AISLAMIENTO, PURIFICACIN E IDENTIFICACIN DE PRINCIPIOS TXICOS

ALCALOIDALES EN PLANTAS DEL GENERO CROTALARIA Y ALIMENTO

CONTAMINADO PARA AVES








ALBA TERESA ALVAREZ MARTNEZ








UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE QUMICA
BUCARAMANGA
2004
AISLAMIENTO, PURIFICACIN E IDENTIFICACIN DE PRINCIPIOS TXICOS
ALCALOIDALES EN PLANTAS DEL GENERO CROTALARIA Y ALIMENTO
CONTAMINADO PARA AVES




ALBA TERESA ALVAREZ MARTNEZ




Tes is de grado para optar el ttulo de
Mags ter en Qumica




Directora
ELENA E. STASHENKO, Ph.D.





UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE QUMICA
LABORATORIO DE CROMATOGRAFA, CIBIMOL
BUCARAMANGA
2004
TABLA DE CONTENIDO


INTRODUCCIN 1
1 ESTADO DEL ARTE 5
1.1 ALCALOIDES 8
1.2 TOXINAS ALCALOIDALES 12
1.2.1 Alcaloides pirrolizidnicos 15
1.2.1.1 Principales fuentes de PAs 16
1.2.1.2 Utilizacin de las Leguminos as en la agricultura 17
1.2.2 Mecanis mo de accin txica de los alcaloides
pirrolizidnicos 19
1.2.3 Bios ntes is de alcaloides pirrolizidnicos 24
1.2.4 Mecanis mo de defens a de las plantas . 26
1.3 ANLISIS DE ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS 28
1.3.1 Tcnicas de preparacin de mues tras 28
1.3.1.1 Extraccin as is tida por ultras onido 28
1.3.1.2 Extraccin Soxhlet 29
1.3.1.3 Extraccin as is tida por radiacin de microondas 30
1.3.1.4 Extraccin en fas e s lida 31
1.3.2 Mtodos de anlis is de alcaloides pirrolizidnicos 33
1.3.2.1 Anlis is cualitativo de alcaloides pirrolizidnicos por
cromatografa de gas es de alta res olucin 36
1.3.2.2 Determinacin es tructural de alcaloides pirrolizidnicos 37
1.3.2.2.1 Anlis is por GC-MS 41
1.4 ANLISIS ESTADSTICO DE DATOS 42
1.4.1 Anlis is de varianza 44
2 PARTE EXPERIMENTAL 46
2.1 DESARROLLO DEL MTODO ANALTICO 46
2.1.1 Anlis is cromatogrfico 46
2.1.2 Implementacin del mtodo de extraccin 47
2.1.2.1 Extraccin Soxhlet de alcaloides 48
2.1.2.1.1 Limpieza de los extractos de s emilla. 48
2.1.2.2 Extraccin de alcaloides as is tida por ultras onido 49
2.1.2.3 Extraccin de alcaloides as is tida por radiacin de
microondas 50
2.1.2.4 Extraccin de alcaloides con modificacin del pH de
la matrz. 50
2.2 CULTIVO EXPERIMENTAL 50
2.2.1 Anlis is de s uelos 51
2.2.2 Es pecies de plantas utilizadas 51
2.2.3 Condiciones de es trs aplicadas s obre material vegetal 52
2.2.3.1 Es trs por herbivora natural 52
2.2.3.2 Es trs por herbivora s imulada 54
2.2.3.3 Es trs hdrico 54
2.2.3.4 Es trs por herbicidas 54
2.2.3.5 Blanco de es trs 55
2.2.4 Anlis is de material vegetal 55
2.2.4.1 Anlis is preliminares en follaje, s in es trs ambiental. 55
2.2.4.1.1 Limpieza de los extractos de follaje. 56
2.2.4.2 Anlis is de follaje en condiciones de es trs ambiental. 57
2.3 CARACTERIZACIN ESPECTROSCPICA 57

3 RESULTADOS 59
3.1 DESARROLLO DEL MTODO ANALTICO. 59
3.1.1 Determinacin de factores de res pues ta. 59
3.2 IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS
POR CROMATOGRAFA DE GASES/ESPECTROMETRA
DE MASAS 62
3.3 IMPLEMENTACIN DEL MTODO DE EXTRACCIN DE
PAS 72
3.3.1 Anlis is preliminar en s emillas 72
3.3.2 Anlis is de varianza 73
3.3.3 Seleccin del mtodo de extraccin de PAS 78
3.4 CARACTERIZACIN DE FOLLAJE 82
3.4.1 Anlis is preliminares 83
3.4.2 Condiciones de es trs ambiental 85
3.4 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE
ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS EN CROTALARIAS 93
3.5.1 Alcaloide en s emillas de Crotalaria retusa 93
3.5.2 Alcaloides en s emillas de Crotalaria nitens 101
3.6 ANLISIS DE ALIMENTO CONTAMINADO 104
4. CONCLUSIONES 106
5. RECOMENDACIONES 108

BIBLIOGRAFA 109
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 120
ANEXO 1 130
ANEXO 2 136



LISTA DE TABLAS


Tabla 1. Clas ificacin de alcaloides por grupos . 10
Tabla 2. Seales qumicas por RMN 13C para alcaloides pirrolizidnicos
monos ter de bas es necinas ins aturadas [ 75] . 39
Tabla 3. Seales qumicas por RMN 13C para alcaloides pirrolizidnicos
dis ter macrocclicos de bas es necinas ins aturadas [ 75] . 40
Tabla 4. ANOVA de dos factores con ms de una lectura por mues tra. 45
Tabla 5. Repetibilidad de la medicin de los factores de res pues ta
para el es tndar interno, difenilamina, por GC/FID. 60
Tabla 6. Repetibilidad de las reas cromatogrficas a
diferentes concentraciones de difenilamina (ISTD), por GC/FID 61
Tabla 7. Alcaloides ais lados en Crotalaria nitidula. 63
Tabla 8. Niveles s uperior e inferior para los factores pH y tiempo 73
Tabla 9. Valor de y (conce ntracin) para las rplicas de l PA (Ik 2397),
s egn mtodo de extraccin. 74
Tabla 10. Valores promedio de concentracin relativa al is td para el PA
con Ik 2397. 75
Tabla 11. Efecto de cada factor y de las interacciones entre dos factores . 75
Tabla 12. Valor del parmetro F. 76
Tabla 13. Caracterizacin de s uelos . 83
Tabla 14. Tiempos de s iembra y recoleccin de follaje en anlis is
preliminares. 84
Tabla 15. Tiempos de s iembra y recoleccin de follaje en condiciones de
estrs ambiental. 86

viii


Tabla 16. Variacin del contenido de PAs en Crotalarias , bajo divers as
condiciones de es trs . 87
Tabla 17. Seales qumicas por RMN 13C para el alcaloide ais lado en
semillas de Crotalaria retusa. 98
Tabla 18. Des plazamientos qumicos (d, ppm) de los hidrgenos en el
es pectro de RMN 1H del alcaloide ais lado en s emillas de
Crotalaria retusa. 99


ix


LISTA DE FIGURAS


Figura 1. Es tructuras de compues tos aromticos producidos por plantas . 6
Figura 2. Alcaloides derivados de aminocidos de ornitrina y lis ina. 9
Figura 3. Es tructuras del cido lis rgico y compues tos relacionados . 9
Figura 4. Es tructuras de algunas drogas alcaloides . 11
Figura 5. Es tructura qumica de la Saxitoxina PSP. 12
Figura 6. Es tructuras qumicas de micotoxinas producidas por el
hongo As pergillus flavus . 13
Figura 7. Es tructuras de algunos alcaloides pirrolizidnicos detectados
en especies de Crotalaria. 18
Figura 8. Es tructuras bas e de alcaloides pirrolizidnicos . 20
Figura 9. Equipo de extraccin Soxhlet. 30
Figura 10. Equipo de extraccin en fas e s lida (SPE). 32
Figura 11. Deteccin de PAs con el reac tivo de Erlich
(reaccin de color). 34
Figura 12. Frmulas es tructurales de fragmentos de cidos necnicos . 38
Figura 13. Dos es pecies de Crotalaria A. C. retus a y B. C. nitidula. 52
Figura 14 Polilla 1, Utetheis a ornatrix Hubner. 53
Figura 15. Polilla 2. Familia Notodontidae. 53
Figura 16. Es tructura qumica de la Atrazina. 55
Figura 17. Es pectro de mas as del alcaloide pirrolizidnico con Ik 1499. 64
Figura 18. Pos ibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con Ik 1499. 64
Figura 19. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con Ik 2096. 65
Figura 20. Pos ibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con Ik 2096. 66
Figura 21. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con Ik 2195. 67

x
Figura 22. Pos ibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con
Ik 2195 experimental. 67
Figura 23. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con Ik 2397. 68
Figura 24. Pos ibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con Ik 2397
experimental. 69
Figura 25. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con Ik 2497. 69
Figura 26. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con Ik 2499. 70
Figura 27. Pos ibles es tructuras de alcaloides pirrolizidnicos con Ik
experimentales 2497 y 2499. 70
Figura 28. Variacin del contenido de PA (Ik 2397), s egn
mtodo de extraccin. 77
Figura 29. Eficiencia de la extraccin de alcaloides pirrolizidnicos para
diferentes tiempos de extraccin, s in modificacin de pH. 79
Figura 30. Eficiencia de la extraccin de alcaloides pirrolizidnicos para
diferentes tiempos de extraccin y pH. 80
Figura 31. Eficiencia de la extraccin de alcaloides pirrolizidnicos . 81
Figura 32. Cromatogramas tpicos para evaluar el contenido del
alcaloide en 40 g de follaje de Crotalaria retus a, a 150 das
de crecimiento, inyeccin s plitles s . FID. 85
Figura 33. Cromatogramas tpicos de extractos de follaje de Crotalaria
retusa, obtenidos por extraccin as is tida por radiacin de
microondas . MSD. A. Es trs por herbivora. B. Es trs hdrico. 89
Figura 34. Cromatogramas tpicos de extractos de follaje de Crotalaria
nitidula, obtenidos por extraccin asistida por radiacin de
microondas . MSD. A. Es trs por herbivora; B. Es trs hdrico. 89
Figura 35. Variacin en la compos icin de PAs en Crotalaria retusa
s egn condiciones de es trs . 91
Figura 36. Es tructura qumica de la loliolida. 92
Figura 37. Es pectro de mas as de la monocrotalina. 94

xi

Figura 38. Es tructura qumica de la monocrotalina. 94
Figura 39. Pos ibles rutas de fragmentacin de la monocrotalina. 95
Figura 40. Es pectro infrarrojo del alcaloide (monocrotalina) ais lado en
s emillas de Crotalaria retusa. 96
Figura 41. Pos ibles es tructuras por DRX para el alcaloide denominado
monocrotalina. 100
Figura 42. Es pectro infrarrojo de alcaloide "A", ais lado de Crotalaria
nitens. 102
Figura 43. Es pectro infrarrojo de alcaloide "B", ais lado de Crotalaria
nitens. 102
Figura 44. Es pectros de mas as de los alcaloides "A" y "B", ais lados de
Crotalaria nitens. 103
Figura 45. Cromatogramas tpicos de extractos en alimento para aves .
A. Alimento contaminado con s emillas de Crotalaria retus a;
B. B. Alimento para aves (Blanco). FID. 104




xii


LISTA DE ESQUEMAS


Es quema 1. Ruptura enzimtica de glicoalcaloides . 15
Es quema 2. Bios ntes is de alcaloides pirrolizidnicos . 25
Es quema 3. Interacciones exis tentes entre factores medioambientales . 27
Es quema 4. Proces o de particin en fas e s lida. 33
Es quema 5. Formacin de iones caracters ticos en el es pectro de mas as
de la retronecina. 65
Es quema 6. Ruta de fragmentacin de la licops amina. 68
Es quema 7. Es quema de fragmentacin de alcaloides pirrolizidnicos
dis ter macrocclicos de bas e necina s aturada. 71

xiii


LISTA DE ABREVIATURAS

CIBIMOL Centro de Inves tigacin en Biomolculas
CI-MS Chemical ionization (Ionizacin Qumica)
DSP Diarrheic s hellfis h pois oning (Veneno dis enterico de crustceos)
FAB Fas t atom bombarding (Bombardeo con tomos acelerados )
FID Flame Ionization Detector (Detector de ionizacin en llama)
GC/MS Cromatografa de gas es acoplada a es pectrometra de mas as
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografa
lquida de alta eficiencia)
HRGC High Res olution Gas Chromatography (Cromatografa de gas e s
de alta resolucin)
HRGC/MSD High Re s olution Gas Chromatography/Mas s Selective Detector
(Cromatografa de gases de alta res olucin acoplada a un
detector s electivo de masas)
Ik

ndice de retencin de Kovts
IR Es pectros copa infrarroja
TF-IR Es pectros copa infrarroja con trans formada de Fourier
ICN Ins tituto de Ciencias Naturales de Colombia
ISTD Es tndar interno
LD
50
Dos is letal media
RMN Espectroscopa de res onancia magntica nuclear
RMN
13
C Es pectros copa de res onancia magntica nuclear de carbono-13
NPK Nitrgeno, fs foro y potas io
Mw Microondas
PSP Paralitycal shellfish pois oning (Veneno paralizante de
crustceos)

xiv
PAs Pyrrolizidine Alkaloids (Alcal oides pirrolizidnicos )
R
f
Factor de res pues ta
SFE Supercritical Fluid Extraction (Extraccin con fluido
supercrtico)
SNC Sis tema nervios o central
Sx Soxhle t
TLC Thin Layer Chromatography (Cromatografa en capa fina)
tR Tiempo de retencin
t
RR
Tiempo de retencin relativo
Us Ultras onido


xv

TTULO: AISLAMIENTO, PURIFICACIN E IDENTIFICACIN DE PRINCIPIOS TXICOS
ALCALOIDALES EN PLANTAS DEL GNERO DE CROTALARIA Y ALIMENTO
CONTAMINADO PARA AVES *AUTOR: ALBA TERESA ALVAREZ MARTNEZ


PALABRAS CLAVES : Alcaloides pirrolizidnicos, Crotalaria, extraccin asistida por radiacin
de microondas (MW), orugas, estrs ambiental.


Las Crotalarias son leguminosas ampliamente utilizadas en tcnicas de rotacin de cultivos
por su habilidad de fijar nitrgeno en el suelo, retardando procesos de erosin de los
mismos. La contaminacin de granos y alimentos para animales especialmente aves, con
semillas de Crotalaria que contienen alcaloides pirrolizidnicos, ha sido un tema de especial
atencin en las ltimas dcadas, tanto por su importancia econmica as como por los
problemas de hepatoxicidad y neumotoxicidad que generan.


Es conocido que estos alcaloides juegan un rol en las funciones ecoqumicas en plantas de
las especies de Senecio y Crotalaria; la int eraccin ms aceptada comprende la relacin
planta-insecto herbvoro, el cual ha desarrollado mecanismos de detoxificacin a estos
metabolitos secundarios. La sntesis de estos alcaloides por parte de las plantas considera
otras formas de estrs ambiental. implicaciones que se relacionan con la supervivencia de la
planta.


El objetivo de este trabajo fue establecer la variacin en los contenidos de alcaloides
pirrolizidnicos en dos especies de Crotalaria, sujetas a diferentes condiciones de estrs
ambiental. Se hicieron extracciones del material vegetal y de semillas, asistidas por radiacin
de microondas (metanol, 5 min.). Los tipos de estrs incluyeron, estrs por herbivora,
herbivora simulada e hdrico. En los extractos se identificaron varios compuestos derivados
de la retronecina, que constituye la estructura base de los alcaloides pirrolizidnicos. El
estrs por herbivora se llev a cabo con orugas de las familias Artiidae y Notodontoidae, en
su ltimo periodo larval (instar) observndose mayor numero de alcaloides comparado con
los otros tipos de estrs.







* Tesis de grado
** Facultad de ciencias,
Escuela de Qumica
Maestra en qumica
Directora: Elena E. Stashenko, Qumica Ph.D.




xvi
TITLE: ISOLATION, PURIFICATION AND IDENTIFICATION OF ALKALOID TOXIC
PRINCIPLES IN PLANTS OF THE GENERA OF CROTALARIA AND CONTAMINATED
FOWL FOOD

AUTOR: ALBA TERESA ALVAREZ MARTNEZ

KEY WORDS: Pyrrolizidine alkaloids, Crotalaria, extraction attended by microwaves radiation
(MW), caterpillars, environmental stress.


The Crotalarias are leguminous widely used in rotation technical cultivation using theirs ability
to fix nitrogen in soils which detains erosion processes. The grain and food contamination for
animals especially for fowl, with seeds of Crotalaria that contain pyrrolizidine alkaloids, it has
been a topic of special attention in the last decades, as by its economic importance as by the
hepatotoxic and neumotoxic problems that it generates.


It is known that these alkaloids play a role i n the ecochemist functions in plants of the specie
of Senecio and Crotalaria; the most accepted interaction understands the relationship plant
herbivorous insect, which has developed mechanisms of detoxificacin to these secondary
metabolits. The synthesis of these alkaloids from those plants considers other forms of
environmental stress, implications that are related to the survival of the plant.


The aim of this work was to establish the variation in the contents of pyrrolizidine alkaloids in
two types of Crotalaria, they were subjected to different conditions of environmental stress.
They were made extractions of the solid material and seeds, attended by microwave radiation
(methanol, 5 min). The types of stress included were, herbivory, simulated herbivory and
hidric stress. In the extracts were identified several compounds derived from the retronecin,
that constitutes the structure base of the pyrrolizidine alkaloids. The herbivory stress was
carried out with caterpillars of the Artiidae and Notodontoidae families, in its last larvar period
(instar), it was observed greater number of alkaloids extracted, compared to the others types
of stress.




** Sciences Faculty,
Chemistrys School
Magister chemistry
Director: Elena E. Stashenko, Chemist, Ph.D.






INTRODUCCIN


En la bs que da de me jorar las formas tradicionale s de cultivo, e l hombre ha
incorporado en l os s uelos diversos productos qumicos, algunos de e llos
nocivos para la s alud humana; tales rutinas logran mayores niveles de
productividad del alime nto con la prdida de l valor cultivable de los s ue los .
Sin e mbargo, e n las ltimas dcadas e s ta prctica ha s ido re e mplazada con
tcnicas de rotacin de cultivos , con la incorporacin s uce s iva de plantas
fijadoras de nitrgeno, habitualmente con Leguminos as , incluidas las de l
gnero Crotalaria.

Sin embargo, es ta prctica agrcola pue de provocar la contaminacin de
granos y alime ntos pre parados a bas e de s orgo, con s e millas de Crotalaria,
las cuales e n ltimo trmino se incluyen en la dieta de los animale s ,
e s pe cialme nte ave s . La inge s tin de los alcaloide s pirrolizidnicos pre s e nte s
tanto en la planta como en las s emillas de Crotalaria, puede dis minuir el ritmo
de cre cimie nto de los animale s y caus ar s u intoxicacin, originando grande s
prdidas econmicas a pequeos y grandes avicultores .

El cons umo de alime ntos , que contie ne n alcaloide s pirrolizidnicos , origina
les iones tales como necros is hemorrgica irrevers ible, cirros is heptica, dao
pulmonar, alteraciones carcinognicas y teratognicas [1-4] . Las
alteraciones teratognicas , desempean un papel muy importante en las
enfermedades de los animales por herencia, pueden caus ar defectos
esquelticos y drmicos , los cuales hacen al animal ms susceptible a

2
enfermedades por agentes patgenos . Estudios previos e s table ce n
conce ntracione s de alcaloide s pirrolizidnicos a nive le s de has ta un 5 % e n
pes o s eco de s emilla [ 5] .

La toxicidad de alcaloide s pirrolizidnicos ha s ido atribuida a la formacin de
pirrole s re activos a partir de s te re s de 1,2 dihidropirrolizdinas [6,7] . Las
dos is letale s s on de l orde n de LD
50
= 75 mg del txico (monocrotalina)/kg de
peso c orporal, determinadas mediante e xpe rime ntos c on r at as [8] , lo que
clas ifica a es ta s us tancia como altamente txica (Clas ificacin II EPA),
e s tableciendo que el 50 % de los animales expues tos a s ta dos is , mueren.

La contaminacin c on alcaloides pirrolizidnicos , tambin pue de ocurrir e n
productos alimenticios de cons umo humano, e.g l a mie l. S in e mbargo, los
mayores regis tros que s e han docume ntado s e es tablecen por cons umo del t
de plantas que contienen alcaloides pirrolizidnicos , algunos de ellos s olubles
en agua [9-11] .

El control de calidad de los alimentos , es un tema de es pecial atencin para la
Comunidad Andina de Naciones (como se es tablecien el Protocolo de
Bios eguridad, mayo 1999) debido a l a restriccin en la come rcializacin
internacional de productos alimenticios eventualmente contaminados con
me tale s pe s ados , pe s ticidas , impure zas botnicas y otros productos txicos ,
en la que s e incluyen los alcaloides pirrolizidnicos [ 12,13] .

Esta s ituacin no puede des ligars e de las implicaciones econmicas que
conlle va, pue s to que para e l cas o colombiano, e l volume n de produccin de
alime ntos como e l s orgo e s comparable al de pas e s como Ve ne zue la, de l
orden de 222 Mil. ton/ao (datos promedio de 2002), lo que e quivale a
US$ 25530.000 para la produccin nacional de s orgo, te nie ndo e n cue nta un

3
pre cio prome dio de re fe re ncia de 115 US$/ton, e s table cido por e l s is te ma
andino de franjas de precios [ 14,15] .

