UNIVERSIDAD PRIVADA FRANZ TAMAYO

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

BIOQUIMICA Y FARMACIA

VARIABILIDAD GENÉTICA
DOCENTE: Dr. BRAYAN JOSE ROLLANO SANTANDER
ESTUDIANTES:
 ERICKA BALDERRAMA QUEZADA
 ANAHI CHOQUE CHIPANA
 LILIAN QUISPE MAMANI
 SHELY HUAYHUA RAMOS
 LIZ ROMINA MACHACA CONDORI
SEMESTRE: QUINTO.
LA PAZ -EL ALTO GESTION 2023
 Variabilidad genética en regiones codificantes del antígeno de
superficie y el dominio de la transcriptasa inversa de la polimerasa
del virus de la hepatitis B, Colombia, 2002-2014

Genetic variability in coding regions of the antigen

surface and reverse transcriptase domain of polymerase
of hepatitis B virus, Colombia, 2002-2014

Balderrama Ericka, Choque Anahi, Quispe Lilian, Huayhua Ramos Sheli, Machaca.

Resumen
Se centró en analizar la diversidad genética del virus de la hepatitis B (VHB) en Colombia a lo largo
del periodo comprendido entre 2002 y 2014. En Colombia, la endemia es variable y circulan diferentes
genotipos virales. Las mutaciones a lo largo del genoma se han asociado con resistencia antiviral, el
escape ante la reacción de anticuerpos neutralizadores tras la vacunación o a la infección natural, la
infección oculta y la progresión a carcinoma hepatocelular. El objetivo principal fue examinar las
variaciones genéticas en las regiones codificantes del antígeno de superficie (HBsAg) y en el dominio
de la transcriptasa inversa de la polimerasa del virus.
La investigación se llevó a cabo utilizando muestras recopiladas durante este periodo de doce años y
se aplicaron técnicas moleculares para evaluar las secuencias genéticas específicas del VHB. El
proceso de "Extracción del ADN viral y amplificación de las regiones codificantes del antígeno S y
del dominio RT de la polimerasa del HBV mediante PCR" implica varias etapas clave en la
investigación del virus de la hepatitis B (VHB). Este proceso proporciona información crucial sobre la
diversidad genética del virus de la hepatitis B en las regiones específicas estudiadas. La combinación
de la extracción de ADN, la amplificación mediante PCR y la posterior secuenciación permite una
comprensión detallada de las características genéticas del virus, lo que es esencial para la investigación
epidemiológica y el diseño de estrategias de prevención y control.
Los resultados revelaron una notable variabilidad genética en las regiones analizadas, sugiriendo la
presencia de diferentes genotipos y subgenotipos del virus en la población colombiana durante el
periodo de estudio. Este análisis de la variabilidad genética es esencial para comprender la
epidemiología y evolución del VHB, así como para evaluar la efectividad de las estrategias de
prevención y control de la hepatitis B en Colombia. La información obtenida puede contribuir al diseño
de intervenciones más específicas y adaptadas a las características genéticas particulares de las cepas
de VHB presentes en la región. El estudio destacó la diversidad genética del virus de la hepatitis B en
Colombia a lo largo de un periodo de doce años, proporcionando información valiosa sobre la
evolución de las cepas virales y su relevancia para la salud pública y las estrategias de control de la
hepatitis B en el país.

Palabras claves: virus de la hepatitis B; genotipo; ADN polimerasa dirigida por ARN; mutación.
Abstract

It focused on analyzing the genetic diversity of the hepatitis B virus (HBV) in Colombia throughout
the period between 2002 and 2014. In Colombia, the endemicity is variable and different viral
genotypes circulate. Mutations throughout the genome have been associated with antiviral resistance,
escape from the neutralizing antibody reaction after vaccination or natural infection, dry infection, and
progression to hepatocellular carcinoma. The main objective was to examine genetic variations in the
coding regions of the surface antigen (HBsAg) and in the reverse transcriptase domain of the virus
polymerase.
The research was carried out using samples collected during this twelve-year period and molecular
techniques were applied to evaluate the specific genetic sequences of HBV. The process of "Extraction
of viral DNA and amplification of the coding regions of the S antigen and the RT domain of the HBV
polymerase by PCR" involves several key steps in hepatitis B virus (HBV) research. This process
provides crucial information about the genetic diversity of the hepatitis B virus in the specific regions
studied. The combination of DNA extraction, PCR amplification and subsequent sequencing allows a
detailed understanding of the genetic characteristics of the virus, which is essential for epidemiological
research and the design of prevention and control strategies.
The results revealed a notable genetic variability in the regions analyzed, suggesting the presence of
different genotypes and subgenotypes of the virus in the Colombian population during the study period.
This analysis of genetic variability is essential to understand the epidemiology and evolution of HBV,
as well as to evaluate the effectiveness of hepatitis B prevention and control strategies in Colombia.
The information obtained can contribute to the design of more specific interventions adapted to the
particular genetic characteristics of the HBV strains present in the region. The study highlighted the
genetic diversity of the hepatitis B virus in Colombia over a twelve-year period, providing valuable
information on the evolution of viral strains and their relevance to public health and hepatitis B control
strategies. . in the country.
Keywords: Hepatitis B virus; genotype; RNA-directed DNA polymerase; mutation.

