Brote de quitridiomicosis en un programa de cría en
cautividad de la rana gigante chilena
(Calyptocephalella gayi): Caracterización genómica
y hallazgos patológicos.
Las enfermedades infecciosas emergentes en la fauna
silvestre se asocian cada vez más con la mortalidad
animal y el declive de las especies, pero su origen y
caracterización genética a menudo sigue siendo difícil
de determinar. La quitridiomicosis de los anfibios,
causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis
(Bd), se ha asociado a descensos y extinciones
catastróficas y bien documentadas de poblaciones de
anfibios a escala mundial. Hemos utilizado la histología
y la secuenciación del genoma completo para describir
las lesiones causadas por dos aislados de Bd obtenidos
en un evento de mortalidad masiva en una población
cautiva de la amenazada rana gigante chilena
(Calyptocephalella gayi), así como la variabilidad
genética de los mismos. Era la primera vez que se
detectaba una asociación entre Bd y mortalidad
elevada en esta especie de rana carismática y en
declive. Los exámenes patológicos revelaron que 30
ranas metamorfoseadas muertas presentaban
agnathia o brachygnathia, una condición de la que se
informa por primera vez en asociación con la
quitridiomicosis. Los análisis filogenómicos revelaron
que los aislados de Bd (PA1 y PA2) de C. gayi en
cautividad se agrupan con otros aislados de Bd (AVS2,
AVS4 y AVS7) formando un único clado de Bd chileno
altamente apoyado dentro del linaje panzoótico global
de Bd (BdGPL). Estos hallazgos son importantes para
informar sobre el refuerzo de las medidas de
bioseguridad para prevenir los impactos de la
quitridiomicosis en programas de cría en cautividad en
otros lugares.
INTRODUCCIÓN
Aunque el enigmático declive de los anfibios ya había
sido identificado por los herpetólogos en la década de
1970, no se reconoció hasta dos décadas más tarde
como un fenómeno global que en algunos casos no
podía explicarse únicamente por cambios
medioambientales u otros factores antropogénicos
esperables (1-3). El descubrimiento del hongo asesino
de anfibios Batrachochytrium dendrobatidis [en lo
sucesivo, Bd (4, 5)] supuso un punto de inflexión para
entender por qué muchas especies de anfibios han
sufrido un acusado declive. La aparición del Bd,
causante de la enfermedad letal quitridiomicosis de los
anfibios, se ha asociado al declive de las poblaciones
de anfibios de más de 500 especies, incluida la
presunta extinción de al menos 90 especies (6). Las
pruebas sugieren que el Bd se ha extendido
recientemente por todo el mundo desde un foco
endémico, siendo Asia oriental la fuente más probable
desde donde se expandió a otros continentes durante
el siglo pasado (7-10). Su propagación mundial se ha
visto facilitada principalmente por el comercio
internacional de anfibios, en particular de la rana toro
norteamericana (Lithobates catesbeianus), la rana
criada de forma más intensiva en todo el mundo (11-
15).
Las nuevas técnicas genómicas, como la
secuenciación del genoma completo y la tipificación de
secuencias multilocus, han demostrado la existencia
de al menos cinco linajes principales de Bd: BdGPL,
BdCAPE, BdASIA-1 (incluido BdCH), BdASIA-
2/BdBRAZIL y BdASIA-3 (9, 10, 16). De ellos, el linaje
panzoótico global (BdGPL) es la variante más extendida
de Bd y es responsable de la mayoría de los casos
conocidos de declive de poblaciones de anfibios
debido a la quitridiomicosis (9). Aunque el BdGPL es
muy virulento, sus efectos dependen del contexto (17),
y en algunas condiciones otros linajes pueden ser
responsables de la enfermedad letal y del declive de las
poblaciones (18). Además, múltiples introducciones de
Bd han llevado a que diferentes linajes de Bd entren en
contacto, dando lugar a la formación de recombinantes
entre linajes (por ejemplo, a través de la co-infección de
anfibios) que pueden tener mayor patogenicidad o
transmisibilidad (9, 10, 14, 16, 19, 20). Por ejemplo, se
han descrito recombinantes interlineales de BdGPL con
BdASIA-2/BdBRAZIL, y de BdGPL conBdCAPE (9, 10, 14,
19).