La problemtica del control en la calidad de los productos agrcolas y
alime nticios , s e ce ntra e n la care ncia de normas o e s pe cificacione s tcnicas
para la extraccin y cuantificacin de alcaloides pirrolizidnicos , debido a las
dificultades tcnicas y analticas por la pres encia de s us tancias interferentes ,
de ntro de las cuale s s e incluye n prote nas , gras as , flavonoide s y clorofilas ,
e tc. El conte nido prote ico y de gras as e n mue s tras de alime nto, no pe rmite n
proces os eficiente s de extraccin del alcaloide con s olventes polares , debido
a la solubilidad de algunas protenas , las cuales tienden a aglomerars e
impidie ndo conce ntrar e l analito para s u pos te rior de te ccin; as mis mo, las
grasas pueden interferir cuando se tienen alcaloides lipoflicos , con
es tructuras s us ceptibles de sufrir hidrlis is en proces os de
trans es terificacin. Adicionalmente, los procedimientos tradicionales de
e xtraccin, e mple an periodos largos de tie mpo y grandes cantidade s de
muestra.

En e l pres ente trabajo, se realizla identificacin y cuantificacin de
alcaloide s pirrolizidnicos , pre s e nte s e n s e milla y follaje de dos (2) e s pe cie s
de Crotalaria, una de las cuales fue detectada en cultivos de s orgo
colombiano.

Se es tablecieron los niveles del alcaloide en la planta, en diferentes
condiciones de es trs ambiental , mediante la implementacin de una
metodologa rpida, s ens ible y s egura para la extraccin y deteccin de es tas
sustancias txicas.


4
Para la extraccin de los alcaloides en s emilla y follaje se e mple aron
diferentes tcnicas de ais lamiento, tales como extraccin Soxhlet, extraccin
asistida por ultras onido y/o por radiacin de microondas , imple me ntandos e
s ta ltima para el anlis is de alcaloides pirrolizidnicos (PAs ). El es tudio de
la compos icin e identificacin de los alcaloides pirrolizidnicos , s e realizpor
cromatografa de gas es de alta res olucin (HRGC) con detectores de
ionizacin en llama (FID) y s electivo de mas as (MSD).

Inicialmente, se realiz la identificacin tentativa de los alcaloides
pirrolizidnicos con base en sus ndices de retencin de Kovts y la
cuantificacin se lleva cabo por el mtodo de e s tandarizacin interna;
detectndos e por GC/MS la pres encia de 6 alcaloides en s emilla de Crotalaria
nitidula y 8 e n follaje de Crotalaria retusa, con la utilizacin de la tcnica de
extraccin as is tida por radiacin de microondas .

Res ultados parciales de la pres ente inves tigacin, fueron pres entados en el IX
Congres o Latinoamericano de Cromatografa y Tcnicas Afines , COLACRO IX
y e n e l 3
e r
. Congres o Colombiano de Cromatografa celebrados en Cartagena
de Indias , Colombia, e n fe bre ro de 2002. Asmis mo, s e participcon e l
trabajo "The use of puls e d s plitles s injection for trace detection of toxic
pyrrolizidine alkaloids in food", en el 24
th
International Sympos ium on
Cromatography, realizado en Leipzig, Alemania, en s eptiembre de 2002.





5

1 ESTADO DEL ARTE

Las plantas pos e e n una gran capacidad para producir s us tancias altame nte
complejas . Algunas de s tas son productos de su metabolis mo primario,
ne ce s arias para lle var a cabo funcione s normale s de nutricin. Sin e mbargo,
las plantas s e han es pecializado en la produccin de otro tipo de compues tos
neces arios para su s upervivencia y reproduccin, los cuales , se han
es tablecido como s ubproductos del metabolis mo s ecundario.

Durante e l proceso evolutivo, las plantas des arrollaron un complejo
mecanis mo de interaccin mutua adecuado para s u proces o de reproduccin,
entre los organismos vivos alrededor de la mis ma (e .g. los ins ectos ); sin
embargo, e xis te n organis mos pe rjudiciale s que pue de n alte rar su ritmo de
crecimiento, con lo cual s e activan proces os encaminados a la elaboracin de
s us tancias , algunas txicas para el s er humano por inges tin, pero de utilidad
para la planta como mecanismo de defensa.

Dentro de l conjunto de s us tancias producidas por las plantas , s e pue de n
enumerar [ 16] :
Lpidos: A. Hidrocarburos saturados e ins aturados ; B. Hidrocarburos
funcionales e.g. alcoholes , aldehdos, cetonas , s teres , cidos gras os ;
C. Hidrocarburos terpnicos e.g. hemiterpenos , C
5
, monoterpenos , C
10
;
s es quiterpenos , C
15
; diterpenos , C
20
; triterpenos , C
30
; tetraterpenos , C
40
.

Compues tos aromticos : A. Fenlicos e.g. taninos y flavonoides (Figura 1);
B. compues tos no fenlicos , e.g. clorofila y auxinas

Carbohidratos , aminas , protenas , cidos nucleicos y alcaloides

6
Figura 1. Es tructuras de compues tos aromticos producidos por plantas.





































OH
OH
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
C
H
O
O
R5
R3
R4
R
R1
R2
N
H
CO
2
H
N
N N
N
O
R
MeO
2
C
Mg
O
O
OH
O H
OH
OH
OH
OH
OH
O H
COOH
Flavonas
Isoflavonas
Dihidroflavonoles
Chalconas
Flavonole
Flavanonas Auronas
Antocianinas
Auxina
Clorofila a R= CH3
Clorofila b R= CHO
A. COMPUESTOS AROMTICOS NO FENLICOS
B. COMPUESTOS AROMTICOS FENLICOS
Hidroquinona
Resorcinol
Catecol
Timol
Simples
Flavonoides
Taninos
Acido glico
Acido indl actico


7
Los compues tos fenlicos , terpenos y las toxinas nitrogenadas (glucos inolatos
y alcaloides ) se cons ideran como parte del proces o del metabolis mo
s e cundario. En e s te s e ntido s e de fine n los compue s tos s e cundarios , como
s us tancias e colgicame nte e ficace s de vala para la planta e n re lacione s de
mutualis mo, competencia y proteccin [ 17] ; dentro del grupo de compues tos
con mayor atencin para s u es tudio s e hallan los alcaloides .

En los s is te mas vegetales , cerca del 40% de la totalidad de familias de
plantas contienen al me nos una especie que produce alcaloides ; la mayor
incidencia de dichas s us tancias se pres enta en las familias de las
Leguminos as , Solanceas y las Compues tas.

Algunos alcaloides s on cons iderados toxinas (s us tancias qumicas con efectos
potencialmente txicos sobre humanos, como res ultado de su ocurrencia
natural en los alimentos y el medio ambiente). Tal es el cas o de los alcaloides
del tipo pirrolizidinas , los cuale s pos e e n una marcada accin hepatotxica
s obre mamferos, por ingestin de sus extractos acuosos (e .g. Senecio
formosus) y/o cons umo de alimentos proces ados contaminados con alcaloides
de plantas del gnero de las Crotalarias [ 10,11] .

Las s us tancias txicas , e n ge ne ral penetran al organis mo por dos grandes
vas . La prime ra e s la va pulmonar, que tie ne un pape l primordial e n e l cas o
de txicos que pueden pres entars e e n la atms fera. La otra va e s la
dige s tiva, la cual e s la ms comn, dado que la mayora de los txicos s e
encuentran e n e l s entido ms amplio del trmino, e n diferentes
concentraciones en los alimentos tanto de origen animal, como vegetal y en el
agua. A pes ar de que es ta va de penetracin de las s us tancias txicas es en
general, menos e ficaz que la pulmonar, no por e llo es menos importante,

8
cons ide rando la gran pos ibilidad de difus in de los compue s tos txicos e n la
alimentacin humana y animal.

El orige n de las toxinas e n alime ntos pue de s e r por plantas , que contie ne n
s us tancias txicas , bacte rias , algas , hongos y animale s . Los tipos de toxinas
pre s e nte s e n alime ntos s on e n s u mayora de tipo alcaloidal; las principale s
toxinas c omprenden: glucos inolatos , ficotoxinas (en comida de mar),
micotoxinas, e strgenos (es teroides ), compuestos alergnicos, toxinas
bacteriales , y alcaloides pirrolizidnicos , entre otros [1] .

1.1 ALCALOIDES

Los alcal oides s on molculas cclicas cons ideradas como la ms divers a clas e
de metabolitos s e cundarios de rivados de molculas de aminocidos , de los
cuales s e conocen alrededor de 5000 compues tos .

Los diferentes tipos es tructurales de alcaloides que se encuentran, s e
res umen en:

Derivados de aminocidos aromticos de fenil alanina y tiros ina;
Derivados de los aminocidos de ornitina y lis ina (
Figura 2);
Derivados del cido lis rgico (Figura 3).

La clas ificacin de los alcaloides estbas ada en una mezcla de criterios
qumicos y botnicos con la cual, s tos tambin pueden agrupars e de acuerdo
con la familia de plantas de la que provienen, como s e des cribe en la Tabla 1.

9
La clas ificacin segn es tructura qumica se lleva a cabo s obre las
pirrolidinas , piridinas y alcaloides indlicos [ 18] .

Figura 2. Alcaloides derivados de aminocidos de ornitrina y lis ina.

















Figura 3. Es tructuras del cido lis rgico y compues tos relacionados .







N
O
O
O
N
C H
3
N H
2
OH
N
H
N-CH
3
O H O
Ergotamina
Acido lis rgico

PIRROLIDINAS
H
N MeCOCH
2
CH
2
OH H
O H
N
H
N
N
H
H
N
N
CH
3
O
N
CH
3
O
CH CH
2
OH
Atropina
PIPERIDINA
Isopeletierina
Retronecina
PIRROLIZIDINA
QUINOLIZIDINA
Esparteina
PIRIDINA
Nicotina


10


La accin fisiolgica de l os alcaloides es muy variada; pueden producir
dilatacin de la pupila ocular (atropina), marcada accin e s timulante s obre e l
s is te ma ne rvios o ce ntral (SNC) e .g cocana, vas odilatacin e .g. papave rina,
accin expectorante e.g. emetina, accin s imultnea depres ora y es timulante
e.g. morfina, accin diurtica y es timulante del SNC e .g. cafe na, te obromina,
teofilina (Figura 4) [ 19] .

Tabla 1. Clas ificacin de alcaloides por grupos .

Grupo de
alcaloide
Eje mplo Grupo de
alcal oide
Eje mplo
Del opio
a
morfina, apomorfina,
tebana, codena,
dihidrocodena,
papaverina
fedra efedrina, clorhidrato
de s eudoefedrina,
trifolidina
Tropano atropina
belladona
homotropina,
benzotropina,
Fis os tigmina salicilato de
fis os tigmina
neostigmina (me til
sulfato)
Xantina
c
cafena,
teobromina,
te ofilina
Chinchona
a
quinina
es tricnina
quinacrina
Ipecacuana
a
cefaleina fenlica,
e me tina
Rauvolfia res erpina

Ergot
b
colchicina,
ergotamina
Otros
Alcaloides
aconitina, pilocarpina,
niquetamida cocana
a
Alcaloides quinlicos e is oquinlicos
b
Alcaloides indlicos
c
Alcaloides
purnicos [ 19,21]

11


Figura 4. Es tructuras de algunas drogas alcaloides.























Compue s tos tale s como e l opio y la cocana, fue ron utilizados e n s us inicios
para e l alivio de dolore s inte ns os por le s ione s fs icas ; s in e mbargo, muchos
R
2
O
O
N
H
H
R
1
O
CH
3
6
7
8
14
N
O-CH
3
O-CH
3
CH
3
-O
CH
3
-O
N
N
O O
R1
R2
H
H
H
H
H
N
N
H
H
H
CH
3
OMe
H
3
COOC
H
R
1
O R
2
OH H
NHCH
3
H
CH
3
N
H
OH
C H
3
Morfina : R
1
=R
2
= H
Codeina: R
1
= H, R
2
= CH
3
Papaverina
Estricnina : R1 = R2 = H
Reserpina: R
1
= O-CH
3
R
2
= 3,4,5-trimetoxibenzoilo
D- Efedrina
Atropina


12
de los compue s tos me ncionados , por s u us o continuado cre an hbito y/o
deterioro fs ico y mental [ 20] .


1.2 TOXINAS ALCALOIDALES

Los alcaloide s e xis te n e n anfibios , organis mos marinos y microorganis mos ;
los ejemplos ms repres entativos s on:

La ne urotoxina e xis te nte e n la piel de una e s pe cie de rana venenos a
Colombiana (Dendrobates lehmanni); s us tancia utilizada por e l animal
como mecanis mo de defens a.

La te trodotoxina (ficotoxina) pre s e nte e n e l s is te ma re productor de un
tipo de pez globo japons y en otros anfibios s uramericanos.

De ntro de las ficotoxinas ms importante s s e e ncue ntran la PSP (Paralitycal
s hellfis h pois oning) y la DSP (Diarrheic s hellfis h pois oning). Exis ten cerca de
veinte PSPs , las cuales s on todas s olubles en agua y cuya es tructura bas e es
una tetrahidro purina s us tituida. Las toxinas ms poderos as son las
s axitoxinas (Figura 5) y las tetradotoxinas [ 1] .

Figura 5. Es tructura qumica de la S axitoxina PSP.






NH
N
+
N
N H
H
2
N
O
O
N H
2
H
N
OH
R
H
2
+

13




Por otra parte , los alcaloide s e n plantas s e pue de n producir por la pre s e ncia
de hongos toxignicos , originando la infe ccin de la planta y producie ndo
micotoxinas (Figura 6), cuyas es pecie s ms re pre s e ntativas pe rte ne ce n a los
gneros Fusarium, Alternaria y Aspergillus. El ataque de los hongos pue de
darse en cereales des pus de la cos echa, durante el trans porte o
almacenamiento si las condiciones ambientales para su produccin s on
favorables (temperaturas entre 12 a 41 C, humedad relativa del 70 a 80 % y
humedad s obre los granos del 15 %).

Figura 6. Es tructuras qumicas de micotoxinas producidas por el hongo
Aspergillus flavus.











Las micotoxinas , son toxinas de accin carcinognica en s eres humanos y
animales , son protenas con divers os compues tos de alta actividad
farmacolgica. Las micotoxinas pueden s er de carcter exgeno o endgeno,
O O
O R
O
O O
CH
3
O O
O
O
O
R"
O
R CH
3
CH
2
CH
2
-O Aflatoxina G
1
Aflatoxina B
2
Aflatoxina G
2
Aflatoxina B
2
a
Aflatoxina G
2
a
CH
2
-CH
2
CH
2
-CH
2
-O
CH
2
-CH
2
CH
2
-CH
2
-O
H
H
OH
OH
R R"
Aflatoxina B
1
R

14
s e gn e l lugar de s u produccin e n e l hongo. De e s te tipo de alcaloide s s e
conoce su marcada accin neurotxica, siendo stos res pons ables de los
problemas de vas ocons triccin o adelgazamiento de vas os s anguneos , lo que
conduce a la muerte de te jidos por dis minucin e n la irrigacin s angune a
(ergotismo) [ 22, 23] .

Se gn re gis tros his tricos , una alta tas a de mortalidad ocurrida e n la Edad
Me dia, s e as ocicon e l cons umo de pan de ce nte no contaminado; e l hongo
res pons able fue el Claviceps prupurea (Ergot) [ 1, 24] .

Los glicoalcaloides o glucos inolatos , s on otro tipo de metabolitos s ecundarios
pres entes en plantas que contienen glics idos . Los glics idos s on un grupo de
s us tancias unidas a azcare s , las cuale s me diante hidrlis is , conduce n a la
formacin de aldehdos , cetonas y cianuros orgnicos (glics idos
cianognicos ).

La funcin principal de los glicoalcaloides es s ervir como mecanis mo qumico
de de fe ns a de la planta ante cie rtos de pre dadore s , tales como pe s te s de
ins ectos , con efectos inhibitorios a la accin de los hongos .

Las plantas que pos e e n glucos inolatos con glics idos que contie ne n azufre ,
pertenecen a l a familia de las Bras s icaceas, por e je mplo las s e millas de
mos taza (B. juncea,y B. nigra), e n ve ge tale s como re pollo, brcoli y coliflor;
glics idos cianognicos en plantas de la familia Solancea como e l tomate , la
papa y en especies del gnero Sorghum [ 25] .

Plantas como el s orgo, son utilizadas como recurso forrajero del s ue lo;
dichas plantas son la principal die ta de animales c omo los rumiantes y
cons tituyen la principal caus a de intoxicacin en es tos animales . La cantidad

15
de cido cianhdrico que pue de s e r inge rida por animale s (no lactante s ) de
500 kg es de 500 ppm, lo que equivale al cons umo de 2 kg de materia s eca de
s orgo; a s u ve z, e n rumiante s e n lactacin, e l nive l de tole rancia e s de 1630
mg HCN/kg materia s eca [ 26].

Exis ten cerca de 100 tipos de glucos inolatos , los cuales exhiben propiedades
anticarcinognicas . Sin embargo, los efectos txicos s e deben principalmente
a que conducen para el cas o de los glics idos cianognicos (por ruptura de la
molcula en pres encia de -glucosidasa produciendo cido cianhdrico
(Es quema 1), a la atrofia de l ne rvio ptico, complicacione s en el s is tema
ne rvios o ce ntral, parlis is mus cular y al ce s e de los proce s os de re s piracin
celular; anemia debida a los glics idos pirimidnicos , etc. [ 22].

Esquema 1. Ruptura enzimtica de glicoalcaloides .



R
N-OSO
3
S-C
6
H
11
O
5
R1
R2
O-C
6
H
11
O
5 CN
R
NH
SH

HO-C
6
H
11
O
5
R SC N
N R
H
2
O
R1
R2
CN
OH
R1
R2
O HC N
R1
R2
CN
OH
H2O
-Glicosidasa
Tioglucosidasa
C
Nitrilo
Tiocianato
+
+

16
1.2.1 ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS

Los alcaloide s pirrolizidnicos (PAs ) pe rte ne ce n al s e gundo tipo e s tructural,
son e l gr upo de alcaloides s imples ms venenos os ; S e e s t i ma e n 8000
especies e l nme ro de plantas que contie ne n PAs , las cuale s a su ve z
corres ponden al 3 % del total de plantas que florecen.


1.2.1.1 Principales fuentes de PAs

Las familias de plantas ms ampliamente es tudiadas , c orresponden a las
Boraginaceas , Compuestas y las Le guminos as ; de ntro de las Le guminos as ,
tan s olo las del genero Crotalaria contienen alcaloides pirrolizidnicos ; en las
Boraginceas ocurren en todos los gneros (200 especies en el genero
Heliotropium) y e n las Compue s tas s e han hallado e n ce rca de 160 e s pe cie s
con alcaloides txicos [27] . En s ta ltima familia de plantas (gnero
Astearaceas), se encuentran alcaloides pirrolizidnicos principalmente e n
plantas del gnero Senecio (S. formosus, S. vulgaris, S. callosus y S.
bracteatus) las cuale s s on ampliame nte utilizadas e n re me dios he rbale s para
infus in de s us hojas ; provocando in toxicacin por inges tin [ 28, 29] .

Estudios previos de los niveles de alcaloides en Symphytum officinale
(Comfrey) en diferentes e s tados de cre cimie nto de la planta, e s table ce n
mayore s conte nidos de alcaloide s e n las parte s are as (follaje ) durante la
floracin y en las races al final de la formacin del fruto [ 30] .

Exis ten cerca de 500 es pecies de Crotalarias, en todo el mundo; s on es pecies
herbceas pequeas a medianas en tamao, c on hojas lisas, cre cimie nto
erguido, vaina redondeada, flores amarillas , amarillo-caf, azul o prpuras ;

17
conocidas vulgarmente como "Cas cabel", "Sonaja", "Campanita" e "Hie rba de
sapo", e ntre otros , de bido a que s us s e millas maduras s on s ue ltas de ntro de
la vaina [ 31] .

Estas plantas crecen en suelos preferentemente drenados, con alta
iluminacin s olar y e n climas clidos ; e l e s tado de floracin s e alcanza e n
promedio a 110 das dependiendo de la es pecie [ 32, 33] .

Se puede mencionar algunas es pecies importantes , tales como: C. intermedia,
C. lanceolata, C. mucronata, C. spectabilis y C. incana, las cuale s cre ce n
extens ivamente en Suramrica. La es pecie ms comnmente dis tribuida en el
trpico es la Crotalaria incana, la cual habita e n campos cultivados , a orillas
de las carre te ras y e n lugare s eros ionados . Los principales compue s tos
hallados en es pecies de Crotalaria se observan en la Figura 7 [ 34].


1.2.1.2 Utilizacin de las Leguminos as en la agricultura

Leguminos as como las Crotalarias, pos e e n un alto valor como forraje , abono
verde y s e us an en control de la eros in; s u follaje pos ee entre 0.5 1 % de
nitrgeno, el cual al ser incorporado al suelo mejora su fertilidad y l a
retencin de nutrientes , dando lugar a mejor es tructura del s uelo, retardando
los proce s os de e ros in de los mis mos . Se alcanzan mayore s nive le s de
productividad de alime ntos cuando s e utilizan tcnicas de rotacin (s ie mbra
s uce s iva de dife re nte s cultivos ), s in la prdida de l valor cultivable de los
s uelos [ 13, 35] .




18

Figura 7. Es tructuras de algunos alcaloide s pirrolizidnicos de te ctados e n
es pecies de Crotalaria [ 34] .


























