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142 J. Agrícola. Química de los alimentos. 2001, 49, 142­145

Compuestos mosquitocidas, nematicidas y antifúngicos de semillas de Apium

graveolens L.
Rafikali A. Momin y Muraleedharan G. Nair*

Productos Naturales Bioactivos y Fitocéuticos, Departamento de Horticultura y Seguridad Alimentaria Nacional y

Centro de Toxicología, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, Michigan 48824

Se investigó el extracto metanólico de semillas de Apium graveolens en busca de compuestos bioactivos y se logró
aislar y caracterizar los compuestos mosquitocidas, nematicidas y antifúngicos sedanolida (1), senkyunolide­N (2) y
senkyunolide­J (3). Sus estructuras se determinaron mediante métodos espectrales de RMN 1H y 13C . Los compuestos
1­3 dieron una mortalidad del 100 % a 25, 100 y 100 µg ml­1, respectivamente, en el nematodo Panagrellus redivivus.
El compuesto 1 mostró una mortalidad del 100 % a 50 µg ml­1 en el nematodo Caenorhabditis elegans y en larvas de
mosquito de cuarto estadio, Aedes aegyptii. Además, inhibió el crecimiento de Candida albicans y Candida parapsilasis
a 100 µg mL­1. Los compuestos 2 y 3 se aislaron por primera vez de A. graveolens. Este es el primer informe de las
actividades mosquitocidas, nematicidas y antifúngicas de los compuestos 1­3.

Palabras clave: Apium graveolens; umbelíferas; apio; mosquitocida; nematicida; antifúngico; sedanolida; senkyunolida

INTRODUCCIÓN por millón) basado en δ residual de CHCl3 a 7,24 para 1H NMR y de CDCl3 a
77 ppm para 13C NMR. Las constantes de acoplamiento, J, están en hercios.
Apium graveolens L., el apio, se cultiva ampliamente en la zona El gel de sílice usado para VLC y MPLC fue gel de sílice Merck 60 (tamaño de
templada como cultivo de jardín, y sus tallos de hojas se utilizan partícula de 30­70 µm). Para la purificación por HPLC preparativa (LC­20, Japan
como verdura popular. En los Estados Unidos, la fruta de apio, Analytical Industry Co., Tokio), se utilizaron dos columnas JAIGEL­ODS,
comúnmente conocida como “semilla de apio”, se importaba en A­343­10 (20 mm × 250 mm, 10 µm, Dychrom, Santa Clara, CA) en tándem. .
gran medida de Europa, pero desde la Segunda Guerra Mundial Los picos se detectaron utilizando un detector UV equipado con un
ha sido suministrada por productores nacionales, especialmente cromatointegrador modelo D­2500 (Hitachi, Tokio). Los análisis de CD de los
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en Michigan y Wisconsin. Las semillas de apio poseen un aroma compuestos 2 y 3 se realizaron en un espectropolarímetro JASCO J­710 CD­
característico y un sabor picante y se utilizan como condimento ORD. El nitrógeno se generó mediante un generador de nitrógeno modelo
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para dar sabor a productos alimenticios. El apio se puede clasificar NG­150 a una velocidad de 40 L min­1.