Introducción.
La variabilidad genética es un fenómeno comúnmente observado en los virus, incluido el virus de la
hepatitis B (VHB). El VHB es un virus de ADN que infecta y daña el hígado de los seres humanos, y
es responsable de la hepatitis B crónica, cirrosis hepática e incluso cáncer de hígado. La variabilidad
genética en regiones codificantes clave del antígeno de superficie (HBsAg) y el dominio de la
transcriptasa inversa de la polimerasa (RT) del VHB puede tener implicaciones clínicas significativas.

El HBsAg es la proteína de superficie del VHB y juega un papel crucial en la infección del virus. Esta
proteína tiene tres regiones principales llamadas "a", "b" y "c", y la región "a" es la más variable. La
variabilidad en la región "a" se debe a mutaciones puntuales que resultan en cambios en los
aminoácidos de la proteína. Estas mutaciones pueden afectar la capacidad del sistema inmunológico
para reconocer el virus, lo que puede conducir a la evasión del sistema inmunológico y al desarrollo
de la enfermedad.

La comprensión de la variabilidad genética en estas regiones codificantes del VHB es fundamental

para el desarrollo y la mejora de estrategias de diagnóstico, prevención y tratamiento de la hepatitis B.
Esto incluye el desarrollo de vacunas más efectivas que puedan abordar la diversidad genética del
virus, así como la selección adecuada de medicamentos antivirales en función de las características
genéticas del VHB en los pacientes.
En resumen, la variabilidad genética en regiones codificantes del HBsAg y el dominio de la RT del
VHB es un factor importante que puede influir en la patogénesis de la enfermedad, la respuesta
inmunológica y la eficacia del tratamiento antiviral. El estudio de esta variabilidad genética continuará
siendo de gran importancia en la lucha contra la hepatitis B y el desarrollo de mejores estrategias de
control y tratamiento.

Se estima que 240 millones de personas en el mundo tienen infección crónica con el virus de la hepatitis
B (HBV). En Colombia, la endemia es variable y circulan diferentes genotipos virales. Las mutaciones
a lo largo del genoma se han asociado con resistencia antiviral, el escape ante la reacción de anticuerpos
neutralizadores tras la vacunación o a la infección natural, la infección oculta y la progresión a
carcinoma hepatocelular.

Desarrollo.

En el presente estudio se llevo a cabo la detección molecular, la genotipificacion y la identificación de

mutaciones en las regiones codificantes del antígeno S y el dominio RT de la polimerasa de HBV a
partir de 495 muestras de suero con resultado positivo para HBsAg provenientes de los 32
departamentos de Colombia, las cuales se recibieron para diagnóstico de hepatitis B.(Peláez-Carvajal
et al., 2018)