N
O
O
O
O
C H
3
H
H
H
H
H
O H
OH
CH
3
CH
3
N
CH
2
OH
H
H
H
O H
O H
C
8
H
13
NO
3
C
18
H
25
NO
6
CH
2
OH H
O H
N
C
8
H
13
NO
2
N
O
O
O
O
H
H
CH
3
CH
3 C H
3
H
O H
H
C
16
H
23
NO
5
N
O
O
O
O
H
H
H
H
CH
3 OH
CH
3
CH
3
C
18
H
25
NO
5
N
O
O
O
O
H
H
CH
3 C H
3
H
O H
CH
3
OH
H
C
16
H
23
NO
6
N
O
O
O
O
H
H
OH
CH
2
OH
H
C H
3
C
18
H
23
NO
6
CH
2
N
O
O
O
O
H
H
OH
H
C H
3
CH
3
C
18
H
23
NO
5
CH
2
N
O
O
O
O
H
H
OH
CH
2
OH
CH
3
H
H
C
18
H
23
NO
6
CH
3
N
CH
3
O
O
O
O
H
H
C H
3
H
OH
CH
3
O
CH
3
C
19
H
27
NO
6
CH
3
O
O
O
O
H
H
C H
3
H
OH
CH
2
OH
H
N
C
18
H
25
NO
6
Retrorsina
CH
3
N
H
O
H
O
C H
3
H
CH
3
O
O CH
3
OCH
3
CH
3
OH C H
3
O H
H
Lasiocarpina
Anacrotina
Crotanecina
Retronecina
Fulvina
Integerrimina Monocrotalina
Ridelina
Senecifilina
Usaramina
Senkirkina


19

Es tas es pecies , s on generalmente res is tentes en s uelos pobres en nutrientes
de l clima tropical, re quirie ndo baja cantidad de fe rtilizante s pue s to que s on
fijadoras de nitrge no. Forman gran cantidad de ndulos de bido a bacte rias
de e spe cie s comune s como e l Rhizobium. La bacte ria s imbitica ataca los
pelos radiculares de la planta husped, induciendo el crecimiento de las
clulas alre de dor de la bacte ria; e n los ndulos formados s e fija nitrge no
atmos frico, e l cual e s liberado e n forma de iones amonio y nitrato
promovindos e el inte rcambiado con la planta de nutrientes y abrigo de la
mis ma. Este proces o es tablece concentraciones mayores de
15
N e n los
ndulos de Leguminos as a diferencia de otras plantas [ 36- 38] .

La des ventaja de s u cultivo en general, radica en que puede albergar algunas
e s pe cie s de ins e ctos nocivos para los ctricos ; pos e e n s e millas re s is te nte s
las cuales pueden germinar aos des pus de e s parcidas contaminando otras
cos e chas , as como s u conte nido de alcaloide s pirrolizidnicos [33, 35] , los
cuale s s on s inte tizados e n las race s de las plantas , cuyo producto primario
generalmente es el N-xido del PA, para luego ser trans portados y
dis tribuidos a s us diferentes partes [ 39] .


1.2.2 MECANISMO DE ACCIN TXICA DE LOS ALCALOIDES
PIRROLIZIDNICOS

Qumicamente, las pirrolizidinas se dis tingue n por la pre s e ncia de dos (2)
anillos de cinco mie mbros fus ionados , los cuales contie ne n un tomo de
nitrge no e nlazante e ntre los dos anillos , formando un alcaloide te rciario. El
anillo es frecuentemente s us tituido con un grupo hidroximetileno e n la
posicin C
1
y un grupo hidroxilo e n l a pos icin C
7
. Es t a es tructura s e

20
denomina base necina (Figura 8). Los alcaloides pirrolizidnicos con una
ins aturacin e n la pos icin 1,2 necina, se cl asifican en retronecina y
otonecina cuando s on s aturados del tipo platinecina.

Figura 8. Es tructuras bas e de alcaloides pirrolizidnicos .
















Los alcaloides pertenecientes al tipo retronecina, son s olubles solo e n
solventes orgnicos de naturaleza polar. En cambio, los alcaloides tipo
otonecina, son s olubles tanto e n s olve nte s orgnicos no polare s , como e n
agua [ 9] . Es to s ugiere que hay una interaccin trans-anular e ntre N
4
y C
8
e n
la bas e ne cina, tal que e lla pue da e xis tir en una forma cargada; la alta
s olubilidad en s olventes acuos os explica los problemas de s alud por inges tin
de remedios herbales que contienen alcaloides pirrolizidnicos en agua.

3
2
1
8
7
6
5
C H
2
9
O
7
N
O
9
R
2
R
1


N
O
O
O
O
CH
3
O
3
2
1
8
7
6
5
CH
2
OH
9
O H
N
O
O
O
O
CH
3
O
N
+
Base necina
R
1
= H, R
2
= H Retronecina
Platinecina
Alcaloide pirrolizidnico, tipo otonecina.
cido necnico
Forma no ionizada
Forma ionizada


21
Los compues tos hallados en es pecies de Crotalaria y Senecio s on s teres de
amino alcohole s (bas e ne cina). La toxicidad de e s tos compue s tos aume nta
con la s us titucin por grupos s te r o ciclos te r, s in e mbargo, alcaloide s con
base necina saturada tipo platinecina no son txicos debido a su baja
reactividad, al no s er fcilmente oxidados a pirroles reactivos [ 9].

Una variedad de plantas ha sido utilizada e n me dicina indgena, remedios
cas eros para combatir divers as dolencias , tal es el cas o de l rnica de Bogot
(Senecio formosus), cuyas infus iones son utilizadas como s udorfica,
depuradora de l a sangre y antis ifiltica, pero debido a su contenido de
re trors ina (Figura 7), genera enfermedades venooclus ivas , conduce nte e n la
mayora de los cas os a as citis (acumulacin de lquido e n e l abdome n) y
coma he ptico. Los alcaloides tipo platine cina, han sido utilizados en e l
pas ado en tratamientos de hipertens in arterial, lceras internas y en drogas
oftalmolgicas (tartrato de platifilina al 1%) [ 11, 32, 40] .

Los PAs producen en primera ins tancia, les iones venooclus ivas conducentes
al des arrollo de cirros is ; pos een actividad carcinognica y mutagnica, la cual
de pe nde de l me tabolis mo y la forma re activa que produce n e n e l organis mo
en e l cual actan. En experimentos c on c l ul as hepticas embrionarias
humanas , la retrors ina mos trs er ms txica que la las iocarpina (Figura 7), a
diferencia de en ratas , en l a cual actan de forma inversa. Todos es tos
re s ultados indican, que los te jidos he pticos e mbrionarios humanos s on ms
hbiles en metabolizar alcaloides pirrolizidnicos para producir pirroles [ 2, 4] .


La pre s e ncia de l e nlace doble e n e l ncle o pirrolizidinico e n la pos icin 1,2,
es tablece su actividad carcinognica debido a que este enlace facilita l a

22
des hidrogenacin al c orres pondiente pirrol, el cual estsujeto a ataque
nucleoflico [ 4] .

Inve s tigacione s re alizadas por A. Mattocks [41] , e s table ce n la pre s e ncia de
N-xidos , as como los corres pondientes metabolitos pirrlicos , formados del
alcaloide pirrolizidnico mediante rearreglo de la ins aturacin e n s is temas
micros omales hepticos , cuyo mecanis mo de accin en el organismo e s
enteramente diferente. Los alcaloides pirrolizidnicos ms lipoflicos , dan
lugar a velocidades de su metabolis mo ms altas. La relacin de N-
xidos /metabolito pirrlico cambia dependiendo del tipo de s ter de l
alcaloide; y es alta para alcaloides dis teres y baja para dis teres
macrocclicos de 12 miembros y monos teres .

Los niveles de metabolitos pirrlicos enlazados a tejidos hepticos
(re s pons able s de la he patoxicidad e n ratas ) no re fle jan las ve locidade s de
formacin de tales metabolitos , de te rminados mediante ensayos in vitro.
Influyen factores adicionales , tales como la qumica, la es tabilidad y la
reactividad del metabolito txico [ 41] .

La toxicidad aguda de un producto qumico s uele s er expres ada como "dos is
letal " (LD
50
), que e s la dos is de un compue s to txico, que pue de matar al
50 % de los animale s e xpue s tos a es ta s us tancia. La LD
50
s e e xpre s a
generalmente en miligramos de sustancia activa por kilogramo de pe s o
corporal (mg/kg), unidade s que de pe nde n de l tipo de compue s to. Las dos is
le tale s por cons umo de alcaloide s pirrolizidnicos , s on de l orde n de LD
50
=75
mg (monocrotalina)/kg, determinadas mediante experimentos con ratas [ 8].

Nive le s de toxicidad e n pollos , con dive rs as e s pe cie s de Crotalaria, fue ron
determinados por Corbun. W. [ 42] . De tal trabajo s e es tablecimediante

23
cromatografa lquida de alta e ficie ncia (HPLC), e l conte nido de alcaloides
pirrolizidnicos , utilizando monocrotalina y es pectabilina como es tndares de
calibracin. Altos niveles de alcaloide fueron hallados en semillas de
Crotalaria (C.) spectabilis (3.85%), C. retusa (2.69%), C. alata (1.60%), C.
quinquefolia (1.19%) y C. argyrolobioides (1.01%); es ta ltima es pecie
produce s e ale s txicas , pe ro no la mue rte cuando s e alime nta al animal con
cantidade s de 10 mg de alcaloide /kg de pe s o corporal; las prime ras cuatro
es pecies producen la muerte del animal, cuando s e alime nta con dos is de 2 a
6 mg/kg pes o corporal.

Las aves con problemas en el hgado muestran sntomas imprecis os y
generales , tales como prdida de apetito, apata, disminucin del pe s o,
debilidad, diarrea, plumaje en mal es tado, s ed y aumento en la produccin de
orina, e tc. En un e s tado ms avanzado pre s e ntan uratos (porcin blanca de
las heces ) teidas de verde o amarillo, inflamacin abdominal, acumulacin de
lquido e n abdome n (as citis ), alteracin en la coagulacin de la s angre ,
hemorragias intes tinale s , re blande cimie nto y s obre cre cimie nto de l pico y de
las uas . Los s ntomas pueden pas ar des apercibidos has ta que la enfermedad
estmuy avanzada [43] . Es to hace difcil e l diagns tico e n sus prime ras
fas e s , con lo cual e s ms fcil la pre ve ncin e n e l s uminis tro de alime nto
contaminado con alcaloides pirrolizidnicos .

La mayor s us ceptibilidad de intoxicacin con alcaloide s pirrolizidnicos s e
presenta en aves, a diferencia de los ovinos , los cuales pos een mayor
re s is te ncia a dichas s us tancias . Inve s tigacione s lle vadas a cabo por Craig y
colaboradores [44] s ugieren que el mecanis mo de proteccin primaria en los
ovinos estlocalizado en la microflora ruminal anaerobia; las bacterias

24
ruminale s me tabolizan rpidame nte los pirrole s re activos , de s e chando altos
niveles de s tos en el hgado.


1.2.3 BIOSNTESIS DE ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS

La bios ntes is de alcaloides pirrolizidnicos s e es tablece inicialme nte e n la
raz, en es te centro de produccin los alcaloides s e hallan predominantemente
e n forma de N-xidos , los cuale s s on ms fcilme nte trans portados por la
planta a sus diferentes partes. Estos metabolitos son localizados y
almacenados en tejidos perifricos de hojas y tallos; sin embargo, s on
tras locados de hojas vie jas a hojas jve ne s re cie nte me nte formadas , con lo
cual el contenido de PAs es mayor en es tas ltimas ; en las flores y s emillas
los alcaloide s s e acumulan ge ne ralme nte e n s u forma bas e como una amina
terciaria lipoflica [45, 46] .

La s ntes is de la bas e necina (Es que ma 2) comienza con una unin primaria de
molculas de putre s cina y/o aminobutilo, conformando la homoe s pe rmidina
como primer intermediario, formada a partr de la homoes permidina s intetas a,
e nzima que cataliza la trans fe re ncia de un grupo aminobutilo, putre s cina o
e s pe rmidina a una s e gunda molcula de putre s cina. Las bas e s ne cinas de la
mayora de alcaloides ( tipo s enecionina y licops amina) son derivados de
aminocidos alifticos . Estudios realizados por Hartman [ 39] s obre
bios ntes is en As tearaceas , es tablecen un e s t r i c t o proceso c ontrolado y
coordinado de produccin de alcaloide s con e l cre cimie nto de las race s , e l
cual des ciende cuando ces a el crecimiento de las mis mas .


25

Esquema 2. Bios ntes is de alcaloides pirrolizidnicos .


























N
CH
2
OH
H
NH
2
NH
2 NH
2
NH
NH
2
NH
2
N
NH
2
H
CH
2
OH H
O H
N
H
CH
2
OH
N
H
N
NH
2
N
CHO
N
+
O
O
O
O
O H
CH
3
CH
3
CH
2
OH
N
OR
C H
3
CH
3
COOH
O
O
N
+
O
C H
3
CH
3
CH
3
OH
OH
O
NH
2
C H
3
CH
3
HOOC
C H
3
CH
3
O HOOC
C H
3
CH
3
CH
3
O
OH
HOOC
C H
3
CH
3
CH
3
OH
HOOC
OH
Acido
(+)-Traquelantico
Putrescina
Traquelantimidina
Retronecina
Isoretronecanol
In iminio
+
+
Retronecanol
Senecionina N-xido
Homoespermidina
2
Valina
Acido 2-oxoisovalrico
+

26
1.2.4 MECANISMO DE DEFENSA DE LAS PLANTAS.

La qumica ecolgica es el es tudio de las interacciones qumicas e ntre
organis mos y su me dio; e s tos me canis mos de inte raccin hace n parte de l
proceso evolutivo de los organismos vivos , permitiendo el des arrollo de
diversas estrategias de defensa encaminadas a la s upervivencia y
continuidad de la es pecie.

Para el cas o es pecfico de las plantas , s tas han des arrollado mecanis mos de
de fe ns a, por me dio de la produccin de me zclas comple jas de compue s tos
orgnicos. Su cre cimie nto e s tcondicionado a una s e rie de inte raccione s
variadas con factores medioambientales (exgenos ), los cuales determinan la
s ntes is y produccin de me tabolitos s e cundarios ; los factore s s e pue de n
agrupar en:

Factores biticos , ins ectos , herbivora, agentes patgenos , enfermedades ;
Factores abiticos , luz, hume dad, radiacin UV, nutrie nte s , te mpe ratura,
pH del s uelo;
Competencia por es pacio, agua, luz y nutrientes ;
Polucin, metales pes ados , ozono, productos qumicos ;
Herbicidas y pes ticidas.

Los ale loqumicos , e ntre e llos los compue s tos fe nlicos , quinonas , te rpe nos ,
cidos orgnicos y alcaloides , entre otros, son la suma de compues tos
es tablecidos por equilibrio q umico-ecolgico o interaccin de factore s , as
como s e des cribe en el Es quema 3 [ 47].




27

Esquema 3. Interacciones exis tentes entre factores medioambientales .











De ntro de los factore s e ndge nos que afe ctan e l de s arrollo normal de las
plantas s e encuentran las enzimas (para el control qumico en los organis mos
multicelulares ) y las hormonas . Las fitohormonas abarcan e tile no, auxinas ,
giberelinas , citoquininas y el cido abs cs ico, cada uno activo a bajas
conce ntraciones dentro de la planta; otros factores endgenos relevantes s on
la e dad de la planta, e dad de l te jido, e l e s tado fe nolgico, las caracte rs ticas
anatmicas y morfolgicas de las hojas [ 48, 49].

Es tudios es pecficos con glicoalcaloides (s eccin 1.2), han de te rminado que
s u pre s e ncia s e e s table ce como me canis mo qumico de de fe ns a de la planta
ante depredadores (ins ectos ). L a conce ntracin de alcaloide s de pe nde de
factores tales como el clima, el crecimiento bajo, las condiciones inadecuadas
de almacenamiento y el ataque por hongos [ 1] .

Para e l cas o de los alcaloide s pirrolizidnicos , s e ace pta que la condicin de
herbivora tie ne alta incidencia e n la produccin de e s tos me tabolitos . Sin
Factor bitico
Factor abitico
Aleloqumicos
Herbicidas
Competencia
Polucin
Crecimiento
de la planta

28
e mbargo, s u rol e n de fe ns a contra ins e ctos he rbvoros an no e s muy clara.
Ensayos de herbivora e n laboratorio des arrollados por Van Dam y
colaboradores [ 50] en Cynoglossum offinale, con diferentes es pecies de
larvas , apoyan la te ora de la produccin de PAs como proteccin de l a
planta, en es pecial de s us rganos ms valios os .

En los e ns ayos re alizados con Senecio misser e n fidos (Myzus persicae),
ins e ctos de la familia de los Hompte ros , s e e s table ciuna inhibicin fue rte
de l a actividad alimenticia de los fidos, por la pre s e ncia de alcaloides
pirrolizidnicos en la planta [ 51] .

Los me canis mos de defensa de las plantas cons is te n, e n ge ne ral, e n la
s nte s is de s us tancias qumicas que inhiban las prote as as de los he rbvoros ,
con el fin de reducir el dao en los tejidos . La dis tribucin puede s er variable
e n los dife re nte s te jidos ve ge tale s , e n puntos e s pe cficos o e n toda la planta
dependiendo de s u vala para la mis ma, as como la redis tribucin, que avanza
s e gn e l de s arrollo fe nolgico y cuya de te ccin pue de s e r al cabo de horas ,
das o s emanas [ 17, 52] .


1.3 ANLISIS DE ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS


1.3.1 TCNICAS DE PREPARACIN DE MUESTRAS


1.3.1.1 Extraccin as is tida por ultras onido

Tcnica de extraccin rpida y efectiva que utiliza frecuencias de ultras onido
(16 kHz) para la ruptura o s e paracin de l analito de la matriz. La irradiacin

29
de un lquido por ultras onido, ge ne ra pe que as burbujas que s e e xpande n y
colaps an, fenmeno conocido como cavitacin, que puede generar altas
temperaturas locales y pres iones en puntos definidos del lquido. Es te
proce s o ocurre a te mpe raturas e ntre 40 a 50 C por cale ntamie nto de l bao
en el cual es tinmers o el recipiente que contiene la mues tra [ 55] .

En tejidos vegetales o animales el colaps o de las burbujas contra las clulas ,
caus a la ruptura de las me mbranas , con lo cual los analitos pue de n s e r ms
fcilmente s olubilizados en el s olvente [ 53] .

Las frecuencias de ultrasonido han sido utilizadas e n la s nte s is dire cta de
compues tos organometlicos y de coordinacin, me diante la activacin de
s uperficies metlicas , ascomo en proces os electroqumicos para e l
trans porte de iones hacia la s uperficie de l electrodo y en la limpieza de s tos
[ 54] .

1.3.1.2 Extraccin Soxhlet

Tcnica de e xtraccin continua, aplicada a matrice s s lidas o s e mis lidas .
Cons is te en la s olubilizacin de los analitos de la matriz, empleando solventes
generalmente polares de bajo punto de ebullicin, en un proces o continuo de
lavado de los analitos de inters por un tiempo generalmente largo de 12 a 24
horas , operando a la te mpe ratura de e bullicin de l s olve nte (Figura 9). El
extracto obtenido es c oncentrado por e vaporacin del solvente a pre s in
reducida [ 56] .

30

Figura 9. Equipo de extraccin Soxhlet.













1.3.1.3 Extraccin as is tida por radiacin de microondas


La radiacin de microondas , corres ponde a la regin del es pectro
electromagntico entre el infrarrojo (IR) y las ondas de radio; abarca las
frecuencias entre 300 MHz y 300 GHz (longitudes de onda de 1cm a 1m).

Es ta tcnica de aplicacin de e ne rga inte ns a a 915 2450 MHz e n hornos
convencionales, genera una orientacin de las molculas del analito junto con
las de l s olve nte bajo un campo e lctrico aplicado, dando lugar al aume nto
local de la te mpe ratura y la s olubilizacin de los compue s tos de inte rs ,
c o-ayudado por el rpido calentamiento del s olve nte , cuando s te pos ee
cons tante die lctrica alta, caus ado por la rotacin rpida de las molculas e n
un campo elctrico alternante [ 55].



31

Los procedimientos generales de extraccin por radiacin de microondas , s e
llevan a cabo utilizando me tanol y/o me zclas de me tanol/cido actico y
metanol: hidrxido de amonio o s odio, a temperaturas inferiores del punto de
ebullicin del s olvente. Sin e mbargo, e llo de pe nde de la compatibilidad de l
s olvente con el analito [57] .


El e mple o de e s ta tcnica de e xtraccin, ha te nido amplia ace ptacin e n las
ltimas dos dcadas para la extraccin y fraccionamie nto de matrice s s lidas .
Desarrollada inicialme nte para la dige s tin cida de mine rale s , fue aplicada
pos te riorme nte para la e xtraccin de productos naturale s . Tal e s e l cas o de
los aceites es enciales , permitiendo extracciones ms rpidas y eficientes que
las tradicionales [ 58].


1.3.1.4 Extraccin en fas e s lida


Extraccin en fas e s lida (SPE) es un mtodo de extraccin s lido-lquido, e l
cual pe rmite ais lar y conce ntrar los analitos de la matriz. Las s us tancias s on
ads orbidas s obre la fase slida (s orbente) contenida en cartuchos de
polipropile no, y e ludas con un s olve nte apropiado (Figura 10). Es te proce s o
puede s er llevado a cabo de igual forma, para la re te ncin de compue s tos
indes eados (interferencias ), en la s olucin de la mues tra.

Dependiendo del tipo de fas e s lida, la s e paracin s e lle va a cabo e n fas e
normal (e l s orbente e s ms pol ar que la fase mvil o la solucin de l a
mue s tra), o e n fas e re ve rs a, por me dio de inte rcambio inico y/o e xclus in

32
por tamao, as como s e re pre s e nta e n e l Es que ma 4. El analito pue de s e r
enlazado a la fas e por un nme ro de me canis mos s e me jante s a los de la
cromatografa lquida, e.g. puentes de hidrgeno, interacciones dipolo-dipolo,
fuerzas de dis pers in hidrfoba e interacciones electros tticas [59, 60].


Figura 10. Equipo de extraccin en fas e s lida (SPE).








Las etapas de es te proces o comprenden:

1. Acondicionamiento del cartucho con s olventes , a fin de eliminar impurezas
y preparar la fas e ads orbente.
2. Adicin de la muestra.
3. Lavado del cartucho con agua, s olucin buffer o solvente
4. Elucin del analitos con s olvente o mezcla de s olventes de polaridad
s emejante a compues tos del inters .

Es ta tcnica de preparacin de mues tras tiene gran aplicacin en la indus tria
de alimentos , farmacutica, anlis is clnico, medioambiental y ciencias
forens es (drogas de abus o, pes ticidas etc) [ 59] .


33

Esquema 4. Proces o de particin en fas e s lida.

















