APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, June 2003, p.

3540–3548
Vol. 69, No. 6
0099-2240/03/$08.00_0 DOI: 10.1128/AEM.69.6.3540–3548.2003
Copyright © 2003, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

Estructura de la Comunidad Bacteriana y Localización en el Queso Stilton

Danilo Ercolini,† Philip J. Hill, y Christine E. R. Dodd*

* Corresponding author. Mailing address: Division of Food Sciences,

School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington
Campus, Loughborough, Leicestershire LE12 5RD, United
Kingdom. Phone: 441159516163. Fax: 441159516162. E-mail: christine
.dodd@nottingham.ac.uk.
† Present address: Dipartimento di Scienza degli Alimenti, Sezione
di Microbiologia, Universita` degli Studi di Napoli “Federico II,” 80055
Portici, Italy.

División de las Ciencias de Alimento, Escuela de Biociencias, Universidad de

Nottingham, Loughborough, Leicestershire LE12 5RD, Reino Unido
Recibido el 19 de septiembre 2002/Aceptado el 27 de febrero de 2003

La diversidad microbiana que ocurría en el queso de Stilton fue evaluada por

análisis del DNA ribosomal 16S con PCR- desnaturalizando en electroforesis de
gradiente de gel. Los moldes de DNA para los experimentos de PCR fueron
extraídas directamente del queso tan bien como las células a granel cosechadas a
partir de una variedad de medios de viable-cuenta. Las regiones variables V3 y
V4-V5 de los genes 16S fueron analizados. Identificaron a los parientes más
cercanos de Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesenteroides, Staphylococcus equorum, y
Staphylococcus sp .que fueron identificados por secuenciación de los fragmentos
de DGGE. Sondas de oligonucleótidos fluorescentemente marcadas fueron
desarrolladas para detectar Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum,y
Leuconostoc mesenteroides en experimentos de hibridización in situ (FISH), en
fluorescencia , y su especificidad para la especie que ocurría en la comunidad del
queso Stilton fue revisada en experimentos en FISH llevados a cabo con cultivos
de referencia. El uso combinado de éstas sondas y la sonda bacteriana Eub338 en
experimentos en FISH sobre secciones del queso de Stilton permitió el gravamen
de la distribución espacial de las diversas especies microbianas en la matriz de la
lechería. Las colonias microbianas de bacterias demostraron una localización
diferenciada en las diversas partes del queso examinado: la base, las venas, y la
corteza. El Lactococci fue encontrado en la parte interna de las venas como
colonias mezcladas y como colonias aisladas dentro de la base. El Lactobacillus
plantarum. fue detectado solamente por debajo de la superficie, mientras que el
Leuconostoc microcolonias fueron distribuidas homogéneamente en todas las
partes observadas. El acercamiento molecular combinado se demuestra ser útil
para describir simultáneamente la estructura y la localización de la flora bacteriana
en queso. La distribución diferencial de las especies encontradas sugiere las
razones ecológicas específicas del establecimiento de sitios del crecimiento

1
microbiano real en el queso, con implicaciones de la significación en entender la
ecología de los sistemas del alimento y con la puntería de alcanzar la optimización
de las tecnologías de la fermentación así como la preservación de productos
tradicionales.

Stilton es un queso azul internamente moldeado-madurado semiblando obtenido

de la leche de vaca pasteurizada; la acidificación es realizada por la adición de
Lactococcus lactis como un cultivo iniciador , mientras que la maduración es
promovida por el desarrollo de los moldes ( Penicillium roqueforti ) así como las
levaduras y otras bacterias, de modo que el producto madurado tenga una
complejidad así como la composición microbiana típica (24). Los moldes se
agregan generalmente como esporas al principio de la fabricación. Después de
cerca de 6 semanas de maduración, los moldes sin prensar de la cuajada se
perforan con las agujas de acero inoxidable para permitir la entrada del aire. El
desarrollo del molde a lo largo de las venas se alcanza en un rato de maduración
de tres semanas, dando el aspecto azul típico al queso. El queso de Stilton se
concede el estatus de un producto de origen de designación protegida, y las
lecherías que lo producen están conformes a la intervención regular por una
inspección independiente por una agencia de inspección acreditadal Standard
Europeo EN 45011. Solamente los quesos producidos en los condados de
Nottinghamshire, Leicestershire, y Derbyshire en el Reino Unido se pueden
nombrar Stilton.
Las características específicas de productos típicos se presentan principalmente
de las materias primas específicas empleadas, el área de la producción, las
condiciones ambientales, y las herramientas y la fabricación tradicionales. El
conocimiento adicional es necesario para entender las relaciones entre
propiedades microbiológicas y bioquímicas que conducen al desarrollo de texturas
y de sabores típicos

La microflora compleja del queso de Stilton es responsable de la maduración del

queso así como el desarrollo típico del aroma. Sin embargo, ningunos estudios
publicados tienen divulgaron sobre la estructura de la comunidad microbiana en el
queso de Stilton, aunque éste puede representar un conocimiento importante para
las condiciones de proceso y de maduraciones el mejorar para realzar la calidad
del producto final mientras que preserva su naturaleza típica.
Algunos estudios han sido realizados en las composiciones microbianas de las
matrices del alimento usando técnicas moleculares tales como análisis de 16S
ribosomal DNA (rDNA) PCR-desnaturalizando en electroforesis del gel en
gradiente (PCR-DGGE) (7, 8, 13, 38), sobre la base que una imagen más
confiable de la comunidad podría ser obtenida así. Sin embargo, demostramos
previamente que mientras que estas técnicas tienen valores, hay una necesidad de
utilizar un sistema combinado, incluyendo la cultivación, para superar el diagonal
del acercamiento de "cultivo-independiente-solamente" (18). La hibridación in situ
fluorescente (FISH) con las sondas del rRNA 16S es aplicada extensamente en la
ecología microbiana, proporcionando actualmente la identificación microbiana, la
detección física de los microorganismos incultivables (32, 35), y la distribución de