Materiales y métodos
Muestras clínicas
Se hizo un estudio descriptivo en 495 muestras de sueros provenientes de 32 departamentos del país y
de Bogotá, conservadas en congelación entre los -20 °C y los -30 °C la seroteca del Grupo de Virología
del Instituto Nacional de Salud para el diagnóstico de hepatitis B, y recolectadas durante el periodo
2002-2014 Se seleccionaron muestras con resultado positivo en la prueba ELISA para el antígeno de
superficie de HBV (HBsAg), no necesariamente confirmado mediante prueba de neutralización.
Para la extracción del ADN viral y ante la eventual necesidad de detectar virus con genoma de ARN
se utilizó el estuche por el Purelink RNA /DNA se siguió las instrucciones del fabricante.
Para la amplificación y secuenciación de las regiones codificantes del antígeno S y del dominio RT de
la polimerasa del HBV, se utilizaron los Oligonucleótidos externos. La mezcla de reacción para la PCR
incluyó 10 pmoles de cada oligonucleótido, 1,35 U de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity™
(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 60 mM de Tris-SO4 (pH 8,9), 18 mM de (NH4)2
SO4. 2,4 mM de MgSO4, 480 nM de cada dNTP, 5 µl del extracto de ADN viral y agua libre de
nucleasas, para un volumen final de 25 µl. El perfil térmico consistió en una desnaturalización inicial
a 94 °C durante dos minutos, seguida de 35 ciclos de amplificación (a 94 °C durante 30 segundos, a
50 °C durante 30 segundos, a 72 °C durante dos minutos) y una extensión final a 72 °C durante cinco
minutos.(Alegre et al., 2004)
Secuenciación edición de secuencias y análisis filogenético.
Los productos de PCR positivos para ADN del HBV se purificaron utilizando el estuche QIAquick
PCR purificación kit y secuenciaron usando el estuche BigDye.
La secuenciación se llevó a cabo en un analizador las secuencias obtenidas se visualizaron editando y
ensamblando mediante el módulo SeqMan de la suite Laserge versión 7.2.1 y posteriormente se
alinearon empleando al algoritmo plus tal con el programa mega 6.0 y se incluyeron secuencias
disponibles en el Genbak pertenecientes a los diferentes genotipos y subtítulos del HBV humano así
como el máximo número de secuencias colombianas previamente reportadas y con longitud genómica
requerida para estos análisis y además una secuencia HB derivada del mono lánudo como grupo
externo. Para las de construcción del árbol filogenético se generaron dos matrices la primera para
analizar la longitud máxima del genoma se extendía entre las posiciones 2858-3182… 1-1266 y la
segunda para incluir el máximo número de secuencias colombianas previamente reportadas se extendía
entre las posiciones 281 y 657 el análisis filogenético se hizo con el programa mega 6.0 y el método
de neighbor-joining. el soporte de la topología del árbol se obtuvo mediante un proceso de Bootstrap
de 1000 réplicas.(Herráiz et al., 2004)

Análisis de mutaciones de resistencia a medicamentos antivirales y de escape

Para la determinación del impacto de las diferentes mutaciones presentes en las secuencias del HBV
circulantes en el país, se emplearon dos herramientas bioinformáticas disponibles en línea: la HIV-
grade HBV drug resistance interpretation (DRI) y la Geno2pheno [HBV] (G2P), las cuales permiten
determinar el genotipo viral, identificar las Mutaciones en la región codificante del dominio RT de la
polimerasa viral asociadas con resistencia a fármacos e identificar mutaciones en el marco de lectura
abierto (Open Reading Frame, ORF) del gen que codifica para el antígeno S pequeño (S-HBsAg),
previamente asociadas con escape por disminución de la unión al anticuerpo.

