Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
de Ecoisiología
Licenciatura en Manejo
Sustentable de la Zona Costera
Manual de Prácticas
de Ecoisiología
Licenciatura en Manejo Sustentable de la Zona Costera
Febrero 2012
Unidad Multidisciplinaria de Docencia
e Investigación, Facultad de Ciencias, UNAM
Adscripción:
1
Unidad Multidisciplianaria de Docencia e Investigación de Sisal, Fac. de Ciencias, UNAM. Puerto
de Abrigo de Sisal, Domicilio Conocido, Sisal, Hunucma, Yucatán, México. Tel: (988) 912-01-47.
Web:www.sisal.unam.mx
Índice
PRESENTACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Presentación
Práctica 1
Introducción
La salinidad es uno de los factores del medio más importante para los
organismos acuáticos, y en especial para los que habitan la zona costera,
pues con frecuencia están expuestos a importantes cambios de salinidad
provocados por la marea, las lluvias y la descarga de los ríos. Algunas espe-
cies marinas como los camarones, que habitan en las zonas inundadas de
la costa, están expuestos a aguas salobres, marinas, e incluso, hipersalinas.
Estos organismos tienen un ciclo de vida con fases estuarina y marina.
Las fases larvarias habitan aguas oceánicas en donde se desarrollan hasta
transformarse en postlarvas; en esta etapa, se orientan hacia los estuarios y
lagunas costeras en donde se reclutan como juveniles tempranos. En estos
sitios, donde la salinidad es altamente variable, algunas especies de cama-
rones tienen la capacidad de colonizar ambientes más diluidos que otras.
En un estudio llevado a cabo con tres especies de camarones peneidos,
Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus californiensis, y Litopenaeus vannamei
(Mair, 1980), se observó que L. vannamei es la especie que mejor tolera
los ambientes diluidos. En este mismo estudio, juveniles tempranos de L.
vannamei colocados en un gradiente experimental de salinidad, preirieron
salinidades entre 3 y 6, en comparación a los 32-35 ó 9-26 UPS (Unida-
des prácticas de salinidad) que preirieron L. stylirostris y F. californiensis,
respectivamente.
A través de una curva de tolerancia, como su nombre lo indica, se
pueden deinir los intervalos de un factor ambiental dentro de los cuales
los organismos desempeñan sus funciones biológicas: aquel donde se
permite la perpetuación de la especie se llama zona de tolerancia de
compatibilidad o biocinética. Así mismo, en la curva de tolerancia se
puede identiicar otra sección, zona de resistencia o letal, en donde los
mecanismos de compensación isiológica son puestos en marcha para
resistir a una condición especíica que afecte el desempeño biológico
general y en la cual el organismo puede incluso llegar a la muerte de los
organismos (Fig. 1) (Vernberg, 1983; Prosser, 1991).
10 Prácticas de Ecoisiología
Objetivo
Determinar la curva de tolerancia a la salinidad de juveniles del camarón
Litopenaeus vannamei.
Material y método
a) Materiales y equipos.
o Siete acuarios de 80 L
o Bombas de aireación
o Dos acuarios de 100 L
o Agua marina, agua dulce y sal de mar para preparar agua con
distintas salinidades
o Redes de mano de 10 x 10 cm
o Agua destilada
o Papel secante
o Refractómetro de mano
o Termómetro
o Potenciómetro
b) Procedimiento
Preparación de agua a distinta salinidad
Se acondicionarán 7 acuarios con las siguientes salinidades: 4, 10,
20, 30, 40, 50 y 60 ‰.
Se realizará la preparación mediante la siguiente fórmula:
donde:
a = volumen de agua de mar a emplear.
b = volumen del agua potable. A = salinidad mayor.
B = salinidad menor. D = salinidad deseada. d = volumen requerido.
Diseño experimental
Se colocarán los 20 camarones en cada uno de los acuarios preparados
y se registrará la hora en la cual se colocan. Durante las 96 horas que dura
el experimento los camarones no serán alimentados. Todos los días se
realizarán recambios de agua en proporción al 50 % del volumen total de
cada estanque.
Por las mañanas antes de realizar el recambio de agua, se registrara la
salinidad, temperatura y la concentración de oxígeno disuelto de cada
acuario. Para hacer el recambio es necesario tener agua de mar preparada
para cada salinidad, en el volumen suiciente para hacer estos recambios.
Se cuantiicará el número de animales muertos a las 0, 1, 2, 4, 6, 8, 20,
24, 28, 32, 48, 52, 56, y 96 horas.
Prácticas de Ecoisiología 13
Resultados
1. Elabore una tabla en la cual se registre el número de organismos
muertos a lo largo del ensayo. Siga el ejemplo de la Tabla 1.