A pesar de que Sudamérica es la región con mayor
pérdida de biodiversidad a causa del Bd (6), sólo se ha
caracterizado genéticamente un bajo número de
aislados de Bd de esta región (14, 21-26). Esto limita
nuestra capacidad para entender adecuadamente los
procesos epidemiológicos que han llevado a los
impactos de la quitridiomicosis en los anfibios nativos
de Sudamérica. Nuestro objetivo aquí, la rana gigante
chilena (Calyptocephalella gayi), es endémica de Chile
y se considera un fósil viviente, ya que su familia
representa un antiguo clado neobatrachian que divergió
durante el Cretácico alrededor de 100-120 Mya (27)
Con hembras que alcanzan hasta 2 kg, esta es la
segunda especie de anuros más grande de todo el
mundo, lo que ha llevado a esta especie a ser de interés
económico como fuente de alimento (28). Esta especie
altamente acuática está considerada Vulnerable por la
Lista Roja de la UICN y se ve amenazada por el
consumo excesivo, la pérdida de hábitat debido a la
agricultura y las especies invasoras, entre las que se
incluyen varios peces introducidos y la rana de uñas
1
africana [Xenopus laevis (29)]. Se sospecha que la
quitridiomicosis contribuye a su pronunciado declive
(30), pero hasta la fecha no se han encontrado pruebas
que relacionen el Bd con efectos letales en C. gayi.
Basándose en la histología y la secuenciación del
genoma completo, el objetivo de este estudio es
describir las lesiones de la quitridiomicosis en C. gayi y
la caracterización genética de los aislados de Bd
obtenidos de un brote de quitridiomicosis ocurrido en
un programa de cría en cautividad de C. gayi en Chile.
Además, la genómica de los aislados de Bd de C. gayi
en cautividad junto con los aislados de Bd chilenos
obtenidos previamente se comparan con un panel
global de Bd.
MATERIALES Y MÉTODOS
Centro de cría en cautiverio de la rana gigante
chilena
El centro de reproducción en cautiverio de rana gigante
chilena (Resolución N◦2358/2013 del Servicio Agrícola
y Ganadero de Chile) en Santiago funciona desde 2013,
con su objetivo de generar conocimiento reproductivo y
apoyar la conservación de C. gayi. El centro fue
construido en un área de 70 m2 y estaba compuesto
por 10 estanques grandes y 10 pequeños para
renacuajos (100 y 30 L cada uno, respectivamente), 10
estanques pequeños para ranas recién
metamorfoseadas (30 L) y 20 estanques medianos para
ranas adultas (50 L). El agua utilizada en los tanques
procedía de la red de suministro, pero se había dejado
reposar durante 2 días para permitir la evaporación del
cloro. Alrededor del 50% del agua de los tanques se
cambiaba dos veces por semana. Los renacuajos se
alimentaron con algas espirulina suplementadas con
lechuga administrada ad libitum, mientras que los
postmetamorfos y los adultos se alimentaron dos
veces al día con crustáceos anfípodos secos
(Orchistoidea spp.) suplementados con proteínas de
pollo, vitaminas y minerales. En agosto de 2016, el
programa de cría en cautividad comprendía ∼400
renacuajos de 1 año, seis juveniles y 86 adultos
reproductores (43 hembras y 43 machos).
Análisis de mortalidad y patología
En septiembre de 2016, el programa recibió nuevos
individuos de otro programa de cría en cautividad de C.
gayi que había finalizado. Los individuos recién llegados
consistían en 800 renacuajos de 2 años y 18 adultos
reproductores (9 hembras, 9 machos), que se
mantuvieron en tanques separados de los animales
residentes. A principios de noviembre de 2016, 40 de
los nuevos renacuajos completaron la metamorfosis.
