Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Ingeniería en Alimentos

Estudio de Triticum aestivum para la concepción

de un método estándar de extracción y
caracterización de gliadinas

Memoria presentada como parte de los

requisitos para optar al título de
Ingeniero en Alimentos

María Fernanda Paredes Altamirano

Valdivia – Chile
2013
 i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1 INTRODUCCIÓN 3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

2.1 Generalidades 5

2.2 Trigo 5

2.2.1 Estructura 6

2.2.2 Composición química 7

2.2.3 Clasificación 7

2.3 Proteínas 8

2.3.1 Propiedades funcionales 8

2.3.2 Proteínas vegetales 8

2.3.2.1 Proteínas citoplasmáticas 9

2.3.2.2 Proteínas reserva 10

2.3.2.2.1 Gliadinas 10

2.3.2.2.2 Gluteninas. 12
 ii

3 MATERIAL Y MÉTODO 13

3.1 Materiales 13

3.1.1 Materia prima 13

3.1.2 Equipos y otros materiales 13

3.1.3 Solvente 13

3.2 Método 13

3.2.1 Determinación de la calidad del trigo 14

3.2.1.1 Peso hectólitro 14

3.2.1.2 Peso de mil granos de trigo 14

3.2.1.3 Contenido de humedad del trigo 15

3.2.1.4 Dureza del grano 16

3.2.1.5 Vitrosidad y opacidad 16

3.2.1.6 Granulometría 17

3.2.2 Proceso de obtención de harina 17

3.2.2.1 Acondicionamiento 18

3.2.2.2 Molienda 18

3.2.3 Proceso de extracción de gliadinas 19

3.2.4 Técnica de estrés osmótico 20

3.2.4.1 Determinación del correcto funcionamiento del osmómetro 21

3.2.4.2 Calibración de PEG en solución de etanol 21

 iii

3.2.4.3 Determinación del efecto de la presión osmótica sobre la 22

concentración de gliadinas

3.2.5 Análisis de SE- HPLC 22

4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 24

4.1 Caracterización del grano de trigo 24

4.2 Proceso de obtención de harina de trigo 25

4.3 Proceso de extracción de gliadinas 25

4.4 Determinación del efecto de la presión osmótica sobre la 26

concentración de gliadinas

4.4.1 Determinación de la presión osmótica a diferentes concentraciones 26

PEG

4.4.2 Determinación del efecto de la presión osmótica sobre la 28

concentración de gliadinas

4.5 Análisis por SE- HPLC 29

5 CONCLUSIONES 32

6 BIBLIOGRAFÍA 33

7 ANEXOS 35
 iv

INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Clasificación de la familia de Gramineae 6

2 Composición química del grano del trigo 7

3 Composición porcentual de aminoácidos en globulinas y albúminas 10

4 Composición porcentual de aminoácidos en gliadinas 11

5 Composición porcentual de aminoácidos en las subunidades de 12

gluteninas

6 Clasificación de trigo en función de su dureza PSI 17

7 Soluciones de referencia PEG 20.000 Da en agua destilada 21

8 Soluciones de PEG 20.000 Da diluidas en solución de etanol (55% 22

v/v)

9 Resumen de los promedios obtenidos para la caracterización del 24

grano de trigo

10 Resultados obtenidos, a partir del proceso de molienda de trigo 25

11 Fracción de proteína soluble en etanol 55% v/v, obtenidas por SE- 31

HPLC
 v

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Clasificación de las proteínas del trigo 9

2 Proceso de extracción de gliadinas 20

3 Carta Gantt del proceso de extracción de gliadinas 26

4 Comparación de los resultados de presión osmótica obtenidos en 27

función de la concentración en PEG en solución con agua (círculos
rojos) y en solución con etanol (círculos negros), con los datos
entregados por la bibliografía.

5 Concentración de gliadinas en función de la presión osmótica ejercida 28

por la solución de PEG externa

8 Resultados obtenidos por el análisis SE-HPLC 30

 vi

INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Protocolo de extracción de extracción de gliadinas 35

2 Determinación de la presión osmótica ejercida a diferentes 38

concentraciones de PEG 20.000 Da.

3 Estudios del comportamiento de PEG en solución etílica (55%v/v) sin 40

regulación de temperatura.