Salinidades
No. Alumno Hora Horas 4‰ 10‰ 20‰ 30‰ 40‰ 50‰ 60‰
Día monitoreo
1 Todos 11:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0
1 María G/David Z 12:00 p.m. 1 0 0 0 0 0 0 0
1 Mariana M/Oscar M 02:00 p.m. 2 2 0 0 0 0 0 2
1 Dalia M/Erick B 04:00 p.m. 4 0 0 0 0 0 0 0
1 Jazmín Z/Eduardo P 06:00 p.m. 6 4 0 0 0 0 0 0
1 Isabel B/Miguel T 08:00 p.m. 8 3 0 0 0 0 0 0
2 Isabel B/Miguel T 08:00 a.m. 20 0 0 0 0 0 0 1
2 Alejandro S/Guillermo M 12:00 p.m. 24 1 0 0 0 0 0 0
2 María G/Alejandro H 04:00 p.m. 28 0 0 0 0 0 0 0
2 Zabi C/Paulina C 08:00 p.m. 32 0 0 0 0 0 0 0
3 Mariana M/Oscar M 12:00 p.m. 48 0 0 0 0 0 0 2
3 Jazmín Z/Isabel B 04:00 p.m. 52 0 0 0 0 0 0 1
3 Eduardo P/Miguel T 08:00 p.m. 56 0 0 0 0 0 0 1
4 Maria G/David Z 08:00 a.m. 68 0 0 0 0 0 0 0
4 Dalia M/Erick B 08:00 a.m. 96 0 0 0 0 0 0 0
Muertos 10 0 0 0 0 0 7
Sobrevivientes 0 10 10 10 10 10 3
aspectos particulares del ciclo de vida del género Litopenaeus spp y las
adaptaciones isiológicas que presentan ante cambios de salinidad.
Literatura recomendada.
Brito, R., Chimal, and Rosas C. 2000. Effect of salinity in survival, growth and
osmotic capacity of early juveniles of Farfantepenaeus brasiliensis (decapoda;
penaeidae). Journal Experimental Marine Biology and Ecology 244: 253-263.
Mair,J.M. 1980. Salinity and water type preferences of four species of postlarval
shrimp (Penaeus) from Wets México. Journal Experimental Marine Biology
and Ecology 45: 69-82.
Prosser, L. (edit) 1991. Enviromental and Metabolic Animal Physiology. 4a. edi-
ción. Wiley-Liss Inc. Pub. New York, U.S.A. 578 pp.
Rosas,C., López,N., Mercado,P., Martinez,E. 2001. Effect of salinity acclimation on
oxygen consumption of white shrimp Litopenaeus vannamei juveniles. Journal
Crustacean Biology 21: 279-292.
Staples,D.J., Heales,D.S. 1991. Temperature and salinity optima for growth and
survival of juveniles banana prawns Penaeus merguiensis. Journal Experimen-
tal Marine Biology. Ecology. 154: 251-274.
Vernberg F.J. (edit) 1975. Physiological adaptation to the environment: Procee-
dings of a symposium held at the 1973 meeting of the American institute of
Biological Sciencies. Intext Educational Publishers. New York, U.S.A. 650 pp.
Glosario
Gradiente.- Aumento o disminución gradual de un factor en un determinado
espacio o tiempo.
Larva.- Primera etapa del desarrollo metamórico de crustáceos decápodos.
pH.- Concentración de hidrogeniones que determina la medida de la acidez/alca-
linidad, va de ácido (pH 1) a alcalino (pH 14) medido en escala logarítmica.
Postlarva.- Estadio del ciclo biológico de crustáceos decápodos, alcanzado des-
pués de pasar por los diferentes estadios larvales.
Refractómetro.- Instrumento óptico que se utiliza para conocer el contenido de
sales de una solución.
Salinidad.- Contenido de sales disueltas en suelos o agua.
Zona de resistencia o letal.- Zona límite de la curva de tolerancias donde el
organismo despliega mecanismos isiológicos y energéticos para poder para
resistir a una condición que afecta el desempeño biológico general llegando
incluso a ocasionar su muerte.
Zona de tolerancia o compatibilidad biocinética.- Zona de la curva de toleran-
cias donde los organismos desempeñan sus funciones biológicas que garanti-
zan la perpetuación de la especie.
Práctica 2
Efecto del cambio de salinidad en la
regulación de la presión osmótica de
juveniles de camarón.
Prácticas de Ecoisiología 17
Práctica 2
Introducción
La salinidad es un factor ambiental que modula el estado isiológico de
los organismos acuáticos (Fry, 1947). En los ambientes costeros, como las
lagunas costeras donde viven juveniles de crustáceos, peces y moluscos,
la salinidad luctúa con frecuencia por ser una zona expuesta al ciclo de
mareas, de cambios estacionales (épocas de secas/lluvias), e inluencia de
ríos. Para lograr sobrevivir y crecer a su tasa máxima, algunos organismos,
como los camarones, están adaptados y presentan diversos mecanismos
isiológicos que les permiten compensar cambios bruscos de salinidad. Así
por ejemplo, una disminución en la salinidad signiica una entrada masiva
de agua como consecuencia de un proceso de difusión simple. Para evitar
una dilución extrema y, por lo tanto, un aumento en el volumen celular,
ocurren los siguientes procesos:
a) Reducción de la concentración de los principales iones osmoefec-
tores disueltos en el citoplasma (Na+, Cl+, K+).
b) Transporte de osmolitos de la célula hacia la sangre, y de ahí, a la
glándula digestiva.
c) Cambio en la permeabilidad de las células branquiales.
Durante los ajustes a la salinidad, la entrada y salida de osmolitos (io-
nes y aminoácidos) produce cambios en la concentración osmótica de la
sangre o hemolinfa, por lo cual los organismos tienen que realizar ajustes
para mantener el volumen celular. La capacidad para realizar los ajustes
de la concentración osmótica se puede medir utilizando un osmómetro, el
cual mide directamente la cantidad de moléculas osmóticamente activas
en un luido.
