Direccionamiento (targeting)

de proteínas a distintos
compartimentos de la célula
eucariota (repaso clase 1)

1
 Citosol
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Núcleo
(destino: secreción)
Cloroplastos Peroxisomas

Mitocondrias

Retículo endoplasmático

Golgi

Vesículas
Endosomas tardíos secretorias

Lisosomas

Endosomas tempranos

Exterior celular
 SRP (Signal Recognition Particle)
Unión de la SRP al péptido señal
causa que se pause la traducción
El péptido señal
del polipéptido
1
naciente
Reconocimiento

Direccionamiento La traducción
Reciclado 5 2 continúa y
comienza la
traslocación
Liberación
4 3 Citosol

Lumen del ER
El Receptor de la SRP Translocador de
en la membrana del proteínas
ER (“el translocón”)

3
Estructura del translocón (“el complejo Sec61”)

Cerrado Abierto

Bisagra
subunidad
gamma

Cierre Tapón Tapón

desplazado
Péptido
señal
Bicapa lipídica Polipéptido
naciente

4
N- -C Citosol

N- TM -C Secreción

C
Citosol
N- TM TM -C
Lumen ER
N N
Citosol
N- + TM -C
Lumen ER
C C
Citosol
N- TM + -C
Lumen ER

N
5
 Glicosilación
Potencial?

N- NXS -C Citosol no

N- TM NXS -C Secreción sí

C
Citosol
N- TM TM NXS -C no
Lumen ER
N N
Citosol
N- + TM NXS -C sí
Lumen ER
C C
Citosol
N- TM + NXS -C no
Lumen ER

N
6
 C
Citosol

N- TM TM TM TM -C
Lumen ER
N

N
Citosol
N- + TM TM TM -C
Lumen ER
C

C
Citosol
N- TM + TM TM -C
Lumen ER
N
7
Ribosoma SRP

Peptido señal

Jomaa et al, 2021 Cell Reports

Direccionamiento (targeting)
de proteínas a distintos
compartimentos de la célula
eucariota (clase 2)

9
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL

1
3 2

APARATO DE GOLGI

10
Alitalia

Foto: Alberto Kornblihtt

11
12
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Tránsito vesicular
Golgi Golgi Golgi
RER Endosoma
cis medio trans tardío
Endosoma
temprano

Vesícula
secretoria

Tránsito anterógrado

13
Tránsito retrógrado
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Destino: membrana del RER

Tránsito anterógrado

Tránsito retrógrado

pII
Co

14
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Destino: lumen del RER

Tránsito anterógrado

Tránsito retrógrado

II
Cop

15
Direccionamiento (targeting) de proteínas a
distintos destinos en la célula eucariota
Sin translocación de membrana ni pasaje
de compuertas
1. Citosol

Con translocación de membrana

Translocación co-traduccional
2. Secreción (exterior) N- afuera, C- adentro
C- afuera, nada adentro
3. Membrana plasmática
C- afuera, N- adentro
4. Membrana del R.E.R Multipaso
5. Lumen del R.E.R Ancladas por la cola
6. Lisosoma
Translocación post-traduccional
7. Mitocondria Matrix mitocondrial
Espacio intermembrana
8. Cloroplasto

Con pasaje de “compuertas" (gated transport)

9. Núcleo
10. Peroxisomas 16
 TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Destino: lumen LISOSOMAS

Christian De Duve: premio Nobel 1974

Bomba de protones / cloroquina
17
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL LISOSOMAS PRIMARIOS Y
Lisosoma
primario
SECUNDARIOS

Lisosoma
secundario
(fagolisosoma)

AUTOFAGIA

18
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
LLENADO DE LISOSOMAS
Etiqueta Manosa 6-fosfato = Man 6-P

Man6P GOLGI

Lisosoma 1ario

19
 TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
LLENADO DE LISOSOMAS: vías endógena y exógena

Man6P GOLGI

vesícula de
secreción Lisosoma 1ario

Exterior

20
 TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Enfermedad de las células I: mutación que impide adicionar Man 6-P a las proteínas lisosomales

GOLGI

Lisosoma 1ario Vacío!

Las podemos “curar"

agregando:
Medio condicionado de células
en cultivo SANAS
Exterior

21
 TRANSLOCACIÓN CO- PROTEÍNA
(ENZIMA)
TRADUCCIONAL LISOSOMAL

gregado de Man 6-P a enzimas

lisosomales

Reconoce una particular conformación común

a todas las enzimas lisosomales (parche
conformacional)

Al lisosoma

Az-P-P-N = azúcar – fosfato – fosfato - Uridina = UDP-GlnNAc (N-Acetil-Glucosamina)

22
 TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL

Condiciones para que una proteína sea dirigida al lumen del lisosoma

1. Péptido señal "start transfer" y sitio de reconocimiento para la peptidasa de la señal.

2. Translocación co-traduccional

3. Asp-X-Ser o Asp-X-Thr en lado luminal

4. Glicosilación en lumen de RER

5. Parche confomacional

6. Agregado de Man 6-P en Golgi trans

23
Direccionamiento (targeting) de proteínas a
distintos destinos en la célula eucariota
Sin translocación de membrana ni pasaje
de compuertas
1. Citosol

