Titulo Lactobacillus con
para la PRODUCCIÓN DE
potencial probiótico
aislado del pulque
Propiedades del Lactobacillus tiene la
Microorganismo capacidad que tienen las
bacterias lácticas de
fermentar diversas
fuentes de carbono
simples y producir ácido
láctico. Cuando las
bacterias lácticas llegan a
los intestinos, empiezan a
producir ácido láctico, el
cual acidifica la región
intestinal haciendo que la
flora patógena disminuya.
Interés biotecnológico Probiótico
Objetivo de uso del La cepa nativa de
Microorganismo Lactobacillus permite la
posibilidad de desarrollo
de productos de consumo
con probióticos que sean
C.Z.
Producción de biomasa Pseudomonas sp.
de Microbacterium sp.
(BSC3) para la generación
de materia orgánica
humificada (cepa
bacteriana solubilizadora
de carbón)
Microbacterium sp. Tiene
capacidad de producir
Sustancias Húmicas
mediante la solubilización
de carbones de bajo rango.
pertenece al grupo de las
actinobacterias y ha sido
descrito como un
organismo endófito o
asociado a la rizosfera de
plantas en zonas áridas y
salinas.
Biofertilizante
Desarrollar un inoculante
que contemple el uso de
carbón tipo lignito
inoculado con BSC3, para
usarlo como fuente de
materia orgánica
producción de PROTEASAS
biosurfactantes EXTRACELULARES POR
Pseudomonas sp. M211
EN FERMENTACIÓN
SUMERGIDA
cepa de Pseudomonas sp. En cepas de Pseudomonas
aislada de un sitio se han descrito proteasas
crónicamente alcalinas termoestables
contaminado con con amplio rango de
hidrocarburos en la ciudad sustratos, tolerantes a
de Campana, provincia de solventes orgánicos, y con
Buenos Aires. Esta altos valores de actividad
bacteria posee un 99,4% en amplios rangos de pH y
de identidad respecto de temperatura
Pseudomonas
granadensis. Diversas
bacterias de este género
han sido identificadas en
bibliografía como
productoras de
biosurfactantes.
Biorremediación Producción de proteasas
Los biosurfactantes es el Las proteasas,
de mejorar el proceso de principalmente las de
atenuación natural e origen microbiano,
intensificar la constituyen el grupo más
biodegradación de importante de enzimas
Hidrocarburos. comerciales, ya que tienen
 típicos y autóctonos de la humificada en suelos gran variedad de
cultura mexicana degradados por la minería aplicaciones en las
industrias: alimentaria,
farmacéutica, cosmética,
médica, peletera, textil,
entre otras. Además, estas
enzimas son usadas en la
formulación de
detergentes y en el
manejo de residuos y
procesos de
biorremediación.
Objetivo Formular y optimizar un producción de biomasa de Conocer la temperatura y Medio de cultivo para la
medio de cultivo con BSC3. concentración de glicerol producción de proteasas
materia prima de bajo óptima en el medio de extracelulares.
costo que permita el buen cultivo utilizado para la
crecimiento de la cepa de producción de
Lactobacillus obtenida del biosurfactantes. donde
pulque concentración de glicerol y
temperatura fueron los
factores y concentración
de biosurfactante la
respuesta
Parámetros evaluados  Influencia de la  Determinación del  Estimación de la  Ensayo de la actividad
temperatura Se efecto del pH. Se producción de proteolítica se
evaluaron tres evaluaron 3 valores de biomasa. Se estimó la determinó según la
temperaturas: 23°C, pH [5,6 (inicial del producción de metodología descrita
29°C y 37°C. La medio de cultivo); 6,0 biomasa del por Anson con algunas
biomasa se determinó y 6,5], el pH fue microorganismo a modificaciones
por el peso seco modificado con HCl partir del peso seco usando caseína como
celular. (0,1N) o NaOH (0,1N) sustrato, La reacción
según fuera necesario. enzimática consistió