De acuerdo al patrón de comportamiento osmótico, en general existen
dos tipos de organismos: aquellos que son capaces de mantener la con-
centración osmótica del medio interno constante dentro de un intervalo
amplio de concentraciones osmóticas del medio externo (salinidad), los
osmorreguladores, y aquellos organismos que cambian la concentración
osmótica del medio interno en relación con el cambio en el medio exterior,
denominados osmoconformadores.
18 Prácticas de Ecoisiología
Objetivo
Conocer los mecanismos de compensación osmótica que presentan los
camarones de Litopenaeus vannamei ante diferentes cambios de salinidad
(brusco y paulatino).
Material y método
a) Materiales y equipos
o Cinco redes de mano de 10 x 10 cm
o 10 acuarios de 80 L
o Recipiente con agua de mar (hielera o tara)
o Contenedor hermético con agua congelada, (para ayudar a dismi-
nuir la temperatura)
o 120 Jeringas hipodérmicas desechables
o Solución anticoagulante para camarón (SIC-EDTA)
o Placa congelante
o Franela y papel desechable
o 70 cuadros (4 x 4cm) de Papel parailm
o Vaso de precipitado de 50 ml con agua destilada
o Papel secante suave
o Termómetro
o Refractómetro de mano
o Microosmómetro (Advanced Instruments) y accesorios
b) Procedimiento
Obtención de los organismos
Los camarones serán colectados del área de estanques exteriores de la
Unidad de la UNAM en Sisal. En cada tanque se colocarán 20 camarones,
por lo que se requieren capturar 200 juveniles de L. vannamei para asegu-
rar los 120 camarones que se requieren para la práctica.
Los camarones capturados, serán colocados en dos tanques de 100 L,
para su traslado al área experimental. Se registrarán los parámetros isi-
coquímicos (temperatura, salinidad, concentración de oxígeno disuelto y
pH) del estanque de donde se extraigan los organismos.
Preparación del agua a diferentes salinidades
Se prepararán diferentes salinidades mediante la siguiente fórmula:
donde:
a = volumen de agua de mar a emplear. b = volumen del agua potable.
Prácticas de Ecoisiología 19
A = salinidad mayor.
B = salinidad menor. D = salinidad deseada. d = volumen requerido.
Diseño experimental
Se acondicionarán ocho acuarios de 80 L con agua de mar a 36 ‰. Los
camarones se mantendrán a esta salinidad antes de ser expuestos a las
salinidades experimentales. Para el caso de los acuarios en los que se hará
el cambio paulatino, 60 camarones serán colocados en tres grupos de 20
animales por cada acuario y se les harán cambios diarios de salinidad del
orden de 10 partes por día (Tabla 1). En el caso de los tanques del cam-
bio brusco, también se colocarán 20 camarones por acuario y el cambio
brusco se realizará 24 horas previas al muestreo para que ambos grupos
de camarones estén expuestos a la salinidad inal (4, 36 y 60 ‰) el mismo
tiempo.
Tabla 1. Diseño experimental: ajuste de salinidad
Cambio SALINIDADES ‰
BRUSCO 6 36 66
Día 0 36 36 36
Día 1 36 36 36
Día 2 36 36 36
Día 3 6 36 66
PAULATINO 10 partes por día
Día 0 36 36 36
Día 1 26 36 46
Día 2 16 36 56
Día 3 6 36 66
Día 4 Muestreo
Muestreo
Manejo de los organismos
El manejo de los animales antes de la toma de muestras de hemolinfa
es un aspecto crucial en este tipo de análisis. La manipulación en sí misma
puede alterar de manera signiicativa los componentes sanguíneos o de la
hemolinfa, por lo cual, antes del muestreo de extracción de la sangre o
hemolinfa, los camarones se deben introducir en un baño frío (5 ºC por
debajo de la temperatura inicial) para disminuir su metabolismo.
Se preparará el recipiente (hielera o tara) en donde van a ser transpor-
tados los organismos al laboratorio, llenando el recipiente a la mitad del
volumen de agua en la que han sido mantenidos los camarones, y se re-
gistrará la temperatura. Posteriormente se introducirá un contenedor con
agua congelada manteniéndolo hasta que la temperatura haya disminuido
5 °C por debajo del registro inicial. En todo momento debe de evitarse
una manipulación excesiva de los camarones. Es importante considerar el
volumen del recipiente donde van a transportarse los animales al labora-
torio porque la densidad genera disminución de oxígeno, y por lo tanto,
estrés.
Obtención de Hemolinfa
Una vez que los animales han sido acondicionados a la baja temperatura
y a la luz ambiental del laboratorio (cinco minutos), se toman las muestras
de hemolinfa. Al momento de sacar al animal del recipiente (hielera o
tara), es necesario secarlo perfectamente para evitar un posible contacto
entre la hemolinfa y el agua.
Para extraer la muestra de hemolinfa se utilizará una jeringa desechable
hipodérmica la cual contendrá 100 µL de solución anticoagulante fría, 8
°C (SIC-EDTA, Vargas-Albores et al., 1993). Justo antes de la extracción
Prácticas de Ecoisiología 21
Resultados
1. A partir de los datos obtenidos (Presión Osmótica, (PO)), calcular
la Capacidad de osmorregular (CO), de la siguiente manera:
Ejemplo:
Literatura Recomendada
Charmantier,G.,1998. Ontogeny of osmoregulation and salinity tolerance in two
decapod crustaceans. Biological Bulletin. 175: 102-110.
