Materia orgánica en

disolución
 Análisis de materia orgánica en disolución

Múltiples papeles en el Medio Ambiente:

• Sustrato para la formación de tejidos,

• sustrato en profundidad para la remineralización bacteriana de nutrientes,
• complejantes e intercambiadores de metales, cationes
• otra materia orgánica de relevancia ambiental (contaminantes),
• reducen penetración luz, absorbancia de radiación solar
• fuente de electrones (reductores) durante fotoxidación (ROS, reducción metals,
oxidación material orgánica, etc),
• absorbe calor,
• etc.

Extraordinaria dificultad debido a la gran variedad de compuestos y sus bajas

concentraciones.
Análisis de materia orgánica
Ciclo y flujos de carbono
Análisis de materia orgánica en disolución
DOM en el océano equivale al CO2 atmosférico total

Jiao et al Nature Reviews Microbiology 8, 593-599 (August 2010)

 Fotoquímica acuática
Creación de oxígeno singlete

Compuestos que han demostrado actuar como aceptadores

de energía con 3CDOM *
McNeill/Canonica. Environ. Sci.: Processes Impacts, 2016, 18, 1381-1399
Compuestos seleccionados que han demostrado reaccionar con 3CDOM *
 los compuestos que son buenos oxidantes en
el estado fundamental (por ejemplo,
quinonas) y los compuestos que tienen altas
energías de tripletes (por ejemplo, cetonas)
son a menudo oxidantes poderosos en su
estado de triplete

Reacciones de reducción de media onda de la 3-metoxiacetofenona

(3MAP) en su estado fundamental y su estado excitado triplete
Generación de superóxido a patir de DOM
 DOC
Debido a la naturaleza heterogénea de la variable puede presentarse en diferentes
unidades y hay distintos métodos de análisis:
HTCO (high temperature catalytic oxidation)

Si el método es elemental se requiere retirar previamente todo el carbono inorgánico por

Acidificación + purga gas inerte
Para el filtrado se usan filtros GF pretratados como el material de muestreo (acidificación más combustión) y filtración
por gravedad (evitar vacío que rompe celulas sobreestimando DOC). Filtros más comunes 0.7 mm excepto cuando se
quiere aislar la contribución bacteriana
Las muestras se preservan por termosellado con acidificación (pH 2-3 con H3PO4 o HCl). A veces se recurre a
congelación.
HTCO (high temperature catalytic oxidation)
Catalizador más usado: Al2O3 impregnado con 0.5% Pt
Detección por IR. Admite medidas de POC
Sólo un material de referencia para agua de mar a bajas
concentraciones: RSMAS, Dr Hansell, 2 y 45 mM C
 HTCO para la medida de DOC
El método más usado con diferencia para dar una medida del total de carbono orgánico
disuelto
La preparación de muestras requiere utilizar un ambiente de laboratorio límpio de solventes.
Se requieren estándares de calibración (a partir de biftalato de potasio), estándares de
eficiencia de oxidación (sulfatiazol y EDTA), blancos y viales perfectamente límpios

Enorme dificultad para obtener blancos

 POC y PON
Necesarios para completar las estimaciones de materia en los diversos compartimentos de ciclos globales.
Importantes para estimar flujos verticals, dispersion y utiización de macronutrientes y remineralización
 Analizadores elementales CHN
Dan la proporciones de los elementos mayoritarios de una muestra sólida y son usados
principalmente para el análisis de C,H y N aunque los modelos más modernos incluyen O y S.
Pequeñas cantidades de muestra (mg) son combustionadas en presencia de oxígeno puro por
encima de 900ºC (hasta 1800ºC) liberando CO2, H2O y N2 (método Dumas).
Una vez reducidos a gas inorgánico, la combinación de NO2,CO2,SO2,H2O es separada en una
columna de GC y sus concentraciones detectadas por conductividad térmica
 CDOM y FDOM