1.3.2 MTODOS DE ANLISIS DE ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS


Divers os mtodos de anlisis se han des arrollado para la deteccin de
alcaloides pirrolizidnicos ; los ms utilizados , comprenden los mtodos
preliminares por cromatografa en capa delgada, utilizando gel de s lice como
fase es tacionaria. El solvente ms utilizado es metanol; sin embargo, e n
mezclas de alcaloides de diferente polaridad, la elucin s e realiza con mezcla
cloroformo-metanol -amonaco (85/14/1) o ace tato de e tilo-ace tona-etanol -
amonaco ( 5/3/1/1); s is temas de s olventes de mayor polaridad como n-
_
O
O
O- Si(CH
3
)n
CH
2
-CH
2
-CH
2
- C
N
O
2
N
H H
N
Fase normal
Sorbente: Ciano
propilo
+
Si
Si
Si
O
O
O- Si(CH
3
)n
O CH
3
-CH
2
P
O CH
3
-CH
2
O
N N
CH
3
C H
3
C
(CH
2
)
17
-CH
3
Fase reversa
Sorbente: Octadecilo
Analito : Diazinon
Si
Si
Si
O
O
CH
2
CH
2
CH
2
--- SO
3
-
CH
OH
OH
OH
CH
2
N H
H
CH
3
Intercambio inico
Si
Si
Si
OH
+
Sorbente: Acido sulfnico aromtico
Analito : Epinefrina


34
butanol-cido actico-agua (4/1/5) s on utilizados cuando s e s eparan PAs N-
xidos s obre gel de s lice [ 61].

La deteccin de los alcaloides s e lleva a cabo con agentes reveladores como
vapores de yodo, solucines de yodoplatinato acidificado, Dragendorff
modificado (BiNO
3
/AcOH; KI/H
2
O) y Erlich; no obs tante, la de te ccin de
alcaloides 1-2 saturados se dificulta por el empleo de es ta tcnica,
es pecialmente con la s olucin de Dragendorff [ 62, 63] .

Figura 11. Deteccin de PAs con el reactivo de Erlich (reaccin de color).








El re activo de Erlich pe rmite la de te ccin de pirrole s de rivados ; la s oluc in
cida de 4-dimetilaminobenzaldehdo reacciona (e n la pos icin ) con los
pirroles obtenidos por des hidrogenacin del PA inicial con una s olucin de
o-cloranilo o por des hidratacin del N-xido de PA, con un complejo de Fe II
(nitroprus iato) en cido as crbico y cale ntamie nto por de bajo de los 100 C,
para formar un complejo coloreado (Figura 11). Estas pruebas pue de n
detectar niveles de N-xidos de 0.002% en el material vegetal [ 41, 64].

La s eparacin de alcaloides se lleva a cabo utilizando cromatografa e n
columna con almina neutra o gel de s lice como fase es tacionaria con
N
C H
3
CH
3
CHO
N
H
O
O O
O
N
H
O
O
O
O
O
O
O
O
N
N
CH
3
CH
3
o-cloranilo
Color magenta


35
s olventes de carcter polar; s in embargo, el empleo de cromatografa lquida
de alta e ficie ncia (HPLC) prove e un mtodo de s e paracin ms ve rs til e n
mezclas complejas de tales s us tancias .

La utilizacin de columnas Bondapak C
18
para sistemas en fase re ve rs a
(e luye ndo con me zcla de me tanol y buffe r de fos fato) y columnas e n re s inas
de es tireno-divinilbenceno (eluyendo con acetonitrilo en solucin de
amonaco), presentan ciertas des ventajas , entre las cuales figuran corto
tie mpo de vida de los PAs de bido al pH alto de las s olucione s buffe r; picos
cromatogrficos con "colas ", lo cual origina baja res olucin y alteracin de los
lmites de s ens ibilidad (cambio en la res pues ta del detector como funcin del
cambio en la cantidad o concentracin del analito) [ 61, 65] .

El acople de cromatografa lquida a la es pectrometra de mas as , ha permitido
la s eparacin e identificacin de mezclas complejas . Sin embargo, la
confirmacin ine quvoca de la e s tructura de un compue s to de be conte mplar,
la combinacin de ms de una tcnica de anlis is . La utilizacin de la
res onancia magntica nuclear (RMN) protnica y de
13
C, permite la
diferenciacin entre c ompuestos de igual pe s o molecular, entre is meros
es tructurales y geomtricos . Por e llo, e l acople de HPLC a RMN podra s e r
una he rramie nta de s e paracin y e lucidacin e s tructural e xce pcional e n e l
anlis is de extractos crudos con mezclas complejas de componentes [ 40, 66] .

Mtodos de deteccin de inmunoens ayo recientes , des arrollados por Ros eman
y colaboradores [ 67] , permiten determinar niveles de PAs dis te r
macrocclicos del orden de ng/ml en mues tras ambintales y biolgicas . Es tos
procedimientos es tablecen la N-alquilacin de los PAs con pos terior

36
conjugacin a una protena de arras tre, des arrollando la prueba de
inmunoensayo Elisa.


1.3.2.1 Anlis is cualitativo de alcaloides pirrolizidnicos por cromatografa de
gas es de alta res olucin

Los trabajos de Witte , Hartman y colaboradore s [68] , permitieron llevar a
cabo la identificacin preliminar de PAs , bas ados en el clculo de los ndices
de re te ncin de Kovts (Ik), en c olumnas capilares con diferentes fas es
es tacionarias , DB-1, DB-5 y DB-17; y e n columnas e mpacadas , OV-1701 y
OV-5. Es te trabajo interlaboratorio, es tablecila reproducibilidad alta de los
Ik para cerca de 100 alcaloides pirrolizidnicos , comparados con los mtodos
de de rivatizacin de los PAs e n s us de rivados trime tils illicos , pe rmitie ndo
as la aplicabilidad del mtodo para la identificacin preliminar de PAs .

Los Ik indican e l orde n de aparicin de los compue s tos e n un cromatograma
respecto a parafinas line ale s , que e luye n de la columna e n me zcla con la
mue s tra proble ma. El Ik de una parafina normal, e s cie n ve ce s e l nme ro de
tomos de carbono que conte nga el compue s to [69, 70] . La e xpre s in
utilizada para el clculo de Ik, de compues tos diferentes a los alcanos , cuando
s e emplean condiciones is otrmicas es :

Ik = 100n + 100 ( (logt
R
x-logt
R
n) / (logt
R
N-log t
R
n)) Ecuacin 1

Cuando s e utiliza la programacin de temperatura, la expres in para el clculo
del Ik es:


37
Ik = 100n + 100 ( (t
R
x-t
R
n) / (t
R
N-t
R
n)) Ecuacin 2

Donde:
t
R
x =Tiempo de retencin del compues to de inters
t
R
n= Tiempo de retencin de l n-alcano que eluye antes del compues to x;
t
R
N= Tiempo de retencin del n-alcano que eluye des pus del compues to x;
n = Nmero de tomos de carbono e n el alcano, que eluye antes de l
compuesto x.

Los procedimientos de derivatizacin de PAs a sus de rivados trifluoro-
proplicos , permiten es tablecer la pres encia de alcaloides tipo retronecina, del
orden de M, utilizando cromatografa de gas e s acoplada a un de te ctor de
captura de e le ctrone s (GC-ECD) aplicados para e l anlis is de PAs e n le che .
Estos anlisis re quie re n proce dimie ntos e xte ns os de hidrlis is con bas e s
fuertes , para formar la denominada bas e necina y s u pos terior reaccin con el
anhdrido heptafluoro-butrico; la des ventaja de es te mtodo radica en que no
permite diferenciar e l tipo de alcaloide pirrolizidnico, mono-dis te r
macrocclico o de cade na abie rta y as mis mo, de te rminar la toxicidad e n
alimentos [ 71] .


1.3.2.2 Determinacin es tructural de alcaloides pirrolizidnicos

Por medio de espectroscopa infrarroja (IR), pueden detectars e
ins aturaciones , grupos hidroxilo y bandas de s teres carbonlicos , los cuales
s on los grupos funcionale s ms re pre s e ntativos e n PAs . El grupo carbonilo
s e pres enta a 1730 1740 cm
-1
e n PAs ins aturados , con de s plazamie nto de
la banda a 1710-1720cm
-1
e n e l cas o de PAs s aturados . En dis te re s tipo
otone cina (Figura 8), s e produce un incre me nto de la inte raccin trans anular

38
N....C=O, caus ando un de s plazamie nto a baja fre cue ncia e n la abs orcin de l
grupo carbonilo [ 61] .

Mtodos de anlis is ins trumental modernos incluyen la res onancia magntica
nucle ar, us ada para la de te rminacin de las bas e s libre s de PAs y s us N-
xidos en material vegetal inmaduro de Cynoglossum officinale, utilizando p-
dinitrobenceno como es tndar interno [ 72] . Las s e ale s caracte rs ticas por
NMR-
1
Hde H-2 (e n la bas e ne cina) s on a
H
5.5-5.7 para PAs ins aturados ,
monos te re s y dis te re s n o ciclados ; a
H
5.9-6.1 para alcaloide s de 11
miembros y a
H
6.1-6.3 para alcaloides de 12 miembros [ 73, 74] .

Las seales qumicas por RMN
13
C permiten e s table ce r grupos carbonilo
alrededor de 169.22, grupos me tilo a 21.31.5, me didos e n s olucin de
cloroformo deuterado ( CDCl
3
). Las seales de grupos metoxi en el cido
ne cnico (Figura 8) aparecen a 56.80.3. Las s e ale s qumicas de algunos
PAs monos te re s , e s te rificados e n pos icin C
7
con los fragme ntos a, b y c
(Figura 12) s e pre s e ntan e n la Tabla 2. De igual forma, las s e ale s de PAs
dis teres macrocclicos de bas e necina ins aturada s e pres entan en la Tabla 3
[ 75] ; las diferencias en los valore s e ntre es tereois meros de PAs s on
pequeas.

Figura 12. Frmulas es tructurales de fragmentos de cidos necnicos .



C H
3
4
3
CH
3
2
C H
1
O
C H
3
4
3
2
C H
3
C H
1
O
C H
3
4
3
2
C H
3
C H
1
O
CH
3
2``
b
c
a
3`
2`
2``
2`
3``

39


Tabla 2. Se ale s qumicas por RMN
13
C para alcaloide s pirrolizidnicos monos te r de bas es necinas ins aturadas
[ 75] .

Se ale s de los carbonos e n la bas e ne cina
Compues to Frmula
Pe s o
mole cular C
1
C
2
C
3
C
5
C
6
C
7
C
8
C
9

A- Ange loil-he liotridina C
13
H
19
NO
3
237 137,7 126,5 63,2 53,6 34,6 74.1 75.9 60.1
B- Ange loil-re trone cina C
13
H
19
NO
3
237 138,1 127,7 62,1 53,8 30,2 77.7 79.2 59.8
C- Se ne cioil-re trone cina C
13
H
19
NO
3
237 138,8 121,8 61,8 53,5 34,3 72.4 76.3 59.4
D- Ange loil-platine cina C
13
H
21
NO
3
239 43,9 28,7 55,6 53,6 35,2 72.4 69.2 62.7
E-Licops amina C
15
H
25
NO5 299 133.0 130.2 62.9 53.9 36.2 71.0 87.2 62.5

Contina Tabla 2
Se ale s de los carbonos e n e l fragme nto de cido ne cnico
Compue s to
Fragme nto de cido
ne cnico s us tituido e n C
7 C
1
C
2
C
2
` C
3
C
3
` C
4

A- b 168.7 124.4 20.5 140.8 - 15.9
B- b 167.6 125.3 20.5 139.9 - 15.8
C- a 168.0 115.0 - 138.8 27.6 20.5
D- b 167.0 127.2 20.8 139.4 - 15.8
E- c / en C
9
174.4 83.6 70.9 32.4 17.4 17.4
El fragmento de cido ne cnico a C7 corre s ponde n a los pre s e ntados e n la Figura 12.

40

Tabla 3. Se ale s qumicas por RMN
13
C para alcaloide s pirrolizidnicos dis te r macrocclicos de bas e s ne cinas
ins aturadas [75] .

Se ale s de los carbonos e n la bas e ne cina
Compue s to Frmula
Pe s o
mole cular C
1
C
2
C
3
C
5


C
6
C
7
C
8
C
9

A-Monocrotalina C
16
H
23
NO
6
325 132.3 134.2 60.4 53.7 33.5 74.6 76.8 61.9
B-N-xido de monocrotalina C
16
H
23
NO
7
341 131.7 134.1 78.8 69.2 33.8 74.8 96.6 62.0
C-Se ne cifilina C18H23NO5 333 132.2 136.6 62.7 53.3 36.0 74.9 77.7 61.2
D-Inte rre gimina C
18
H
25
NO
5
335 131.8 136.4 62.2 63.2 33.8 75.4 77.4 60.8
E-Retrors ina C
18
H
25
NO
6
351 132.2 135.2 62.2 52.8 36.9 75.7 76.7 63.3

Contina Tabla 3
Se ale s de los carbonos e n e l fragme nto de cido ne cnico
Compue s to C
11
C
12
C
13
C
14
C
15
C
17
C
18
C
19
C
20
C
21

A 174.8 78.6 77.7 44.2 174.3 22.4 18.2 14.3 - -
B 178.4 78.8 80.5 44.9 177.1 23.7 19.7 15.6 - -
C 177. 0 76.4 146.4 37.2 131.4 167.1 24.9 114.4 135.8 15.2
D 178.2 76.4 39.4 29.6 134.1 169.2 25.2 11.8 135.3 14.2
E 175.6 81.3 35.6 36.0 131.3 167.3 66.7 11.6 136.2 15.2


41
La caracte rizacin de un compue s to por RMN, re quie re la alta pure za de la
s us tancia; en la actualidad el acople de la cromatografa lquida de alta
e ficie ncia a la RMN pe rmite e l ais lamie nto y la caracte rizacin dire cta e n
mezclas complejas de extractos naturales [66] .


1.3.2.2.1 Anlisis por GC- MS

Los anlisis de alcaloides pirrolizidnicos saturados e ins aturados , pue de n
realizars e por cromatografa de gases/ e s pe ctrome tra de mas as (GC/MS),
incluye ndo la de te ccin de me tabolitos de los PAs (pirrole s ) e n te jidos [41,
76].

El anlisis por MS por impacto de electrones , provee la informacin
es tructural, que permite la diferenciar alcaloides con bas es necinas s aturadas
e ins aturadas , las cuales pos een iones fragmento caracters ticos [ 68, 77] , as :

En alcaloides disteres de bas e ne cina saturada (tipo platine cina): m/z
82, 95/96, 211, 222/237.

En alcaloides monos teres con sustitucin e n la pos icin de l oxgeno
(Figura 8) en:
O
7
s ter, 1-2 ins aturados picos a m/z 93, 136, 137, 138.
O
9
s ter, 1-2 ins aturados picos a m/z 80, 106, 111, 136, 137, 138.
O
9
s ter, 1-2 s aturados picos a m/z 55, 83, 96, 124, 142,
O
9
s ter, 1-2 s aturados , grupo OH en C
7
, m/z 82, 95, 140, 158.

Alcaloides dis teres macrocclicos tipo otonecina:
m/z 94, 96, 110, 122, 123, 149, 150, 151

42
Alcaloides dister macrocclicos de base necina ins aturada, la
fragmentacin inic ia en el ster allico e involucra un rearreglo tipo
McLafferty [ 79] .

El anlis is de e s pe ctros de mas as de me tabolitos N-xidos , obtenidos por
impacto de electrones , en fluidos biolgicos y material vegetal, pre s e nta
dificultades debido a la ines tabilidad trmica de es tas molculas (s on
termolbiles ), obtenindose generalmente e s pe ctros donde no apare ce la
s eal del ion molecular, pero s e detecta el in [ M-O]
+
[ 80] .

En es pectros de mas as , obtenidos por bombardeo con tomos rpidos (FAB-
MS), de dis ter macrocclicos N-xidos , el pico de bas e corres ponde a un ion
molecular protonado (M+H)
+
, y s e regis tran fragmentos en m/z 80, 94, 106,
118, 120, 136 [ ] .

La es pectrometra de masas por ionizacin qumica (CI-MS), de iones
negativos (OH
-
, como re actante ), pre s e nta fragme ntos (M-H)
-
y (M+ OH)
-
,
que pe rmite n dife re nciar los PAs monos te r y dis te r macrocclicos . El ion
(M+OH)
-
de un compue s to cclico, e s un aducto (por re accin de ataque
nucle oflico), que conduce a la ruptura de l anillo, y ge ne rando un pico de
intensidad alta. La abundancia re lativa de los ione s de la cade na e n bas e s
necinas s aturadas es baja, comparada con las bas es necinas ins aturadas [ 81] .


1.4 ANLISIS ESTADSTICO DE DATOS

Para determinar la valide z de los re s ultados obte nidos e n un e xpe rime nto
es tablecido el cual pos ea determinaciones repetidas (e.g. implementacin de
mtodos de extraccin y cuantificacin de s us tancias qumicas ), debe

43
estimarse el error relativo inherente en l as determinaciones mediante e l
anlis is es tads tico datos .

Existen dos tipos de errores , aleatorios y s is temticos . Los e rrore s
aleatorios , no se pueden eliminar pero pueden ser minimizados , y s on
caus ados por e rrore s ins trume ntale s , me todolgicos y pe rs onale s . Es te tipo
de errores dan lugar a la dis pers in de los res ultados alrededor del promedio.

La determinacin de la dis pers in de los res ultados en un ens ayo dado utiliza
la desviacin es tndar (), la cual s e calcula as :.

=
i
i
n
X x
1
) (

2

Ecuacin 3
X : promedio
n: nmero de mediciones
xi: valores de la variable

La comparacin e ntre las de s viacione s e s tndar, de dive rs os e xpe rime ntos ,
con e l mis mo obs ervable (y), pe rmite es tablecer si las diferencias e ntre
res ultados s e atribuyen a errores aleatorios . Una forma de calcularlo, s e lleva
a cabo con el cociente de los cuadrados de las des viaciones es tndar (prueba
F):
2
2
2
1

= F
Ecuacin 4

1
= des viacin es tndar del experimento 1

2
= des viacin es tndar del experimento 2


44
1.4.1 ANLISIS DE VARIANZA

En un dis eo de experimentos , en el cual exis ta ms de un factor y una fuente
de variacin aleatoria, se aplica la tcnica de anlis is ANOVA (anlis is de
varianza).

El anlis is de varianza, permite evaluar si las diferencias entre los
tratamientos realizados son s ignificativas (factor controlado) o pue de n
atribuirs e al error experimental.

En un ANOVA de dos factores con ms de una le ctura por mue s tra, s e
calculan los parmetros Q, Q
A
, Q
B
, Q
AB
y Q
W
a partir de las s iguientes
relaciones:

Q: Sumas de cuadrados
Q
A
: Suma de cuadrados entre los grupos , factor A
QB: Suma de cuadrados entre los grupos , factor B
Q
AB
: Interaccin entre factores
Q
W
: s uma de cuadrados dentro de los grupos ,









( )
Q
ijk
x
x
k j i
=

2
Ecuacin 5
( )
B
j
Q
x
x
I K
j
=

2
. . Ecuacin 6
( )
A
i
Q
x
x
J K
i
=

2
..
Ecuacin 7

45




i: columnas
j: filas
k: nmero de rplicas


Tabla 4. ANOVA de dos factores con ms de una lectura por mues tra.
SS Grados de
libertad
Cuadrado promedio F
Factor A QA i-1
2
A=QA/(i-1) F
(A)
=
2
A/
2
W
Factor B Q
B
j-1
2
B
=Q
B
/(j-1) F
(B)
=
2
B
/
2
W

Interaccin Q
AB
(i-1)(j-1)
2
AB
=Q
AB
/[ (i-1)(j-1)] F
(AB)
=
2
AB
/
2
W

Dentro
de grupos
Q
W
Ij(k-1)
2
W
=Q
W
/[ ij(k-1)]
Suma Q ijk-1
2
=Q/(ijk-1)


El valor de F calculado, s e compara con e l valor crtico de F que s e halla e n
tablas , el cual as ocia el nmero de grados de libertad y el nivel de
probabilidad des eados . S i e l valor de F calculado e s me nor que e l valor
crtico, entonces , no exis te efecto s ignificativo entre los factores [82] .

( )
AB
j i
Q
x
x
x x
K
i j i j
=
+

2
. .. . .
Ecuacin 8

46


2 PARTE EXPERIMENTAL

2.1 DESARROLLO DEL MTODO ANALTICO

2.1.1 ANLISIS CROMATOGRFICO

El s is te ma ins trume ntal utilizado compre nde , cromatografa de gas e s de alta
res olucin con detector de ionizacin en llama, HRGC-FID (Hewlett-Packard,
HP 5890A Series II), columna capilar HP-5 (30 m, 0.25 mm d.i., 0.25 m f.e.),
con programacin de te mpe ratura de horno 100C (1 min) has ta 250C (30
min) @ 5C/min, inyeccin splitless.

Como tcnica confirmatoria para alcaloides pirrolizidnicos se utiliz
cromatografa de gas es de alta res olucin acoplada a un detector s electivo de
mas as , HRGC/MSD (Hewlett-Packard HP 5890A Series II/ HP MSD 5972)
ope rado e n e l modo full scan; un s is te ma de datos HP MS Che mStation, con
dos bibliote cas de e s pe ctros de mas as NBS75K (75.000 e s pe ctros ) y WILEY
138 (138.000 e s pe ctros ). Columna HP-5MS (60 m x 0.25 mm d.i., 0.25 m
f.e.), con fase es tacionaria ligeramente polar de 5% de fe nil
poli(metils iloxano); con programacin de temperatura de 120C(10 min) has ta
280C (15 min) @ 4C/min, inye ccin splitless. La te mpe ratura de la cmara
de ionizacin fue de 180 C y la energa de los electrones bombardeantes de
70 eV. Los e s pe ctros de mas as y las corrie nte s inicas re cons truidas s e
obtuvieron por medio de barrido de radio frecuencia en un analizador
cuadropular en un rango de mas as m/z 40 450.