De diciembre de 2016 a enero de 2017, 75 de los
nuevos individuos murieron: 37 renacuajos, 35
postmetamorfos y tres adultos reproductores. Todos
los postmetamorfos muertos no habían consumido
ningún alimento después de la metamorfosis, y se
observó que algunos de los renacuajos estaban
letárgicos antes de morir y mostraban una
despigmentación parcial de las piezas bucales, un
hallazgo consistente con la quitridiomicosis de los
anfibios (31). Los animales recién muertos (4
renacuajos y 29 postmetamorfos) fueron transportados
en condiciones refrigeradas al laboratorio para su
examen postmortem y aislamiento de Bd. Las
necropsias de los 29 postmetamorfos se realizaron
según el protocolo estándar (32). Se recogieron
secciones de tejido de los postmetamorfos en
formaldehído neutro al 10% de cualquier órgano que
presentara lesiones macroscópicas y de pulmón,
hígado, bazo, riñón, músculo esquelético, corazón,
piel, estómago e intestino delgado y grueso. Para los
análisis histopatológicos, los tejidos se embebieron en
parafina, se seccionaron (4-5μm) y se tiñeron con
hematoxilina y eosina (H&E).
Muestreo de Bd y ensayo qPCR
Se obtuvieron hisopos cutáneos no invasivos (MW100,
Medical & Wire Equipment Co.) de anfibios
postmetamórficos (n = 29) pasando firmemente los
hisopos cinco veces cada uno sobre el abdomen
ventral y la pelvis, cada miembro posterior ventral
(fémur y tibia) y la superficie plantar de cada pie
posterior (33). Además, de renacuajos muertos (n = 4),
se obtuvieron muestras del disco bucal girando el
hisopo 10 veces alrededor de la abertura bucal. Los
hisopos se conservaron en una nevera hasta su
congelación a -80◦C una vez de vuelta en el laboratorio.
Brevemente, la extracción de ADN de los hisopos
cutáneos y orales y la posterior detección de ADN de Bd
mediante un ensayo qPCR específico en tiempo real se
realizó siguiendo a Soto-Azat et al. (34). Para cada
muestra, los ensayos de diagnóstico se realizaron por
duplicado, y se incluyeron estándares de
concentración conocida de zoosporas (obtenidos de un
cultivo previo de Bd) dentro de cada placa de PCR como
controles positivos. Asumimos que un hisopo positivo
a Bd era indicativo de infección por Bd. Al incluir
concentraciones conocidas de ADN de Bd en pocillos
de control positivo diluidos en serie en cada placa de
PCR, pudimos cuantificar la intensidad de la infección,
que definimos como el número de zoosporas
equivalentes/ hisopo (ZE). Para cuantificar y corregir la
intensidad de la infección por frotis, cada valor
genómico obtenido del ensayo qPCR se multiplicó por
120 para tener en cuenta la dilución de la muestra (35).
2
Aislamiento de Bd
Se utilizaron renacuajos recién muertos con sospecha
de infección por Bd (n = 4) para el aislamiento de Bd
siguiendo a Longcore et al. (5) y Fisher et al. (36). La
confirmación posterior del estado de la infección por
Bd y la carga por qPCR, sirvió para guiar los esfuerzos
de aislamiento de Bd. Dentro de las 8 h. siguientes a la
muerte, se retiraron las piezas bucales enteras de los
renacuajos muertos positivos para Bd, se seccionaron
en pequeños trozos y se depositaron en un medio TGhL
de crecimiento fúngico (8 g. de triptona, 2 g. de
hidrolizado de gelatina, 4 g. de lactosa, 10 g. de agar).