2
poblaciones microbianas en varios ambientes (4, 5, 31). A pesar del considerable
conocimiento de fondo, hasta hace poco tiempo el FISH no se ha utilizado en
microbiología del alimento para la localización física de bacterias in situ en
alimento, aunque la información ecológica importante sobre el desarrollo de la
microflora en matrices fermentadas del alimento podría ser obtenida. En un estudio
reciente (17), presentamos un método para los FISH que pueden ser utilizados
para las matrices frágiles como el queso. En el actual estudio un acercamiento
molecular combinado fue utilizado para evaluar la diversidad microbiana que
ocurría en el queso de Stilton vía el análisis de tres regiones variables del rDNA
16S por PCR-DGGE.
El FISH entonces fue aplicado para localizar las especies microbianas encontradas
en la matriz del queso usando las sondas de prueba rRNA- oligonucleotido-
marcada desarrolladas en este estudio. Discutimos los resultados, centrándose en
la conveniencia del acercamiento del conjunto para los estudios in situ en el
desarrollo microbiano de la especie en matrices del alimento.

TABLA 1 Sondas de Oligonucleótidos usadas en este estudio

Microorganismo(
Sonda Abreviación s) blanco en este Secuencia Marca Fuente
estandarizada estudio de
referencia
S-D- Bact- Eub338 Eubacteria 5´-CGT Fluoroceina 3
0338-a-A-18 GCC TCC
CGT AGG
AGT-3´
S-D- Bact- Eub338 Eubacteria 5´-GCT Cy3 3
0338-a-A-18 GCC TCC
CGT AGG
AGT-3´
S-S-L.lact- LactV5 Lactococcus 5´-GCT Fluoroceina Este
0821-a-A-18 lactis CCC TAC estudio
ATC TAG
CAC-3´

S-S-Lb.pl- LbpV3 Lactobacillus 5´-CCG Cy3 Este

0468-a-A-18 plantarum TCA ATA estudio
CCT GAA
CAG 3´
S-S-Lc.ms- LeucV5 Leuconostoc 5´-CCT Cy3 Este
0748-a-A-19 mesenteroides CCT AAC estudio
ACC TAG
TGT T-3´

3
MATERIALES Y MÉTODOS

Clases microbianas y condiciones de cultivo. Las clases siguientes fueron

utilizadas en este estudio: Lactobacillus plantarum NCDO 1193 (Colección
Nacional de los Organismos de la Lechería, Aberdeen, Reino Unido), Lactococcus
lactis subsp. lactis NCIMB 8586 (Colección Nacional de las Bacterias Industriales
y Marinas, Aberdeen, Reino Unido), Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides NCIMB 10817,Enterococcus faecalis NCTC 775 (Colección
Nacional de Tipos de Cultivos, del Laboratorio Central de la Salud Pública,
Londres, Reino Unido), Lactobacillus curvatus LTH 1432 ( Instituto für
Lebensmitteltechnologie, Universitat Hohenheim, Stuttgart, Alemania) y
Staphylococcus equorum DSM 20674 ( Zellkulturen, Braunschweig, Alemania
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen). Todas los cultivos fueron crecidos a
30°C. Lactococcus y Enterococcus fueron crecidos en el caldo M17 (Oxoid),
Lactobacillus y Leuconostoc fueron crecidos en el caldo MRS (Oxoid), y el
Staphylococcus estaba en el caldo de la infusión del corazón del cerebro (Oxoid).

Enumeración microbianas y colección de células en grandes cantidades.

Dieciséis muestras de queso comercialmente disponible de Stilton, de diversas
áreas de la producción, eran analizadas. Las muestras fueron procesadas
inmediatamente después de la compra. Las diluciones seriadas del queso de
Stilton en la solución de Ringers en cuarto-fuerza (Oxoid) fueron utilizadas para la
enumeración microbiana con los medios siguientes: agar nutriente (Oxoid), MRS
agar (Oxoid) para las bacterias del ácido láctico, el agar de Rogosa (Oxoid) para
los lactobacilos, el agar M17 (Oxoid) para los estreptococos, y el agar de la sal del
mannitol (MSA; Oxoid) para los estafilococos. Las porciones (0.1 ml) de diluciones
apropiadas fueron separadas plaqueadas en triplicado. Las cuentas en el MRS
agar, M17 agar, MSA, y agar de Rogosa fueron obtenidas después de la
incubación por 48 hs a 30°C. Las placas de agar nutriente fueron incubadas a
10°C por 5 días para la detección de la microflora psycrofilica. Inocularon y fueron
incubadas dos series de placas de MRS agar bajo condiciones aerobias y
anaerobias, respectivamente. Los resultados eran calculados como los significados
de tres determinaciones. Después de las cuentas microbianas, las placas fueron
utilizadas para la formación de grandes cantidades según lo descrito previamente
(19). Las suspensiones de grandes cantidades de las células (1 ml) de las placas
contables para cada medio fueron utilizadas para la extracción del DNA según lo
descrito abajo.

Extracción del DNA de las células en cantidad y del queso

La suspensión del queso en 1x salino fosfato-buffer (PBS) (Oxoid) (10 2 ,1‫ ־‬ml) o 1
ml de suspensión de la célula en cantidad fue centrifugada a 18.000 x g por 10
minutos; 500μ l de lysozyma (20 mg ml 1‫ )־‬en el buffer de TES (50 mM Tris,1 mM
EDTA, 8.7% sacarosa)-5 μl del mutanolysina (5 U μl 1‫)־‬-50 μl de rNasa (10 mg ml‫־‬
1) fueron agregados al pellet, y a la mezcla fue sacudida por vortereado por 1
minuto y después incubados a 37°C. Después de 1 h de incubación, 50μl de
proteinasa K (10 mg ml1‫ )־‬fue agregado, y las muestras fueron incubadas más a
fondo en 50°C por 50 minutos y entonces en 65°C por 10 minutos. El buffer de

