmenes grandes y centrifugaciones rápidas porque el
sedimento solo tiene que recorrer el diámetro del tubo. La separación se produce de
forma lateral, el componente más pesado se deposita en el lateral más alejado del eje del
rotor.

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Según su función

Existen en el mercado múltiples variantes en cuanto a capacidad, tamaño y velocidades, pero

se pueden diferenciar algunos tipos específicos como:

• Microcentrífugas. Son de pequeño tamaño, pero alcanzan las velocidades más altas. Algunos
modelos tienen además refrigeración. Se utilizan para volúmenes muy pequeños de muestra,
por lo que los tubos que admiten son muy pequeños (tipo Eppendorf). Se usan en biología
molecular.

• Citocentrífugas. Se usan para acelerar la sedimentación de células sobre un portaobjetos.

Gracias a la centrifugación y a la filtración se obtiene una muestra concentrada del líquido en
estudio (orina, líquido cefalorraquídeo [LCR], líquido sinovial, muestras líquidas ginecológicas,
etc.).

• Microhematocrito. Especialmente diseñadas para centrifugar a alta velocidad un capilar con

sangre total y obtener el hematocrito sanguíneo. Están en desuso.

Tipos de centrifugación

Según la cantidad de muestras y del objetivo final de la separación se pueden establecer dos
tipos de centrifugación, la analítica y la preparativa.

La analítica no se suele usar en el laboratorio clínico. Su objetivo es medir las propiedades

físicas de las partículas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentación o su
masa molecular. Las aplicaciones son:

· Averiguar la pureza de un compuesto.

· Determinar la proporción relativa de sus componentes.

· Conocer e interpretar las estructuras moleculares de diferentes compuestos presentes en

una muestra.

El otro tipo de centrifugación, la preparativa, se emplea ampliamente en el laboratorio clínico

y permite preparar o adecuar una muestra para su posterior análisis. Su objetivo es la
separación de los componentes de la mezcla, para grandes volúmenes de muestra

Existen tres tipos de centrifugación preparativa: la preparativa, la preparativa diferencial y la

preparativa en gradiente de densidad 41
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3500 rpm
5 min
gación
Centrifu
tiva
prepara
ny
cn ic a m ás comú 1500 rpm
Es la t é para
tiliz a so bre todo 10 min
se u de
entación
la sedim ina.
s e n sangre y or
célula

gación
Centrifu ncial
p arativa difere
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de
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rifug ac ión se ut
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para sep ulos
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diferent s.
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Para aplicar esta técnica se

rativa necesita un soporte fluido
u ga ción prepa
Centrif nsidad con gradiente de densidad.
ra dien te de de
en g Se trata de un soporte cuya
mite la concentración aumenta
nica per
Esta téc ios desde la zona superior hacia
a rac ión de var
sep tra
te s de la mues la inferior, es decir, que tiene
en
compon y la un gradiente de
os ellos,
o de tod as
a ció n d e medid concentración (y a mayor
realiz s. concentración, mayor
analítica
densidad).

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Aplicaciones de la centrifugación

Las centrifugaciones preparativas tienen muchas aplicaciones en los laboratorios de

análisis clínicos. Algunas de ellas son:

• Obtención de leucocitos. Se aplica una centrifugación por gradiente de

densidad zonal en la que se emplean medios comerciales formados por
mezclas de Ficoll.

• Fraccionamiento subcelular. A partir de un homogenizado tisular se

obtienen por centrifugación diferencial los diferentes componentes
celulares: células, orgánulos, macromoléculas y otros solutos.

• Obtención de suero o plasma. Aplicando a la sangre una FCR de 3.500 g

durante 10 minutos se consigue una buena separación del suero o plasma del
coágulo.

• Concentración de células. En líquidos corporales, como la orina o el

LCR, la centrifugación permite concentrar las células para su estudio.

• Extracción de biomoléculas. Se realiza una separación de fases por

centrifugación, para la posterior extracción de biomoléculas mediante
disolventes

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Técnicas difusionales de separación

Las técnicas difusionales separan los componentes de la muestra debido a la mayor

difusión de un componente desde una fase a otra.

La difusión es el movimiento de un componente a través de una mezcla debido a la

diferencia de concentraciones, de solubilidad o afinidad. Veremos a continuación las
extracciones con disolventes y la adsorción, que son técnicas con aplicaciones en los
laboratorios biomédicos.
Extracción con disolventes

La extracción con disolventes es una técnica que separa los componentes de una
mezcla aprovechando las diferencias de solubilidad de estos en un disolvente
adecuado.

En los laboratorios biomédicos se aplica con distintos objetivos:

• Extracción de lípidos. Se lleva a cabo por el método de Folch, que utiliza una mezcla
de cloroformo y metanol como disolvente. Los lípidos de la muestra se disuelven en el
cloroformo; después se elimina el cloroformo por evaporación y se recuperan los
lípidos.

• Extracción y purificación de ácidos nucleicos. La extracción de ADN genómico a partir

de sangre periférica es un ejemplo. Para hacerla se añade una solución de lisis a la
sangre, se centrifuga y se recupera la fase acuosa, que contiene el ADN. Se eliminan los
compuestos orgánicos usando una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico y
finalmente se añade etanol. Puesto que el ADN es insoluble en etanol, precipita y se
puede recuperar por centrifugación.

• Extracción de glúcidos. Varias técnicas, que suelen acabar en una cromatografía,

retiran las proteínas, ácidos nucleicos y lípidos de una muestra.

• Extracción de proteínas. Se usan técnicas de centrifugación para separar las

proteínas solubles de las unidas a membranas; seguidamente se aplican métodos
como la precipitación salina, que logra una separación de proteínas concretas
aumentando la fuerza iónica del medio.

La adsorción

La adsorción es una técnica en la cual las partículas que se desea separar son
atrapadas o retenidas en la superficie de un material adsorbente.

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