4 Determinación de la presión osmótica y concentración de gliadinas 41

mediante espectrometría

5 Resultados obtenidos en la caracterización del grano de trigo 46

6 Norma Chilena NCh1.237 48

7 Perfil típico de una muestra de harina por SE- HPLC 49

 1

RESUMEN

El principal objetivo de este estudio fue la extracción de una de las proteínas de

reserva del trigo, las gliadinas. Para lo cual, se realizó un estudio osmótico sobre la
proteína, determinando su comportamiento a diferentes presiones y posteriormente se
determinó el perfil del extracto por medio de SE HPLC.
Se utilizó como materia prima, Triticum aestivum de la variedad Haussman, el cual fue
estudiado en base a sus propiedades físico-químicas que condicionan su
comportamiento en las transformaciones posteriores. Se procedió a su molienda y
transformación en harina de trigo para continuar con la elaboración de un protocolo
estándar para el proceso de extracción de proteínas basado en la solubilidad de los
componentes de la materia prima, mediante extracción líquido-líquido (L-L) y posterior
liofilización. El producto obtenido fue almacenado a temperatura de refrigeración (4 ±
1°C) hasta su utilización.
Se realizó un estudio del perfil del extracto de proteínas obtenido por medio de SE-
HPLC y fue comparado con una muestra de harina que no ha sufrido transformación.
Por último se realizó un estudio de osmometría con poli-etilénglicol (PEG) de 20.000
como solvente, ello con la finalidad de conocer el comportamiento de dispersión de la
proteína al ser sometida a diversas presiones osmóticas.
Los resultados obtenidos mostraron, que esa variedad de trigo cumple con los
requisitos de calidad requerida y puede ser clasificado como un trigo fuerte, pues en la
caracterización del mismo, se logró obtener información sobre su calidad, predecir el
rendimiento y comportamiento en procesos mecánicos de transformación. Respecto al
proceso de molienda, se logró obtener un rendimiento igual al 75%.
Una vez extraída la proteína se realizaron dos estudios. El primero consistió en realizar
un análisis de su perfil mediante SE- HPLC, que permitió verificar que la extracción fue
correctamente efectuada lográndose obtener un extracto con una concentración de
gliadinas superior al 80%. El segundo estudio consistió en determinar el
comportamiento de la solución de gliadinas cuando es sometida a diferentes
concentraciones osmóticas. Se observó que al aumentar la presión osmótica la
concentración de gliadinas aumenta, en consecuencia el volumen disminuye hasta
alcanzar un punto en el cual la presión se mantiene prácticamente constante mientras
la concentración sigue progresando. En este intervalo, la solución pasa gradualmente
de la fase liquida a la sólida y posteriormente cualquier aumento de presión generará
un leve aumento en la concentración de gliadinas.
Como corolario del presente estudio, se puede establecer que el lote de trigo de
variedad Haussman cumple con todos los requisitos de calidad, presentando un apto
comportamiento en su proceso de trituración y obteniendo como resultado un
rendimiento del 75% en el proceso de molienda. A su vez, en el proceso de extracción,
la utilización del método extracción liquido-líquido permitió separar correctamente los
componentes de la harina, siendo verificado a través de un análisis de perfil por SE-
HPLC, el cuál mostró que el extracto contiene sobre el 80% de gliadinas.
 2

SUMMARY

The main objective of this study was the removal of one of the reserve of the gliadins,
wheat proteins. For which, an osmotic study on protein, determining their behavior
different pressures and was subsequently determined through HPLC are extract profile.

It was used as a raw material, Triticum aestivum of the Haussman variety, which was
studied on the basis of their physic-chemical properties which determine their behavior
in subsequent transformations. It proceeded to its milling and processing in wheat flour
to continue with the elaboration of a standard protocol for protein extraction process
based on the solubility of components from raw material extraction liquid-liquid (l-l) and
subsequent freeze-drying. The product obtained was stored at refrigeration temperature
(4 ± 1 ° C) until its use.

A study of the profile of the protein extract obtained by means of SE - HPLC was made
and was compared with a sample of flour that has not under gone any transformations.
Finally a study was conducted by osmometry with polyethylene glycol (PEG) 20.000 Da
as solvent, this with the purpose of knowing the behavior of dispersion of protein being
subjected to different osmotic pressures.

The results show that this variety of wheat complies with the requirements of quality
required and it can be classified as strong wheat, as it was achieved in the
characterization of the same, information on the quality of the wheat, predict
performance and behavior in mechanical processes of transformation. As regards the
grinding process achieved a performance equal to 75%.