4
Prewarmed NTS (NaCl de 0.2 M, 0.1 M Tris, sulfato dodecyl de sodio al 2%
[ SDS ]) (300μl ) fue agregado, y las muestras fueron incubadas a 65°C por 10
minutos. Sucesivamente, el NaCl 5 M (300 μl) fue agregado y las muestras fueron
mantenido a 4°C por 15 minutos y después centrifugadas en 29.000 x g por 15
minutos a 4°C. Los sobrenadantes fueron precipitados con 0.7 volumen del
isopropanol frío a -20°C por 30 minutos y luego centrifugados a 29.000 xg por 15
minutos a 4°C. Los pellets fueron lavados con etanol del 70%, resuspendidos de
nuevo en 500μl de agua, y purificados una vez con el fenol (pH 8.0) y dos veces
con el alcohol cloroformo-isoami'lico (24:1), cada vez con la centrifugación a
29.000x g por 15 minutos a temperatura ambiente. La fase acuosa finalmente fue
precipitada con 0.7 volumenes de isopropanol por centrifugación a 29.000x g por
15 minutos a 4°C, y el pellet lavado con etanol al 70% y fue resuspendido de nuevo
en 50μ l del buffer de TE (10 mM Tris, 1 mM (EDTA).

Amplificación por PCR. Dos sistemas de primers fueron utilizados, las regiones
variables que amplificaban del rDNA 16S. Los primers V3F y V3R amplificaron la
región variable V3 (34), mientras que los primers V4F y V5R amplificaron las
regiones V4 y V5 (41), dando productos de PCR del cerca de 200 y 400 bp ,
respectivamente. A los primers delanteros, una abrazadera GC fue agregada
según lo descrito por Muyzer et el al. (34). Las amplificaciones fueron realizadas en
una incubadora programable de calor (Techne; Progene). Cada mezcla (el
volumen final, 25μ l) contuvo 20 ng de DNAmolde, cada primer en una
concentración de 0.2 μM, cada deoxynucleosido trifosfato en una concentración de
0.25mM, 2, .5 Mm de MgCl2, 2.5 μL de 10 x buffer PCR (Invitrogen), y 2.5 U de la
Taq polimerasa (Invitrogen). Las mismas condiciones fueron utilizadas para
ambos pares deprimers . El DNA molde fue desnaturalizado por 5 minutos a 94°C.
Un momento del aterrizaje PCR fue realizado según lo descrito previamente (18).
La temperatura inicial del recocido era 66°C, y éste era 1°C disminuido cada ciclo
para 10 ciclos; finalmente, 20 ciclos fueron realizados a 56°C. La extensión para
cada ciclo fue realizada a 72°C por 3 minutos, mientras que la extensión final
estaba en 72°C por 10 minutos. Las partes alícuotas (2 μl) de productos de PCR
fueron comprobadas rutinariamente en los geles del agarose del 2%.

Análisis de DGGE. Los productos de PCR eran analizados por DGGE usando un
aparato Bio-Bio-Rad Dcode. Las muestras de 200 pb fueron aplicadas a 8%(peso
vol1‫)־‬, en los geles de polyacrylamida, mientras que las muestras de 400 pb
fueron corridas en 6.5% (peso vol 1‫ )־‬en geles de polyacrylamida en 1 x buffer de
TAE. Los experimentos paralelos de electroforesis fueron realizados a 60°C
usando los geles que contenían de 30 a 50% gradiente que desnaturalizaba de -
urea-formamide (el 100% correspondido a la urea de 7 M y al formamide del 40%
[ peso vo1‫)] ־‬. Los geles eran analizados por electroforesis de gel por 10 minutos
en 50 V seguidos por 6 hs en 170 V, manchados con el bromuro de ethidio por 3
minutos, y aclarados en agua destilada por 15 minutos. Las imágenes fueron
adquiridas por ImageMaster VDS (Amersham Pharmacia Biotech, poco Chalfont,
Reino Unido). Las bandas fueron detectadas automáticamente y analizadas con el
1D de ImageMaster del software (Amersham Pharmacia Biotech).

5
 Secuenciación de los fragmentos de DGGE. Las bandas de DGGE que se
secuenciarán fueron purificadas en agua según lo descrito por Ampe et el al. (7). El
DNA eluido (1μ l) de cada banda de DGGE era reamplificada usando el primer
apropiado y las condiciones descritas arriba. Los productos de PCR que dieron una
sola banda comigrando con la banda original después fueron purificados con un kit
de la purificación de Qiaex PCR (Qiagen) y secuenciados.
La secuenciación fue realizada por la unidad que secuenciaba de la Universidad
de Nottingham; un secuenciador de DNA 373 (Biosistemas Aplicados de Perkin-
Elmer) fue utilizado con el ciclo terminador de secuenciación del kit adaptador de
Taq Dye Deoxy (Biosistemas Aplicados de Perkin-Elmer). Los primers V3R y
V5R fueron utilizadas para secuenciación de los fragmentos V3 y V4-V5,
respectivamente.
Para determinar a los parientes conocidos más cercanos de las secuencias
parciales del rDNA 16S obtenidas, las búsquedas fueron realizadas en las
bibliotecas públicas de los datos (GenBank) con el programa de la búsqueda de la
ráfaga. (Blast search program)