Chen,J.C., Lin,J.L., 1994. Responses of osmotic and chloride concentrations of Pe-
naeus chinensis (Osbeck) subadults acclimated to different salinity and tempe-
rature levels. Journal Experimental Marine Biology and Ecology.179: 267-278.
Fry, F.E.J,1947. Effect of the environment on animal activity.University of Toronto
Studies. Biol. Series, No. 55, 62 pp.
Prácticas de Ecoisiología 25
Glosario
Aminoácidos (AA).- Molécula orgánica compuesta de carbono, oxígeno y ni-
trógeno y contiene al menos un grupo carboxilo (COOH) y un grupo amino
(NH2). Cuando dos o más aminoácidos se unen se denominan péptidos: las
proteínas se conforman de cadenas de péptidos.
Aclimatación.- Cambio persistente en una función especíica debido a una pro-
longada exposición a una condición ambiental realizada en condiciones con-
troladas.
Citoplasma.- Sustancia semiluida que llena el interior de la célula a excepción del
núcleo e incluye en su seno otros organelos (mitocondria, aparato de Golgi,
etc.): es ahí donde toman lugar la mayoría de las actividades celulares.
Equilibrio hidromineral. Proceso de mantenimiento de líquidos corporales.
Glándula digestiva.- Órgano que secreta y/o excreta sustancias que intervienen
en el proceso digestivo
Hemolinfa: Fluido circulatorio de los artrópodos y moluscos; es análogo a la
sangre de los vertebrados. Contiene agua, aminoácidos azúcares, sales, célu-
las. Circula por el bombeo del corazón y su principal función es transportar
oxígeno, productos digestivos y de excreción.
Hemocianina: Proteína presente en la sangre de los artrópodos, moluscos, etc.
Se encarga del transporte de oxígeno: presenta dos átomos de cobre en su
centro activo.
Iones.- Es un átomo o grupo de átomos con una carga eléctrica.
Osmol.- Unidad estándar de presión osmótica
Osmoconformador: Organismo que exhibe poca osmorregulación o carece de
ella. De manera que la osmolaridad de sus líquidos corporales sigue las altera-
ciones de la osmolaridad del ambiente.
Osmoefectores.- Principales iones y también algunas moléculas orgánicas y me-
tabolitos que intervienen en el proceso osmótico.
Osmolito.- Iones y moléculas orgánicas que intervienen en el mantenimiento
del volumen de la célula y el equilibrio de luidos; participan en la regula-
ción de la osmolaridad sin alterar funciones celulares.
26 Prácticas de Ecoisiología
Práctica 3
Introducción
El alimento es uno de los factores bióticos del medio indispensable para el
crecimiento y la reproducción de los organismos debido al aporte de energía
y nutrientes que éste proporciona. El lujo de materia y energía que man-
tiene un estado isiológico integral ocurre de manera simultánea e incesante
a partir de los nutrimentos (lípidos, carbohidratos y proteínas) contenidos
en el alimento. La energía química contenida en ellos se trasforma en gra-
dientes eléctricos, iónicos, osmóticos y en concentración muscular, etc., in-
dispensable para producir trabajo y mantener la integridad estructural, para
que los organismos se mantengan, crezcan, y se reproduzcan (Hill, 1997).
Por lo tanto, un organismo vivo requiere un aporte frecuente de alimento
debido al gasto continuo de energía necesaria para mantener su funciona-
miento y estructura en todos los niveles de organización. Si el suministro
energético disminuye por debajo de la cantidad requerida para su man-
tenimiento, el organismo consumirá sus propias reservas energéticas, y al
agotarlas, el organismo morirá inevitablemente (Eckert R. 1990). Entonces,
en cualquier organismo la deposición, movilización y utilización de los nutri-
mentos es indispensable como parte del mantenimiento de la homeocinesis.
Por esto, las concentraciones de diferentes nutrimentos (carbohidratos, lípi-
dos y proteínas) en la hemolinfa, tejido de transporte de estos nutrimentos,
han sido utilizadas como indicadores de mecanismos de regulación cuando
los organismos se exponen a diferentes condiciones experimentales (Vinagre
y Da Silva, 1992; Racotta y Palacios, 1998; Pascual et al. 2006).
La sangre o hemolinfa de los camarones es el tejido de transporte y
de reserva de nutrimentos. Ahí se encuentran las principales moléculas
energéticas que son transportadas a los distintos tejidos internos, por lo
que pueden ser utilizadas como indicadores del estado nutricional. Entre
las moléculas nutricionales están las proteínas que son compuestos cons-
tituidos por unidades más sencillas, los aminoácidos. No sólo ocupan una
posición central por ser la base para la formación de enzimas, hormonas,
hemocianina, componentes de la respuesta inmunitaria, sino que además
intervienen directamente en la construcción de tejidos (crecimiento), y en
la reparación y mantenimiento de estos. Asimismo son fuente de energía
en los procesos catabólicos y son esenciales en el metabolismo de carbo-
hidratos y lípidos.
30 Prácticas de Ecoisiología
Objetivo
Conocer el efecto de la frecuencia de alimentación en el estado isiológi-
co de juveniles de camarón (L. vannamei) a través del consumo de oxígeno,
la concentración de hemocianina y de proteínas totales en la hemolinfa.