47

2.1.2 IMPLEMENTACIN DEL MTODO DE EXTRACCIN

Para la imple me ntacin de l mtodo de e xtraccin s e utilizaron s e millas de
Crotalaria nitidula, disponibles comercialmente e n tie ndas agroindus triales
(importadas de l Bras il por Se micol S.A), las cuale s pos e e n una alta calidad
fitosanitaria.

Se re alizaron los ensayos preliminares (me diante e xtraccin con s olvente
as is tida por microondas ) con s e millas , corre s pondie nte a los lote s 002 de
Se ptie mbre de 2001 y 000, 001, 002 de Marzo, Julio y Se ptie mbre de 2002,
res pectivamente. Se es tablecila utilizacin de s emillas del lote 002 de 2002,
en el cual s e detectla pres encia de 6 metabolitos s ecundarios , tipo alcaloide
pirrolizidnico.

Los mtodos de e xtraccin utilizados compre ndie ron, la e xtraccin Soxhle t
(Sx), as is tida por ultras onido (Us ) y por radiacin de microondas (Mw). El
tiempo de extraccin para Us y Mw, se es tablecide acuerdo con la
temperatura, a la cual el s olve nte de e xtraccin alcanzun incremento de
10 C re s pe cto al valor inicial, pue s to que el cale ntamie nto del s olvente
acelera la s olubilizacin de los analitos de la matriz.

La cantidad de mue s tra e valuada fue 70 g, la cual pe rmitille var a cabo e l
anlis is cualitativo y cuantitativo para diferentes me tabolitos s ecundarios
presentes en la s emilla. Cada mtodo se realizpor triplicado para s u
validacin estadstica.



48
2.1.2.1 Extraccin Soxhlet de alcaloides

Los tiempos de extraccin para alcaloides pirrolizidnicos utilizando e s ta
tcnica, fue ron 12 y 24 horas . Se pe s aron las s e millas (molida y s e ca) de
Crotalaria (70 g), colocadas en el cuerpo del extractor Soxhlet (Figura 9). Se
lleva cabo la extraccin con 250 mL de me tanol. De s pus de la e xtraccin
con s olvente, la s olucin s e concentren un rotoevaporador (Buchi, modelo
W240) a pre s in re ducida. El e xtracto as obte nido s e s ome tia limpie za, de
acuerdo con el procedimiento des crito a continuacin.


2.1.2.1.1 Limpieza de los extractos de s emilla.

La limpieza de los extractos , s e lleva cabo por acidificacin con HCl 2N (5
mL) hasta pH 2; la me zcla se centrfugpor 5 minutos , e liminndos e e l
re s iduo s lido obte nido; e l s obre nandante s e ajus ta pH 8 con la adicin de
1mL de hidrxido de amonio conce ntrado (NH
4
OH). Los alcaloide s fue ron
extrados con 30 mL de ace tato de e tilo, e n porcione s de 5 mL por ve z,
previa adicin de cloruro de s odio (5 g) para aume ntar la e ficie ncia de la
extraccin.

La fas e orgnica obte nida, fue conce ntrada e n e l rotoe vaporador a pre s in
re ducida has ta alcanzar 5 mL aproximadame nte . Los compue s tos gras os an
pres entes en la s olucin, s e retiraron empleando el s is tema de extraccin en
fas e s lida (SPE), utilizando cartuchos de s lice modificada con octadecilo C
1 8
enlazado

(40 m, 500 mg, Bakerbond SPE columns , J.T Baker), con capacidad
de 3 mL. Se utilize l e quipo de cartuchos para fas e s lida, mode lo Bake r
SPE-246.


49
La etapa de acondicionamiento del cartucho, s e lleva cabo con un s olvente
no polar ( hexano, 6 mL), uno de me dia polaridad (diclorome tano, CH
2
Cl
2
,
6 mL) y por ltimo, e l mis mo s olve nte e n e l cual s e e ncue ntra la mue s tra
(acetato de etilo, 6 mL), ajus tando la velocidad de flujo de una a dos gotas por
s egundo mediante aplicacin de pres in baja.

La aplicacin de la mues tra en el cartucho s e realizs in s uccin, retenindos e
en es te punto los compues tos de naturaleza no polar (cidos gras os ). Para el
lavado del cartucho s e utilizaron 3 mL de acetato de etilo, pos te riorme nte , e l
cartucho s e s e c, con aplicando e l vaco. La s olucin obte nida s e conce ntr
bajo corriente de nitrgeno. Se adicion el estndar interno (ISTD,
difenilamina, 2400 ppm) (50 L), ajus tando el volumen a 1 mL con acetato de
etilo; 1 L de la s olucin se inyectal HRGC/FID.


2.1.2.2 Extraccin de alcaloides as is tida por ultras onido


La extraccin de l os alcaloides pirrolizidnicos as is tida por ultras onido s e
realizdurante 30 y 60 minutos , s in calentamiento. En un recipiente con tapa
ros ca se pesaron las semillas (70 g), se adicionmetanol (100 mL) y la
mezcla s e s ometia la extraccin as is tida por ultras onido.

El e xtracto re s ultante s e filtre n e mbudo Buchne r al vaco, y e l re s iduo s e
lavcon me tanol (40 mL). La s olucin obte nida s e conce ntraun volume n
aproximado de 40 mL e n e l rotoe vaporador a pre s in re ducida, y la s olucin
concentrada se sometia limpieza ascomo se de s cribie n l a Se ccin
2.1.2.1.1.


50
2.1.2.3 Extraccin de alcaloides as is tida por radiacin de microondas

En un re cipie nte con tapa ros ca s e de pos itaron las s e millas (70 g) las cuale s
fueron sometidas a e xtraccin as is tida por radiacin de microondas con
metanol (100 mL). La extraccin s e realizen tiempos de 5 y 10 minutos cada
una, en un horno microondas conve ncional Dae woo mode lo KOG-211M, con
una potencia de cons umo de 1380 W, potencia de s alida de 900 W, frecuencia
de radiacin de microondas de 2.45 GHz, y nive l de pote ncia 1 (10 % de la
potencia mxima). El extracto fue concentrado a pres in reducida y s ometido
a limpieza (Seccin 2.1.2.1.1).

2.1.2.4 Extraccin de alcaloides con modificacin del pH de la matrz.

Se aplicaron los proce dimie ntos de e xtraccin de s critos e n los Nume rale s
2.1.2.1 a 2.1.2.3. Para la extraccin as is tida por Mw, Us y la extraccin Sx s e
ajust e l pH de la matriz, mediante el uso de la buffer de
carbonato/bicarbonato a pH 8.6 (20 mL); pos teriormente, s e adicionmetanol
(80 mL) para llevar a cabo las extraccines as is tidas por Mw y Us , y 230 mL
para la extraccin Soxhlet.


2.2 CULTIVO EXPERIMENTAL


Para la pre s e nte inve s tigacin, s e de s arrollun cultivo e xpe rime ntal de dos
es pecies de Crotalaria, C. retusa y C. nitidula, con el fin de es tudiar el efecto
de dive rs os e s tados de cre cimie nto y condicione s de e s trs ambie ntal s obre
la produccin de alcaloides en la planta.


51
Las plantas se s embraron en predios de la Universidad Indus trial de
Santander, en dos s e ctore s (S1, Se ctor 1; S2, Se ctor 2), que pre s e ntaron
variabilidad e n los s ue los . Las s e millas s e dis e minaron al azar e n cuatro
s urcos por cada era cons truida.


2.2.1 ANLISIS DE SUELOS


La caracterizacin de s uelos , para determinacin del contenido de elementos
mayores y me nore s , s e lle varon a c abo con colaboracin de l Laboratorio
Qumico de Suelos (Ciudad univers itaria), adscrito a la Secretaria de
Agricultura y Des arrollo Rural departamental.

Los anlisis re alizados compre ndie ron las de te rminacine s de pH, textura,
elementos mayore s , carbono (C), fs foro (P), calcio (Ca), magne s io (Mg),
s odio (Na), potas io (K); elementos menores , boro (B), hierro (Fe), manganes o
(Mn), cobre (Cu) y zinc (Zn).


2.2.2 ESPECIES DE PLANTAS UTILIZADAS


Las e s pe cie s de Crotalaria utilizadas fueron clas ificadas por e l Ins tituto de
Ciencias Naturales de Colombia (ICN), as i:

52

Familia: Fabaceae No Col.: 480752
Especie: Crotalaria retusa Crotalaria nitidula

Figura 13. Dos es pecies de Crotalaria A. C. retusa y B. C. nitidula.








2.2.3 CONDICIONES DE ESTRS APLICADAS SOBRE MATERIAL VEGETAL

Los tratamientos realizados en el cultivo experimental comprendieron e l
des arrollo de diversas condiciones de estrs, con e l fin de obtener una
respuesta de la planta para la produccion de me tabolitos secundarios, tipo
alcaloide pirrolizidnico.


2.2.3.1 Es trs por herbivora natural


Comprendila utilizacin de orugas de Le pidpte ros , de la familia Artiidae
(Figura 14) y Notodontoidae (Figura 15), adaptados a la es pecie de Crotalaria
nitidula y Crotalaria retusa, res pectivamente.

A.
B.

53
Los Lepidpteros utilizados , fueron clas ificados (has ta es pecie para la polilla
1 y familia para la polilla 2) con colaboracin de la Dra. nge la Amarillo,
Entomloga, U. Kentucky, EE.UU, as :

Familia: Artiidae
Subfamilia: Arctiinae
Tribu: Callimorphini
Especie: Utetheisa ornatrix Hubner

Figura 14 Polilla 1, Utetheisa ornatrix Hubner.







Figura 15. Polilla 2. Familia Notodontidae.







Los ejemplares fueron adquiridos en los alrededores de la ciudad de
Bucaramanga, hallados en plantas s ilves tres de Crotalaria. Los Le pidpte ros

54
s e emplearon e n e s tado de oruga, e n s u ltimo pe riodo larval o ins tar, e n e l
cual s e es tablece s u mayor tas a de herbivora.

La tas a de he rbivora s obre la planta fue e n prome dio de l 5 al 10%, por
ubicacin de cada e je mplar de oruga s obre e l follaje . Las orugas de s foliaron
parcialmente la planta. El material vegetal s e recolecta los diez (10) das de
realizada la condicin de es trs .


2.2.3.2 Es trs por herbivora s imulada

Se re alizaron corte s parciale s e n las hojas de cada una de las e s pe cie s , con
una tas a prome dio e ntre el 5 y 10%. La re cole ccin de l mate rial ve ge tal s e
realiza los diez (10) das de es tablecida la condicin de es trs .


2.2.3.3 Es trs hdrico

Fue realizado cuando las condiciones ambientales aslo permitan, por
es pacio de 2 a 3 s emanas en aus encia parcial de agua, evitando la muerte de
la planta.


2.2.3.4 Es trs por herbicidas

Se e mple un herbicida come rcial del 80% de pureza, cuya base e s e l
compuesto qumico denominado Atrazina (Figura 16), ampliamente utilizado
en el control de malezas para cultivos de s orgo. La dos is aplicada fue inferior
(cuatro veces) a la recomendada (100 mg L
-1
m
-2
), de acuerdo con l as

55
es pecificaciones de aplicacin de l producto, con el fin de caus ar s olo la
condicin de es trs , s in producir la muerte de la planta.

Figura 16. Es tructura qumica de la Atrazina.







2.2.3.5 Blanco de es trs


Es table ce las mis mas condicione s de iluminacin (las cuale s s on variable s
para cada lote de s ie mbra), as como e l dficit de nutrie nte s de l suelo e
interaccin con otros agentes biticos . Es tas plantas es tuvieron parcialmente
irrigadas , con el fin de evitar un es trs hdrico.


2.2.4 ANLISIS DE MATERIAL VEGETAL

2.2.4.1 Anlis is preliminares en follaje, s in es trs ambiental.

En los extractos preliminares (s in condicin de es trs ) realizados al material
vegetal, s e utilizaron 25 a 40 g de follaje s eco. Las tcnicas aplicadas fueron
extracciones Soxhlet, y as is tida por ultras onido y microondas . Para la
extraccin Soxhlet, la mue s tra se c oloce n e l cue rpo de l extractor con
me tanol (150 mL), por 24 horas . La e xtraccin as is tida por microondas y
N
N
N
Cl
C
2
H
5
HN NH
CH
3
CH
3

56
ultras onido, s e lleva cabo por 5 y 60 minutos , res pectivamente. Se depos it
el material vegetal en un recipiente con tapa ros ca. Cada extracto res ultante,
obtenido por ultras onido y microondas , s e s ome tia filtracin al vaco e n
embudo Buchner, y el res iduo de filtrado s e lavcon metanol (40 mL).

Las s oluciones obtenidas por los tres mtodos , se c oncentraron hasta un
volumen aproximado de 40 mL en un rotoevaporador a pres in reducida. Los
extractos obtenidos se s ometieron a limpieza, de acuerdo con e l
procedimiento des crito a continuacin.


2.2.4.1.1 Limpieza de los extractos de follaje.

Los e xtractos me tanlicos s e acidificaron con HCl 2N (5 mL). En e s te punto
se re tiraron pigme ntos como la clorofila, por lavados sucesivos con te r
e tlico. Los N-xidos pre s e nte s se re duje ron con Zn me tlico e n polvo; la
reaccin de oxido-reduccin s e lleva cabo por 2 horas con agitacin
cons tante . La me zcla s e filtry la s olucin de filtrado s e ajus ta pH 8 con
hidrxido de amonio (NH
4
OH) conce ntrado (1 mL). Los alcaloide s fue ron
extrados con acetato de etilo (30 mL), en porciones de 5 mL por vez, previa
adicin de cloruro de s odio (5 g) para aumentar la eficiencia de la extraccin.

La fase orgnica obtenida fue concentrada en rotoevaporador a pre s in
reducida has ta alcanzar un volumen de 5 mL aproximadamente y bajo
corriente de nitrgeno a un volumen inferior a 1 mL. Se adicion el es tndar
interno (ISTD, difenilamina, 2400 ppm) (50 L), ajus tando e l volume n a 1 mL
con acetato de e til o; 1 L de l a s olucin se inyectal HRGC/FID y al
HRGC/MSD, para anlis is confirmatorio de PAs .


57
2.2.4.2 Anlis is de follaje en condiciones de es trs ambiental.


En un recipiente con tapa ros ca s e pe s aron de 10 a 25 g de follaje s e co, s e
adicionaron 100 mL de me tanol y la me zcla s e s ome tia e xtraccin as is tida
por radiacin de microondas por e s pacio de 5 minutos , s e gn de te rminacin
de las me jore s condicione s para la e xtraccin de alcaloide s pirrol izidnicos
(s eleccin del mtodo, s eccin 3.3.3). La s olucin obtenida, se conce ntr
hasta un volumen aproximado de 40 mL, en rotoevaporador a pre s in
reducida. El extracto s e s ometia limpieza, de acuerdo con el procedimiento
des crito en el numeral 2.2.4.1.1.


2.3 CARACTERIZACIN ESPECTROSCPICA


Para la identificacin completa de alcaloides , s e lleva cabo s u purificacin y
pos terior caracterizacin mediante la utilizacin de las s iguientes tcnicas :

Es pe ctros copa infrarroja (IR): los e s pe ctros s e obtuvie ron e n un e quipo
NICOLET AVATAR mode lo 360 FT-IR s obre pas tillas de KBr (Laboratorio
de Sntes is Orgnica fina, Es cuela de Qumica, UIS).

Es pectros copa de re s onancia magntica nuclear de carbono 13 (RMN
13
C): los e s pe ctros s e obtuvie ron e n un e quipo RMN Bruke r Avance de 300
MHz (Univers idad de Antioquia, Departamento de Qumica, Medelln).

Es pectrometra de masas: los es pectros se obtuvieron e n un GC-MS
Hewlett-Packard HP 5890A Series II/ HP MSD 5972, operado en el modo full

58
scan. Columna HP-5MS (60 m x 0.25 mm d.i., 0.25 m f.e.) (Laboratorio de
Cromatografa, Es cuela de Qumica, UIS) .

Difraccin de rayos X: los e s pe ctros fue ron bte nidos e n un difractmetro
para mues tras policris talinas de Rayos X, RIGAKU D-MAX-III/B ( Laboratorio
de Difraccin de rayos X, Es cuela de Qumica, UIS).


59



3 RESULTADOS

3.1 DESARROLLO DEL MTODO ANALTICO.

3.1.1 DETERMINACIN DE FACTORES DE RESPUESTA.

El anlisis cuantitativo se llev a cabo empleando el mtodo de
es tandarizacin interna, utilizando difenilamina como es tndar interno. Debido
a la pres encia e n los extractos de semillas de ms de un alcaloide
pirrolizidnico ( de acuerdo con e l anlis is GC-MS), los cuales no e s tn
dis ponibles come rcialme nte , la determinacin del factor de re s pue s ta (R
f
)
e mple e l estndar interno en dife re nte s conce ntracione s , y se calculla
pendiente de la recta as ociada a la s iguiente relacin:

) / (
) (
L mg in Concentrac
cuentas rea
Rf =
Ecuacin 9

La re pe tibilidad de las re as cromatogrficas y los factore s de re s pue s ta, s e
analizme diante la de s viacin e s tndar (, Seccin 1.4) y e l coe ficie nte de
variacin (CV%).
100 * % CV

=

Ecuacin 10
X : promedio de R
f


Las Tablas 5 y 6 c ontienen los re s ultados de re pe tibilidad de los Rf y las
reas cromatogrficas , res pectivamente.

60

Tabla 5. Re pe tibilidad de los factore s de re s pue s ta para e l e s tndar inte rno,
difenilamina, determinados por GC/FID.

Concentracin,
mg/L
rea,
cuentas
Factor de
res pues ta
R
f

prome dio

% CV
315888 3296
300695 3137 96
321523 3355

3300


112


3,45

732899 3824
715602 3733 192
722717 3770

3800


45


1,20

1151817 3999
1224272 4251 288
1121409 3894

4000

183

4,53
2099041 4380
2126835 4438 479
2116692 4417

4400

29

0,67

La cuantificacin relativa al es tndar interno, de los alcaloides pirrolizidnicos
s e determins egn la s iguiente relacin:
Wx
Vf
Rf
Ax
Cx * =
Ecuacin 11
Cx : Concentracin del alcaloide (mg PA/kg de s emilla o follaje)
Ax : rea cromatogrfica del alcaloide
Rf : Factor res pues ta del es tndar interno
Vf: Volumen final del extracto (L)
Wx : Pes o de la mues tra tomado (kg)

61

Tabla 6. Repetibilidad de las reas cromatogrficas a diferente s
concentraciones de difenilamina (ISTD), determinado por GC/FID.

Concentracin,
mg/L
rea,
cue ntas
rea
promedio

% CV
315888
300695 96
321523
310000 10774 3,45
732899
715602 192
722717
724000 8694 1,20
1151817
1224272 288
1121409
117000 52844 4,53
2099041
2126835 479
2116692
2110000 14065 0,67


Te nie ndo e n cue nta que e l coeficiente de variacin, es una e s timacin de l
error relativo que permite comparar la precis in de los res ultados , las
repetibilidades del R
f
y de las re as pre s e ntan valore s ace ptable s (<5%), de
acuerdo con las Buenas Practicas de Laboratorio [ 85] .


62
3.2 IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES PIRROLIZIDNICOS POR
CROMATOGRAFA DE GAS ES/ ESPECTROMETRA DE MASAS


La implementacin del mtodo de extraccin s e lleva cabo con s emillas del
lote 002 de s eptiembre de 2002. Se utilizaron 70 g de s emillas , metanol como
s olvente, y las tcnicas de e xtraccin Soxhle t, as is tida por microondas y
ultras onido de acue rdo con lo descrito en el Numeral 2.1.2 de la S e ccin
Experimental. Todos los extractos se analizaron utilizando el s is tema
HRGC/FID y como tcnica confirmatoria de la pres encia de alcaloide s ,
GC/MS.

Los ndices de rete ncin de Kovts (I
k
), s e determinaron por comparacin de
los tiempos de retencin con los de una mezcla patrn de hidrocarburos de C
7

a C
18
, en columna HP-5. Los ndices s e compararon con los reportados en la
literatura por Witte y colaboradore s (Se ccin 1.3.2.1), utilizando igual fas e
es tacionaria.

Se identificaron tentativamente en las s emillas de Crotalaria nitidula 6 PAs
por s us ndices de retencin de Kovts . Los alcaloides hallados s e relacionan
e n la Tabla 7, donde aparecen iones caracte rs ticos , con la identificacin
s e gn bas e s de datos NBS75K y WILEY 138 e ide ntificacin con bas e e n los
Ik calculados , us ando la literatura cientfica [ 76, 77, 79] . En los es pectros de
masas que s e pres entan en las Figura 17, 19, 21, 23, 25 y 26, s e regis traron
fragme ntos caracte rs ticos de alcaloide s pirrolizidnicos monos te r (m/z 80,
106, 111, 136, 137, 138) y dister (m/z 80, 93, 106, 120, 136).



63

Tabla 7. Alcaloides ais lados en Crotalaria nitidula.
Compuesto
identificado segn
bas e de datos *
% de coincidencia
con el es pectro de
la bas e de datos
Ik
experimental
Identificacin del
compues to s egn Ik
[ 68]
Iones caracters ticos
m/z (I %)**
Retronecina 88 1499 Heliotridina(7S)/
1495
41 (23), 53 (15), 68 (18), 80 (100), 94
(21), 111 (44), 155 (17)

9-0-Propionil
retronecina
53 2096
N.D.
41 (34), 43 (61), 55 (20), 68 (16), 69
(18), 80 (100), 93 (24), 94 (32), 111
(53), 120 (21), 124 (18), 136 (21), 137
(20), 138 (12), 154 (10), 220 (12), 281
(22)
3Acetil-
licops amina
70 2195

Licopsamina/ 2197
Intermedina / 2188
41 (20), 53 (12), 67 (13), 80 (29), 93
(100), 111 (9), 138 (69), 155 (20), 224
(5), 239 (3), 283 (1)
Interregimina 40 2397 Spartioidina/ 2400
Interregimina/ 2402
43 (62), 69 (19), 80 (32), 93 (49), 120
(83), 136 (100), 222 (7), 264 (2), 337
(3)
Senecionina 25 2497 Jacobine/ 2495 41 (11), 43 (24), 75 (17), 80 (12), 93
(21), 94 (18), 120 (100), 121 (28), 136
(29), 264 (28), 365 (1)
Jacobina 33 2499 Rindellina/ 2513 41 (40), 43 (54), 69 (20), 80 (35), 93
(62), 95 (75), 106 (19), 120 (100), 121
(62), 136 (53), 137 (44), 222 (17) 264
(3), 337 (1)
* Bas es de datos utilizadas : NBS75K y WILEY 138 N.D. - No dis ponible
**m/z (I %) Relacin m/z, I, %- Intens idad relativa

64
El compue s to con I
k
2096, no s e encuentra reportado en la literatura cientfica
[ 68] ; la "calidad" de su identificacin por c omparacin c on e s pe ctros de
mas as de la bas e de datos fue de l 53%, y corre s pondia la 9-O-propionil
retronecina, en cuyo es pectro de mas as aparecen fragmentos tpicos de
alcaloides monos ter ins aturados .