Diseño de moldes y FISH. Las sondas de oligonucleotido rRNA fueron

diseñadas de las secuencias recuperadas, y las especificidades fueron revisadas
en las bibliotecas de los datos (GenBank) con el Centro Nacional para el Programa
de la Búsqueda de la ráfaga de la Información de la Biotecnología. Los nombres de
las sondas, de las etiquetas, de la región apuntada, y de la especificidad (este
estudio) se divulgan en la tabla 1. Las sondas fueron sintetizados por Sigma
Genosys (Biotechnologies Ltd. de Genosys, Cambridge, Reino Unido) y eran todas
etiquetadas en las terminaciones 5´.
La fijación del cultivo microbiano fue realizado a partir de 300 μ l del cultivo de
toda la noche usando el paraformaldehydo del 4% (3). Cerca de 20 μ l de la
suspensión fija de la célula en PBS fueron manchados en una diapositiva poly-L-
lysine-revestida, secados en un horno a 46°C por 10 minutos, y deshidratados
sucesivamente en las soluciones 50, 80, y 100% de etanol por 3 minutos cada uno.
Una vez que el etanol se hubiera evaporado, los especímenes fueron utilizados
para la hibridización.
Las secciones del queso de Stilton fueron obtenidas de diversas zonas de la
matriz; particularmente, la superficie, las venas, y la base considerado. El encajar
del espécimen en resina de polimerización fría del methylacrylato del glicol fue
realizado según lo descrito previamente (17).
Tratamiento previo de todos los especímenes con la proteinasa K (10 mg ml 1‫;־‬
sigma) fue realizado a 37°C por 10 minutos, seguido por un paso que se lavaba
con 1 x PBS helado (Oxoid). El buffer de hibridización (formamida del 25%, NaCl
de 0.9 M, 0.01% SDS, 20 mM Tris-HCl [pH 7.2]) (30 μl) conteniendo 10 ng de la
sonda del rRNA 16S (Genosys Biotechnologies) fue manchado sobre el espécimen
seco, y las diapositivas fueron incubadas en un compartimiento húmedo oscuro a
42°C por 14 hs (3 hs para los cultivos); un paso de lavado

En el prewarmed buffer de lavado (20 mM Tris-HCl [pH 7.2], 0.01% SDS, 40 mM

de NaCl, EDTA de 5 mM) entonces fue realizado A 42°C por 15 minutos. Cuando

6
más de una sonda fue utilizado para el mismo espécimen, fueron mezclados en el
buffer de hibridización en las cantidades iguales hasta 10 ng.

Microscopia. Las observaciones microscópicas fueron realizadas con un

microscopio de la fluorescencia de Zeiss Axiovert 135, con un HASTA
monocromador fotonicos para la excitación, un filtro de varias bandas del
isocianato isotiocianato-isothiocyanate-tetramethyl del rhodamine de los 4.6-
diamidino-2-phenylindole-4,6-diamidino-2-phenylindole-fluorescein fijado para la
visión, y los filtros single-pass montados en una rueda del filtro del biopoint para la
captura de la imagen con refrescada chargecoupled la cámara fotográfica del
dispositivo (ORCA 2; Hamamatsu, Welwyn Garden City, Reino Unido). El software
de Openlab (Improvision) fue utilizado para el análisis de imagen. Cerca de 250
secciones que se presentaban de las diversas zonas del queso eran analizadas.
Por lo menos 40 campos fueron observados para cada espécimen en una
ampliación de x 100.

Números de accesión de la secuencia de nucleotidos. Los números de

accesión de GenBank para las secuencias parciales del rDNA 16S recuperadas de
bandas de DGGE se dan en las tablas 2 y 3.

7
.
RESULTADOS

Enumeración de microorganismos. El análisis fue realizado en una muestra de

queso de Stilton elegida entre los 16 defendidos previamente (véase abajo). Las
cuentas viables del los agares selectivos y no selectivos se demuestran en la tabla
4. Los números de cada grupo microbiano apuntaron pareció ser absolutamente
similares, con valores de cerca de 10 8 CFU g 1‫־‬.Contajes en el agar de Rogosa
eran 1 unidad de logaritmo registro más bajo que las otras cuentas de la flora.
Láctica. Interesantemente, las cuentas de las bacterias psychrophilicas eran cerca
de 10 8 CFU g1‫־‬, indicando que una sección predominante de la flora podría crecer
a las bajas temperaturas
.
TABLA 4.Contaje viable de grupos bacterianos del Queso Stilton
Medio T°de Grupo identificado Log CFU g 1‫־‬ª
incubación(°C) (SD)
Agar M17 30 Streptococos 8.97(0.22)
mesofílicos
Agar MRS 30 Bacteria ácido láctica 8.87 (0.25)
mesofílica
Agar MRS en 30 Bacteria ácido láctica 8.85 ( 0.33)
anaerobiosis mesofílica anaeróbica

Agar Rogosa 30 Lactobacilos 7.76 (0.21)

MSA 30 Stafilococos 8.04 (0.04)

Agar nutriente 10 Microflora Psycrofílica 8.14 (0.32)