Objetivos particulares
1. Evaluar indicadores bioenergéticos: consumo de oxígeno.
2. Evaluar indicadores sanguíneos: hemocianina y proteínas totales
solubles.
3. Determinar el estadio de muda.
Material y método
a) Materiales y equipos
o Seis acuarios de 70 L
o Bombas de aireación
o Mangueras
o Piedras de aireación
o Redes de mano de 10 x 10 cm
o Termómetro
o Piseta con agua destilada
Prácticas de Ecoisiología 31
o Oxímetro
o Refractómetro
o Balanza granataria
b) Procedimiento
Obtención de los organismos
Los camarones serán colectados del área de estanques exteriores de la
Unidad de la UNAM en Sisal. En cada tanque se colocarán 10 camarones,
por lo que se requieren capturar 100 juveniles de L. vannamei para asegu-
rar los 60 camarones que se requieren para la práctica.
Los camarones capturados, serán colocados en dos tanques de 100 L.,
para su traslado al área experimental. Se registraran los parámetros isico-
químicos (temperatura, salinidad, la concentración de oxígeno disuelto y
pH) del estanque, donde se encuentran los organismos al momento de su
captura.
Diseño experimental
Se colocarán diez organismos en cada uno de los seis acuarios de 80
litros. Antes de ser colocados en los acuarios, se pesarán individualmente
cuidando de secarlos previamente con papel o tela absorbente. Los ani-
males se mantendrán por un período de tres semanas que es el tiempo
que dura el experimento. Los animales serán mantenidos por un periodo
de tres semanas. Se pesarán individualmente secándolos con un papel o
tela, antes de ser colocados en los acuarios.
Los acuarios funcionarán como un sistema cerrado de recirculación. Dia-
riamente por la mañana se registrarán las característica isioquímicas del
agua: temperatura, salinidad y oxígeno disuelto; el pH se registrará sema-
nalmente. Después de la toma de parámetros se realizará la limpieza de
los acuarios (sifoneo). El agua que se pierde por esta actividad de limpieza,
se compensará con el agua del tanque reservorio. En caso de que haya
mudas o muertos se cuantiicarán y se extrairán del acuario.
Las condiciones de alimentación serán:
1. Organismos alimentados una vez a la semana.
2. Organismos alimentados diariamente.
Material y método
o Tres camarones juveniles de L. vannamei del tratamiento A
o Tres camarones juveniles de L. vannamei del tratamiento B
o Redes de mano de 10 x 10 cm
o Siete cámaras respirométricas de 2 L
o Oxímetro luorométrico de 10 canales (Oxy-10)
o Balanza granataria
o Papel secante
Para evaluar el consumo de oxígeno se utilizan cámaras respirométricas,
en las cuales se introducen los organismos experimentales, uno por cada
cámara (Fig 1). Dichas cámaras deben estar conectadas bajo un sistema de
lujo continuo de suministro de agua. Para el caso de esta práctica se uti-
lizará un sistema de cerrado recirculación para cuidar que los parámetros
isicoquímcos se mantengan en niveles adecuados sin alterar la respuesta
a evaluar que es el efecto de la frecuencia de alimentación.
Tomando en cuenta que la respiración de rutina se deine como la ener-
gía invertida en actividad espontánea y de ayuno, es necesario colocar a
los organismos en las cámaras respirométricas durante 24 horas sin ali-
mentarlos, es decir, permanecerán todo un día en las cámaras en ayuno
antes de comenzar la evaluación de consumo de oxígeno.
En total se montarán siete cámaras respirométricas: tres por cada trata-
miento, A y B, respectivamente, y una más que será la cámara control.
Como se coloca un camarón por cámara, (como ya se ha mencionado),
para cada tratamiento serán seleccionados al azar tres camarones, uno por
cada acuario para así completar los tres camarones de cada tratamiento.
En la cámara que funcionará como control no se pondrá ningún camarón;
en ella se evalúa el consumo de oxígeno de bacterias y algas presentes en
el agua y que es importante considerar en los cálculos.
Al momento de cerrar la cámara, una vez que se colocó al organismo,
se debe tener mucho cuidado que quede bien sellada y sin burbujas de
aire para así evitar fugas y alteraciones en la evaluación del consumo de
oxígeno.
Prácticas de Ecoisiología 33
Obtención de Hemolinfa
Material y equipo
o 5 portaobjetos y 5 cubreobjetos
o 70 jeringas hipodérmicas de 1 ml, desechables
o 30 ml Solución anticoagulante para camarón (SIC-EDTA)
o 2 Placas congelantes
o Franela
o 70 cuadros (4 x 4cm) de Papel parailm
o Papel secante suave (que no deje pelusa)
o 60 cuadros (10 x5 cm) de papel aluminio
o Recipiente con agua de jabón
o Piseta con agua destilada
o Tijeras de disección
o Balanza granataria
Una vez que los animales han sido acondicionados a la baja temperatura
y a la luz ambiental (cinco minutos aproximadamente), es posible tomar
las muestras de hemolinfa. Al momento de extraer al animal, debe cuidar-
se el alterar lo menos posible a los que quedan en la tara/hielera. Como
primer paso, es necesario secar perfectamente al organismo para evitar un
posible contacto entre la hemolinfa y el agua.