Medida de los compuestos orgánicos que absorben en el UV-vis o que presentan

fluorescencia
Sustancias que controlan la penetración de la luz en la columna de agua con importantes
implicaciones en la producción primaria: absorción CO2, imagen de satélites, producción
de especies por fotólisis o LMCT (ROS, CO, CS, DMS, Fe(II), Cu(I), etc). Distribución global,
gran importancia en los ciclos biogeoquímicos del C y otros elementos

Muy poco es conocido sobre la composición de CDOM, las sustancias húmicas (terrestres
o generadas insitu) son un componente importante así como algunos fenilos y quinonas
producto de la acitividad biológica. No se puede calibrar en unidades de carbono. Se usan
compuestos conocidos para calibrar pero se obtiene en general una pobre correlación con
DOC. No todo el CDOM es FDOM pero la medida de FDOM es más sensible y permite el
mapeado por espectroscopía de EEM que incrementa enormemente la información sobre
la naturaleza del FDOM.
 CDOM y FDOM
No hay acuerdo sobre si la congelación es un método adecuado de preservación con
trabajos contradictorios. Interacciones de CDOM y FDOM con otros componentes de
la matriz (pH, tª, salinidad y elementos traza –”quenching”-) han demostrado que las
propiedades ópticas cambian (l de max absorción y absorbancia).
Repasar conceptos como absorbancia vs absorción.
Los blancos suelen muy problemáticos porque algunos componentes inorgánicos de
la disolución (nitratos, cloruros) absorben en el UV y el agua destilada suele llevar
compuestos orgánicos. Importancia de digestión UV previa.
La absorción disminuye exponencialmente con l. A veces se trabaja con la pendiente
espectral (S) obtenida en un rango determinado de l.

a(l)=a(l0)e-S(l-l0)
 Problemas analíticos
(Sharpless/ Blough 2014)

photobleaching

Uso pendiente espectral

 Problemas analíticos
(Sharpless/ Blough 2014)

photobleaching

Uso pendiente espectral

EEM (Excitation Emission Matrix)
PARAFAC (Parallel Factor Analysis)
 EEM +
PARAFAC

Desplazamiento de máximos hacia el rojo a mayor

Longitud de onda de excitación

Murphy etal 08. Clasificación de señales en
EEM espectros según la naturaleza de la
materia orgánica
Análisis carbohidratos
15-30% DOC. En plantas los polisacáridos son constituyentes
mayoritarios de la pared celular (CH estructurales). Reserva energética
celular, base del metabolismo en oscuridad (CH de almacenamiento).
En el exterior celular se agregan formando geles (exopolisacáridos)
que acaban precipitando y arrastrando otros componentes de la
disolución por adsorción o coagulación.

Como carecen de cromóforos su análisis no puede hacerse por

espectrofotometría o fluorescencia sin derivatización (2,4,6-tripyridyl-
s-triazine (TPTZ) method (Myklestad et al., 1997)).

Presentan variadas cargas superficiales dificultando su retención en

columna.
Los polisacáridos son hidrolizados en ácido antes del análisis.
Análisis por HPLC requiere la desalinización previa de la muestra.
EXTRACCION: tanto de estructurales como de almacenamiento mediante hidrólisis ácida
(HCl, H2SO4, TFA) a alta temperatura (100-120ºC) durante horas (1-22).
A veces tratamiento de dos pasos (ácidificación fuerte seguido de dilución más
calentamiento). Algunos monosacáridos quedan destruidos

Una vez hidrolizadas las muestras se

retiran las sales por adsorción en resinas
de intercambio aniónico previamente
depuradas con extracción por Soxhlet.
La extracción se realiza o con un flujo de
N2 (para GC) o con una disolución
alcalina.
 Análisis de carbohidratos
espectrofotometría
2 métodos principales:

PSA: deshidratación de azúcares en presencia de H2SO4 (concentrado) para dar furfurales (a partir de
pentosas) y hidroxifurfurales (a partir de hexosas) que se condensan con fenol y absorben a 480-490
nm.