ª Los datos son el resultado de 3 repliques

8
 Análisis de PCR-DGGE. Las 16 muestras del queso de Stilton fueron defendidas
inicialmente analizando los perfiles de DGGE demostrados después de la
extracción directa de la DNA y de la amplificación de PCR de la región V3 del
rDNA 16S. El análisis de la región V3 de DGGE fue demostrado previamente para
ser útil para discriminar tanto el producto comercial así como los productos lácteos
artesanales (14, 16). La variabilidad en la composición microbiana, determinada
por el número de bandas y la posición de la migración en geles de DGGE, era baja
entre las 16 muestras del queso de Stilton analizadas (los datos no demostrados).
Una muestra de queso de Stilton fue elegida como representante y utilizada para el
análisis posterior
Las huellas digitales del rDNA 16S fueron obtenidas por el análisis de PCR-DGGE
de las regiones variables V3 y V4-V5 realizado en el DNA extraído directamente
del queso de Stilton tan bien como de las células en cantidad recogidas en
diversos medios después de las cuentas microbianas.
La huella digital V3 de la flora del queso de Stilton obtenida del DNA extraído
directamente del queso fue compuesta de seis bandas (fig. 1, carril g).
Desafortunadamente, la purificación y la secuenciación de la banda 5 no probaron
exitosamente. Todas las secuencias recuperadas correspondieron a las porciones
del rDNA 16S de bacterias .Las cercanías relativas, el porcentaje de identidad, y
los números de accesión de las secuencias analizadas son reportados en la Tabla
2. Como resultado de la secuenciación de los fragmentos de la región V3, la flora
del queso de Stilton fue encontrada para consistir en los parientes más cercanos
del Lactococcus lactis (Fig. 1, carril g, banda 1), Enterococcus faecalis (la banda
2), curvatus del Lactobacillus curvatus (banda 3), S. equorum (banda 4), y
Lactobacillus plantarum (la banda 6). El mismo procedimiento fue seguido con los
primers que amplificaban la región V4-V5. Los perfiles obtenidos se demuestran en
Fig. 2, mientras que los resultados para las secuencias se divulgan en la Tabla 3.
El perfil obtenido por el análisis directo del queso de Stilton consistió en cuatro
diversas bandas (Fig. 2, carril g) que da lo más relativamente cerca posible
parientes del Lactococcus lactis (banda 1), Staphylococcus sp (banda 3), S.
equorum (banda 4), y Leuconostoc mesenteroides (banda 6). El análisis de la
secuencia fue ampliado a los perfiles obtenidos del análisis de PCR-DGGE del
DNA extraído de las células a granel de las placas contables. En la Fig. 1 los
perfiles V3 de las células a granel de las placas contables de diversos medios
también son reportadas. Por el análisis de la región V3, encontraron a los parientes
más cercanos del E. faecalis, Staphylococcus sp y S. equorum (enumerado como
aparecen en el gel desde el fondo a la cima) fueron encontrados sobre el agar
M17 (Fig. 1, carril a); El E. faecalis, Staphylococcus sp, S. equorum, y Lactobacillus
plantarum fueron encontrados en el MRS agar (Fig. 1, carril b); El S equorum. Y
Lactobacillus plantarum fueron encontrados en el MRS agar cuando estaba
incubado anaerobicamente (Fig. 1, carril c); y el Lactobacillus curvatus y
Lactobacillus plantarum fueron encontrados en el agar de Rogosa Fig. 1, carril d).
Las células a granel colectadas de MSA y el agar nutriente demostraron el mismo
perfil, consistiendo en el E. faecalis y el S. equorum. (Fig. 1, carriles e y f). Según
lo demostrado en la Fig. 1, la comigracion de dos diversas especies
(Staphylococcus sp y Lactobacillus curvatus) fue observado por la correspondencia
de la banda 3. El análisis de células a granel también fue repetido para que la
región V4-V5 identifique la especie que ocurría en las placas contables después

9
del cultivo (Fig. 2, carriles a a f). secuencias del rDNA 16S que dan a los parientes
más cercanos del E. faecalis, Staphylococcus sp ,S. equorum ,y el Leuconostoc
mesenteroides fueron recuperados de las placas contables del agar M17 (Fig. 2,
carril a); Los Staphylococcus sp , el S. equorum., y el Leuconostoc mesenteroides
fueron encontrados en las placas de agar MRS ( Fig. 2, carril b); solamente el
Leuconostoc mesenteroides fue encontrado en el MRS agar cuando estaba
incubado anaerobicamente (Fig. 2, carril c); Lactobacillus plantarum fue encontrado
en el agar de Rogosa (Fig. 2, carril d); El S equorum. fue encontrado en MSA (Fig.
2, carril e); y el S equorum y el Leuconostoc mesenteroides fueron encontrados en
las placas de agar nutrientes (Fig. 2, carril f).

FIG. 1. Perfiles DGGE de la región V3 variable del queso Stilton y de las células.
Carriles: a, agar M17 (107‫ ;)־‬b, MRS agar (107‫ ;)־‬c, MRS agar (anaerobiosis, 107‫;)־‬
d, agar de Rogosa (106‫ ;)־‬e, MSA (106‫ ;)־‬f, agar nutriente (106‫ ;)־‬g, queso de
Stilton después de la extracción directa de la DNA. Bandas: 1. Lactococcus lactis;
2 .E. faecalis; 3. Lactobacillus curvatus. -Stafilococcus sp.4, S. equorum.; 5. no
identificado; 6. Lactobacillus. plantarum

10
FIG. 2. Perfiles variables DGGE de la región V4-V5 del queso Stilton.y de las
células. Carriles: a, agar M17 (107‫ ;)־‬b, MRS agar (107‫ ;)־‬c, MRS agar
(anaerobiosis, 107‫ ;)־‬d, agar de Rogosa (106‫ ;)־‬e, MSA (106‫ ;)־‬f, agar nutriente (10
6‫ ;)־‬g, queso de Stilton después de la extracción directa del DNA. Bandas: 1.
Lactococcus; lactis. 2. E faecalis; 3. Stafilococcus sp 4, S. equorum.; 5.
Lactobacillus; 6. Leuconostoc mesenteroides.
.
FISH. La conveniencia de las sondas recuperadas de la secuenciación de los
fragmentos de DGGE fue comprobada por los experimentos en FISH realizados
con clases de cultivos de la colección. Las condiciones descritas en Materiales y
Métodos fueron encontradas para ser el grado óptimo, proporcionando una buena
producción en fluorescencia así como la especificidad para las especies del
interés. La sonda Eub338 dio hibridación con todos los cultivos probados. La sonda
LactV5 hibridizó con Lactococcus lactis solamente, la sonda LeucV5 hibridizó con
Leuconostoc solamente, y la sonda LbpV3 hibridizó con Lactobacillus plantarum
solamente. Ningunas de las sondas nuevamente diseñadas hibridizaron con el E.
faecalis, Lactobacillus curvatus, y S.equorum o demostraron reacciones cruzadas
en FISH.