Las secciones cultivadas se limpiaron primero
utilizando una placa de agar con antibióticos (200 mg/L
de penicilina-G y 400 mg/L de sulfato de
estreptomicina), y luego se colocaron individualmente
en la placa de agar TGhL con antibióticos incubada a
15-20◦C. Debido a que la liberación de zoosporas
puede ocurrir inmediatamente, especialmente de las
piezas bucales de los renacuajos, los cultivos fueron
examinados con un microscopio invertido para
detectar la presencia de zoosporas activas todos los
días durante un máximo de 1 semana. Una vez
observado el crecimiento de zoosporas y/o
zoosporangios, parte del agar se transfirió a una nueva
placa de agar TGhL sin antibióticos y se incubó a 15-
20◦C hasta 1 semana. A continuación, los aislados se
pasaron no más de tres veces para reducir la
posibilidad de cambios genómicos debidos al cultivo
prolongado en laboratorio (37).
Extracción de ADN, Biblioteca de Secuencias
Preparación y análisis filogenómicos Realizamos la
extracción de ADN utilizando el kit MasterPureTM Yeast
DNA Purification Kit (Epicentre, Wisconsin, EE.UU.) a
partir de todos los cultivos de Bd purificados obtenidos.
Las extracciones de ADN se cuantificaron primero
utilizando un Tapestation 2200 (Agilent Technologies,
California, EE.UU.) y un fluorímetro Qubit 2.0 (Thermo
Fisher Scientific, Massachusetts, EE.UU.), y luego se
secuenciaron utilizando un Illumina HiSeq 2000
(Illumina, California, EE.UU.). A continuación, se
prepararon bibliotecas de secuenciación sin gel TruSeq
Nano 350 para la secuenciación de extremo pareado de
125 + 125 pb utilizando la química Illumina HiSeq high
output v4, y se limpiaron las lecturas de secuenciación
de secuencias adaptadoras y se recortó su calidad
utilizando cutadapt v1.10 (38). Las lecturas del genoma
de referencia JEL423 (accesión de ensamblaje del
GenBank: GCA_000149865.1) se mapearon utilizando
Burrows-Wheeler Aligner v0.7.8 (39).
Procesamos los archivos de mapa de alineación de
secuencias (SAM) resultantes utilizando SAMtools
v1.3.1 con los programas "fixmate" y "sort" para leer los
archivos para el descubrimiento de variantes.
Realizamos la detección de variantes en un proceso de
dos pasos utilizando la versión dbb6160 de Freebayes
(40). En primer lugar, los archivos SAM ordenados para
cada aislado en la filogenia se llamaron de forma
independiente para encontrar posiciones de variantes y
se fusionaron en un único archivo de formato de
llamada de variantes (VCF). En segundo lugar, cada una
de las muestras se volvió a llamar utilizando las
posiciones del archivo VCF, para producir un conjunto
de llamadas cuadradas (se realizó una llamada de
genotipo en cada locus para cada aislado, incluidos los
datos que faltaban). Todos los archivos VCF se
procesaron utilizando vcflib (41) para descomponer las
variantes complejas en primitivas alélicas y vt (42) para
normalizar las secuencias cortas de inserción y
deleción. A continuación, los archivos VCF se
sometieron a un filtrado de calidad con bcftools v1.3.1
(43) para aceptar sólo las variantes con suficientes
pruebas de apoyo. Los sitios potencialmente
polimórficos se filtraron utilizando la configuración de
bcbio.variation.recall squaring-off pipeline (44), y los
sitios que no superaron estos filtros se establecieron
como referencia homocigota (no había pruebas
suficientes para declarar una variante en esa posición).
A continuación, los archivos VCF procesados se
fusionaron en un único VCF multimuestra y se extrajo
un archivo FASTA de las llamadas de variantes SNP. Los
análisis filogenómicos se realizaron utilizando RAxML
v8.2.9 con el modelo GTRCAT con 500 ejecuciones
bootstrap. El estimador de Weir y Cockerham se realizó
usando una comparación de ventana deslizante de FST
de aislados chilenos de Bd contra un panel global de
diversidad global representativa de Bd en vcftools. Los
polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que estaban
en alto desequilibrio de ligamiento fueron eliminados
del conjunto de datos usando el paquete SNPRelate
versión 1.10.2 en R v3.4.0 (45). Después de la poda
usando un análisis basado en ventanas deslizantes y un
umbral de desequilibrio de ligamiento de 0,125,
quedaron 3.900 posiciones de SNPs que fueron
analizadas usando SNPRelate y graficadas con ggplot2
(46). Finalmente, el agrupamiento de los aislamientos
chilenos de Bd contra un panel global de Bd fue
investigado usando el análisis de componentes
principales (PCA) con el paquete adegenet (47) y
graficado con ggplot2 (46).