Para extraer la hemolinfa deberá utilizar una jeringa desechable hipo-
dérmica La jeringa deberá contener aproximadamente 100 μL de solución
anticoagulante fría (2-8 °C): Solución Isotónica para Camarón (SIC-EDTA)
(Vargas-Albores et al., 1993).
Es necesario resaltar la importancia del cuidado en la condición termal
(2-8 °C), tanto en las soluciones (SIC-EDTA) como el manejo y manteni-
miento de las muestras, para evitar lo más posible el desencadenamiento
del proceso de coagulación desde el momento de extraer la hemolinfa
tanto por el contacto con el aire como por el cambio de temperatura.
Justo antes de la punción, la solución anticoagulante debe descartarse
completamente de la jeringa. La hemolinfa se extrae del seno ventrolate-
ral del abdomen. La aguja se inserta suavemente, y lentamente se desliza
la aguja, al mismo tiempo, se retira suavemente el émbolo de la jeringa,
36 Prácticas de Ecoisiología
Hemocianina
Material y equipo
o 2 cajas con puntas para micropipeta (2-200 μL)
o 1 Caja con puntas para micropipeta (100-1000 μL)
o Vaso de precipitado con 100 ml de agua destilada
o 2 celdas para lecturas Ultravioleta (UV) en espectrofotómetro
o Papel secante suave (que no deje pelusa)
o Piseta con agua destilada
o Parailm
o Micropipeta de 2 - 20μL
o Micropipeta de 100 – 1000 μL
o Espectrofotómetro con lámpara de UV (absorbancia 335 nanóme-
tros, nm)
o 100 ml TRIS 0.1 M pH 8.0
Para evaluar la hemocinana se requiere del espectrofotómetro con lám-
para UV, longitud de onda de 335 nm. Se coloca una para UV de 1 mL
en el espectro la cual deberá contener 990 μL de TRIS 0.1 M pH 8.0 y se
calibra el espectro a cero de absorbancia. Se debe tener cuidado de no
tocar con los dedos los lados de la celda por el lado del paso de luz, y
de limpiarla con un papel suave (que no deje pelusa) antes de meterla al
espectrofotómetro.
Con una micropipeta se toman 10 μL de la hemolinfa depositada en el
parailm y se mezclan con los 990 μL de TRIS 0.1 M pH 8.0. La mezcla
se logra al succionar y pulsar varias veces el contenido de la punta de la
Prácticas de Ecoisiología 37
Proteínas totales
Material y equipo
o 60 tubos Eppendorf de 1.5 ml con 40 μL de SIC-EDTA
o 60 tubos Eppendorf de 1.5 ml
o Solución anticoagulante para camarón (SIC-EDTA)
o 2 cajas con puntas para micropipeta (2-200 μL).
o Vaso de precipitado con 100 ml con agua destilada
o Recipiente frío para colocar los tubos Eppendorf (2-8 °C)
o Recipiente con agua de jabón
o Micropipeta de 2 – 20 μL
o Micropipeta de 20 - 200 μL
o Micropipeta de 100–1000 μL
o Centrífuga refrigerada
o Refractómetro de proteínas
Debido a la susceptibilidad de la hemolinfa para coagularse al entrar en
contacto con el aire y con el cambio de temperatura, es necesario diluir la
hemolinfa en el SIC-EDTA frío (2-8 °C): por cada volumen de hemolinfa
se requieren dos de SIC-EDTA. Los tubos Eppendorf (1.5 ml) deben estar
previamente llenados con SIC-EDTA (2-8ºC), y marcados de forma numé-
rica progresiva con plumón indeleble (uno por cada muestra de camarón).
Se toman 20 μL de hemolinfa y se mezcla con los 40 μL de la solución
anticoagulante contenida en el tubo Eppendor. Ya con la hemolinfa dilui-
da, los tubos Eppendorf se centrifugan a 800 g por 5 minutos a 4 ºC. Las
muestras con hemolinfa + SIC-EDTA pueden mantenerse en 2-8ºC hasta
4 horas, antes de ser centrifugadas. Después de centrifugar se retira el so-
brenadante (plasma + SIC-EDTA) de los tubos Eppendorf, introduciendo
lentamente la punta de la micropipeta sin tocar el fondo. El sobrenadante
se deposita en tubos Eppendorf nuevos y marcados con la misma secuen-
cia de números que se siguió para las muestras de hemolinfa. Los tubos
con plasma deben mantenerse a una temperatura de 2-8°C.
Antes de poner la muestra en el refractómetro, se limpia el lector del
refractómetro con agua destilada y se seca. Se toman 10 μL de plasma y
se colocan en el lector. Se toma la lectura de la columna izquierda la cual
registra el valor en g/100 mL. Se hacen dos lecturas por muestra.
38 Prácticas de Ecoisiología
Estadio de muda
Material y equipo
o Portaobjetos con urópodos
o Piseta con agua destilada.
o Papel secante
o Microscopio óptico
Para la evaluación de muda, antes de poner a secar al camarón, se corta
el urópodo derecho (viendo al camarón en posición dorsal) y se pone en
el portaobjetos con una gota de agua de mar. En el portaobjetos se irán
colocando uno a uno los urópodos de cada camarón.
La muda (ecdisis) es un fenómeno cíclico que está claramente estable-
cido por el desprendimiento del caparazón viejo (exoesqueleto o exuvia).