Localización de la comunidad bacteriana en el queso de Stilton. Las sondas

desarrolladas y la sonda bacteriana fueron utilizadas en experimentos en FISH con
las secciones encajadas del queso para localizar las diversas especies
microbianas dentro de la matriz del alimento. Las secciones del queso de Stilton
que se presentaban de diversas partes del molde del queso, es decir, la base, las
venas, y la corteza, fueron examinadas.
La sonda bacteriana Eub338 fue utilizada para la detección de las colonias
microbianas; las células fueron identificadas simultáneamente usando las sondas
específicas. Las secciones que se presentaban de la base tenían una composición
simple en especies microbianas: las reacciones de la hibridización con la sonda

11
Eub338 y la sonda Lactv5 demostró que las colonias del Lactococcus lactis todavía
están presentes y representan el 70% de las colonias detectadas. Quince por
ciento de las colonias hibridizaron con el Leuconostoc sonda LeucV5, mientras que
el resto de las colonias seguía siendo no identificado, aunque todas fueron
compuestas como cocos de microorganismos. Las colonias de Lactococcus y del
Leuconostoc encontrados son representadas en las Fig. 3A y B, respectivamente.
Una diferencia apreciable de tamaños de la microcolonia fue notada: el
Leuconostoc formó microcolonias confinadas pequeñas, mientras que las colonias
de Lactococcus eran grandes y el separarse, ocupando a menudo más de un
campo de observación. La composición de la microflora a través de las venas y de
la superficie era más compleja. Detectaron a las colonias extensas de cocos,
extendiendo a menudo sobre 5 a 10 campos de observación, fueron detectadas
con la sonda bacteriana; sin embargo, ningunas de las sondas específicas
desarrolladas dieron un resultado positivo de la hibridación. Según lo demostrado
en la Fig. 3C, encontraron a estas colonias grandes yaciendo a lo largo del
margen de la vena, casi produciendo una frontera. Además, las colonias grandes
de las barras (Fig. 3D) podrían ser detectadas en la vecindad de las venas; sin
embargo, no cruzaron por hibridación con la sonda LbpV3 para Lactobacillus
plantarum, sugiriendo que éstas puedan ser microcolonias del Lactobacillus
curvatus, la otra especie del lactobacilo encontrada. Las microcolonias del
Leuconostoc fueron encontradas en la parte más interna de la vena. Algunas
pocas microcolonias del Lactococcus lactis también fueron encontradas; sin
embargo, desemejante en de la base, estaban en la mayoría de los casos
mezcladas con el otro no identificado de los microorganismos de forma de cocos
(Fig. 3E). La superficie presentó una capa externa de una larga levadura-como las
células que no cruzaban por hibridación con la sonda bacteriana sino perceptible
cuando estaba excitada en 488 nm debido a una señal débil del autofluorescence
(resultados no demostrados). La parte externa también fue caracterizada por la
presencia de las colonias grandes de los cocos no identificados similares a los que
están encontrados a lo largo de las venas, aunque menos extendidos de tamaño.
Apenas debajo de la corteza, diversas especies microbianas podrían ser
detectadas. Las microcolonias del Lactobacillus plantarum estaban con frecuencia
y encontraron aleatoriamente; eran generalmente grandes y concentradas más
bien que se separaban (Fig. 3F). Las microcolonias del Leuconostoc también
fueron encontradas, al igual que microcolonias de las barras no identificadas que
no cruzaban por hibridación con la sonda LbpV3. Por otra parte, no se identificó
ninguna colonia semejante a cocos encontradas debajo de la corteza como lactis
de Lactococcus lactis por FISH .

12
FIG. 3. FISH de la sección del queso de Stilton. (A) Microcolonia del Lactococcus
lactis de la base detectada usando la sonda LactV5 marcada con fluoresceína. (B)
Microcolonia del Leuconostoc mesenteroides de la base detectada por la sonda
LeucV5 marcada con Cy3. (C) Microcolonia de los cocos a lo largo de la vena
detectada por la sonda Eub338 marcada con fluoresceína. (D) Colonia de las
barras por debajo de las venas detectadas por la sonda Eub338 marcada con
fluoresceína. (E) Microcolonia mezclada de Lactococcus lactis y de otras bacterias
de las venas detectadas simultáneamente por el hibridación con las sondas LactV5

13
marcadas con fluoresceína y Eub338 marcada con Cy3. Las flechas indican las
localizaciones del nonlactococcos. (F) Microcolonia de Lactobacillus plantarum por
debajo de la corteza detectada usando la sonda LbpV3 marcada con Cy3.

DISCUSIÓN

Un acercamiento molecular combinado fue aplicado en este estudio; la meta era

obtener la información sobre la flora bacteriana compleja que se desarrolla en el
queso de Stilton y examinar la distribución espacial de las especies encontradas
dentro de la matriz del queso.
Las cuentas microbiológicas demostraron una presencia significativa de todos los
grupos microbianos apuntados; sin embargo, el análisis del rDNA 16S de las
colonias en células a granel de las placas cultivadas reveló que solamente un
número pequeño de especies fue recuperado realmente de las placas. La
identificación de las especies microbianas que ocurrían en el queso de Stilton fue
realizada por secuenciación de los fragmentos de DGGE que pertenecían a las
regiones V3 y V4-V5 del rDNA 16S. La estructura de la comunidad microbiana fue
demostrada de ser compleja. El queso de Stilton se hace de la leche pasteurizada
y se supone así para estar libre de bacterias indeseables; la pasteurización fue
introducida en 1989 como resultado de un brote de la pasta alimenticia
envenenada en Inglaterra asociada a la consumición del queso de Stilton (26).
El Lactococcus lactis se utiliza comúnmente como un iniciador en la fabricación
para proporcionar a la producción una rápida acidificación y producción de la
cuajada. Detectaron a un pariente más cercano del Lactococcus lactis en el perfil
de la comunidad del queso de Stilton a partir de analizar ambas regiones del V3 y
las regiones V4-V5 del rDNA 16S. Sin embargo, el fragmento que correspondía al
lactis de Lactococcus lactis nunca fue encontrado en los perfiles recuperados de
los medios de cultivo. Los análisis del rDNA 16S de las células a granel de
diluciones de 105‫( ־‬las placas fuera de la gama contable) revelaron la presencia de
una banda comigrante con el fragmento de Lactococcus (resultados no
demostrados). Si sólo un acercamiento tradicional hubiera sido utilizado, no se
habría aislado ningún lactococci de las placas, porque sus colonias estaban
presentes no en las placas dentro de la gama contable sino en las placas
confluentes, que no es considerado generalmente para el aislamiento y la
enumeración de bacterias.
Las cantidades considerables de bacterias no iniciadoras del ácido láctico
también fueron encontradas. Detectaron a los parientes más cercanos del
Lactobacillus plantarum y del Lactobacillus curvatus; sin embargo, el Lactobacillus
curvatus fue detectado amplificando la región V3 solamente. Ambas especies
ocurren generalmente en ecosistemas de la lechería: Lactobacillus plantarum se
reconoce como contribuyendo al desarrollo del sabor (1, 6) y como agente
antimicrobiano protector en el queso (15, 44), mientras que el Lactobacillus
curvatus ha sido asociado al desarrollo indeseable del biofilm en el ambiente de la
lechería (42, 51). El Leuconostoc mesenteroides también fue detectado, pero
solamente por la amplificación de la región V4-V5; ésta se encuentra a menudo en
matrices del alimento y en muchos quesos (12, 29, 37, 49). Interesantemente, el