En los resultados mediante amplificación por PCR convencional de 66 muestras (13,3 %) del total de
las muestras procesadas) de 21 unidades territoriales del país, se obtuvo un fragmento de banda única
del tamaño esperado correspondiente al ORF S y, región codificantes del dominio RT de la polimerasa
del HBV. Del total de muestras amplificadas por PCR 28 (42,4%) secuenciaron y mediante el análisis
filogenético se identificaron los genotipos a y f cuyo subgenotipos fueron el a2 y el f3 respectivamente.
De las 28 secuencias 24 (85,7%) correspondieron al genotipo f y 4 14,3% al genotipo a coma similar
a lo reportado para el país en estudios previos. El análisis filogenético mediante la matriz 1 con
consecuencia de longitud de 1.5 91 pb permitió la identificación confiable de los
subgenotipos.(Aguilera Guirao et al., 2006)
Discusión.
En el 2016 los departamentos de Guaviare, Amazonas y Vaupés registraron la mayor incidencia de
casos (12-20/100.000 habitantes) en tanto que Boyacá, Cauca, San Andrés y Buenaventura notificaron
la incidencia mas baja (1-3/100.000 habitantes).
Existe un bajo registro de notificaciones de la enfermedad debido a que la enfermedad en la mayoría
de los casos de pacientes infectados se desarrolla de manera crónica y silenciosa, siendo evidente
cuando ya existe un daño hepático y se manifiesta como cirrosis o carcinoma hepatocelular
(condiciones que requieren trasplante hepático).
El estudio tuvo 495 muestras de estudio que a pesar de que la PCR fue optimizada se observó una
detección baja de la enfermedad, siendo 66 los casos en donde se hallaban falsos positivos que fueron
descartados por medio de la prueba Elisa mostrándonos así el resultado de 33 muestras positivas de
HBV, mismos que realizaron un estudio vemos la predominancia del genotipo F de las cuales el
subgenotipo F3 era el predominante pues es conocido que el mismo es predominante en América.
Las muestras analizadas para el presente estudio fueron remitidas de pacientes de los cuales se tenían
sospechas de la enfermedad y que no habían recibido un tratamiento previo por lo cual el encontrar
mutaciones de resistencia L180M y M204V evidenciamos que el paciente fue infectado previamente
por un individuo que recibía tratamiento con LdT, 3TC, ETV o emtricitabine (FTC).
En el análisis de las secuencias del gen S del HBV, se identificó la mutación P120Q en la muestra de
un paciente proveniente del departamento del Guaviare, la cual fue reactiva para el HBsAg con el
método ELISA. Dicha mutación se ha relacionado con una reacción disminuida en diferentes ensayos
serológicos comerciales y asimismo, se reportó la aparición de esta mutación en un paciente recién
nacido de una madre infectada en Corea, a quien se le había administrado de forma simultánea la
vacuna y el tratamiento profiláctico con inmunoglobulina.
En la región preS/S comúnmente se presentan deleciones y mutaciones puntuales las cuales se han
asociado con falla hepática aguda, cirrosis y hepatitis colestásica ‘fibrosante’. En el estudio se
evidencio que dos de las muestras presentaron una deleción en la región preS1-preS2, cuyas
implicaciones bológicas y clínicas se estudiarán y discutirán en estudios posteriores.

Conclusión.
El objetivo principal fue la caracterización molecular de HBV en Colombia por lo que se hizo un
estudio descriptivo, longitudinal y retrospectivo, de 495 muestras de sueros del país y de Bogotá de
las cuales en 66 de las muestras (13,3% de las muestras procesadas) se determinó el genoma viral,
siendo que 28 de ellas se secuenciaron con éxito. Al realizar el análisis filogenético se evidencio la
presencia de los genotipos y subgenotipos F3 y A2 y la circulación predominante del subgenotipos F3,
observándose a la par mutaciones de resistencia y escape que influyen en la variabilidad genética.
Tenemos como antecedentes de importancia que una muestra presentó simultáneamente las
sustituciones de resistencia L180M y M204V, otra presentó la sustitución I169L y en una se identificó
la mutación P120Q, previamente asociada con variantes de escape. Dos muestras presentaron una
deleción de 105 nucleótidos en la región preS1-preS2.
Por último concluimos en que se estima que el surgimiento de variantes de escape tendrá importantes
implicaciones en salud pública ya que estas mutaciones están relacionadas con el escape frente a la
neutralización por parte de los anticuerpos generados tras la inmunización con la vacuna, o por
infección natural por el HBV, y podrían tener un impacto negativo en el diagnóstico mediante pruebas
serológicas basadas en la detección del HBsAg. Los resultados implican un aporte a la epidemiología
molecular de HBV en Colombia que es información valiosa para la toma de decisiones al momento de
la elección y seguimiento de tratamientos antivirales.
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Referencias.
Aguilera Guirao, A., Romero Yuste, S., & Regueiro, B. J. (2006). Epidemiología y manifestaciones
clínicas de las hepatitis virales. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 24(4), 264–
276. https://doi.org/10.1016/s0213-005x(06)73773-9
Alegre, F., Moreno, D., & Quiroga, J. (2004). Acute infection by hepatitis B virus . Anales Del
Sistema Sanitario de Navarra, 27(SUPPL. 2), 17–25.
https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-
4544290673%7B&%7DpartnerID=40%7B&%7Dmd5=c6b27f26b45322dcd2c26247693b05c3
Herráiz, D. M., Carretero, C., & Herráiz, M. (2004). Infección crónica por el VHB Chronic Hepatitis
B Virus infection. An. Sist. Sanit. Navar, 27(2), 27–32.
Peláez-Carvajal, D., Forero, N. J., Escalante-Mora, M., Laiton-Donato, K., & Usme-Ciro, J. A.
(2018). Variabilidad genética en regiones codificantes del antígeno de superficie y el dominio
de la transcriptasa inversa de la polimerasa del virus de la hepatitis B, Colombia, 2002-2014.
Biomédica, 38, 37–50. https://doi.org/10.7705/biomedica.v38i3.3871