RESULTADOS
Patología y ensayo de qPCR de Bd
Durante diciembre de 2016 y enero de 2017,
observamos un evento de mortalidad masiva en un
3
programa de cría en cautividad de C. gayi, muriendo el
87,5% (35/40) de las ranas metamorfoseadas del grupo
de animales recién adquirido. De éstos, 30 individuos
presentaban: deformación mandibular (n = 21) o
ausencia (n = 9) de estructuras orales, muriendo pocas
semanas después de completar la metamorfosis al no
poder alimentarse adecuadamente (Figura 1A). Se
detectaron muestras PCR Bd-positivas en el 100% de
los renacuajos muestreados, y en los individuos
postmetamórficos (n = 33). La carga de infección en los
anfibios Bd-positivos osciló entre 95 y 147.366 ZE
(mediana = 9.842). Del total de ranas infectadas, el
33,3% (11/33) tenían más de 10.000 ZE. En la necropsia
macroscópica se observó una vesícula biliar distendida
(con bilis) y ausencia de contenido gastrointestinal en
todos los individuos con ausencia/deformación
mandibular (30/35). Confirmamos la infección por Bd
microscópicamente, ya que observamos
hiperqueratosis dentro de la capa superficial de la piel
con distintos estadios de zoosporangios en desarrollo
que son morfológicamente típicos de Bd (Figura 1B).
No se observaron otros hallazgos macroscópicos o
microscópicos en los demás tejidos analizados.
FIGURA 1 | Una rana gigante chilena (Calyptocephalella gayi)
postmetamorfa que muestra signos de enfermedad. (A) Ausencia de
mandíbula (agnatia). (B) Sección histológica de la piel de las
extremidades posteriores. Obsérvense las distintas etapas del desarrollo
de zoosporangios (flechas) y los múltiples espacios vacíos (puntas de
flecha) dentro de la capa queratinizada superficial, morfológicamente
típicos de la infección por Batrachochytrium dendrobatidis. Teñido con
hematoxilina y eosina. Barra = 24 µm (abajo).
Aislamiento de Bd y análisis filogenómicos
De nuestros intentos de cultivar Bd a partir de cuatro
renacuajos de C. gayi recién muertos, obtuvimos dos
aislados (PA1 y PA2, datos de lectura WGS disponibles
en el NCBI Sequence Read Archive:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra con los números de
acceso SRS8215364 y SRS8216816, respectivamente).
Los análisis filogenómicos mostraron que nuestros
aislados de C. gayi se agrupaban dentro de BdGPL
formando un clado único y altamente apoyado (100%
de apoyo bootstrap; Figura 2). Los aislados de Bd se
fijaron para el 99,4% de los sitios segregantes que se
observaron en BdGPL tras filtrar las posiciones que
faltaban. Sólo había 2.257 sitios variables exclusivos de
los aislados de C. gayi Bd. Aunque comparamos los
FIGURA 2 | Filogenia global de 54 aislados de Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd) basada en 363.497 sitios de segregación obtenidos
mediante secuenciación del genoma completo. El clado que contiene
los aislados de Bd PA1 y PA2 del grupo cautivo de C. gayi con otros
aislados de Bd de Chile y el Reino Unido está resaltado en gris. Las
ramas del árbol se pesan (grosor) mediante soporte bootstrap (500
repeticiones), con ramas con 80% de soporte y más etiquetadas.