14
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris se ha demostrado para estimular el
crecimiento del P roqueforti., el molde usado en la maduración de Stilton (23). El
organismo fue detectado de M17, MRS, y de las placas de agar nutrientes en la
dilución más alta de 10 7, sugiriendo una contribución considerable al ecosistema
complejo. El E. faecalis se aísla a menudo de las muestras de la lechería (9, 19,
29, 30); su papel en este ambiente no se define claramente, aunque se ha
sugerido como un adjunto del cultivo en la producción de queso (36).
El S equorum. fue recuperado de las placas de cultivo múltiples y así demostró
ser uno de las especies predominantes en el queso de Stilton. Se ha encontrado
previamente en la leche y el queso (28), y sus características fisiológicas sugerirían
otra contribución a la maduración del queso (11, 43). Finalmente, encontraron a los
parientes más cercanos del Staphylococcus sp. También; sin embargo, la
identificación en los niveles de la especie no se podía alcanzar, probablemente
debido al nivel bajo de la variabilidad de las regiones del rDNA 16S consideradas
entre las especies de estafilococos.
Los resultados obtenidos analizando el queso de Stilton en base de la variabilidad
de la secuencia de las regiones V3 y V4-V5 eran notable diferentes. El análisis de
la región V4-V5 del DNA extraído directamente del queso no permitió el
Lactobacillus plantarum y Lactobacillus curvatus que se detectara, mientras que
ambos amplicones fueron tomados en el perfil de la región V3 que se presentaba
del mismo molde del DNA. Sin embargo, el Lactobacillus plantarum fue detectado
como banda única en el perfil a granel de la célula V4-V5 del agar de Rogosa. Por
otra parte, el Leuconostoc mesenteroides era perceptible solamente analizando la
región V4-V5. Ningunas de los mismos moldes dieron el Leuconostoc perceptible
fragmentos después de la amplificación de la región V3. Además, el E. faecalis era
desapercibido en el perfil V4-V5 del queso de Stilton, y los Staphylococcus sp. eran
desapercibidos en el perfil V3 del queso, aunque ambos fueron recuperados de los
perfiles a granel de la célula de las regiones respectivas. Los moldes y las
cantidades de DNA usados en el PCRs eran exactamente iguales para el análisis
las regiones de V3 y de V4-V5; sin embargo, las estructuras de la comunidad
obtenidas eran diferentes. La inconsistencia de los resultados es probablemente
debido a la amplificación preferencial de los dos pares de moldes usados. La
amplificación selectiva se ha determinado previamente (19, 33, 39, 40, 47, 50), y
los resultados obtenidos en este estudio sugieren que una interpretación más
cuidadosa de los datos obtenidos analizando las regiones 16S de poblaciones
bacterianas mezcladas es necesaria.
La identificación de la especie microbiana de perfiles de DGGE de células a granel
de las placas contables (19) se ha demostrado para ser útil y rápida. Este
acercamiento permitió que la ausencia del Lactococcus lactis en las placas
contables fuera apreciada inmediatamente. El análisis de las células a granel
también destacó la ocurrencia de los Staphylococcus sp en el análisis de la región
V3 y Lactobacillus plantarum y del E. faecalis en el análisis de la región V4-V5,
mientras que estas especies eran desapercibidas en los perfiles correspondientes
del queso de Stilton.
Es significativo, sin embargo, que algunos de los medios no eran muy selectivos.
Los estafilococos fueron encontrados en M17 y la MRS agares, los enterococos
ocurrieron en MSA, y los leuconostocs fueron encontrados en las placas de agar
M17. La carencia de la selectividad de los medios de cultivo para estudiar a