TPTZ: se añade a la muestra una mezcla de FeCl3/AcNa/ac cítrico y se calienta, luego se añade TPTZ
(2,4,6-tripiridil-s-triazina) en ac acético y la muestra absorbe a 595 nm.
Análisis de carbohidratos cromatografía
El material de inyección requiere de limpieza previa con acetonitrilo, metanol y agua
ultrapura y secado en horno a 60ºC

HPAEC-PAD: HP Anion Exchange Chromatography con detección por amperometría

de pulso en electrodo de oro. Los azúcares son retenidos en columna de intercambio
iónico e ionizados al completo usando una base fuerte como eluente. Medición sin
derivatización

GC-FID y GC-MS: derivatización necesaria. Muchos métodos diferentes.

Ejemplo: la adición de una disolución NH4OH/NaBH4 y posteriormente de 1-metil
imidazol y diclorometano provoca la reducción del grupo carbonilo del azúcar
produciendo alcoholes (alditol acetatos)
Con PAD (Pulsed Amperometric Detection)

Schematic diagram showing (a) inline dialysis cell (b) coupling to the sample changer
and IC unit, and (c) spiral-flow dialysis cell.
 Cromatografía de gases con FID
(GC-FID ) o Espectrometría de masas (GC-MS)
 Análisis de aminoácidos en agua
Son los constituyentes de la proteínas y son liberados al medio por exudación, durante el consumo
de fitoplancton por zooplancton (grazing), lisis celular y producción de exoenzimas por bacterias. La
reducción de su concentración relativa a DOC es indicativa de degradación bacteriana (microbial
loop) ya que son incorporados para formar parte de su pared celular

Los aminoácidos tienen isómeros L- y D- pero en bacterias sólo aparecen los D-.
Un 40 de D-alanina de la analina total indica una alta remineralización.
Análisis de aminoácidos en agua
Se distingue entre FAA (amnioácidos disueltos) y THAA (total hidrolizable) dependiendo de si los los aa
combinados han sido separados por hidrólisis (HCl en fase vapor).

El análisis rutinario incluye el análisis de aminas totales (un proxi a la concentración total de aa).
Necesario retirar sales y otros compuestos orgánicos, (difusión a través de membrana, intercambio
iónico o cromatografía)

Existen métodos cromatográficos para el análisis de componentes individuales con derivatización y

análisis por fluorimetría.

La derivatización puede ser quiral. Los aminoácidos tienen isómeros L- y D- pero los D- sólo aparecen
en bacterias. Un 40% de D-alanina de la analina total indica una alta remineralización.
Una mezcla de o-phthaldialdehyde (OPA) y N-isobutyryl-L-cysteine o N-isobutyryl-D-cysteine
hace que los enantiómeros se transformen en diastereoisómeros que son separados en una columna
C18 de fase reversa

A veces el análisis se acopla a un MS para obtener el radio isotópico de carbono y nitrógeno d13C y
d15N que da información extra sobre su origen (relación cadena trófica radio isotópico).

El tratamiento de muestras requiere el uso de guantes de nitrilo libres de polvo para evitar
contaminación
Determinación FAA totales espectrofotométricamente con ninhydrin