tanto como condimento como verdura. Para condimentar se

utilizan las semillas y la planta, así como el aceite esencial
destilado de las semillas (1).
Los extractos de semillas de apio se utilizan ampliamente como
ingredientes aromatizantes en muchos productos alimenticios,
incluidas bebidas alcohólicas y no alcohólicas, postres lácteos
congelados, dulces, productos horneados, gelatinas, pudines,
productos cárnicos, condimentos y condimentos, sopas, salsas,
bocadillos y otros. . Las semillas de apio se utilizan para tratar
enfermedades de la bronquitis, el asma, el hígado y el bazo (2, 3).
La sedanolida, considerada uno de los compuestos del sabor
del apio (4, 5), se informó a partir del aceite de semilla de apio en
1950 (6). Desde el aislamiento de la sedanolida , se han informado
otras ftalidas como la sedanolida, 3­n­butilftalida, cnidilida,
neocnidilida, ligustilida y 3­isobutiliden­3a,4­dihidroftalida a partir
del aceite de semilla de apio (4, 7, 8). En este artículo informamos
por primera vez las actividades mosquitocidas, nematicidas y
antifúngicas de los compuestos 1­3.
MATERIALES Y MÉTODOS
Procedimientos experimentales generales. Todos los espectros de RMN (1H
y 13C) se registraron en un espectrómetro Varian INOVA de 300 MHz. Los
espectros de RMN de 13C se registraron a 75 MHz. Los cambios químicos se
registraron en CDCl3 y los valores están en δ (partes
Los compuestos 2 y 3 se disolvieron en metanol por separado y la CD se
determinó a 185­400 nm. Todos los solventes fueron
de grado reactivo ACS y se adquirieron de Aldrich Chemical Co., Inc.
Material vegetal. Las semillas de apio fueron donadas por Asgrow Seed
Co., Kalamazoo, MI, y se almacenó a ­20 °C hasta la extracción.
Extracción y Aislamiento. Las semillas (905 g) se molieron usando una
licuadora Waring industrial y se extrajeron con hexano (4 x 1,5 l, 48 h) para
producir el extracto de hexano (85 g). Luego se extrajo el residuo de la planta
con MeOH (3 x 1,5 l, 48 h) para producir el extracto de MeOH (20 g). Los
disolventes se evaporaron a presión reducida a 40 °C para producir extractos
crudos. El extracto de MeOH (19 g) se agitó con hexano (2 x 400 ml, 15 min)
para producir fracciones solubles en hexano (7,4 g) e insolubles (11,5 g). La
fracción soluble en hexano (6 g) se separó adicionalmente mediante
cromatografía líquida al vacío (VLC) seguida de cromatografía líquida de presión
media (MPLC) sobre gel de sílice (Sanki Engineering Ltd., bomba modelo LBP­
V que funciona a 10­15 psi; Chemco columna de vidrio MPLC, 55 cm de longitud)
utilizando hexano con cantidades crecientes de acetona y finalmente con MeOH
como disolvente de elución. Las fracciones recogidas fueron las siguientes: A,
404 mg, hexano/acetona, 4:1, 250 ml; B, 142 mg, hexano/acetona, 2:1, 80 ml;
C, 483 mg, hexano/acetona, 2:1, 100 ml; D, 79 mg, hexano/acetona, 2:1, 120
ml; E, 61 mg, hexano/acetona, 1:1, 100 ml; F, 89 mg, hexano/acetona, 1:1, 200
ml; G, 35 mg, hexano/acetona, 1:1, 100 ml; H, 14 mg, 100 % acetona, 20 ml; I,
33 mg, 100% acetona, 130 ml; y J, 8 mg, 100 % MeOH, 250 ml. Los bioensayos
antimosquitos, nematicidas y antifúngicos en estas fracciones revelaron que la
fracción B estaba activa. La fracción bioactiva B (135 mg) se purificó mediante
TLC preparativa (hexano/acetona, 20:1 x 3) para producir tres

* Autor a quien debe dirigirse la correspondencia [teléfono (517) 353­2915;

fax (517) 432­2310; correo electrónico nairm@msu.edu].