Antes y después de la ecdisis, ocurren los mayores eventos metabólicos
asociados especíicamente con el crecimiento, y en los cuales se incluyen la
degradación del viejo exoesqueleto y la síntesis de un nuevo exoesqueleto.
En general, los estadios que integran el ciclo de la muda son: postmuda
(A, B), intermuda (C) y premuda (D). En cada uno de estos estadios, la
concentración de metabolitos presentes en la hemolinfa varía de acuerdo
a los cambios metabólicos necesarios para que se realice el proceso de
ecdisis. Por esto, resulta necesario caracterizar el estadio de muda de cada
uno de los camarones muestreados, y considerar sólo aquellos que se en-
cuentren en intermuda (C) para el análisis de resultados.
Una forma de caracterizarlos es a través de la identiicación visual mi-
croscópica de los cambios estructurales secuenciales en la epidermis de los
urópodos, y en la cual se toma en cuenta el grado de retracción epidermal
de las bases setales considerando la ausencia o presencia de la matriz ce-
lular; la retracción epidermal de la cutícula junto con el desarrollo de las
nuevas setas.
Procesamiento de datos
a) Indicadores bioenergéticos.
El consumo de oxígeno se calcula mediante la fórmula:
VO2 = ([O2]entrada - [O2]salida)* F,
Donde:
VO2 = consumo de oxígeno expresado en mg de O2 por hora por ani-
mal.
[O2]entrada = concentración en mg por litro de O2 en el agua que entra a
la cámara respirométrica,
[O2]salida = concentración en mg por litro de O2 en el agua que sale de
la cámara espirométrica,
F = velocidad o lujo del agua que pasa a través de la cámara respiro-
métrica expresada en litros por hora.
Prácticas de Ecoisiología 39
b)Indicadores sanguíneos.
Hemocianina
La concentración de hemocianina (Hc) se calcula utilizando el coeiciente
de extinción:
ε = 17.26.
Ejemplo: Se tiene un valor de absorbancia de 0.235, entonces:
Hc = (0.235/17.26) x FD
Donde FD es el factor de dilución. Si se utilizaron 10 μL en 990 μL, en-
tonces 1000/10 = 100.
Por lo tanto:
Hc = (0.235/17.26)*100 =1.36 mmol/L
Proteínas totales
La concentración de proteínas totales en mg/ml se calcula:
Proteínas totales en mg/ml= (valor de refractómetro) (10) (FD)
Donde FD es el factor de dilución = 3 porque una parte de hemolinfa
se diluyó en dos partes del anticoagulante.
Ejemplo: se tiene un valor de 6.6, entonces:
Proteínas totales en mg/ml = (6.6) (10) (3) = 198 mg/ml
42 Prácticas de Ecoisiología
Resultados
Con el cálculo de todos los indicadores, considere sólo a los organismos
en el estadio de intermuda (C) para:
1. Graicar el peso seco y la sobrevivencia (eje Y) de los organismos
en las dos condiciones experimentales (eje X).
2. Graicar el consumo de oxígeno de los organismos de ambas con-
diciones experimentales.
3. Graicar la concentración de hemocianina y de las proteínas tota-
les (eje Y) de los organismos en ambas condiciones experimenta-
les (eje X).
Literatura citada
Chen, J.C., Cheng, S.-Y., 1993. Hemolymph PCO2, hemocyanin, protein level and
urea excretions of Penaeus monodon exposed to ambient ammonia. Aquatic
Toxicology 27: 281– 292.
Chen, J. Y J. Lin. 1998. Osmotic concentration and tisuue water of Penaeus chi-
nensis juveniles reald at different salinity and temperature levels. Aquaculture
164: 173-181.
Eckert R. 1990. Fisiología Animal: Mecanismos y adaptaciones. Mc Graw Hill.
España. 3ª edición. 683 pp.
Ferraris, R.P. Parado-Estepa, J. M. Ladia. y E.G. de Jesús. 1998. Effect of salinity on
the osmotic, chloride, total protein and calcium concentrations in the hemo-
lymph of the prawn Penaeus monodon (Fabricius). Comparative Biochemistry
Physiology. 85A (4): 701-708.
Gilles R. 1977. Effects of osmotic stresses on the proteins concentration and pat-
tern of Eriocheir sinensis blood. Comparative Biochemistry Physiology 56A:
109-114.
Hill, R.W 1976. Energy Metabolism y Thermal Relationship. P 7-57. En: Com-
parative Physiology of Animals: An Environmental Approach. Harper & Row,
publishers. New York, USA. 656 pp.
Hagerman, L.1986. Haemocyanin concentration in the shrimp, Crangon crangon
(L.) after exposure to moderate hypoxia, Comparative Biochemistry Physioogy
85A: 721–724.
Lucas, A., 1993. Bionerghetique des Animaux Aquatiques. Masson, Paris, p. 180.
Prácticas de Ecoisiología 43
Pascual, C., Sánchez, A., Zenteno, E., Gaxiola, G., Brito, R., Gelabert, R., Hidalgo,
E., Rosas, C. 2006. Biochemical, physiological, and immunological changes
during starvation in juveniles of Litopenaeus vanamei. Aquaculture: 251:416-
429
Racotta, I.S., Palacios, E., 1998. Hemolymph metabolic variables in response to
experimental manipulation stress and serotonin injection in Penaues vannamei.