Ejemplo derivatización para estudio por fluorescencia

Contaminantes orgánicos persistentes (POP)
Aunque de origen antropogénico se han convertido en un problema
ambiental global incluso en zonas remotas.
Incluyen variados compuestos: PAHs, PCBs, PBDEs,
Ps (HCH, DDT), etc.
Efectos cancerígenos y de disrupción de sistemas hormonales. Son muy
refractarios y se acumulan en fases sólidas por hidrofobicidad.
Se acumulan en lipidos intracelulares y suponen un grave peligro a los
ecosistemas por bioacumulación y biomagnificación a niveles tróficos más
altos.
Niveles altísimos encontrados
En huevos de aves que se ali-
mentan de peces o en leche
materna de humanos
contaminados
Destilación global
 Contaminantes orgánicos persistentes (POP)
• Durante el muestreo debe haber un cuidado extremo con la contaminación causada por
el contacto con el aire circundante (barcos, zonas industriales, urbanas, etc) y se suele
requerir de laboratorios “límpios” para ello. Bajas concentraciones requieren de muestras
en el orden de 5-2000 litros) que a veces se consiguen por bombeo a través de la columna
adsorbente.
• El material debe ser de cristal y bien lavado con detergente o acetona y despues metanol
durante horas.
• Amberlite XAD-2 es la columna más comunmente usada (copolímero cross-linked
específico para compuestos hidrofóbicos). A veces se instalan columnas en serie para
aumentar la eficiencia de la extracción. Columnas de baja calidad necesitan ser
condicionadas (agitación + Soxhlet). La elución es con metanol que puede ser
concentrado con hexano en rotovapor
• El filtrado previo a columna es esencial para evitar que particulas la colmaten. GF o PTFE
filtros pueden ser utilizados si condicionados como explicado antes para el muestreo de
DOM.
• Extracción líquido-líquido con n-hexano ultrapuro
• Cromatografía de adsorción puede usarse para separar
familias de analitos y que sus señales no puedan interferir
durante el análisis por MS (Al2O3, silica gel, florisil)
• El extracto del rotovapor es finalmente evaporado con N2
Hasta un volumen final de 50-500 ml (concentration factor
105-106)
 Contaminantes orgánicos persistentes (POP)

• GC-IT-MS/MS: permite multiple reaction monitoring (MRM). Tres pasos

1. Los eluentes del GC entran al MS y allí mediante inonización electrónica (EI) se forman
si se desea fragmentos de los analitos
2. Los iones seleccionados (correspondientes a POP) en función del tiempo conocido de
elución son atrapados mediante un voltaje oscilante a una frecuencia de radio (RF)
haciendo que sigan trayectorias estables en el colector del MS y otros iones queden
descartados (eliminación interferencias)
3. Mediante disociación por colisión con gas inerte inducida por voltage (CID) las
moléculas y sus fragmentos se disocian en fragmentos menores para confirmar la
identidad del analito
Sustancias Húmicas (HS)
Definición: aquella materia orgánica retenida en una columna con resina XAD-8 (retención fracción
hidrofóbica) con elución posterior en medio alcalino (NaOH). Se distinguen tres fracciones:

• Acidos húmicos: precipitan a pH~1, de mayor peso molecular y más refractarios

• Acidos fúlvicos: solubles a pH 1. Menor peso molecular
• Huminos: sustancia húmica no soluble en agua

HS se encuentran en todas las aguas y suelos del planeta en que haya materia orgánica y consisten
predominantemente de polifenoles y ácidos benzoicos/carboxílicos producto de la degradación de tejidos vegetales
(p.e. lignina).
Muy refractarios (vidas medias de siglos a milenios) y constituyen a menudo el mayor componente de DOM en aguas
naturales.
Imposibles de caracterizar con las técnicas actuales debido a su enorme heterogeneidad.
Complejan metales e intervienen en la
coagulación de materia orgánica en
estuarios que restringe el input de
DOM y metales fluviales al océano.
Murphy etal 08. Clasificación de señales en EEM espectros
según la naturaleza de la materia orgánica
Para muestreos amplios resulta imposible realizar la extracción que supone la
definición de HS debido a la cantidad de material, mano de obra y tiempo que se
necesitaría.
Se buscan proxies que puedan dar una concentración de húmico en función de
sus propiedades físicoquímicas.
El más común es la fluorescencia
Se están desarrollando recientemente métodos electroquímicos para medir HS
facilitado por su adsorción sobre el electrodo debido a su hidrofobicidad. El HS
se compleja primero a un metal cuyo complejo se acumula por adsorción en un
electrodo y después se reduce por voltametría catódica .
Laglera et al, ACA, 2007 Quentel et al, Electroanalysis, 2001
Húmicos y floculación
 Eficiencia fotosintética. Fv/Fm
Fe in the photosystem (PS)
Cuando la luz incide, los pigmentos del PSI al recoger el electrón emiten una fluorescencia que
decrece lentamente (efecto Kautsky). Los centros de recogida de radiación se cierran cuando no
pueden recoger más electrones (porque estos no han pasado todavía al siguiente acceptor de
electrones de la cadena fotosintética). Una alta proporción de sitios cerrados decrece la eficiencia
fotosintética.
 <- Ferredoxin