10.1021/jf001052a CCC: $20,00 © 2001 Sociedad Química Estadounidense

Publicado en la Web el 28/11/2000
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Compuestos bioactivos de la semilla de apio
bandas principales: I, (48 mg, Rf 0,18; II, 65 mg, Rf 0,35; y III, 16 mg,
Rf 0,50. La banda II era biológicamente activa y se purificó
adicionalmente mediante TLC preparativa repetida (hexano/éter 8:1
x 4 y 2:1 × 1) para producir un compuesto 1 puro (22 mg).
La fracción insoluble en hexano (11 g) del extracto de MeOH se
separó en fracciones solubles en cloroformo (2,1 g) e insolubles (8,2
g) agitándolas con cloroformo (2 x 50 ml, 15 min).
La fracción soluble en cloroformo (2,1 g) se separó adicionalmente
en fracciones solubles en hexano (607 mg) e insolubles (1,5 g).
La fracción insoluble en hexano bioactivo se separó adicionalmente
en metanol/agua, 75:25, fracciones solubles e insolubles, y el
precipitado se eliminó mediante centrifugación. La fracción soluble
(684 mg) se separó en ocho fracciones mediante HPLC preparativa
usando metanol/agua, 75:25, como fase móvil a un caudal de 3 ml
min­1. La fracción II (tR ) 48 min, 75 mg) se purificó adicionalmente
mediante HPLC usando metanol/agua, 60:40, como fase móvil a un
caudal de 2 ml min­1 para producir una mezcla 1:1 de los compuestos
2 y 3 . (tR ) 65 min, 12 mg). Esta mezcla se separó en los compuestos
puros 2 y 3 mediante HPLC usando H2O/THF, 90:10, como fase
móvil a un caudal de 4 ml min­1.
Compuesto 1: RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 0,83 (3H, t, J )
7,1 Hz, H­11), 1,00­2,20 (10H, m, H­4,5,8,9,10), 2,22 (1H, m, H­3a),
2,41 (2H, m, H­6) , 3,87 (1H, m, H­3), 6,66 (1H, dd, J )
6,3, 3,0 Hz, H­7); RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ 13,87 (C­11),
20,74 (C­5), 22,50 (C­10), 24,96 (C­4), 25,34 (C­9), 27,49 (C­8),
34,30 (C­3a), 43,04 (C­6), 85,35 (C­3), 131,11 (C­7a), 135,20 (C­7),
170,24 (C­1). El compuesto 1 se identificó como sedanolida.
Los datos espectrales del compuesto 1 fueron idénticos a los valores
publicados para sedanolida (9).
Compuesto 2: RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 0,91 (3H, t, J )
7,2 Hz, H­11), 1,30­1,45 (4H, m, H­9,10), 1,50­2,21 (4H, m, H­5,8),
2,35­2,40 (2H, m, H­4) , 3,91 (1H, ddd, J ) 9,8, 6,1, 3,3 Hz, H­6), 4,41
(1H, dddd, J ) 6,1, 2,5, 2,0, 1,9 Hz, H­7), 4,86 (1H, ddd, J ) 8,1, 3,6,
2,4 Hz, H­3); RMN 13C (75 MHz,
J. Agrícola. Química de los alimentos, vol. 49, núm. 1, 2001 143
CDCl3) δ 13,80 (C­11), 21,3 (C­4), 22,4 (C­10), 26,5 (C­5), 26,8 (C­9),
31,9 (C­8), 67,4 (C­7 ), 71,5 (C­6), 82,9 (C­3), 126,3 (C 7a), 166,7
(C­3a), 173,0 (C­1). El compuesto 2 se identificó como senkyunolida­
N mediante la comparación de sus datos espectrales de RMN de 1H
y 13C con los valores publicados (10).
Compuesto 3: RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 0,91 (3H, t, J )
7,2 Hz, H­11), 1,30­1,45 (4H, m, H­9,10), 1,50­2,21 (4H, m, H­5,8),
2,35­2,40 (2H, m, H­4) , 3,91 (1H, ddd, J ) 9,8, 6,1, 3,3 Hz, H­6), 4,41