4
genomas de los aislados de C. gayi (PA1 y PA2) con un
extenso panel global de Bd, se demostró que son
altamente divergentes del único linaje regional
potencialmente endémico conocido en Sudamérica
(BdAsia2/BdBrasil). Dentro de BdGPL, los aislados de
Bd de C. gayi en cautividad se agruparon con otros
aislados obtenidos de anfibios silvestres en Chile (AVS2
de Batrachyla antartandica, AVS4 de Xenopus laevis y
AVS7 de C. gayi) y un aislado del Reino Unido (UKTvB),
recogido de un tritón liso (Lissotriton vulgaris) en 2009
en Kent, Reino Unido, para formar un clado bien
apoyado (100% de apoyo bootstrap; Figura 2).
Utilizamos el estimador de Weir y Cockerham para
realizar una comparación de ventana deslizante del FST
de los aislados de Bd (PA1 y PA1) frente a todos los
demás aislados de BdGPL. En este análisis,
identificamos varios tramos del genoma en los que el
estimador de FST era más de dos desviaciones
estándar mayor que la media de todos los valores de
FST, indicando diferenciación debida a selección
positiva o tasas reducidas de recombinación (Figura 3).
Por último, analizamos la agrupación de aislados
mediante PCA en un subconjunto filtrado de 3.900 SNP
en equilibrio de ligamiento, revelando una estructura
general de la población coherente con nuestros análisis
filogenéticos (Figura 4).
DISCUSIÓN
La ahora globalizada Bd ha causado la mayor pérdida
de biodiversidad conocida debida a un único patógeno
(6). Los impactos de la quitridiomicosis han sido
probablemente subestimados, ya que las especies de
anfibios afectadas son a menudo difíciles de estudiar,
particularmente en especies crípticas en peligro de
extinción que ocurren en lugares remotos (48).
Además, no todos los linajes de Bd tienen el mismo
impacto en las poblaciones y especies de anfibios
infectados, por lo que un mejor conocimiento de la
diversidad genética de Bd es fundamental para
comprender el riesgo que presenta este patógeno y
para informar las acciones de mitigación (16). En este
estudio, describimos un evento de mortalidad masiva
debido a quitridiomicosis en una especie de anfibio en
peligro de extinción en un programa de cría en
cautividad. Caracterizamos genéticamente dos
aislados de Bd de este brote, mostrando que anidaban
dentro del clado BdGPL y estaban altamente
relacionados con genotipos de Bd aislados
previamente de anfibios salvajes en Chile.
La presencia de agnatía y braquignatía asociada a la
infección por Bd en anfibios postmetamórficos no se
había descrito antes. Las malformaciones orales de los
renacuajos se han asociado a bajas temperaturas (49),
contaminación del agua (50), nutrición (51) o factores
ecológicos (52, 53). Aunque esta malformación podría
deberse a una causa ambiental desconocida o de otro
tipo, es probable que esté asociada a la infección por
Bd de los discos orales de los renacuajos (54-56). La
ausencia o reducción del desarrollo de la mandíbula
inferior puede haber tenido un profundo impacto en la
capacidad de los anfibios postmetamórficos (y de los
renacuajos) para adquirir alimento, contribuyendo a su
muerte junto con la quitridiomicosis. La presencia de
vesículas biliares distendidas y la ausencia de
contenido gastrointestinal en todos los animales
examinados sugiere una falta de alimentación. Aunque
las deformaciones orales en anfibios
postmetamórficos no se han utilizado antes como
indicación de quitridiomicosis, podrían seguir siendo
importantes e indicar una secuela desconocida de la
infección por Bd que podría haberse pasado por alto
anteriormente. Este estudio subraya la necesidad de
utilizar técnicas de diagnóstico precisas como la qPCR
o la histología para poder complementar estas
observaciones (57).