Dentro del grupo de compues tos con base necina se hallan los
es treois meros re trone cina y heliotridina ( Ik 1499), cuyos es pectros s on
muy s imilares , aunque s us ndices de retencin s e diferencian en 30 unidades .

Figura 17. Es pectro de mas as del alcaloide pirrolizidnico con I
k
1499.










Figura 18. Pos ibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con I
k
1499.






40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
0
5000
10000
15000
20000
m/z-->
Abundance
80
111
41
94
68 155
53
205
138 220 124
166
103
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
0
5000
10000
15000
20000
m/z-->
Abundance
80
111
41
94
68 155
53
205
138 220 124
166
103
I
k
1499
CH
2
OH H
O H
N
H
C
8
H
13
NO
2
C
8
H
13
NO
2
H
CH
2
OH H
O H
N
Retronecina
Ik 1465
P.M. 155.2
Heliotridina
Ik 1495
P.M. 155.2


65
El e s pe ctro de mas as de la re trone cina, e xhibe un pico de bas e e n m/z 80,
producto de la es cis in en los carbonos 5 y 7 de la bas e necina, acompaada
de la prdida de un radical CH
2
OH
*
.
Es quema 5. Formacin de iones caracters ticos en el es pectro de mas as de la
retronecina.










Figura 19. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con I
k
2096.













40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
0
10000
15000
20000
25000
Abundance
Scan 3051 (40.644 min): 6A.D
80
43
111
94
281 136
55 124
69
220 154
264
185 248 171
196
207
5000
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
0
10000
15000
20000
25000
Abundance
Scan 3051 (40.644 min): 6A.D
80
43
111
94
281 136
55 124
69
220 154
264
185 248 171
196
207
5000

I
k
2096
CH
2
OH H
O H
N
H
C H
2
CH
2
OH
HC
N
CH
2
OH
N
C H
2
- OH
CH
N
C H
2
- CH
2
OH
C
4
H
9
NO
C
4
H
4
O+
- C
2
H
4
O
*
N
C H
2
+
m/z 111
m/z 155
+.
+
m/z 94
m/z 68
.
+
m/z 80
+

66
En el es pectro de mas as de es te compues to aparecen ione s en m/z 80 y 111,
tpicos para monos teres s us tituidos en la pos icin C
9
, con base ne cina
ins aturada; los iones en m/z 137, 138, s on productos de la ruptura en C
9
-O.


La identificacin realizada s egn la bas e de datos Wiley 138, es tablece como
compues to probable el 9-O-propionil retronecina; sin e mbargo, segn l a
cons ulta en [ 84] , otras pos ibles es tructuras planteadas para es te compues to
por comparacin con su peso molecular ( M
+ *
281) y caracters ticas de
monoster s us tituido en C
9
, a saber:

Figura 20. Pos ibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con I
k
2096.











O
O
CH
3
N OH
O H
C H
3
CH
3
H
C
15
H
25
NO
4
O
O
CH
3
N OH
O H
C H
3
CH
3
H
C
15
H
25
NO
4
O
O
N
CH
3
C
11
H
17
NO
2
Amabilina

P.M. 283.4
Supinina

P.M. 283.4

P.M. 195.4
9-O-Propionilretronecina


67
Figura 21. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con I
k
2195.












Las pos ible s e s tructuras para e l alcaloide con I
k
2195 e xpe rime ntal, s e gn
s us ndices de retencin de Kovts [ 68] , s e pres entan en la Figura 22.

Figura 22. Posibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con Ik 2195
experimental










.
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
240000
260000
280000
300000
m/z-->
Abundance
Scan 3196 (42.265 min): 6A.D
93
138
80
41
155
53 67
111
224
126
239
268 283 194 180 256 206 166


I
k
2195
O
O
CH
3
N OH
O H
C H
3
CH
3
H
H
O H
C
15
H
25
NO
5
O
O
CH
3
N OH
O H
C H
3
CH
3
H
H
O H
C
15
H
25
NO
5
O
O
CH
3
N OH
O H
C H
3
CH
3
H
H
O H
C
15
H
25
NO
5
O
O
CH
3
N OH
O H
C H
3
CH
3
H
H
O H
C
15
H
25
NO
5
Ri nderi na
Ik 2205
P. M. 299
Indicina
Ik 2185
P. M. 299
Ik 2197
P. M. 299
Li copsami na
Ik 2188
P. M. 299
Intermedina

68
Esquema 6. Ruta de fragmentacin de la licops amina.

















Figura 23. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con I
k
2397.













Las pos ibles es tructuras para los alcaloides con Ik 2397, 2497 y 2499
experimentales , s egn s us ndices de retencin de Kovts reportados en [68] ,
s e pres entan en las Figuras 24 y 27.
.
+
.
+
- C
2
H
5
O
- C
5
H
8
O
2
O
O
CH
3
N
O H
C H
3
CH
3
H
O H
OH
O
N
C H
2 O H
H
.
+
O
O
N
CH
3
CH
3
O H
H
OH
- OH
N
CH
2
O H
CH
CH
2
CH
2
OH
N
CH
2
OH
N
CH
2
- OH
C H
3
N
CH
2
- CH
3
O
N
CH
2
- C
2
H
4
O
+
m/z 299
Mc Laffertty
m/z 255
Transp. H
m/z 155
+
m/z 138
m/z 111
Transp H
m/z 94
m/z 80
+ + +
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
20000
40000
60000
80000
m/z-->
Abundance
Scan 3666 (47.520 min): 6A.D
136
120
43
93
69
222
264 206
337 155
294 408 353
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
20000
40000
60000
80000
m/z-->
Abundance
Scan 3666 (47.520 min): 6A.D
136
120
43
93
69
222
264 206
337 155
294 408 353

I
k
2397

69

Figura 24. Posibles es tructuras del alcaloide pirrolizidnico con I
k
2397
experimental.









Figura 25. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con I
k
2497.












40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
20000
40000
60000
80000
100000
m/z-->
Abundance
120
136
264
43 93
75
222
185 59
157
394 365 410
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
20000
40000
60000
80000
100000
m/z-->
Abundance
120
136
264
43 93
75
222
185 59
157
394 365 410

I
k
2497
N
O
O
O
O
H
OH
CH
2 CH
3
H
CH
3
C
18
H
23
NO
5
N
O
O
O
O
CH
3 H
H
H
H
CH
3
OH
CH
3
C
18
H
25
NO
5
Interregimina
Ik 2400
P.M. 333
Espartidionina
Ik 2402
P.M. 335


70

Figura 26. Es pectro de mas as del alcaloide pirolizidnico con I
k
2499.











Figura 27. Posibles es tructuras de alcaloides pirrolizidnicos con I
k

experimentales 2497 y 2499.















40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
10000
20000
30000
40000
50000
m/z-->
Abundance
120
95
43
136
69
222
264
293 337 206 166 248 408 185 309
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
10000
20000
30000
40000
50000
m/z-->
Abundance
120
95
43
136
69
222
264
293 337 206 166 248 408 185 309

I
k
2499
N
O
O
O
O
H
H
OH CH
2
H
C H
3
CH
2
-OH
C
18
H
23
NO
5
Ridellina
Ik 2513
P.M. 349
N
O
O
O
O
H
OH
CH
3
CH
3
H
O
H
C H
3
C
18
H
25
NO
6
Jacobina
Ik 2495
P.M. 351
N
O
O
O
O
H
OH
CH
2
-CH
3
C H
3
H
O
CH
2
C
19
H
25
NO
6
Jacozina
Ik 2525
P.M. 365
N
O
O
O
O
H
OH
CH
3
CH
3 H
H
OH
OH
C
18
H
27
NO
7
Jacolina
Ik 2535
P.M. 369

71

Los compue s tos con I
k
e xpe rime ntale s 2397, 2497 y 2499, pre s e ntan picos
caracters ticos en m/z 120, 136, con diferencias en sus intens idades ; l a
fragme ntacin de las molculas inicia e n e l s te r allico y e n e l s te r C
7
, con
eliminacin del cido necnico (Anc) y formacin del in (M-Anc) en m/z 120,
como s e repres enta en el Esquema 7.

Es quema 7. Es que ma de fragme ntacin de alcaloide s pirrolizidnicos dis te r
macrocclicos de bas e necina saturada.
+
- CO
2
N
O
OC
O
O
H
CH
3
OH
+
.
OC
CH
3
OH O
N
H
H
O H
O
OC
CH
3
OH
N
O
O O
H
H
H
+
.
O
N
H
H
O
2
C
CH
3
OH
O
H
O
-
OC
CH
3
OH
O
H
O
-
CH
2
N
H
H
+
N
CH
2
O
O
H
O
CH
3
+
.
N
O
OC
O O
H
O
CH
3
H
CH
3
O
O
O
--
H
N
C H
2
CH
2

+
m/z 136
+
m/z 120

+
m/z 95


72

3.3 IMPLEMENTACIN DEL MTODO DE EXTRACCIN DE PAS

3.3.1 ANLISIS PRELIMINAR EN SEMILLAS


Se realizaron extracciones por Sx, Mw y Us de s emillas de Crotalaria nitidula
de tres lotes (002- Se ptie mbre /2001, 000-Marzo/2002, 001-Julio/2002), las
cuales no pres entaron alcaloides pirrolizidnicos , segn e l anlis is
confirmatorio realizado por GC-MS.

Es te hecho es trelacionado con la calidad fitos anitaria alta de los cultivos de
esta planta y por ende, de las semillas adquiridas comercialmente; los
metabolitos pirrolizidnicos se forman e n la planta como res pues ta a una
condicin de es trs ambiental (Seccin 1.2.4). Tan s olo e n s e millas de l lote
002 de Septiembre/2002, s e hallla pres encia de 6 metabolitos s ecundarios ,
tipo alcaloide. Este lote de s e millas s e utilizpara la implementacin de l
mtodo de extraccin.

Pre vio a la e xtraccin de alcaloide s , s e re alizla pre cipitacin de prote nas
con e tanol, con lo cual s e disminuycons ide rable me nte la vis cos idad de l
extracto, permitiendo la manipulacin de la mues tra y s u inye ccin al s is te ma
cromatogrfico. Los inconvenientes pres entados fueron caus ados por la
dificultad de precipitar prote nas e n cas os donde la cantidad de gras as e s
elevada, entorpeciendo la manipulacin de la mues tra; por tanto, el s is tema de
limpieza adoptado comprendilos pas os expues tos en la Seccin 2.1.2.1.1.

Se de s cartla utilizacin de la e xtraccin con fluido s upe rcrtico, de bido a
que e l anlis is cualitativo de los PAs por GC/MS, s e lle va cabo utilizando

73
70 g de s e millas y por SFE tan s lo e s pos ible analizar mximo 10 g de l
mate rial. De igual mane ra, la e xtraccin por s orbe nte s lido s e anul, por s u
capacidad baja para retener los analitos y alto cons umo de s olvente.


Es te trabajo preliminar permitideterminar la importancia de la utilizacin de
GC/MS para corroborar la pres encia de PAs , de acuerdo con los patrones de
fragme ntacin e n s us e s pe ctros de mas as (Se ccin 1.3.2.2.1). Se e s table ci
que mltiples sustancias producidas por las plantas (e n semilla y follaje ),
pueden eluir a igual tiempo de retencin relativo y por ende pos eer el mis mo
valor del ndice de retencin de Kovts .


3.3.2 ANLISIS DE VARIANZA


Se e laborun dis e o de 2 factore s (pHy tie mpo) con tres lecturas por
mues tra, y s e aplicaron las ecuaciones pres entadas en la Seccin 1.4.1, de la
parte terica, para cada mtodo de extraccin utilizado, Soxhlet, as is tidas por
ultras onido y r adiacin de microondas . Cada factor pre s e ntdos nive le s ,
s uperior e inferior, as :
Tabla 8. Niveles s uperior e inferior para los factores pH y tiempo
Niveles
Factor Superior Inferior
A (pH) 9 7
B (tiempo) t 2t


74
Los tie mpos de e xtraccin (factor B) fue ron 12 y 24 horas con Soxhle t, 5 y
10 minutos para e xtraccin as is tida por microondas y 0.5 y 1 hor a c on
ultrasonido.

Para de te rminar cmo s e afe cta e l parme tro obs e rvable y(conce ntracin
de PAs , mg/kg) por los factore s pH y tie mpo, s e lle va cabo e l anlis is de
varianza, con bas e en el pico del alcaloide con I
k
2397, pres ente en la mayora
de los e xtractos re alizados , cuyo e s pe ctro de mas as e s tpico de alcaloide s
dister macrocclicos.

Las c onvenciones adoptadas relacionan el mtodo de e xtraccin (Sx, Mw,
Us ), tiempo (s e gn Tabla 8), y por ltimo, la modificacin del pH, e .g.
Sx24pH9.

Tabla 9. Valor de "y" (concentracin) para las rplicas del PA (I
k
2397), s egn
mtodo de extraccin.

pH 7 pH 9 x.j

Us 1h 2,38 1,98 1,71 0,39 0,39 0,42 1,21
Us05h 1,00 1,37 1,25 0,10 0,13 0,10 0,66
xi. 1,69 1,67 1,48 0,25 0,26 0,26
Mw5 1,580 2,115 2,156 0,231 0,271 0,302 1,11
Mw10 1,959 1,730 1,993 0,466 0,337 - 1,30
xi. 1,77 1,92 2,07 0,35 0,30 0,30
Sx12h 1,165 1,186 0,972 1,452 1,788 1,700 1,38
Sx24h 0,621 0,758 0,543 0 0 0 0,32
xi. 0,89 0,97 0,76 0,73 0,89 0,85


75
Tabla 10. Valore s prome dio de conce ntracin re lativa (C
x
/C
i s t d
) para e l PA
con I
k
2397.
Mtodo
Promedio,
mg PA/kg

CV, %
Mw10 1,9 0,14 7,55
Mw10pH9 0,40 0,09 22,86
Mw5 2,0 0,32 16,48
Mw5pH9 0,26 0,02 9,22
Sx12 1,1 0,12 10,68
Sx12pH9 1,6 0,24 14,68
Sx24 0,6 0,11 16,94
Sx24pH9 N.D. - -
Us05 1,2 0,19 15,61
Us05pH9 0,11 0,01 12,81
Us1 2,0 0,34 16,58
Us1pH9 0,40 0,02 4,25
N.D. No detectable

Los efectos de cada factor por s e parado y de las inte raccione s e ntre dos
factores , s egn el mtodo de extraccin, s e res umen en la Tabla 11.

Tabla 11. Efecto de cada factor y de las interacciones entre dos factores .

Mtodo Factor A (pH) Factor B (t) Interaccin
(Q
AB
)
Error (Qw)
Q
A
Q
B
Q
AB
Qw
Us 5,535 0,922 0,206 0,297
Mw 7,799 0,106 0,095 0,258
S x 0,008 3,350 1,045 0,112


76
Tabla 12. Valor del parmetro F.

Mtodo Factor A (pH) Factor B (t) Interaccin (Qab) Valor crtico
para F
F F F
Us 148,937 24,801 5,530 5,32
Mw 241,55 3,28 2,95 5,32
S x 0,55 238,62 74,40 5,32


Los valores de l parmetro F me nore s que sus valores crticos , pe rmite n
es tablecer que la influencia de dicho factor, no produce un efecto s ignificativo
s obre la variacin en el obs ervable y (conce ntracin de PAs ); con lo cual
la modificacin de l pH no alte ra s ignificativame nte la cantidad de alcaloide
extrado por el mtodo de e xtraccin Soxhlet, contrariamente, a l o que
s ucede con los mtodos de extraccin as is tidos por ultras onido y microondas :
es te hecho s e puede vis ualizar en la Figura 28.

El efecto del factor tiempo y la interaccin entre factores no s on
s ignificativos en el caso de la extraccin asistida por radiacin de
microondas . Para la extraccin por ultras onido y Soxhlet, el factor tiempo y la
inte raccin e ntre factore s (pH y tie mpo), tie ne n un marcado e fe cto s obre la
extraccin del alcaloide, s iendo an ms s ignificativa para el mtodo Soxhlet.


La variabilidad de los re s ultados obte nidos , s e pe rcibe e n la s iguie nte figura
con s us corres pondientes barras de error.


77
Figura 28. Variacin del c ontenido de PA (Ik 2397), s egn mtodo de
extraccin.















En la Figura 28 se obs erva que la conce ntracin de PAs por e fe cto de
variacin del tiempo para la extraccin as is tida por Mw a un mis mo pH, no s e
altera s ignificativamente; entre tanto, la variacin de l pH para un mis mo
tiempo s la afecta. Para la extraccin por ultras onido, la variacin del tiempo
a un mis mo pH, incre me nta e n cas i un 50% e l conte nido de alcaloide ; la
variacin de pH e n cambio reduce drs ticame nte e l conte nido de PA, tal
como lo confirma el anlis is de varianza, con el clculo del parmetro F.


Los conte nidos de alcaloide , ais lado tanto por Mw (a los dos tie mpos ) como
por ultras onido (a 1 h) s in modificacin del pH s on s imilare s , con lo cual s tos
dos mtodos bajo las caracters ticas des critas , pres entan los mejores
IMPLEMENTACIN DEL MTODO DE EXTRACCIN
0
1
2
3
M
w
1
0
M
w
1
0
p
H
9
M
w
5
M
w
5
p
H
9
S
x
1
2
S
x
1
2
p
H
9
S
x
2
4
S
x
2
4
p
H
9
U
s
0
5
U
s
0
5
p
H
9
U
s
1
U
s
1
p
H
9
Mtodo de extraccin
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

r
e
l
a
t
i
v
a
,

m
g

P
A
/
k
g

78
res ultados para la extraccin de alcaloide s ; no obs tante, la s eleccin de l
mtodo contempla otros parmetros que se es tablecen en la s iguiente
seccin.


3.3.3 SELECCIN DEL MTODO DE EXTRACCIN DE PAs


La e s timacin de la e ficie ncia de la e xtraccin de alcaloide s pirrolizidnicos ,
utilizando diferentes mtodos (con variacin del pH y e l tiempo de
extraccin), s e realizcon bas e en el nmero mayor de alcaloides extrados y
la cantidad (concentracin relativa) de cada uno, teniendo en cuenta, a s u vez,
tiempos ms cortos de extraccin y cons umo de s olvente bajo.

Como s e obs erva en la Figura 29, exis te una marcada influencia del mtodo y
del tiempo de extraccin sobre e l nmero y en cantidad de alcaloides
extrados . Por el mtodo Soxhle t, s e e xtrae n 2 alcaloide s de l tipo dis te r
macrocclico, en c oncentracin re lativa que no supera l os 2 mg/kg; e s te
mtodo pre s e nta e ficie ncia baja en la e xtraccin de PAs con re s pe cto a los
mtodos por ultras onido y microondas , adems de un mayor cons umo de
s olvente (ver Seccin Experimental) y tiempos ms largos para llevar a cabo
la extraccin.

Para la e xtraccin por Mw, la variacin de l tie mpo es table ce la pre s e ncia de
5 y 4 alcaloides e n tiempos de 5 y 10 minutos de extraccin,
re s pe ctivame nte ; s in e mbargo, la conce ntracin re lativa de los alcaloide s e s
s e me jante e xce pto para e l compue s to con I
k
2195, cuya cantidad ais lada e s
mayor al tiempo de extraccin menor.


79

Figura 29. Eficie ncia de la e xtraccin de alcaloides pirrolizidnicos para
diferentes tiempos de extraccin, s in modificacin de pH.

M
w
1
0
M
w
5
S
x
1
2
h
S
x
2
4
U
s
0
5
U
s
1
h
1499
2097
2195
2397
2497
2499
0
5
10
15
20
25
Concentracin
relativa,
mg/kg
Mtodo
ndices de
Kovts


La extraccin asistida por Us , pre s e nta alta e ficie ncia para los tie mpos de
extraccin ms largos , pe rmitie ndo e xtrae r igual nmero de alcaloide s e n
concentraciones relativas s emejantes a las obtenidas por el mtodo de
extraccin por microondas .

En la extraccin por Us, la variacin del tiempo no slo afecta la
concentracin, s ino el nmero y el tpo de PAs extrados .

80
Figura 30. Eficie ncia de la e xtraccin de alcaloides pirrolizidnicos para
diferentes tiempos de extraccin y pH.
M
w
1
0
p
H
9
M
w
5
p
H
9
S
x
1
2
p
H
9
S
x
2
4
p
H
9
U
s
0
5
p
H
9
U
s
1
p
H
9
1499
2097
2195
2397
2497
2499
0
2
4
6
8
10
Concentracin
relativa,
mg/kg
Mtodo
ndices de
Kovts



La eficiencia de la extraccin a diferentes pH de la matriz, us ando una buffe r
de carbonato/bicarbonato, reduce cons iderablemente el nmero y la cantidad
de alcaloide s pirrolizidnicos al aplicar los mtodos de e xtraccin de Mw y
Us , de bido ala s us ceptibilidad de es tas es tructuras a hidrlis is ; s in embargo,
es tos proces os s uce de n e n grupos s te r, a pH altos , cuando s e us an bas e s
fuertes tipo NaOH y en el cas o de mate rial vegetal, la hidrlis is pue de
iniciars e en la pres encia de ines de Fe
2+
[ 77, 78] .