C.Z.
  Influencia del tamaño Estos valores de pH  Estimación de la caseína, en buffer Tris-
de inóculo. Se fueron seleccionados producción de HCl pH 9 a la cual se le
evaluaron dos según los biosurfactantes añadió del
concentraciones de requerimientos o Medición directa sobrenadante libre de
inoculación: 2 y 5% p/v reportados. de la tensión células de cada medio
 Efecto de diferentes  Determinación de la superficial (ST) de cultivo. La mezcla
formulaciones Se producción de con el método del se incubó por 10 min a
evaluaron seis biomasa. se anillo de Du Nouy, 40 °C, luego se
formulaciones determinó la con un adicionó ácido
diseñadas a partir de producción de tensiómetro digita tricloroacético (ATC) al
materia prima de bajo biomasa por peso  Optimización del 10 y se centrifugó; se
costo seco. medio de cultivo para tomó del
 Optimización del  Determinación de la producción de sobrenadante y se
nuevo medio de parámetros cinéticos biosurfactantes mezcló con NaOH 1,5
cultivo o Velocidad utilizando una M y del reactivo de
 pH y determinación específica de metodología de Folin & Ciocalteu 0,5
de azúcares totales en crecimiento [µ] superficie de M. La reacción se
el medio de cultivo. se o tiempo de respuesta.Los valores incubó a 40 °C por 30
hizo por el método de duplicación [Td] óptimos fueron min y se centrifugó a
antrona, El pH fue o Producción final obtenidos resolviendo 5000 rpm por 5 min, La
medido en los mismos de biomasa la ecuación de concentración de
tiempos en que se Mediante cálculos regresión y analizando caseína digerida en el
realizó la matemáticos. el gráfico de superficie sobrenadante fue
determinación de  Caracterización de respuesta. Se determinada a 660 nm
azúcares totales, por elemental del medio adoptó un diseño mediante una curva de
medio de un de cultivo adaptó la central compuesto calibración elaborada
potenciómetro técnica analítica ASTM (CCD) para determinar usando L- tirosina
manual. D5373 para la un modelo empírico como sustrato.
 Determinación del determinación del efecto y las  Determinación de la
rendimiento Biomasa- instrumental de interacciones de dos concentración de
sustrato, velocidad de carbono, hidrógeno y factores (variables) en proteínas Se utilizó el
crecimiento y tiempo nitrógeno . la producción de método de Bradford

C.Z.
 de generación.
Cálculos matemáticos.
Todos los estudios
cinéticos fueron realizados
a 29°C, pH inicial de 6.4, en
microaerobiosis y sin
agitación, con un inóculo
de 5% p/v
Medios utilizados  caldo modificado MRS
para la preparación
del inoculo.
biosurfactantes siguiendo el protocolo
(respuesta). Se utilizó para microensayo,
el software estadístico  Estudio de un factor a
Minitab 17® para el la vez. La selección de
diseño de los los factores que
experimentos. ejercen un efecto
positivo, de manera
independiente
 Plackett-Burman. se
seleccionaron aquellos
que, en el estudio de
un factor a la vez,
ejercieron un efecto
positivo en la
producción. Se
analizaron 10 factores,
Se realizaron 33
experimentos con una
réplica en dos bloques
y el orden de los
experimentos se hizo
de manera aleatoria.
Para el análisis se
empleó el programa
Minitab versión 17
 agar nutritivo para la  medio mínimo salino  Primero en placas con
preparación del (MSM) suplementado agar triptosa de soya
inoculo con glicerol.  en placas con agar
 cultivo de lisogenia nutritivo
(LB, medio Luria- suplementado con
Bertani) Para realizar gelatina, caseína o
los pre-cultivos de skim milk (1 % w/v)

C.Z.
 activación para los
ensayos.
Medios evaluados  leche entera  melaza de caña  medio mínimo salino Fuentes de carbono:
ultrapasteurizada  lactosuero (MSM) suplementado glicerol, maltosa,
comercial con  cabecilla de arroz con glicerol. galactosa o glucosa
concentración final  medio con carbones nitrógeno: peptona,
7% p/v lactosa y de bajo rango (CBR) y extracto de carne, extracto
concentración 10%, sin inóculo como de levadura o NH4 Cl
50% y 100% p/v sales control las de iones: CaCl2 o KCl.
del medio de cultivo
MRS
 suero de leche con
concentración final
7% p/v lactosa y
concentración 10%,
50% y 100% p/v sales
del medio de cultivo
MRS
 Agua peptonada
como control
negativo,
 Medio de cultivo MRS
(DeMan, Rogosa y
Sharpe) como control
positivo,
Método estadístico Método no estadístico: Un Diseños de superficie de diseño central compuesto diseño experimental
factor a la vez.modifica respuesta Box-Behnken: (CCD) a través de una Plackett-Burman.
una variable a la vez para permiten observar el metodología de superficie permiten determinar los
visualizar el efecto de resultado de las de respuesta. permiten componentes del medio
cada variable en la interacciones entre los modelar y analizar de cultivo que influyen
respuesta factores, al tiempo que situaciones en las que una significativamente en la
reduce el número de variable (respuesta) se producción. A su vez, el