Once extracted the protein, two studies were conducted. The first consisted of an
analysis of its profile by SE - HPLC, allowing you to verify that the removal was properly
carried out, achieving a summary, with a concentration higher to 80% gliadins. The
second study consisted in determining the behavior of gliadins solution when it is
subjected to different osmotic concentrations. It was noted, that higher the osmotic
pressure, higher the concentration of gliadin, consequently the volume decreases until
you reach a point in which the pressure is maintained almost constant while the
concentration is still progressing. In this interval, the solution gradually changes from
liquid to the solid, subsequent to this, any increase in pressure will generate a slight
increase in the concentration of gliadin.

As a corollary of this study, it can set the batch of wheat variety Haussman, complies
with all the requirements of quality, presenting a suitable behavior in their crushing
process and resulting in a yield of 75% in the grinding process. While in the extraction
process, the use of liquid-liquid extraction method allowed to properly separate the
components of flour, verified using the profile analysis by HPLC, which shows that the
extract contains about 80% of gliadins.
 3

1 INTRODUCCIÓN

El trigo es una planta de la familia de las Gramineae, del género Triticum. Es uno de
los cereales más cultivados en el mundo y más utilizados en la elaboración de diversos
alimentos, debido a que presenta un alto nivel de proteínas y otros nutrientes que lo
posicionan como una gran fuente de alimentación primaria; además posee propiedades
tecnológicas que permiten su transformación en diversos productos alimentarios.

Estas propiedades tecnológicas se encuentran estrechamente ligadas a sus

propiedades físico-químicas y estructurales de las proteínas que constituyen el gluten.
Las proteínas representan el 8-16% del grano de trigo, se sitúan mayoritariamente en
el endospermo amiláceo y en el germen, aportándole numerosas funcionalidades
tenso- activas, espumantes, espesantes y texturizantes.

Normalmente, se distinguen las proteínas metabólicas, solubles en agua o soluciones

salinas, y las proteínas de reserva, que resultan insolubles en aquellos solventes.

Las proteínas son un factor determinante en las propiedades del trigo, tanto en
cantidad como en calidad. En calidad, son de gran relevancia las proteínas de reserva,
específicamente las gliadinas y gluteninas que en mezcla con agua forman el gluten.
Las gliadinas poseen propiedades de plasticidad, mientras las gluteninas de
elasticidad; ambas contribuyen en las propiedades visco-elásticas necesarias para un
comportamiento adecuado de la masa al momento de la cocción.

Las características funcionales de estas proteínas, se deben a sus propiedades físico-

químicas que tienen una incidencia en el comportamiento sensorial de las mismas en
el sistema alimentario durante las transformaciones tecnológicas, las preparaciones
culinarias, la conservación y consumación. La funcionalidad de las proteínas es el
resultado de interacciones moleculares ente ellas y su entorno. Estas propiedades se
agrupan generalmente en tres clases: propiedades de hidratación, propiedades de
estructuración y propiedades de superficie.

El estudio de las proteínas de reserva; gliadinas y gluteninas, ha sido siempre un tema

de interés y para Francia, uno de los principales productores de trigo, la investigación
de ella es de gran relevancia, Chile por su parte, basa su alimentación en este cereal,
 4

siendo el pan, su principal exponente. De allí la importancia del presente estudio para
el que se presentan los siguientes objetivos.

Objetivo general. Optimización de un protocolo estándar de extracción de gluteninas y

gliadinas, las proteínas de reserva del trigo, para posteriormente realizar la
caracterización de las gliadinas del grano de trigo.

Objetivos específicos.

 Determinar la calidad del trigo a utilizar, mediante la caracterización de sus

propiedades físico-químicas.
 Determinar el rendimiento de molienda en la elaboración de harina y obtención
de la materia prima.
 Elaboración de un protocolo estándar de extracción de gluteninas y gliadinas,
las proteínas de reserva del trigo.
 Caracterizar el extracto obtenido por medio de SE- HPLC.
 Determinar el comportamiento de la dispersión de gliadinas por medio de un
estudio de osmometría.