La cría en cautividad se ha utilizado cada vez más como
herramienta para la conservación de anfibios, pero para
que estas iniciativas tengan éxito hay que tener en
cuenta varios aspectos, como la gestión genética y los
protocolos de bioseguridad (58, 59). En nuestro caso,
los individuos recién admitidos de C. gayi procedían de
un programa de cría en cautividad semiabierto que se
abastecía de agua de un canal agrícola, en el que se
había registrado previamente la presencia de X. laevis
(34). A pesar de la aplicación de la cuarentena, ésta no
fue suficiente para prevenir la introducción de Bd en el
programa de cría en cautividad, causando mortalidad
en los animales recién admitidos. Esto pone de relieve
la importancia de aplicar protocolos estrictos de
bioseguridad contra el Bd (y otros patógenos), como la
realización de pruebas de Bd antes de la admisión, el
tratamiento preventivo antifúngico o la desinfección del
agua y los materiales (59).
La susceptibilidad a Bd también se ve influida por
factores ambientales, como el clima (20). La función
inmunitaria de los anfibios depende estrechamente de
la temperatura ambiental (60). Por ejemplo, la baja
temperatura se ha asociado con una menor
supervivencia en ranas expuestas a Bd en condiciones
de laboratorio (60,61) y las muertes por
quitridiomicosis se han asociado a menudo con una
mayor elevación, menor temperatura y estación
invernal (62-64). Es posible que, en nuestro caso, el
5
estrés asociado al transporte haya inducido
inmunosupresión, facilitando el desarrollo de la
quitridiomicosis. Ramsey et al. (65) demostraron que la
resistencia natural a Bd en X. laevis puede invertirse
con la aplicación de tratamientos inmunosupresores
subletales, como la exposición a Xirradiación o
inyecciones de norepinefrina.
El linaje de Bd que aislamos de los individuos
infectados en este brote de quitridiomicosis, BdGPL, se
ha asociado con mortalidades masivas catastróficas y
declives poblacionales en múltiples continentes (22,
48, 66, 67). En las últimas cuatro décadas, se ha
producido un severo declive poblacional de dos
especies de ranas de Darwin (Rhinoderma darwinii y R.
rufum) en el centro y sur de Chile. Estudios
retrospectivos y transversales de Bd y datos de
seguimiento de poblaciones sugieren que la
quitridiomicosis ha contribuido a estas extirpaciones
(33, 48) y que Bd ha estado presente en Chile al menos
desde 1970 (33). Aunque hasta ahora no se ha
conseguido caracterizar los aislados de Bd que infectan
a R. darwinii, la identificación de BdGPL en una amplia
zona de Chile apoya la hipótesis de que BdGPL está
causando estos descensos (25).
En nuestro análisis filogenómico del genoma completo,
todos los aislados chilenos de Bd (incluidos los dos
aislados de C. gayi en cautividad) se agruparon con un
genotipo aislado en 2009 en el Reino Unido (UKTvB). Se
observó una relación filogenética similar al restringir el
análisis a un subconjunto del genoma que abarca un
evento de pérdida de heterocigosidad compartido por
todos los aislados de BdGPL, pero en este caso, los
aislados de otros países europeos y un aislado
canadiense también se agrupan con los aislados
chilenos (25). Aunque no se ha informado de
mortalidad en la naturaleza causada por UKTvB, un
desafío con este aislado en el sapo partero mallorquín
(Alytes muletensis) en condiciones de laboratorio
causó una tasa de mortalidad del 73% (18). Es
probable, por tanto, que los genotipos de BdGPL en
Chile sean virulentos y hayan causado mortalidades de
anfibios en la naturaleza (25). Sin embargo, la detección
de mortalidades en la naturaleza es a menudo difícil,
particularmente en especies crípticas, para las que se
necesita una mejor vigilancia. Además, también
evaluamos la presencia del ranavirus Frog virus 3 (FV3)
en los mismos individuos como posible causa de
mortalidad, sin embargo todos dieron negativo
utilizando un ensayo qPCR. Anteriormente, se describió
una mortalidad masiva de adultos de C. gayi,
supuestamente debida a una sequía, en la zona central
de Chile. Sin embargo, se desconoce si el Bd estuvo
implicado en este evento de mortalidad, ya que no se
disponía de cadáveres frescos para realizar necropsias,
detección de Bd u otros diagnósticos (68).