C.Z.
 combinaciones en el
diseño.
análisis ANOVA verifica
los errores y la
significancia de cada
parámetro.
Hallazgos Se observó el mayor Las concentraciones
crecimiento del óptimas para la obtención
lactobacilo en el medio de de biomasa de BSC3
leche con sales del medio fueron: 6% melaza, 2,5%
MRS al 10% p/v, pH 6.4, lactosuero más un
7% p/v lactosa, 29°C a las contenido mínimo de
18 h de cultivo. sales, con un pH de 6,5.
la temperatura ideal para el medio permitió un
realizar los demás incremento en la
estudios cinéticos es de velocidad de crecimiento y
29°C, aunque no es un menor tiempo de
diferente duplicación de BSC3.
significativamente con La interacción de melaza y
respecto al estudio lactosuero ejerce un
cinético realizado a 37°C, efecto positivo y valores, la producción
se observa en el estudio significativo sobre la
cinético realizado a 37°C producción de biomasa ,
C.Z.
encuentra influenciada diseño PB analiza la
por otras (factores), interacción entre los
permite establecer cuáles factores estudiados a
son los valores de los diferentes niveles. Se
factores que maximizan optimizó su producción
dicha respuesta. mediante el estudio de un
Se realizó un análisis de factor a la vez.
regresión múltiple
utilizando una
metodología de superficie
de respuesta (RSM)
análisis de varianza
(ANOVA) verifica los
errores y la significancia de
cada parámetro.
 una concentración de  La cepa fue
7,6%v/v de glicerol y identificada mediante
una temperatura de el análisis de la
25,9°C harían máxima secuencia de los genes
la respuesta. ribosómicos 16S,
 La máxima producción presentando un 99 %
del biosurfactante se de similitud con
obtiene a medida que especies del género
tanto la temperatura Pseudomonas. Esta
como la concentración bacteria presentó
de sustrato se acercan halos de hidrólisis de
a sus valores medios, y 23,0; 22,2 y 22,3 mm
que, si se aumentan o en agares
disminuyen estos suplementados con
gelatina, caseína y
del tensioactivo decae skim milk. Los
con cierta rapidez. diámetros de los halos
 una fase de adaptación Sin embargo, la melaza por  Hay una fuerte de hidrólisis de
del cultivo demasiado sí misma no influye en la interacción entre las Pseudomonas sp
extensa (10 horas) producción de biomasa, y variables, esto hace M211 fueron
mientras que en el el lactosuero por sí mismo que no sea posible superiores a los
estudios cinético realizado no influye positivamente predecir el reportados
a 29°C el tiempo de en el crecimiento del comportamiento de la  esta cepa bacteriana
adaptación del cultivo fue microorganismo. las producción del fue seleccionada para
corto (2 horas) concentraciones del biosurfactante la producción de
La inoculación al 5% p/v extracto acuoso de estudiando el cambio proteasas en
se reduce el tiempo de la cabecilla de arroz no de una de las variables fermentación
fase de latencia y provocan efectos positivos por vez, sino que sumergida.
logarítmica, llegando al ni significativos sobre la deben evaluarse  La influencia de los
estado estacionario a las 8 producción de biomasa de simultáneamente. factores en la
horas, mientras que en los BSC3.  Se ha aplico un producción de forma
estudios cinéticos al 2% el diagrama de Pareto método de diseño independiente
p/v de inóculo se llega a la permite inferir que en este factorial en el que se permite seleccionar
fase estacionaria a las 12 rango de concentraciones analizó la influencia de aquellos que ejercen
horas. (ningún factor influye la temperatura y la un efecto positivo
Todos los estudios individualmente sobre la concentración de  El glicerol fue la fuente
cinéticos en los que se producción de biomasa de glicerol en la de carbono más
utilizó la leche tuvieron BSC3, lo que contrasta con producción de eficiente para la
mayor concentración de el valor óptimo obtenido biosurfactantes en el producción de
biomasa que sus de biomasa. cultivo de una cepa de proteasas en
contrapartes con suero. la reducción de la Pseudomonas sp. Pseudomonas
Existe una relación producción de biomasa aislada de un sitio aeruginosa Pse. Con
directa entre la con la utilización de la crónicamente respecto a la glucosa,
acidificación del medio concentración más alta de contaminado, así por un lado, algunos
con respecto a la melaza (10%) saturación como la interacción de estudios indican que
disminución de de los mecanismos estos factores. disminuye la
concentración de enzimáticos y de producción de
sustrato. transporte de nutrientes al proteasas en
interior de la célula, Pseudomonas sp.