PS I

PS II

Hasta 20 átomos de hierro se ven implicados en la fijación de un sólo electrón desde la

excitación fotónica hasta la formación de ATP
La adición de hierro libera a la célula de una limitación que se traduce en un inmediato
incremento de Fv/Fm (este cambio no se observa en un incremento de la división
celular hasta varios días después)
Eficiencia fotosintética Fv/Fm
Se mide con un FRRF (Fast Repetition Rate Fluorometer) que recoge:
F0: la fluorescencia recogida en oscuridad. Aquí todos los centros con pigmentos están
abiertos preparados para recibir luz. Este estado depende del estado de salud de la planta,
de lo preparados que estén sus pigmentos para recibir radiación
Fm: el equipo emite un corto flash de luz que satura y cierra (reduce) los puntos de reacción
del fotosistema II (PSII). Máxima fluorescencia posible. Si hay un deficit de hierro, algunos
puntos de reacción del fotosistema no estarán preparados para recibir luz y reducirse y Fm
será menor.

Fv=Fm- F0 : fluorescencia variable.

Fv/Fm: ratio fluorescencia/máxima fluorescencia. Da una idea de cuantos centros receptores

de fotones del PSII están abiertos
 Problema con mediciones en
aguas naturales durante el día

Fv/Fm lo largo de un transecto de una

fertilización
Hay muchos otros parámetros de interés
ambiental
Análisis de lípidos: relaciones tróficas

Vitaminas: limitantes en algunas zonas del océano (cobalamina)

Composición isotópica de DOM
Materia orgánica en sistemas acuáticos es un conjunto de sustancias muy activo.
Transformaciones más flujos a través de interfases.
La incorporación de CO2 como carbono orgánico o como HCO3- o la disolución de
CO2 atmosférico cambia la proporción de isótopos. Los radios isotópicos dan gran
información sobre los ciclos biogeoquímicos de los elementos clave.
Se calculan en tres fracciones: DOM, COM, POC. Datos de C son abundates pero no
así los de N, S, H ó O. P sólo tiene un isótopo estable 31P
 Composición isotópica - dX
Se define en relación a un estandard. Unidades ‰. R siendo la abundancia relativa
del isótopo pesado con respecto a la del ligero

dX es el resultado de procesos cinéticos, físicos y de equilibrio. Isótopos más pesados se

encuentran a menor temperatura o en fases más condensadas.
En procesos biogeoquímicos los isótopos más ligeros reaccionan con más facilidad:
fitoplancton incorpora preferentemente 12C y 14N durante el crecimiento.
Como las fuentes de carbono tienen distintas d13C la medida de este parámetro en DOC
puede dar idea de su origen.
Grandes variaciones en d13C desde -35 a -5‰ (teóricamente -80 a 0)
Carbono PCR: photosynthetic carbon reduction; PEPC
(phophoenol pyruvate carboxylase)

Plantas C3 y C4 muy diferentes d13C debido a la

fuerte discriminación de la enzima RUBISCO
(fijación de carbono; mucho más abundante
en C3) de los isótopos pesados
Las plantas marinas usan como fuente de carbono
HCO3- (0‰) en vez de CO2 de las terrestres (-7‰)

La estructura trófica también juega un papel

importante
N: en la atmósfera d15N es 0‰. C cambia muy poco durante la transferencia
de la materia en la cadena trófica, en cambio el N cambia sustancialmente
especialmente en ambientes marinos. Apenas acaba de comenzar a utilizarse
para el estudio de problemas como la nitrificación

H y O: El agua del océano posee radios isotópicos de 0‰ tanto para H como

O. Cuando se forma vapor de agua se hace preferentemente con los isótopos
más ligeros haciéndo que el agua de las nubes sea isotópicamente más ligera.
A medida que la nube viaja, los isótopos más pesados condensan primero y el
agua de lluvia es más pesada isotópicamente que el vapor que permanece en
la nube.
Nitrógeno