Journal World Aquaculture Society 29: 351–356.
Rainer, J y M. Brouwer. 1993. Hemocyanin synthesis in the blue crab Callinectes
sapidus. Comparative Biochemistry Physiology 104B (1): 69-73.
Rosas, C., Cuzon, G. Gaxiola, G., LepPriol, C., Pascual, C., Rossignyol, J., Contreras,
F., Sánchez, A., and Van Wormhoudt, A. 2001a. Metabolism and growth of
juveniles of Litopenaeus vannamei: effect of salinity and dietary carbohydrate
levels. Journal Experiamental Marine Biology Ecology. 259: 1-22.
Van Holde, K., K., Miller, y H. Decker (2001). Hemocyanin and invertebrate evo-
lution. Journal Biological Chemistry 276 (19): 15563-15566.
Vinagre, A.S., Da Silva, R.S., 1992. Effects of starvation on the carbohydrate and
lipid metabolism in crabs previously maintaned on a high protein or carbo-
hydrate-rich diet. Comparative Biochemistry Physiology. 102A: 579– 583.
Zubay, G. Biochemistry 1983. Addison-Wesley Publishing Company, Inc. U.S.A.
1268 pp.
Glosario
Absorbancia.- Es la relación que existe entre la concentración de una solución y
su capacidad de absorber radiación. Se llama densidad óptica a la absorbancia
de un elemento óptico para una longitud de onda determinada; a veces la
misma expresión se usa sin referencia a una longitud de onda especíica.
ATP.- Trifosfato de adenosina o adenosin trifosfato; es una molécula que consta
de enlaces iónicos de alto contenido energético que interviene en la actividad
celular formada por molécula
Bioenergética.- Rama de la biología que estudia los procesos isiológicos que
intervienen en la obtención y uso de energía
Carbohidratos.- Compuestos orgánicos que están constituidos de carbono, hidró-
geno y oxígeno, como ejemplos están la glucosa y el almidón.
Catabolismo.- Degradación de moléculas complejas a más simples, y donde el
tejido vivo se transforma en energía y productos de desechos
Ciclo de Krebs (ciclo del ácido cítrico o de los ácidos tricarboxílicos).- Parte
inal de la cadena de reacciones bioquímicas por las cuales los organismos
transforman el alimento utilizando oxígeno y liberando energía (respiración).
Toma lugar en la mitocondria y al inal se producen moléculas ricas en energía
(ATP).
Ecdisis.- Fenómeno cíclico que está establecido por el desprendimiento del capara-
zón viejo (exoesqueleto o exuvia). Este desprendimiento permite el crecimiento
Enzima.- Catalizador biológico producido en la célula capaz de acelerar las reac-
ciones químicas necesarias para la vida.
44 Prácticas de Ecoisiología
Horas/semana /semestre
Créditos
Teoría Práctica Horas
4 2 96 10
Unidades temáticas
Número de horas
por unidad Nombre de la unidad:
Teoría Práctica
I. Introducción: El organismo y el ambiente
1. Deinición de Ecoisiología
2. Enfoque evolutivo: Teoría de la Adaptación
3. El concepto de Adaptación
7 3
4. Adaptaciones ambientales en el tiempo
5. Homeostasis: Regulación y control
6. Concepto de estrés
7. Factores ambientales: Controladores, Limitantes
II. Equilibrio iónico y osmótico
1. Ambiente marino y dulceacuícola
2. Principales mecanismos de transporte
7 3 3. Mantenimiento del volumen celular
4. Respuesta de los organismos ante cambios de salinidad
5. Osmorregulación y ciclos de vida
6. Interacción de la salinidad con otros factores ambientales
III. La dinámica costera y los mecanismos de adaptación a las interacciones
biológicas.
7 3 1. Competencia
2. Depredación
3. Parasitismo
IV. Adaptaciones isiológicas, nutrición y alimentación.
1. Adaptación enzimática
7 3
2. Adaptación metabólica
3. Adaptación inmunológica
V. Termorregulación
1. Regulación térmica: conductual isiológica
2. Tolerancia y resistencia térmica
7 3
3. Adaptaciones bioquímicas
4. Adaptación en ambientes extremos
5. Adaptaciones frente al cambio climático global
VI. Adquisición de energía: alimentación, digestión y catabolismo
1. Tipos de alimentación
7 3 2. Visión general de los sistemas digestivos
3. Requerimientos nutricionales
4. Efecto de los factores ambientales
VII. Uso de la energía.
1. Respiración y metabolismo.
7 3
2. Metabolismo aerobio y anaerobio
3. Transporte de oxígeno. Pigmentos respiratorios
VIII. Metabolismo
1. Adaptación bioquímica a la disposición de oxígeno
2. Excreción nitrogenada: Absorción de energía
3. Patrones básicos de excreción de compuestos nitrogenados: organismos
acuáticos y terrestres
7 5 4. Metabolismo del amonio, urea y ácido úrico
5. Asimilación
6. Metabolismo energético: basal, estándar, de rutina y activo
7. Tasa metabólica
8. Campo de crecimiento, producción de biomasa, reproducción
9. Efectos de los factores ambientales
IX. Ritmos Biológicos
4 3 1. Ritmos circadianos
2. Ritmos endógenos
Prácticas de Ecoisiología 47