Con translocación de membrana

Translocación co-traduccional
2. Secreción (exterior) N- afuera, C- adentro
C- afuera, nada adentro
3. Membrana plasmática
C- afuera, N- adentro
4. Membrana del R.E.R Multipaso
5. Lumen del R.E.R Ancladas por la cola
6. Lisosoma
Translocación post-traduccional
7. Mitocondria Matrix mitocondrial
Espacio intermembrana
8. Cloroplasto

Con pasaje de “compuertas" (gated transport)

9. Núcleo
10. Peroxisomas 24
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Fusión de vesículas en tránsito interno

25
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL

Fusión de vesículas en tránsito interno

SNAP 2
t-SNARE
(sintaxina)
v-SNARE
(sinaptobrevina)

LUMEN O EXTERIOR

26
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Fusión de vesículas en tránsito interno

27
28
 Direccionamiento POST-TRADUCCIONAL

La proteína termina de sintetizarse en los ribosomas libres del citosol y luego

atraviesa la membrana del compartimiento al cual se dirige. En algunos destinos
la atraviesa plegada mientras que en otros, desplegada.

Destinos post-traduccionales:

MITOCONDRIAS (translocación)
CLOROPLASTOS (translocación) (no lo vemos)

NÚCLEO (pasaje por compuertas)

PEROXISOMAS (pasaje por compuertas)

29
 TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL

Mitocondrias
Matriz Membrana Membrana
mitocondrial externa interna
(crestas)

Espacio
intermembrana

30
 TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL
Destino: matriz mitocondrial

Hsp70
citoplásmica

MTS

MTS (Pépido de tránsito a mitocondria): señal anfipática rica en

aminoácidos hidrofóbicos y en aminoácidos básicos (carga positiva) 31
 MTS es una etiqueta anfipática
(ejemplo: MTS de la citocromo oxidasa amino ácidos 1 a 18)

MLSLRQSIRFFKPATRTL Hidrofóbico
Hidrofílico

1 1

18 18

Vista “cintas" Vista “superficie de hidrofobicidad”

 TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL
Destino: espacio intermembrana
A
DOS PÉPTIDOS
CITOSOL
TOM
SEÑAL PARA
MITOCONDRIAS
EN TANDEM
ESPACIO
INTERMEMBRANA
Péptido de anclaje a
membrana interna
TIM
MATRIZ MITOCONDRIAL (hidrofóbico)

B C
N

CITOSOL TOM
Péptido de tránsito
ESPACIO a matriz
INTERMEMBRANA (anfipático)

TIM

MATRIZ MITOCONDRIAL

33
Direccionamiento (targeting) de proteínas a
distintos destinos en la célula eucariota
Sin translocación de membrana ni pasaje
de compuertas
1. Citosol

Con translocación de membrana

Translocación co-traduccional
2. Secreción (exterior) N- afuera, C- adentro
C- afuera, nada adentro
3. Membrana plasmática
C- afuera, N- adentro
4. Membrana del R.E.R Multipaso
5. Lumen del R.E.R Ancladas por la cola
6. Lisosoma
Translocación post-traduccional
7. Mitocondria Matrix mitocondrial
Espacio intermembrana
8. Cloroplasto no

Con pasaje de “compuertas" (gated transport)

9. Núcleo
10. Peroxisomas 34
35
Randy Schekman
1987 Clonado del translocón —> Sec61
 Cómo clonar los genes de las proteínas del aparato de traslocación?
(identi car cuáles son los genes)
Vive sin histidina
GEN HIS4 Localización de la enzima pero en presencia de
Aproximación histidinol?

genética N- HIS4 -C Citosol sí

Translocon
TranslocónWT
WT
Diseñar una estrategia
que permita
SELECCIONAR
Peptido señal
mutantes donde la
traslocación sea N- HIS4 -C
Secreción no
defectuosa.
(no se la puede anular
por completo porque Translocón WT
se trata de un proceso
esencial para toda
célula) Peptido señal
N- HIS4 -C Citosol
+ sí
Secreción
Translocon mutante
fi
 Mutagénesis La ADN polimerasa pone T
en frente de etil-Guanina
mutagénesis
(EMS)
Guanina + EMS —> etil-Guanina
Etilmetilsulfóxido
pares G:C mutan a A:T
cultivo WT cultivo mutagenizado

Clave: Usar levaduras haploides

Levadura

Millones de levaduras, cada

una con 1 a 3 mutaciones ( )
al azar en alguna parte de su
genoma

La esperanza es que
alguna mutación caiga en
el gen que quiero
2 mutaciones
encontrar
 Mutagénesis
Control de que las
levaduras estaban vivas
mutagénesis
(EMS) + histidina

Etilmetilsulfóxido
pares G:C mutan a A:T
cultivo WT cultivo mutagenizado

Clave: Usar levaduras haploides - histidina (c/ histidinol)

Esta colonia tiene una

mutación que hace que
His4 se transloque mal
sec61
 Clonado del gen mutado por “complementación"
- histidina (c/ histidinol) Esta es la colonia que
tiene el plásmido con
Esta colonia tiene una SEC61 normal (WT)
mutación que hace que
His4 se transloque mal
Transformo con
library genómica + histidina
Cada colonia tiene un
fragmento genómico
distinto clonado en un + histidina
Replica
plásmido
plating
(copia)
SEC61 - histidina (c/ histidinol)

Alguna colonia va a tener justo el del gen mutado

42