Evaluación de Pipeteo

Laboratorio de Biología Molecular

Prácticas Química Biológica Clínica
Instrucciones
Antes de empezar
1. Conecte el espectofotómetro y enciéndalo, permitiéndole realizar las pruebas y
calentar la lámpara el tiempo que lo requiera.
2. Prepare un beaker de 250 mL al lado del espectrofotómetro para ir descartando
las soluciones que vaya leyendo.
3. Ubique papel limpialentes en trozos al lado del espectrofotómetro para ir limpiando
las celdas espectrofotométricas antes de leerlas.
Primera Parte: Preparación del material
1. Prepare la solución madre del colorante que tenga a disposición. Para hacerlo,
coloque alrededor de 50 mL de agua destilada en un Erlenmeyer de 100 mL y una
gota del colorante que se le asignó.
2. Realice un espectro de barrido de la muestra (380 a 800 nm) en el
espectrofotómetro. Para hacerlo, necesitará una segunda celda
espectrofotométrica con agua destilada, para establecer el blanco.
3. Identifique el pico de máxima absorción que tuvo la solución del colorante utilizado.
a. La longitud de onda a la cual se tuvo la máxima absorción debe usarse para
el resto de la actividad.
b. Si el valor de la absorción en ese punto se encuentra por debajo de 1.8 y
por encima de 1.1, puede usar la solución como solución madre.
c. Si el valor de la absorción se encuentra por encima de 1.8, diluya la solución
madre hasta que obtenga un valor entre 1.1 y 1.8, aproximadamente, y use
la nueva dilución como solución madre.
d. Si el valor de la absorción se encuentra por debajo de 1.1, deberá añadir
una gota más del colorante y repetir el procedimiento.
Tabla 2. Información del colorante a utilizar

Color del colorante

Longitud de onda máxima

Segunda Parte: Dilución por pipeteo
1. Rotule un grupo de microtubos de 1.5 mL según la siguiente tabla.
2. Realice el pipeteo de los volúmenes correspondiente de cada reactivo a cada
microtubo.
3. Mezcle el contenido de cada microtubo.
4. Obtenga la absorbancia de la solución en cada microtubo a la longitud de onda
donde obtuvo la absorbancia máxima, determinada en la Primera Parte.
Tabla 2. Esquema de pipeteo de colorante

Volumen solución de Absorbancia a

Tubo Volumen agua
colorante __________ nm

A 1000 µL 0 µL

B 998 µL 2 µL

C 995 µL 5 µL

D 990 µL 10 µL

E 975 µL 25 µL

F 950 µL 50 µL

G 900 µL 100 µL

H 700 µL 300 µL

I 500 µL 500 µL

J 100 µL 900 µL

Tercera Parte: Evaluación del pipeteo

1. En la computadora que tiene disponible, en una hoja nueva de Excel, haga una
tabla donde se indiquen los valores de absorción obtenidos para cada una de las
soluciones, en relación con el volumen de colorante añadido.
2. Tal como se muestra en la Figura 1, seleccione las concentraciones (el volumen
de colorante añadido) y sus respectivas absorbancias (puede incluir los títulos, si
lo desea) e inserte una gráfica desde el Menú de Insertar, presionando el botón
para un tipo de gráfica. Prefiera una gráfica de Dispersión XY. El programa le
mostrará una vista previa con solamente colocar el mouse sobre la elección que
desea. Una vez insertada, acomode la gráfica al tamaño deseado.
 Elija la opción de gráfica de
dispersión XY.

Figura 1. Inserción de gráfica a partir de la curva de calibración. Elaboración propia.

3. Haga clic sobre alguno de los puntos de la serie. Asegúrese que todos los puntos
estén sobresaltados de alguna manera, y haga clic derecho. Aparecerá un menú
de opciones a realizar sobre la serie. Elija “Agregar línea de tendencia…” Se
mostrará una línea, tal como se puede observar en la Figura 2.

Figura 2. Adición de una línea de tendencia. Elaboración propia.

4. Haga clic sobre la línea desplegada en el paso anterior. Asegúrese que sea sobre
la línea, y no sobre alguno de los puntos. Aparecerá una serie de opciones en el
recuadro derecho de la pantalla. Asegúrese que la línea de tendencia sea de tipo
lineal y que esté señalizada tanto la caja con “Presentar ecuación en el gráfico…”
como la de “Presentar el valor R cuadrado en el gráfico…”
 Figura 3. Despliegue de valores de la línea de tendencia en la gráfica. Elaboración propia.

5. Reporte el valor de R2 como su coeficiente de correlación y la ecuación de la recta

de regresión resultante.
6. Repita la curva tres veces más y observe cualquier cambio en la correlación
obtenida.