(1H, dddd, J ) 6,1, 2,5, 2,0, 1,9 Hz, H­7), 4,86 (1H, ddd, J ) 8,1, 3,6,
2,4 Hz, H­3); RMN 13C (75 MHz,
CDCl3) δ 13,80 (C­11), 21,1 (C­4), 22,3 (C­10), 26,3 (C­5), 26,6 (C­9),
31,8 (C­8), 67,3 (C­7 ), 71,3 (C­6), 82,8 (C­3), 126,1 (C­7a), 166,5
(C­3a), 172,9 (C­1). El compuesto 3 se identificó como senkyunolida­
J comparando sus datos espectrales de RMN de 1H y 13C con los
valores publicados (10).
Ensayo mosquitocida. Se criaron larvas de mosquito de cuarto
estadio, Aedes aegyptii, a partir de recién nacidos en nuestro laboratorio.
Se colocaron de diez a 15 larvas en 980 µl de agua destilada
desgasificada y se agregaron 20 µl de DMSO o solución de DMSO
que contenía extractos de prueba o compuestos puros. Los extractos
se probaron a concentraciones de 250 µg ml­1 y los compuestos
puros se probaron a concentraciones de 1­200 µg ml­1 . Hubo tres
réplicas por tratamiento. El número de larvas muertas se registró a
intervalos de 2, 4, 6 y 24 h. El control se preparó con 980 µL de agua
destilada desgasificada y 20 µL de solución de DMSO a la que se le
agregaron larvas (11).
Ensayo nematicida. En nuestro laboratorio se mantuvieron cultivos
de nematodos, Panagrellus re divivus y Caenorhabditis elegans . P.
redivivus se cultivó en medio hemo basal líquido axénico (5 ml) en
viales de centelleo. C. elegans se mantuvo en medio agar NG que
contenía una cepa de Escherichia coli en placas de Petri desechables
humedecidas con 2­4 ml de solución salina fisiológica. Los cultivos
se almacenaron a temperatura ambiente y se subcultivaron antes del
ensayo. El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos de poliestireno
Corning. Los nematodos se agregaron a 1 ml de solución salina
fisiológica en un vial de centelleo. Esta solución se diluyó hasta que
el recuento de nematodos fue de 15 a 20 en una alícuota de 48 µl.
Esta solución (48 µL) que contenía nematodos se entregó a cada uno
de los tres pocillos por tratamiento. Se añadieron a cada pocillo dos
microlitros de DMSO (50%) o compuesto de prueba en DMSO al
50%. La placa se cubrió, se parafilmó y se mantuvo en cámara
húmeda. El número de nematodos muertos se registró a las 2, 4, 6, 8
y 24 h mediante observación al microscopio (12).
Ensayo antifúngico. Se evaluó la actividad antifúngica de los
compuestos 1­3 según el procedimiento informado (13).
Los organismos de prueba Candida albicans (cepa MSU) y Candida
parapsilasis (cepa MSU) utilizados para bioensayos antifúngicos se
cultivaron en placas de Petri que contenían medio YMG (20 ml). Se
añadió solución salina fisiológica (2­3 ml) a la placa completamente
desarrollada de cada organismo y luego las suspensiones se diluyeron
para obtener 5 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.
Los bioensayos se realizaron esparciendo 50 µL de la suspensión
celular deseada en placas de Petri del medio YMG. DMSO
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144 J. Agrícola. Química de los alimentos, vol. 49, núm. 1, 2001 Momin y Nair