FIGURA 3 | Análisis de ventana deslizante de la diferenciación poblacional de aislados de Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) (PA1 y PA2) frente a otros 45
linajes panzoóticos globales de aislados de Bd (BdGPL) utilizando el estimador FST de Weir y Cockerham. Cada punto representa una ventana genómica de 10
Kb, con un tamaño de paso de 5 kb. La línea roja discontinua representa la FST media (0,0538). La línea negra continua representa el umbral del cuantil del 95%
del estimador FST (0,3141). Cada punto tiene un tamaño y un color en una escala logarítmica según el número de variantes en cada ventana. La leyenda indica
la escala de colores (el número de SNP incluidos en cada ventana varió de 1 a 364, con una mediana de 31). El tamaño de los puntos, de pequeño a grande, se
escala desde un número de variantes bajo a alto.ramas con 80% de soporte y más etiquetadas.

6
 FIGURA 4 | Análisis de componentes principales (PCA) de 3900 SNP en equilibrio de ligamiento de un panel global de 54 aislados de Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd). Cada punto representa un aislado, coloreado por linaje filogenético. (A) Los aislados de Bd se separan en grupos claramente definidos. (B)
Mayor resolución del grupo del linaje panzoótico global de Bd (BdGPL) que muestra la posición de los aislados chilenos dentro del grupo. Los ejes trazan el primer
y segundo componente principal, PCA1 y PCA2. Los aislamientos chilenos se agrupan dentro de BdGPL. Aislados chilenos (rojo), otros BdGPL (verde),
BdASIA2/BdBRAZIL (rosa), híbridos entre los dos grupos anteriores (negro).

El bajo número de sitios segregantes exclusivos para
los aislamientos chilenos de Bd, comparado con el
número total de sitios donde los aislamientos de
BdGPL son polimórficos, sugiere una única y reciente
introducción de Bd en Chile, posiblemente a través del
movimiento internacional de anfibios, otros animales
acuáticos, fómites o turismo (9, 14, 25, 66). Para
confirmar esta hipótesis se requiere la caracterización
molecular de más aislamientos de áreas no estudiadas
en Chile y países vecinos (por ejemplo, Argentina y
Perú), junto con la calibración de un reloj molecular de
todo el genoma. La existencia de un linaje
aparentemente único y recientemente introducido de
Bd en Chile difiere con la historia conocida de este
patógeno en Brasil, donde coexisten tanto BdGPL como
BdAsia2/BdBrazil, con evidencia de múltiples eventos
de recombinación entre ellos (9, 24). Por lo tanto, junto
con la posible introducción de nuevos genotipos de Bd,
la recombinación entre linajes puede verse facilitada
por la globalización del transporte de personas y
animales (16). Esto subraya la importancia de las
medidas de bioseguridad a nivel nacional y local, para
prevenir la introducción y el establecimiento de nuevos
linajes patógenos de Bd, ya que este patógeno tiene la
capacidad de aumentar su diversidad genómica a
través del intercambio de haplotipos entre linajes (25).
Nuestro trabajo describe por primera vez un evento de
mortalidad masiva en la amenazada rana gigante
chilena de un programa de cría en cautividad.También
proporcionamos nuevos datos sobre la susceptibilidad
potencial de C. gayi a los impactos de la
quitridiomicosis, una especie que ha estado
disminuyendo rápidamente a lo largo de su distribución
en Chile. La alta mortalidad observada en C. gayi con
postmetamorfos exhibiendo agnathia o brachygnathia
como posible consecuencia de la infección oral con Bd
en renacuajos no ha sido descrita previamente y es una
condición que puede ser considerada en el monitoreo
de anfibios mantenidos en cautiverio, como granjas,
zoológicos y programas de conservación ex situ.
Describimos dos nuevos aislamientos de Bd en Chile,
pertenecientes a BdGPL y agrupados en un solo grupo
con otros tres aislamientos de Bd previamente aislados
del centro y sur de Chile (9, 25), para los cuales la
evidencia como causa de mortalidad y declinación
poblacional de anfibios es creciente.