81
Figura 31. Eficiencia de la extraccin de alcaloides pirrolizidnicos .
M
w
1
0
M
w
1
0
p
H
9
M
w
5
M
w
5
p
H
9
S
x
1
2
h
S
x
1
2
p
H
9
S
x
2
4
S
x
2
4
p
H
9
U
s
0
5
h
U
s
0
5
p
H
9
U
s
1
U
s
1
p
H
9
1499
2096
2195
2397
2497
2499
0
5
10
15
20
25
Concentracin
relativa,
mg/kg
ndices de
Kovts



Numeros as inves tigaciones han e mple ado la tcnica de e xtraccin Soxhle t
para e l ais lamie nto de PAs , ge ne ralme nte , e n pe riodos de 16 a 24 horas e
inclus o con modificacin del pH de la matriz con hidrxido de amonio [ 65, 72,
86] . Sin embargo, la aplicacin de otras tcnicas de e xtraccin, como Mw y
Us a pH de la matriz, pe rmitie s table ce r, que e l nme ro y la cantidad de
metabolitos extrados y detectados fue mayor. Estas tcnicas e mple an
tie mpos de e xtraccin ms cortos , cantidad de s olve nte me nor, ade ms , la
extraccin s e realiza a temperaturas menores de 35 C, lo que evita pos ibles
modificaciones de es tructuras por efecto de la temperatura.


82
Para e l pre s e nte cas o, la e xtraccin por Us y Mw s e lle va cabo con un
incre me nto no s upe rior a 10 C a la te mpe ratura ambie nte para e l s olve nte ;
entre tanto, por Soxhlet s e pres entaron los rendimientos ms bajos , ya que s e
trabaja la temperatura de ebullicin de l s olvente y pe riodos de tie mpo
prolongados.

Con bas e e n los re s ultados ante riorme nte pre s e ntados , s e e s table ce que las
me jore s condicione s para la e xtraccin de l mayor nme ro y la cantidad de
alcaloides pirrolizidnicos s on: ultras onido a 1 hora (Us 1h) y/o microondas a 5
minutos (Mw5) s in modificacin del pH de la matriz.


3.4 CARACTERIZACIN DE FOLLAJE


Las plantas , obje to de l pre s e nte e s tudio, fue ron cultivadas e n dos s e ccione s
(S1, S2), cuyos suelos no pres entan variabilidad en su contenido de
elementos mayores y menores , excepto para los contenidos de fs foro.

Ambos s uelos presentan deficiencias en potas io y magnesio, elementos
neces arios para el buen crecimiento de las plantas . Sin embargo, la diferencia
s us tancial en es tos s uelos radica en los contenidos de fs foro dis ponible, el
cual es primordial en Leguminos as como la Crotalaria para alcanzar s u etapa
de madurez (floracin).






83
Tabla 13. Caracterizacin de s uelos .

ENSAYO S 1 S 2
pH 7.8 7.7
% C 0.70 1.1
P (ppm) 1 150
Ca (meq./100g) 13.65 17.51
Mg (meq./100g) 0.90 1.20
Na (meq./100g) 0.43 0.35
K (meq./100g) 0.18 0.20
Al (meq/100g) - -
% Arena 70 70
% Limo 20 20
% Arcilla 10 10
*B (ppm) 0.08 0.20
*Fe (ppm) 3.8 11.1
*Mn (ppm) 0.95 3.76
*Cu (ppm) 0.17 0.58
*Zn (ppm) 0.86 3.80
CIC (meq/100g) 14 15
* Elementos menores ; CIC: Capacidad de intercambio catinico.


3.4.1 ANLISIS PRELIMINARES

Los extractos del material vegetal s e realizaron de acuerdo con e l
procedimiento descrito e n la Seccin 2.2.4.1, a los lotes de s iembra
presentados en la Tabla 14.


84
En los e xtractos no s e re gis traron alcaloide s , e xce pto para la mue s tra de
Crotalaria retusa, a 150 das de re cole ccin, al inicio de la e tapa de floracin
us ando la tcnica de extraccin as is tida por microondas (Figura 32), donde s e
detectun alcaloide dis te r macrocclico con I
k
2497 (Se ccin 3.2). Es to
demues tra que debido a que las condiciones para es tos cultivos
experimentales es tuvieron libre de e s trs ambiental o provocado (male za,
ins e ctos , s e que dad, he rbicidas ), la re s pue s ta de las plantas a la produccin
del alcaloide fue baja.


Tabla 14. Tiempos de siembra y recoleccin de follaje e n anlis is
preliminares.
Sue lo Especie Siembra- Recoleccin Tiempo de
crecimiento (das )
S 1 C. nitidula 05 marzo -15 mayo/2002 105
23 junio -1 nov/2001 120
23 junio/2001 -13 feb/2002 225
S1

C. retusa

05 marzo -18 junio/2002 105
05 dic/2001 - 23 feb/ 2002 70 S2

C. nitidula
05 dic/2001 -14 mayo/2002 150
21 julio -29 nov/2001 120
01 s ept/2001-23 enero/2002 135
S2 C. retusa
05 dic/2001 - 14 mayo 2002 150
El tiempo de crecimiento s e es tablecides de la aparicin de la plntula.



85
Figura 32. Cromatogramas tpicos para e valuar e l conte nido de l alcaloide e n
40 g de follaje de Crotalaria retusa, a 150 das de cre cimie nto, inye ccin
splitless. FID.


















A- Extraccin por Soxhlet (24 h)
B- Extraccin as is tida por ultras onido (1 h)
C- Extraccin as is tida por microondas (5 min).

3.4.2 CONDICIONES DE ESTRS AMBIENTAL

Es conocido que l os alcaloides pirrolizidnicos juegan un rol importante y
cumplen funciones ecoqumicas en plantas de las especies de Senecio,
Crotalaria y Ligularia; la interaccin ms ampliamente aceptada comprende la
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
2
1
9
7
2
3
9
7
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
Alcaloide pirrolizidnico (trazas)
Ik 2497
A
B
C
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
2
1
9
7
2
3
9
7
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
2
1
9
7
2
3
9
7
Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30
Alcaloide pirrolizidnico (trazas)
Ik 2497
A
B
C


86
relacin planta-insecto he rbvoro. Las plantas han des arrollado
mecanis mos de detoxificacin a es tos metabolitos s ecundarios emplendolos
para s us propios mecanis mos de defens a [ 39] .

Tambin se pueden c onsiderar otras formas de e s trs ambiental para l a
s ntes is de es tos alcaloides por parte de las plantas , con lo cual fue neces ario
e valuar e n qucondicione s la planta produce en mayor proporcin e s tas
s us tancias .

Se aplicaron las condiciones de es trs des critas en la Seccin 2.2.3 (e s trs
hdrico, por herbivora, herbivora s imulada y por un herbicida) a los lotes de
siembra pres entados e n la Tabla 15. Las plantas fueron re cole ctadas y
almace nadas para s u pos te rior anlis is . Los e xtractos de l mate rial ve ge tal
(follaje y race s ) s e re alizaron por Mw a un tie mpo de 5 minutos , de acue rdo
con el procedimiento des crito en la Se ccin 2.2.4.2.

Tabla 15. Tie mpos de s ie mbra y re cole ccin de follaje e n condicione s de
es trs ambiental.
Sue lo
Es pecie

Siembra - recoleccin Tiempo de
crecimiento (das )
Tipo de e s trs
S1 C. nitidula 1 s ept. - 11 nov/2002 70 Herbivora
s imulada
S1 C.retusa 2 s ept. - 11 nov/2002 70 Herbivora simulada
S1 C. nitidula 8 s ept. - 17 dic./2002 97 Es trs por
herbicida
S1 C.retusa 1 sept. - 17 dic/2002. 103 Herbivora simulada
S2 C. nitidula 24 mayo -8 ago/2002 70 Herbivora natural,
Es trs hdrico
S2 C.retusa 25 mayo - 8 ago/2002 70 Herbivora natural,
Es trs hdrico
S2 C. nitidula 22 ago- 4 nov/2002 70 Herbivora s imulada
S2 C.retusa 22 ago - 4 nov/2002 70 Herbivora s imulada
* El tiempo de crecimiento s e es tablecides de la aparicin de la plntula.

87
La cuantificacin s e lleva cabo utilizando el detector de ionizacin en llama,
e n e l cual s e corrie ron las rplicas de los e xtractos . La ide ntificacin de los
alcaloides s e re alizcon bas e e n s us ndice s de Kovts y los e s pe ctros de
masas.

La cantidad de mue s tra para e l anlis is de las race s de las plantas e n cada
condicin de e s trs fue baja. Por e s to, los datos e n e s te punto no pre s e ntan
rplicas.

Tabla 16. Variacin del conte nido de PAs e n Crotalarias, bajo diversas
condiciones de estrs.
Mues tra/
Tipo de e s trs
Alcaloide,
I
k

X mg PA /kg
muestra
Des viacin
e s tndar,
CV%
C.nitidula
Herbivora (follaje)
2195 1,72 0,07 4,11
1890 27 2,32 8,75
2195 8 1,47 18,10
2200 6 1,23 19,30
2299 3,3 0,76 22,96
2395 8,3 0,84 10,19
2397 11,7 0,26 2,20
C. retusa
Herbivora
(follaje)
2399 57 2,88 5,00
1890 24 2,94 12,31
2195 9 1,55 17,52
2200 2,3 0,13 5,68
2299 3,1 0,88 28,41
2395 2,4 0,48 19,80
2397 4 1,05 27,64
C. retusa
Hdrico
(follaje)
2399 20,00 0,07 0,36


88
Continuacin Tabla 16.
Mues tra/
Tipo de e s trs
Alcal oide,
I
k

X mg PA /kg
muestra
Des viacin
e s tndar,
CV%
1890 25 - -
2197 32 - -
C. retusa
Herbivora
(races)
2499 1 - -
1890 21 - -
2197 18 - -
2200 6 - -
2395 32 - -
C. retusa
Hdrico
(races)

2499 2 - -

La pres encia del indol es caracters tica de los extractos de Crotalaria retusa,
las dos condiciones de es trs para la produccin de PAs con mayor
incide ncia fue ron he rbivora y e s trs hdrico [Figura 33] a dife re ncia de las
dems condiciones de es trs aplicadas .

Los anlis is por GC/MS de follaje y race s permitieron regis trar la pres encia
de alcaloides pirrolizidnicos adicionales a los ya de s critos en la S e ccin
3.3.1. Los patrones de fragmentacin fueron s imilares y caracters ticos para
dister macrocclicos , pres entando ligeras diferencias con los alcaloides
presentes en semillas de Crotalaria nitidula (semillas utilizadas e n la
implementacin del mtodo de extraccin) con s imilar valor de I
k
. Con s to s e
obs ervla gran cantidad de alcaloides pirrolizidnicos producidos por las dos
especies de Crotalaria, cuya identificacin inequvoca fue difcil de
es tablecer.




89
Figura 33. Cromatogramas tpicos de extractos de follaje de Crotalaria retusa,
obtenidos por extraccin as is tida por radiac in de microondas . MS D. A.
Es trs por herbivora. B. Es trs hdrico.













Figura 34. Cromatogramas tpicos de extractos de follaje de Crotalaria
nitidula, obtenidos por extraccin as is tida por radiacin de microondas . MSD.
A. Es trs por herbivora; B. Es trs hdrico.











A
B
1 0 15 2 0 25 3 0 35 4 0 45 5 0 55
10 15 2 0 25 30 35 40 4 5 5 0 55
i
s
t
d
i
s
t
d
I k
2 1 9 5
mi n
A
B
1 0 15 2 0 25 3 0 35 4 0 45 5 0 55
10 15 2 0 25 30 35 40 4 5 5 0 55
i
s
t
d
i
s
t
d
I k
2 1 9 5
mi n 1 0 15 2 0 25 3 0 35 4 0 45 5 0 55
10 15 2 0 25 30 35 40 4 5 5 0 55
i
s
t
d
i
s
t
d
I k
2 1 9 5
mi n

a
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
i
s
t
d
b
c d
f
B
i
n
d
o
l
g
A
i
s
t
d
a
b
c
d
e
f
g
i
n
d
o
l
Ik
a: 1890
b: 2195
c: 2200
d: 2299
e: 2395
f: 2397
g: 2399
a
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
i
s
t
d
b
c d
f
B
i
n
d
o
l
g
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
i
s
t
d
b
c d
f
B
i
n
d
o
l
g
A
i
s
t
d
a
b
c
d
e
f
g
i
n
d
o
l
Ik
a: 1890
b: 2195
c: 2200
d: 2299
e: 2395
f: 2397
g: 2399


90

Por GC/MS s e determinla pres encia de un s olo alcaloide pirrolizidnico (con
I
k
2195) p ara l a Crotalaria nitidula (Figura 34) a condicin de e s trs por
herbivora, a diferencia de la Crotalaria retusa, para la cual s e e ncontraron 8
alcaloides pirrolizidnicos totales en follaje y races (Figura 33). Los
e s pe ctros de mas as de los alcaloide s con I
k
1890, 2195, 2200, 2299, 2395,
2397, 2399 y 2499, s e pres entan en el Anexo I.


La dis tribucin de alcaloide s e n follaje y race s de Crotalaria retusa, fue
variable en la planta (Figura 35). Para la condicin de es trs por herbivora se
hallaron 7 alcaloide s e n follaje y 3 e n race s , pres entndos e mayores niveles
de los alcaloides en el follaje, concordante con la teora de "defens a qumica"
(Seccin 1.2.4) al ser ms tile s es tos metabolitos para la planta e n l a
proteccin del material vegetal, como agentes anti-alimentarios.

De igual forma, s e e ncontraron 8 alcaloide s totale s e n la condicin de e s trs
hdrico para la Crotalaria retusa, 7 alcaloide s e n follaje y 5 e n race s (Figura
35). Para es ta es pecie de Crotalaria se detect un mayor nmero de
alcaloide s e n las race s durante e l e s trs hdrico re s pe cto a la he rbivora.
Segn Ramos y colaboradores [17] , l os alcaloides son necesarios como
reserva de nitrgeno, en el caso de la activacin del proceso para la
formacin de nuevas hojas por prdida o renovacin de follaje.


91
Figura 35. Variacin e n la compos icin de PAs e n Crotalaria retusa s e gn
condiciones de estrs.

Blanco
Estrs hdrico (follaje)
Estrs hdrico (races)
Estrs por Herbicida
Herbivora simulada (follaje)
Herbivora (races)
Herbivora (follaje)
2
4
9
9 2
3
9
9 2397 2395 2299 2200 2195 1
8
9
0
0
10
20
30
40
Concentracin
relativa,
mg PA/ kg
ndices de Kovts


En res umen, las diferencias en el nmero y la concentracin de los alcaloides
e s tuvie ron re lacionadas con las e s pe cie s de orugas utilizadas para e l e s trs
por he rbivora y la e s pe cie de la planta (C. retusa y C. nitidula); as mis mo,
aunque la condicin de e s trs hdrico tie ne me nor incide ncia, re s pe cto a la
herbivora en la C. retusa, tambin conduce a la produccin de PAs .

En la Figura 35 s e obs e rva, que las condicione s de estrs por he rbivora
s imulada, as como la accin del herbicida Atrazina, no tienen incidencia s obre
la produccin de metabolitos tipo PAs por la planta. De igual forma, para los
blancos de plantas no s e de te ctaron alcaloide s , con lo cual la condicin de

92
es trs nutricional (elementos mayores y menores en el s uelo) no tiene efecto
en la produccin de es tos metabolitos .

Sin embargo, a pe s ar de no hallars e PAs e n los e xtractos de l blanco, de
herbivora s imulada y e s trs por he rbicida, s i s e de te rminpor GC/MS la
pres encia de un te rpe no de nominado loliolida (Figura 36). Es te compue s to,
s egn literatura [ 87] es un metabolito s ecundario de tipo carotenoide, ais lado
en plantas acuticas y algas marinas , el cual pos ee actividad inhibitoria en la
germinacin y actividad antirepelente.

Figura 36. Es tructura qumica de la l oliolida.









O
O
O H
CH
3
C H
3


93

3.5 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE ALCALOIDES
PIRROLIZIDNICOS EN CROTALARIAS

Los alcaloides fueron ais lados en s emillas de dos es pecies , Crotalaria retusa
y Crotalaria nitens, res pectivamente (Clas ificadas por el Ins tituto de Ciencias
Naturales de Colombia), es ta ltima es pecie fue adquirida en los alrededores
del plano me tropolitano de Bucaramanga, la cual e s una e s pe cie de amplia
difusin en la zona.

3.5.1 Alcaloide en s emillas de Crotalaria retusa

El alcaloide de Crotalaria retusa fue extrado mediante procedimiento Soxhlet,
trabajo previo a la implementacin del mtodo de e xtraccin, al s e r s ta una
tcnica de extraccin de amplia aceptacin.

La s eparacin y elucin por cromatografa en columna del extracto obtenido,
s e lleva cabo mediante el us o de gel de s lice de 60 mallas y el s is tema de
s olventes : n-hexano, diclorometano, me zcla de diclorometano-acetato de
etilo y acetato de etilo en es te orden. La purificacin del alcaloide s e lleva
cabo por recris talizacin, utilizando acetato de etilo en caliente. Su
caracterizacin se realiz mediante IR, GC-MS, RMN
13
C, RMN
1
H y
difraccin de rayos X.

La identificacin por es pectrometra de mas as mediante comparacin con los
e s pe ctros de la bas e de datos Wile y 138, e s table cie l alcaloide de nominado
"monocrotalina" con un grado de coincide ncia de l 90%. El e s pe ctro de mas as
pos e e un patrn de fragme ntacin s imilar al de l compue s to con I
k
2399 (Ve r

94
ane xos ) obte nido e n e l anlis is de follaje de plantas cultivadas e n condicin
de es trs por herbivora, para la Crotalaria retusa.
Figura 37. Es pectro de mas as de la monocrotalina.












Figura 38. Es tructura qumica de la monocrotalina.








El e s pe ctro de mas as de l alcaloide e n s e millas de C. retusa, pre s e nta picos
caracters ticos en m/z 80, 93, 120, 136, tpicos para alcaloide s dis te r. La
fragmentacin primaria de la molcula ocurre en el s ter allico y en el s ter
C
7
, acompaada de la eliminacin del cido necnico (Anc) y formacin de los

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
120
136
236
93
43
80
67
106
157 254 194 281 325 171 207 220
M
+.
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
120
136
236
93
43
80
67
106
157 254 194 281 325 171 207 220
M
+.
N
O
O
O
O
H
H
C H
3
H
O H
OH
CH
3
CH
3
1
2
3 4 5
6
7 8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19


95
iones en m/z 136 y 120. Las pos ibles rutas de fragmentacin de la
monocrotalina s e indican en la Figura 39.

Figura 39. Pos ibles rutas de fragmentacin de la monocrotalina.




















El e s pe ctro infrarrojo del alcaloide pirrolizidnico [Figura 40] , confirma la
pres encia de grupos carbonilo de s te re s a 1735 cm
-1
y de grupos OH a
3500cm
-1
, bandas de tens in s imtrica y as imtica de CH en grupos metilo a
2970 cm
-1
.


N
CH
2
O
O
H
CH
3
C H
3
H
O H
O
CH
3
- CO
2
+
.
CH
2
N
H
H
+
m/z 120
+
.
N
O
O
O
O
H
CH
3 C H
3
H
O H
OH
CH
3
+
.
O
H
O
C=O
O
N
H
H
CH
3
OH
CH
3
C H
3
H
O H
+
O
N
H
H
N
C H
2
CH
2
+
N
O
O=C
O
O
H
O
CH
3
H
CH
3
C H
3
H
O H
O
CH
3
C H
3
H
O H OH
CH
3
O
N
O
O
H
H
H
- C
9
H
14
O
4
- C
8
H
13
O
5
- C
8
H
13
O
6
M+*,
m/z 281

+
m/z 136
+
m/z 95
m/z 325

96
Figura 40. Es pectro infrarrojo del alcaloide (monocrotalina) ais lado e n
s emillas de Crotalaria retusa.











Un es tudio es tructural ms detallado de es te alcaloide, se realiz por
e s pe ctros copa de RMN de alta re s olucin. Las as ignacione s de las s e ale s
qumicas de l os carbonos y protone s s e re alizaron te nie ndo e n cue nta los
experimentos DEPT-135, DEPT-90, DEPT-45, COSY y MC.

El es pectro de RMN
13
C (Ane xo 2.1) del alcaloide pirrolizidnico confirma la
pres encia de 16 carbonos e n la molcula, regis tr ndos e dos seale s a 175
ppm corres pondientes a dos tipos de grupos carbonilo.

El es pectro DEPT 45 (Ane xo 2.2 ) es tablece 11 s eales para grupos CH
3
, CH
2

y CH, de las cuales 7 s eales corres ponden a grupos CH3 y CH2 a 62, 60, 54,
34, 23, 18 y 14 ppm, en comparacin con el es pectro DEPT 90 (Ane xo 2.2) en
e l que s e indica la pre s e ncia de 4 grupos CH a 135, 78, 76 y 44 ppm. Las
s eales qumicas de los grupos CH en el PA, son cons is tentes con las
e xhibidas e n los carbonos C
2
, C
7
, C
8
y C
14
de grupos CH e n la molcula de la
monocrotalina (Figura 38).
20
500
30
40
50
60
70
80
90
100
%
T
r
a
n
s
m
i
t
t
a
n
c
e
1000 1500 2000 4000
Wavenumber s ( c m-1)
1
0
6
5
6
0
6
6
9
5
8
2
2
8
6
2
9
6
3
1
0
2
6
1
1
7
3
1
2
4
5
1
3
5
8
1
4
2
8
1
4
6
7
2
7
3
5
2
8
5
3
2
9
7
4
3
0
0
8
3
0
6
9
3
4
9
9
3000 3500 4000
1
7
3
5
20
500
30
40
50
60
70
80
90
100
%
T
r
a
n
s
m
i
t
t
a
n
c
e
1000 1500 2000 4000
Wavenumber s ( c m-1)
1
0
6
5
6
0
6
6
9
5
8
2
2
8
6
2
9
6
3
1
0
2
6
1
1
7
3
1
2
4
5
1
3
5
8
1
4
2
8
1
4
6
7
2
7
3
5
2
8
5
3
2
9
7
4
3
0
0
8
3
0
6
9
3
4
9
9
3000 3500 4000
1
7
3
5


97
La dife re ncia e ntre e l e s pe ctro normal y e l DEPT 45 e s table ci5 carbonos
cuaternarios a 176.7, 175.6, 134.7, 77.7 y 80 ppm; de igual forma, s e
relacionaron en la molcula de monocrotalina c on las s eales para los
carbonos cuate rnarios C
1
, C
11
, C
12
, C
13
y C
15
, s ie ndo los carbonos C
11
y C
15

pertenecientes a dos grupos carbonilos .