o se colocó cuidadosamente el compuesto de prueba disuelto en

DMSO (20 µl) en las placas de bioensayo a diversas concentraciones.
Las placas se dejaron secar en una campana de flujo laminar y
luego se incubaron a 27 °C durante 72 h. Las zonas de inhibición
se midieron en milímetros (11, 13). La concentración inhibidora
mínima (CIM) se determinó para los compuestos 1­3 según el
procedimiento publicado (12).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las semillas de apio se molieron y extrajeron secuencialmente

con hexano y MeOH. El extracto de MeOH se repartió en
fracciones solubles e insolubles en hexano.
Los bioensayos preliminares indicaron que la fracción soluble
en hexano era activa sobre C. albicans, C. parapsilasis, larvas
de mosquito, A. aegyptii y nematodos, C. elegans y P. redivivus,
mientras que la fracción insoluble en hexano era activa sobre
el nematodo, P. redivivus . . La fracción soluble en hexano se
purificó mediante VLC y MPLC sobre gel de sílice usando
hexano con cantidades crecientes de acetona y finalmente con
MeOH como disolvente de elución. Se recogieron diez
fracciones, AJ, y se analizaron para determinar su actividad
nematicida. La fracción activa B, eluyendo con hexano/acetona,
se purificó adicionalmente mediante TLC preparativa repetida
para producir el compuesto 1.
La fracción insoluble en hexano del extracto de MeOH de
semilla de apio se repartió adicionalmente para producir
fracciones solubles e insolubles en cloroformo. La fracción
soluble en cloroformo fue activa contra P. redivivus. Esta
fracción se fraccionó adicionalmente en fracciones solubles en
hexano y solubles en hexano. La fracción insoluble en hexano
se disolvió en MeOH, se precipitó con agua y se centrifugó. La
purificación de la fracción soluble de MeOH/H2O se llevó a
cabo mediante HPLC en dos columnas JAIGEL­ODS usando
MeOH/H2O. La fracción II (tR ) 48 min) fue activa en P.
redivivus y se purificó adicionalmente mediante HPLC usando
MeOH/H2O como fase móvil para producir una mezcla de los
compuestos 2 y 3 (tR ) 65 min, 12,5 mg).
Esta mezcla se separó en los compuestos 2 y 3 mediante HPLC
usando H2O/THF como fase móvil.
La estructura del compuesto 1 se confirmó mediante datos
espectrales de RMN de 1H y 13C y fue idéntica a los datos
espectrales publicados para la sedanolida (9). Los compuestos
2 y 3 se identificaron como senkyunolide­N y senkyunolide J,
respectivamente, mediante comparación de sus espectros de
CD. Además, los datos espectrales de RMN de 1H y 13C para
los compuestos 2 y 3 fueron idénticos a los datos publicados
(10). El espectro CD del compuesto 2 mostró un efecto Cotton
positivo a 194 nm, lo que indica que el compuesto 2 tiene la
configuración 6S y 7S , mientras que el compuesto 3 mostró
un efecto Cotton negativo a 194 nm, lo que indica que 3 tiene
la configuración 6R y 7R (10 ). Por lo tanto, las identidades
estructurales y estereoquímicas de los compuestos 2 y 3 se
confirmaron como senkyunolide­N y senkyunolida­J (10). Los
compuestos 2 y 3 se informaron previamente de los rizomas
secos de Ligusticum chuangxions (10). Este es el primer
informe del aislamiento de los compuestos 2 y 3 de A.
graveolens.
El compuesto 1 mostró una mortalidad del 100 % (LD100) a
25 y 50 µg ml­1 cuando se probó contra P. redivivus y C.
elegans, respectivamente (Figuras 1 y 2). A 100 µg mL­1, los
compuestos 2 y 3 mostraron una mortalidad del 100 % cuando
se probaron contra P. redivivus (Figura 1). Además, el
compuesto 1 dio una mortalidad del 100 % a 50 µg ml­1 cuando
se probó en larvas de A. aegyptii de cuarto estadio . Los
compuestos 2 y 3 no fueron activos contra las larvas de A. aegyptii delnematicidas
En el bioensayo preliminar, sólo el compuesto 1 dio zonas de
inhibición de 11 mm cada una para C. albicans y
Figura 1. Porcentaje de actividad nematicida contra P. redivivus
para los compuestos 1­3 a las 24 h. El análisis estadístico se realizó
mediante ANOVA (p = 0,01) y las medias se compararon calculando
la diferencia menos significativa (LSD).
Figura 2. Porcentaje de actividad nematicida contra C. elegans para
el compuesto 1 a las 24 h. El análisis estadístico se realizó mediante
ANOVA (p = 0,01) y las medias se compararon calculando la
diferencia menos significativa (LSD).
C. parapsilasis a 100 µg mL­1 en placas de cultivo YMG.
Además, inhibió completamente el crecimiento de C. albicans y
C. parapsilasis a 100 µg mL­1.