15
comunidades ambientales complejas del alimento se ha demostrado previamente
(7, 19, 38).
La otra meta importante de este estudio era examinar la distribución espacial de
las bacterias dentro de la matriz del queso. Esto fue alcanzado por medio de los
experimentos de los PESCADOS realizados en secciones encajadas del queso
usando la sonda Eub338 (3) conjuntamente con otras sondas del rRNA 16S
desarrolladas en este estudio.
Las sondas específicas del oligonucleotido fueron diseñadas de las secuencias
recuperadas del análisis de DGGE y apuntaron las regiones de los rRNAs 16S del
Lactococcus lactis, del Leuconostoc mesenteroides, y Lactobacillus plantarum.
Estos sondas no fueron pensadas para ser específicas más allá del ambiente del
estudio, y las especificidades fueron comprobadas solamente entre la especie que
ocurría en el queso. La puntería no era desarrollar sondas absolutamente
específicas pero desarrollar solamente las sondas capaces de distinguir, y
entonces localizando, algo de la especie detectó en este estudio en el queso de
Stilton. De hecho, las sondas se han desarrollado de las secuencias DGGE-
recuperadas, que garantizaron una diferencia significativa en la composición de
pares de bases, composición de los fragmentos, puesto que podrían ser separadas
según su secuencia en DGGE. Otras sondas del rRNA 16S han sido desarrolladas
para la identificación de las bacterias del ácido láctico (25); sin embargo, su
conveniencia para los experimentos de hibridación in situ con el rRNA 16S nunca
no se ha demostrado. La conveniencia de las sondas del rRNA 16S para los
PESCADOS se relaciona con la accesibilidad de la sonda al rRNA 16S en su
conformación natural (21, 22).
El uso combinado de la sonda universal Eub338 y las sondas del específico en
experimentos de los PESCADOS en secciones del queso de Stilton demostraron
una distribución espacial diferenciada de la flora bacteriana dentro de la matriz de
la lechería. Una diferencia significativa entre la base y el resto del queso fue
detectada. La densidad de la colonia en la base era más baja alrededor de
quíntuplo que ésa en la superficie y las venas, aunque en el microambiente en los
últimos dos, las bacterias estaban fuera de competencia por el desarrollo del
molde. En la base, la mayoría de las microcolonias eran de Lactococcus lactis,
aunque una cantidad considerable de Leuconostoc mesenteroides también fue
detectado. Lactococos fueron detectad por el aislamiento directo del DNA del
queso y del análisis de PCR-DGGE. Interesantemente, a pesar del hecho de que el
lactococos fue desapercibido de los perfiles a granel de la célula de DGGE de las
placas de agar M17, sus colonias en la matriz seguían siendo perceptibles por
FISH . Las células de Lactococcus no miraban reacciones positivas dañadas y
rendidas de los FISH. La falla de recuperar las especies en altos números en
agares selectivos, sin embargo, sugiere una cierta medida de debilitación
metabólica de las células.
Las bacterias Barra-formadas no fueron encontradas en la base, pero las
cantidades visibles de Lactobacillus plantarum y, presuntamente, del Lactobacillus
curvatus fueron encontradas por debajo de la corteza. A través de las venas, por
otra parte, algunas microcolonias de Lactobacillus plantarum podrían ser
observadas, mientras que las microcolonias de barras más cortas que se
asemejaban a Lactobacillus curvatus fueron mucho más abundantes. En la
superficie, y mucho más a lo largo del margen interno de las venas, detectaron a

16
las colonias muy grandes de los cocos del non-Lactococcus; suponemos éstos
para ser estafilococos aunque la identificación no se ha alcanzado. Los
estafilococos crecerían mejores en esta parte del queso, donde está disponible
más oxígeno, puesto que son anaerobios facultativos. Por otra parte, el pH en
estas zonas se piensa para ser más alto debido al desarrollo del molde, y los
estafilococos no son tolerantes como las bacterias del ácido láctico. Las colonias
de cocos a lo largo de las venas pudieron también ser traídas adentro mientras que
el queso se perfora con la aguja, pero la presencia de los lactobacilos en la parte
interna de las venas y por debajo de la superficie del queso sugiere que ellos se
presenten de la leche. Si es así es interesante especular porqué no se convirtieron
en la base del queso y solamente hacia los bordes. Esto es probablemente debido
a las razones ecológicas: ellos pueden encontrar condiciones óptimas del
crecimiento en la presencia de otras entidades y moldes bacterianos que lanzan
los metabolitos útiles para su propia nutrición. Los lactococos se utilizan como
iniciadores y se piensan para ser distribuidos homogéneamente en el queso; su
ocurrencia en las partes del queso que son menos ricas en bacterias sugiere
solamente que tengan fuera de competencia las otras bacterias en este sitio. Esto
representa probablemente a comunidad dinámica antes de la perforación. Después
de que se introduzca el aire, el crecimiento de los moldes produce un ambiente
cambiante que permite que un nuevo equilibrio se convierta. Interesantemente,
algunas microcolonias de lactococos fueron encontradas en las secciones de la
vena, y fueron mezcladas con otros cocos, indicando un comensalismo posible en
esa parte de la matriz de la lechería. La distribución espacial diferenciada de la
especie microbiana en el queso tiene un impacto significativo en conocimiento en
la ciencia de la lechería...
La localización de las diversas especies en diversas zonas de la matriz implica
ciertamente la utilización diferenciada de los alimentos de la lechería, por lo tanto
produciendo una distribución desigual del sabor y compuestos antimicrobianos en
el queso. Esto alternadamente afectaría el desarrollo local de la flora y puede en
parte explicar la distribución diferenciada de la especie vista. Cuando se presentan
los productos de mala calidad, puede ser debido a la carencia del desarrollo de
uno o más de estos microambientes.
Otros estudios se han centrado en la supervisión de la distribución espacial de la
flora bacteriana en alimento, pero eran cualquier PCR dependientes (7, 20) o
basado en la detección anticuerpo-mediada de las bacterias in situ (45, 46). La
microscopia electrónica de la exploración, así como fluorescencia y microscopia
ligera, se ha utilizado para examinar diversidad microbiana en el queso (27, 52),
aunque estas técnicas proporcionan solamente la información no específica.
Recientemente, la microscopia confocal también se ha sugerido como herramienta
para estudiar la viabilidad de bacterias in situ en el alimento (10, 48). Sin embargo,
el análisis de los rRNA-Pescados 16S tiene la ventaja potencialmente de
proporcionar la detección específica y no específica en un solo paso. Además, la
sonda blanco en FISH es el rRNA, que se piensa para estar más lejos disponible
en células que en fragmentos geonómicos específicos de DNA. Los resultados de
este estudio son interesantes no solamente para la contribución al conocimiento en
la microflora del queso de Stilton pero también porque el uso de trabajo del
acercamiento del conjunto puede representar una herramienta de la importancia
extrema en los estudios ecológicos que miran el desarrollo específico de la

17
microflora en queso. Por otra parte, esta clase de acercamiento puede
desempeñar un papel importante en el control de calidad y la preservación del
artesanal así como los alimentos fermentados industriales.

RECONOCIMIENTOS
Esta investigación fue apoyada por la Comisión de las Comunidades Europeas
bajo quinto programa de base (FP5) que implicaba la universidad de Nottingham
como sitio del entrenamiento de Marie Curie (No. del contrato. QLK1-CT-2000-
60022).
Danilo Ercolini agradece Salvatore Coppola por ayuda y el estímulo. Las tensiones
NCDO 1193, LTH 1432, y DSM 20674 fueron proporcionados por el degli Alimenti,
Universita ' "Federico II de Dipartimento di Scienza," Nápoles, Italia.

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