El es pectro DEPT 135 (Ane xo 2.1) permitidis tinguir entre los grupos CH
3
y
CH2, me diante e l cual s e confirmaron 3 s e ale s de grupos CH3 a 14, 18 y 23
ppm y 4 s eales de grupos CH
2
a 34, 54, 60 y 62 ppm.

El e s pe ctro de corre lacin carbono-hidrgeno (Ane xo 2.3), establecilas
s eales de los protones de grupos metilo ( en C
19
, C
18
y C
17
) en el es pectro de
RMN
1
H a 0.9, 1.1, 1.2 ppm; la s eal en 0.9 ppm aparece en forma de doblete,
lo que indica la interaccin a campo alto con un hidrgeno perteneciente a un
carbono te rciario, como s e apre cia e n e l carbono C
14
e n la e s tructura de la
monocrotalina; este hecho se c onfirmcon los datos de l e s pe ctro COSY
(Anexo 2.4), e n e l cual s e apre cia la inte raccin de los hidrge nos de l grupo
metilo a 0.9 ppm con el hidrgeno del CH en C
14
a 2.9 ppm.

El e s pe ctro de RMN
1
H (Ane xo 2.5) tambin re ve la que los protones de l
grupo metileno e n C
9
adyacente al oxgeno en O
10
no s on equivalentes , ya que
pos e e n caracte rs ticas de protone s AB. Los protone s 9-Ha re s ue nan e n la
re gin de campo alto ( 3.6-3.8 ppm) e n forma de doble te , e ntre tanto l os
protones 9-Hb res uenan a campo ms alto (3.2-3.4 ppm) tambin en forma de
doble te . Los de s plazamie nto qumicos de los protone s se corroboraron con
ayuda del es pectro COSY, en donde s e obs e rva la corre lacin e ntre los
protones 9Ha/9Hb.


98
Los protone s de l grupo me tile no e n C
5
(2.4-2.6 ppm) res uenan a campo ms
bajo que C
6
(1.75 -1.95 ppm) de bido al e fe cto e le ctroatraye nte de l nitrge no.
Sin e mbargo, los protones en C
9
re s ue nan e n la re gin de campo an ms
bajo, que e n C
5
y C
6
, por e l mayor e fe cto e le ctroatraye nte de l oxge no O
9
,
que caus a la des proteccin de l e ntorno e le ctrnico de los protone s de l CH
2
.
Los de s plazamie ntos qumicos (, ppm) de los hidrge nos e n e l e s pe ctro de
RMN
1
H se presentan en la Tabla 18.

Los valore s de las s eales qumicas por RMN
13
C para e l alcaloide ais lado
res pecto a los es tablecidos en literatura [ 75] s e relacionan en la Tabla 17.

Tabla 17. Seales qumicas por RMN
13
C para e l alcaloide ais lado en s emillas
de Crotalaria retusa.

C
1
C
2
C
3
C
5
C
6
C
7
C
8
C
9
C
11
C
12
C
13
C
14
C
15
C
17
C
18
C
19

T.* 132. 3 134,2 60,4 53,7 33. 5 75 76,8 61,9 175 78,6 77,7 44. 2 174,3 22. 4 18,2 14,3
Exp**. 134.7 135. 9 60,3 54,8 34. 5 76 78,6 62,3 176.7 78.6 77.8 44. 5 175,6 23,0 18,6 14,6
M-
Nox
131.7 134.1 78.8 69.2 33.8 74.8 96.6 62.0 178.4 78.8 80.5 44.9 177.1 23.7 19.7 15.6
M-Nox: Monocrotalina N-xido, T: Seal de la monocrotalina s egn literatura en * CDCl 3,
Exp**: experimental en CD3OD.

Comparando las seales qumicas obtenidas en el espectro RMN
13
C de l
alcaloide aislado, con las reportadas en lite ratura [ 75] , se es tablecieron
diferencias pequeas , teniendo en cuenta que s us es pectros s e obtuvieron en
s olve ntes deuterados diferentes (CDCl 3 y CD3OD). Las s eales qumicas
reportadas para un alcaloide pirrolizidnico de es tructura s imilar, la
monocrotalina N-xido, s e obs ervaron marcadas diferencias en los carbonos
C
3
, C
5
y C
8
.


99
Tabla 18. De s plazamie ntos qumicos (, ppm) de los hidrge nos e n e l e s pe ctro de RMN
1
H del alcaloide ais lado en
s emillas de Crotalaria retusa.
2
N
4
3
1
8
7
6
5
9
O
10
11
O
16
15
14
13
12
O
O
H
H
C H
3
19
H
O H
OH
CH
3
17
CH
3
18
Hb
Ha
Ha
Hb
H
H
Hb
Ha
H


2 3a 3b 5a 5b 6 7
5.88 (s) 3.30
(dd, J = 16.21
Hz)
3.66
(dd, J = 16.18,
5.07 Hz)
2.47
(C, J = 3.02 Hz)
2.97
(m, J =3.15,
6.35 Hz )
1.82
(m, J =4.51,
1.95 Hz)
4.91
(m, J =4.91,
5.30, 1.77 Hz)
8 9a 9b 14 17 18 19
4.20
(m, J =2.14 Hz)

4.36
(d, J =11.72 Hz)
4.58
(d , J =9.59 Hz)
2.87
(C, J =7.18 Hz)
1.21
(s)
1.14
(s)
0.98
(d, J =7.19 Hz)


100

Por ltimo la confirmacin de la e structura de l alcaloide s e realizpor
difraccin de rayos X. El compue s to pre s e nte l grupo e s pacial (P212121) y
las cons tantes de celda a:10.16, b:11.44 y c:13.63. La bs queda en la bas e de
Cambridge Crystalographic Data, es tablecidos pos ibles es tructur as para e l
alcaloide denominado monocrotalina, las cuales pres entan is omera
conformacional as :

Figura 41. Pos ible s es tructuras por DRX para e l alcaloide de nominado
monocrotalina.














La caracte rizacin completa de este alcaloide , e s table cisu identificacin
como monocrotalina, e l cual e s un compue s to txico con un LD
50
75 mg/kg
[ 8].

N
O
O
O
O
C H
3
O H
OH
C H
3
CH
3
N
O
O
O
O
C H
3
OH
OH
CH
3
C H
3
C
1 8
H
23
NO
6
C
18
H
2 3
NO
6
Wang Shoudao, Sci.Sin. 24,497,1981
Reference
Formula
Space Group: P212121 Cell: a 13.578 b 11.433 c 10.153
R-Factor (%) 0.0 Temperature (K): 295 Density(g/cm3): 1.371
Reference Wang Shoudao, Kexue Tongbao
(in Chinese), 23,670,1978
Formula
Space Group: P212121 Cell: a 13.578 b 11.433 c 10.153
R-Factor (%) 7.6 Temperature (K): 295 Density(g/cm3): 1.271

101
3.5.2 Alcaloides en s emillas de Crotalaria nitens

Los alcaloides de Crotalaria nitens fueron ais aldos de s emillas por extraccin
as is tida por la radiacin de microondas a un tiempo de 5 minutos en metanol,
s e gn e l proce dimie nto e s table cido e n la Se ccin 2.1.2.3. En e l e xtracto s e
de te ctla pre s e ncia de dos alcaloide s (A y B) tipo dis te r macrocclico de
bas e necina ins aturada, s u s eparacin s e lleva cabo mediante cromatografa
en columna con fas e es tacionaria de almina neutra, con s olventes : n-he xano,
diclorometano, acetato de etilo y mezcla de acetato de e tilo-metanol
res pectivamente

El alcaloide A fue eluido en columna cromatogrfica de almina con s olventes ,
ace tato de e tilo:me tanol e n re lacin 9/1. El alcaloide B fue purificado e n
placa pre parativa de ge l de s lice . Los alcaloide s pre s e ntaron aparie ncia de
s lidos amorfos , color marrn. Las cantidades obtenidas fueron de 10 y 8 mg,
re s pe ctivame nte ; s u caracte rizacin s e lle va cabo me diante IR y GC-MS,
puesto que las cantidades tan bajas no permitan su caracte rizacin
estructural por resonancia magntica nuclear.

Los es pectros IR de es tos dos alcaloides (Figuras 42 y 43) pres entan bandas
de abs orcin similares. La pre s e ncia de grupos funcionales s e es tablecia
travs de la obs e rvacin de las bandas de te ns i n s imtrica y as imtrica de
CH de grupos me tilo (2970 cm-
1
), las bandas caracte rs ticas que indican la
pres encia de grupos carbonilo de s te re s a 1735 cm
-1
y de grupos OH a
3500 cm
-1
con banda confirmatoria entre 1305-1250 cm
-1
.


102
Figura 42. Es pectro infrarrojo de alcaloide "A" , aislado de Crotalaria nitens.











Figura 43. Es pectro infrarrojo de alcaloide "B", aislado de Crotalaria nitens.












Los es pectros de mas as , pres entaron picos caracters ticos de dis te r
macrocclicos en m/z 93, 119, 120, 136; los ndice s de re te ncin para e s tos
compue s tos , fue ron I
k
2200 y 2397; s u comparacin con los re portados por
20
500
30
40
50
60
70
80
90
100
%
T
r
a
n
s
m
i
t
t
a
n
c
e
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumbers (cm- 1)
7
2
3
7
5
5
9
4
7
1
0
1
5
1
1
1
2
1
1
8
4
1
2
5
1
1
3
3
6
1
3
8
3
1
4
5
6
1
6
0
5
1
7
3
7
2
9
8
4
3
4
2
5
20
500
30
40
50
60
70
80
90
100
%
T
r
a
n
s
m
i
t
t
a
n
c
e
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumbers (cm- 1)
7
2
3
7
5
5
9
4
7
1
0
1
5
1
1
1
2
1
1
8
4
1
2
5
1
1
3
3
6
1
3
8
3
1
4
5
6
1
6
0
5
1
7
3
7
2
9
8
4
3
4
2
5

%
T
r
a
n
s
m
i
t
t
a
n
c
e
500
50
60
70
80
90
100
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumbers (cm-1)
6
0
3
7
6
5
9
4
7
1
0
1
4
1
0
5
5
1
1
5
5
1
2
2
9
.
1
2
7
0
1
3
3
7
1
3
8
5
1
4
5
6
1
5
5
8
.
1
6
3
5
1
7
3
8
2
5
6
5
2
9
7
8
3
4
1
9
%
T
r
a
n
s
m
i
t
t
a
n
c
e
500
50
60
70
80
90
100
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumbers (cm-1)
6
0
3
7
6
5
9
4
7
1
0
1
4
1
0
5
5
1
1
5
5
1
2
2
9
.
1
2
7
0
1
3
3
7
1
3
8
5
1
4
5
6
1
5
5
8
.
1
6
3
5
1
7
3
8
2
5
6
5
2
9
7
8
3
4
1
9


103
Witte y colaboradore s [68] , pe rmitiidentificar las es tructuras probables
presentadas e n las Figuras 22 y 2 4, correspondientes a licopsamina y la
es partidionina.

Figura 44. Es pectros de mas as de los alcaloides "A" y "B, ais lados de
Crotalaria nitens.





















3.6 ANLISIS DE ALIMENTO CONTAMINADO

m/z-->
60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Abundance
119
136
93
80
106
55
65
m/z-->
60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Abundance
119
136
93
80
106
55
65

Abundance
6 0 8 0 100 120 140 160 180 200 220 240 260
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
m/ z-->
120
136 236
93
8 0
10 6
55
Abundance
6 0 8 0 100 120 140 160 180 200 220 240 260
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
m/ z-->
120
136 236
93
8 0
10 6
55


104
Se re alizaron los anlis is de los e xtractos , obte nidos de alime nto para ave s
(s orgo) contaminados con s e millas de Crotalaria retusa (Figura 45 A) y e l
blanco (Figura 45 B), utilizando e l me jor mtodo de e xtraccin e s table cido
(Mw, 5 min, s in modificacin del pH).

















Figura 45. Cromatogramas tpicos de e xtractos e n alime nto para ave s . A.
Alime nto contaminado con s e millas de Crotalaria retusa; B. Alime nto para
aves (Blanco). FID.

El pico con e l tie mpo de re te ncin t
R
= 26.3 min corres ponde al alcaloide con
I
k
2397, cuyo es pectro de mas as es idntico al de un PA dis ter macrocclico
denominado "monocrotalina". La conce ntracin de l alcaloide e n mue s tras de
alimento preparado alcanz20 mg/kg.

min 5 10 15 20 25 30 35
counts
100000
200000
300000
400000
2
5
.
6
0
1
1
3
.
7
0
5
min 5 10 15 20 25 30 35
counts
100000
200000
300000
400000
2
5
.
6
0
1
1
3
.
7
0
5

min 5 10 15 20 25 30 35
counts
100000
200000
300000
400000
2
6
.
2
4
9
1
3
.
7
0
5
min 5 10 15 20 25 30 35
counts
100000
200000
300000
400000
2
6
.
2
4
9
min 5 10 15 20 25 30 35
counts
100000
200000
300000
400000
2
6
.
2
4
9
1
3
.
7
0
5

A
B

105
En es tudios previos s e han es tablecido cantidades mayores de monocrotalina
en divers as es pecies de Crotalaria. Sin embargo, las cantidades halladas para
las mues tras objeto del pres ente es tudio pueden causar la muerte e n
animale s altame nte s us ce ptible s a dichos compue s tos como lo s on las ave s ,
cuando s tas s e alime ntan a razn de 2 a 10 mg de s e millas de Crotalaria/g
de pes o corporal [42] .




















106

CONCLUSIONES


Se imple me nte l mtodo por GC/FID/MS, para e l anlisis de alcaloides
pirrolizidnicos , utilizando la extraccin con s olvente as is tida por radiacin de
microondas durante 5 minutos , s in modificacin del pH de la matriz.


En los extractos de s e millas de Crotalaria nitidula, s e de te ctaron por
GC/MS, ocho alcaloide s pirrolizidnicos que s e ide ntificaron con bas e e n s us
ndice s de re te ncin de Kovts y patrone s de fragme ntacin caracte rs ticos ,
corres pondientes tanto a bas e s ne cina simples (tipo retronecina), como a
es tructuras ms complejas tipo dis ter macrocclicos .


Las extracciones as is tidas por radiacin de microondas y por ultras onido,
pe rmitie ron e l ais lamie nto de un mayor nme ro de alcaloide s e n s e millas , e n
comparacin con l a tcnica de extraccin por Soxhlet, la cual pre s e nt
eficiencia baja en el aislamiento de PAs, adems de consumo alto de
s olventes y tiempos largos para llevar a cabo el proces o de extraccin.


La produccin de metabolitos s ecundarios tipo PAs en plantas del gnero
Crotalaria, es tdirectamente relacionada con el es trs medioambiental, cuyo
e fe cto involucra caracte rs ticas e ndge nas para cada e s pe cie , de pe ndie ndo
del tipo de es trs aplicado.


107
Se presentvariabilidad en l a dis tribucin de alcaloide s e n plantas de
Crotalaria retusa, donde l os nive le s de PAs ms altos se obtuvie ron de
plantas cultivadas e n las condicione s de e s trs hdrico y de he rbivora con
orugas de Utetheisa Ornatrix (familia de las Arctiidae)


La es pecie de Crotalaria nitidula, pos ee baja res pues ta para la produccin
de alcaloide s pirrolizidnicos e n la condicin de e s trs por he rbivora, por lo
que s e es tablece, que s ta Leguminos a puede s er ampliamente utilizada como
abono verde, mediante tcnicas de rotacin, s in el ries go de la contaminacin
de los cultivos con alcaloides txicos , provenientes de s emillas u otras partes
de la planta.


En los extractos de s emillas de Crotalaria retusa, s e identificel alcaloide
pirrolizidnico denominado monocrotalina, us ando divers as tcnic as de anlis is
tales como IR, GC/MS, RMN
13
C, RMN
1
H y difraccin de rayos X.


En mue s tras de alime nto para ave s , s e de te ctla pre s e ncia de l alcaloide
pirrolizidnico monocrotalina (compues to txico), mediante el us o de equipos
analticos modernos que poseen sensibilidad alta.



108


RECOMENDACIONES


Realizar es tudios , aplicando la me todologa de s arrollada e n e l pre s e nte ,
trabajo, en mues tras de alimento para cons umo humano, con alta probabilidad
de contaminacin por alcaloides pirrolizidnicos (cereales , carne, lcteos , etc).


De bido a la te rmoine s tabilidad de los alcaloide s pirrolizidnicos N-xidos ,
se recomienda la utilizacin de otras tcnicas analticas como la
cromatografa lquida de alta e ficie ncia y la e le ctrofore s is capilar, las cuale s
s on alternativas aplicables en el anlis is de metabolitos de plantas .


Hace r e l ais lamie nto y caracte rizacin de los alcaloide s pirrolizidnicos
pres entes en las es pecies de Crotalaria de frecuente cultivo en nues tro pas ,
de acuerdo con la cantidad y tipo de alcaloide, teniendo en cuenta la
condicin de es trs , a cual s e s ometen durante s u cultivo.


Pe rmitir la adaptacin de las orugas de Utetheisa ornatrix e n plantas de
Crotalaria nitidula, con el fin de comparar el efecto del es trs por herbivora,
con la misma es pecie de Lepidpteros , e n la produccin de alcaloides
pirrolizidnicos.

109


BIBLIOGRAFIA


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England, 1998, 334p.

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130











ANEXO 1

Alcaloides pirrolizidnicos en follaje de Crotalaria retusa s egn s us I
k
y
es pectros de mas as .



131

Anexo 1.1 Alcaloides pirrolizidnicos pres entes en follaje de Crotalaria retusa
s e gn s us I
k
.

Compues to s egn
bas e de datos
I
k

experimental
Compuesto "identificado" s egn
lite ratura/ Ik [ 68]
3` Acetillicops amina 1890 9-Tiogloilretronecina /1888
7-Senecioilplatinecina/1886
7-Tiogloylplatinecina/1900
- 2195 Indicina /2185
Intermedina/2188
Licops amina/2197
Senecionina 2200 Rinderina/2205
Retus ina 2299 7-9Disenecioyl
platinecina/2285
7-9Ditiogloilplatinecina/2300

Jacoline 2395
Jacozine 2397
Senecionina 2399
Es partioidina/2400
Interregimina/2402
9-0-(2-
metilpropionil)
retronecina
2499 Jacobina/2495




132

Ane xo 1.2 Es pe ctros de mas as de los compue s tos con I
k
1890 y 2195,
ais lados del follaje de Crotalaria retusa.


























60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
m/z-->
Abundance
Scan 8135 (41.995 min): MUESTRA9.D
194
93
120
136
80
57
106
251
236
212 282
325 154


Ik 2195
40 50 60 70 80 90 100110120130 140150 160170180190200210 220230
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
Abundance
93
138
80
67 53
183 120 108
155 227 209
40 50 60 70 80 90 100110120130 140150 160170180190200210 220230 40 50 60 70 80 90 100110120130 140150 160170180190200210 220230
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
Abundance
93
138
80
67 53
183 120 108
155 227 209

I
k
1890

133

Ane xo 1.3 Es pe ctros de mas as de los compue s tos con I
k
2200 y 2395,
ais lados del follaje de Crotalaria retusa.


























40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
m/z-->
Abundance
Scan 8539 (43.679 min): MUESTRA9.D
119
136
93
80
106
53
67
222
194 309
264 154 238 207 281


I
k
2200
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
m/z-->
Abundance
119
136
93
264
67
220 185
351 151 239 281 52 167
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
m/z-->
Abundance
119
136
93
264
67
220 185
351 151 239 281 52 167

I
k
2395

134
Ane xo 1.4 Es pe ctros de mas as de los compue s tos con I
k
2397 y 2399,
ais lados del follaje de Crotalaria retusa.
























60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
m/z-->
Abundance
Scan 9242 (46.610 min): MUESTR11.D
120
136 93
236
80
207 55
67
108
281 157

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
Abundance
120
136 236
93
80
108
53
67 157
254 207 194 281 325
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
Abundance
120
136 236
93
80
108
53
67 157
254 207 194 281 325

I
k
2399

I
k
2397

135

Ane xo 1.5 Es pe ctro de mas as de l compue s to con I
k
2499, ais lado de l follaje
de Crotalaria retusa.


















60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
m/z-->
Abundance
Scan 10089 (50.141 min): MUESTR11.D
93
138
207
80
67 55
281
117
191 107


I
k
2499

136











ANEXO 2


Es pectros RMN-
1
H y
13
C del alcaloide ais lado en Crotalaria retusa



137

Anexo 2.1. Es pectro de RMN-
13
C y DEPT 135 del alcaloide ais lado de semillas de Crotalaria retusa.




138

Anexo 2.2. Es pectro DEPT 90 y DEPT 45 del alcaloide ais lado de s emillas de Crotalaria retusa.


















139

Anexo 2.3. Es pectro HMQC del alcaloide ais lado de s emillas de Crotalaria retusa.



















140
Anexo 2.4. Es pectro COSY del alcaloide ais lado de s emillas de Crotalaria retusa.





















141

Anexo 2.5 Es pectro de RMN-
1
H del alcaloide ais lado de s emillas de Crotalaria retusa.