C.Z.
 Se observo un aumento
en la velocidad de
crecimiento especifico y
biomasa-rendimiento y
una disminución del
tiempo de generación
Es reportado que cuando
el pH es menor a 4.0 tiene
un efecto inhibitorio en el
crecimiento del género de
Lactobacillus por lo que la
fase de muerte se
presentó a las cuatro
horas cuando el cultivo
alcanzó un pH inferior a
4.0.
C.Z.
debido al exceso de debido a mecanismos
nutrientes en el medio. de represión
El factor más influyente catabólica.
para la producción de  Los microorganismos
biomasa de BSC3 en el metabolizan las
rango de concentraciones fuentes de nitrógeno
de sustratos 0 – 6% fue la para obtener
melaza aminoácidos y
las combinaciones de proteínas. En este
melaza - extracto acuoso sentido,se ha descrito
de cabecilla de arroz, que las de naturaleza
lactosuero - extracto orgánica son más
acuoso de cabecilla de efectivas para la
arroz generan efectos producción de
negativos sobre el proteasas. su
crecimiento de BS utilización varía de
La mayor producción de cepa a cepa, e el
biomasa en el rango 0 – extracto de levadura,
6% la peptona y el
El factor menos extracto de carne
significativo para el diseño incrementan en 90 %,
0 – 6% fue el extracto 52 % y 10 % la
acuoso de cabecilla de producción de
arroz proteasas. otros
en el medio optimizado se autores reportaron a
produjo menor biomasa, la peptona como la
mayor velocidad fuente de nitrógeno
especifica de crecimiento y más eficiente para la
menor tiempo de producción de
duplicación en proteasas en
comparación con el medio Pseudomonas sp. y
control, esto se debe a que Bacillis subtilis, otros
 la saturación de nutrientes estudios indican que el
induce cambios osmóticos extracto de carne
que reducen la eficiencia disminuye en 60 % la
de algunos sistemas producción de
enzimáticos implicados en proteasas en
la absorción y Pseudomonas sp. NH4
transformación de Cl incrementó tan solo
azucares. en 7 % la producción
concentración de carbono de proteasas en
está influenciada por el Pseudomonas sp
contenido de lactosuero y M211.
la dilución de la que fue  Los iones metálicos
objeto durante la estimulan la
optimización de la producción óptima de
producción de biomasa de proteasas así, el CaCl2
BSC3, o, el incremento en y el KCl incrementaron
la concentración de N la producción en un 20
puede ser efecto del %, mientras que el
contenido de lactosuero. NaCl la disminuyó en 9
% y el CuS04 la inhibió.
 El análisis de varianza
(ANOVA) del diseño PB
presentado, indica
que el extracto de
levadura (x6 ) y la
peptona (x5 ) son los
factores que influyen
significativamente en
la producción de
proteasas por
Pseudomonas sp

C.Z.
  El diseño PB permitió
determinar que, de los
10 factores
seleccionados de los
21 y analizados, sólo
dos influyeron
significativamente en
la producción, estos
factores fueron el
extracto de levadura y
la peptona. Estos
resultados indican que
las fuentes de
nitrógeno influyen de
manera significativa
en la producción de
proteasas, lo cual
permitió incrementar
la producción y reducir
el número de factores
en estudio.
 El estudio de un factor
a la vez permitió
seleccionar las fuentes
de carbono, nitrógeno
y de iones que tienen
un efecto positivo en
la producción de
proteasas por
Pseudomonas sp.
M211.

C.Z.
Peso-seco: consiste en centrifugar la muestra, posteriormente, el paquete celular se filtra al vacío, se lava con agua destilada y se pone a secar a
45°C en estufa por 24 h o hasta que se registra peso constante.

C.Z.