Las ftalidas son productos naturales bioactivos y se
encuentran ampliamente en plantas umbelíferas. Además de
su papel en el olor característico del apio, la sedanolida se
informó anteriormente como un compuesto inhibidor de
tumores en la parte anterior del estómago de ratones hembra
A/J al inducir la actividad de la enzima glutatión S­transferasa
(9 ) . La planta tradicional china, Ligusticum chuangxiong, se ha
utilizado para tratar el dolor de cabeza, la anemia, la sensación
de frío y la irregularidad de la menstruación. Senkyunolide­N y
­J se encontraron en los rizomas de L. chuangxiong (10). Estos
resultados apoyan la idea de que las ftalidas son biológicamente
activas. El anillo de lactona de cinco miembros junto con la
cadena lateral de butilo en las ftalidas pueden ser importantes
para las actividades biológicas observadas. Zheng et al. (9)
informaron que el anillo de lactona de cinco miembros en las
ftalidas es importante para la alta actividad de la glutatión S­
transferasa. Los extractos y aceites de semillas de apio, que se
utilizan en perfumería, para aromatizar y condimentar alimentos
y en preparaciones farmacéuticas, también tienen potencial
para usarse en el manejo de plagas agrícolas, si la toxicidad y
los efectos secundarios son mínimos. Las actividades
y antimosquitos
cuarto estadio . de los compuestos 1­3 sugieren
que se requieren más estudios para determinar su posible
toxicidad y efectos secundarios.
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Compuestos bioactivos de la semilla de apio
RECONOCIMIENTO
Los recién nacidos de A. aegyptii fueron suministrados por
los Dres. A. Raikhel y A. Hays, Departamento de Botánica y
Fitopatología, Universidad Estatal de Michigan. Las cepas de (10) Naito, T.; Katsuhara, T.; Nitsu, K.; Ikeya, Y.; Okada, M.;
S. cerevisiae fueron proporcionadas por el Dr. John L. Nitiss,
St. Jude Children's Research Hospital, North Lauderdale, Memphis, TN.
LITERATURA CITADA
(1) Salzer, U. Sobre la composición de ácidos grasos de los lipoides
no volátiles de algunas especias. Fette Seifen Anstrihm. 1975,
446.
(2) Chopra, enfermera registrada; Chopra, IC; Handa, KL; Kapur, L.
D. En Drogas indígenas de la India de Chopra; Publicación de
Dhur and Sons: Calcuta, India, 1958; pág.495.
(3) Satyavati, GV; Raina, MK En Plantas medicinales de la India;
Consejo Indio de Investigaciones Médicas: Nueva Delhi, India,
1976; vol. Yo, págs. 80, 107.
(4) Bjeldanes, LF; Kim, IS Componentes de ftalida del aceite esencial
de apio. J. Org. Química. 1977, 42, 2333­2335.
(5) Tang, J.; Zhang, Y.; Hartman, TG; Rosen, RT; Ho, CT Compuestos
volátiles libres y unidos glicosídicamente en apio fresco (Apium
graveolens L.). J. Agrícola. Química de los alimentos. 1990, 38,
1937­1940.
(6) Guenther, E. En Los aceites esenciales; Van Nostrand: Nuevo
York, 1950; vol. 4, págs. 591­602.
(7) Fehr, D. Hojas esenciales de apio (Apium graveolens).
Farmazie 1974, 29 (5), 349.
(8) Uhlig, JW; Chang, A.; Jen, JJ Efecto de las ftalidas sobre el sabor
del apio. J. Ciencia de los alimentos. 1987, 52, 658­660.
J. Agrícola. Química de los alimentos, vol. 49, núm. 1, 2001 145
(9) Zheng, GQ; Zhang, J.; Kenney, primer ministro; Lam, LKT
Quimioprevención del cáncer de estómago inducido por
benzo[a]pireno en ratones mediante ftalidas naturales del aceite
de semilla de apio. Nutrición. Cáncer 1993, 19, 77­86.
Mitsuhashi, H. Dos ftalidas de Ligusticum chuangxiong.
Fitoquímica 1992, 13 (2), 639­642.
(11) Roth, GN; Chandra, A.; Nair, MG Nuevas bioactividades de los
componentes de Curcuma longa . J. Nat. Pinchar. 1998, 61,
542­545.
(12) Nair, MG; Putnam, AR; Mishra, SK; Mulks, M.
H.; Taft, WH; Keller, JE; Molinero, JR; Zhu, P.­P.; Meinhart, JD;
Lynn, DG Faeriefungin: Un nuevo antibiótico de amplio espectro
de Streptomyces griseus var. au totrophicus. J. Nat. Pinchar.
1989, 52, 797­809.
(13) Chang, Y.­C.; Nair, MG; Nitiss, JL Metabolitos de daidzeína y
genisteína y sus actividades biológicas. J.
Nat. Pinchar. 1995, 58, 1901­1905.
Recibido para revisión el 25 de agosto de 2000. Manuscrito revisado
recibido el 23 de octubre de 2000. Aceptado el 25 de octubre de 2000.
RAM agradece a la Fundación Aga Khan, Ginebra, Suiza, por su apoyo
financiero. Los datos de RMN se obtuvieron de instrumentación que se
compró, en parte, con fondos de la subvención NIH 1­S10­RR04750, la
subvención NSF CHE­88­00770 y la subvención NSF CHE­92­13241.
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