.
 5

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Generalidades
El trigo (Triticum spp. L.) es el alimento que más se cultiva a nivel mundial, los primeros
pronósticos para la cosecha de trigo 2013 apuntan a un aumento de la producción
hasta 690 millones de toneladas, un 4,3% más que en 2012. El aumento de la
producción se espera sobre todo en Europa, en particular la Federación de Rusia. El
panorama en Estados Unidos se ve menos favorables debido a las condiciones
iniciales de sequía (FAO, 2013).
El 37% de la población lo utiliza como su principal cereal, aportando alrededor de 20%
de las calorías consumidas por el hombre. Uno de los componentes nutricionales más
importantes del trigo es la proteína, cuyo contenido varía entre 6-25% dependiendo de
las condiciones de crecimiento. También contiene carbohidratos principalmente
almidón, minerales, vitaminas y lípidos (BLACKMAN y PAYNE, 1987).
En Chile, el trigo ha alcanzado una producción de 1.212.983 toneladas anuales,
utilizando 245.231 hectáreas de cultivo durante el periodo de producción 2012
(ODEPA, 2012).

2.2 Trigo

El trigo es un monocotiledón perteneciente al género Triticum de la familia de las

Gramineae, siendo las dos especies más cultivadas el trigo blando (Triticum aestivum)
y el trigo duro (Triticum durum), sin embargo existen más clasificaciones tal como lo
muestra el CUADRO 1 (FEILLET, 2000). Es uno de los cereales más usados en la
elaboración de alimentos y por tanto el más cultivado; siendo el producto agrícola más
importante de los Estados Unidos y Canadá (BADUI, 2006).

Uno de los componentes nutricionales más importantes del trigo es la proteína, cuyo
contenido varía entre 6-25% dependiendo de las condiciones de crecimiento. También
contiene carbohidratos, principalmente almidón, minerales, vitaminas y lípidos
(BLACKMN y PAYNE, 1987).
 6

CUADRO 1 Clasificación de la familia de Gramineae

Familia Sub- familia Tribu Sub-tribu Género Nombre común

Gramineae Festucoideae Triticeae Triticineae Triticum Trigo duro
Aveneae Trigo blando
Secale Centeno
Hordeum Cebada
Avena Avena
Oryzeae Oryza Arroz
Panicoideae Tripsaceae Zea Maíz
Andropogoneae Sorghum Sorgo

FUENTE: Adaptado de FEILLET (2000)

2.2.1 Estructura. El trigo está formado por tres regiones fundamentales:

a) El endospermo, representa el 83% del peso del grano. Está constituido por tres tipos
de endospermo. El endospermo periférico, el cual se caracteriza por alto contenido
proteico y pequeñas unidades de almidón; el endospermo vítreo, el cual contiene
cuatro estructuras: las paredes celulares donde se encuentra la fibra insoluble y
soluble, gránulos de almidón, matriz y cuerpos proteicos; el endospermo almidonoso,
que se encuentra en la parte céntrica del grano y sus unidades de almidón son de
mayor tamaño y el contenido proteico es menor (HOSENEY, 1994).

b) El salvado, está conformado por cuatro capas: pericardio, testa, aleurona y

epidermis, que poseen una alta proporción de proteínas, celulosa, vitaminas,
hemicelulosa y minerales, representando el 14% del grano y entregando la función de
protección (HOSENEY, 1994).

c) El germen o embrión, que constituye alrededor del 2,5-3,5% del peso del grano y
que consiste en dos parte principales: el eje embrionario, que conforma la raíz y tallo,
y escutelo que sirve como órgano para la absorción de nutrientes y permite la adhesión
del germen al endospermo. El germen posee un alto contenido de proteínas (25%),
azúcares (18%), aceites (16%) y vitaminas E y B (HOSENEY, 1994).
 7

2.2.2 Composición química.La constitución bioquímica del trigo depende de la

variedad y de las condiciones climáticas por la cual es sometida. El grano maduro del
trigo está formado por carbohidratos (65- 75%), proteínas (7- 12%), lípidos (2- 6%),
agua (12- 14%) y micronutrientes (HOSENEY, 1994).

Los granos del trigo son también una buena fuente de minerales (especialmente
magnesio) y vitamina B, contienen un gran número de moléculas como: vitamina E,
componentes antioxidantes (ácido fólico y carotenoides), y compuestos como las
ligninas. En el CUADRO 2 se muestra un resumen de la composición porcentual media
del trigo (SALDIVAR, 1996).

CUADRO 2 Composición química del grano del trigo.

Trigo Carbohidratos (%) Proteínas (%) Lípidos (%) Agua (%) Cenizas (%)
Aestivum 65 – 75 7 – 12 2–6 12 – 14 1.8 – 2.0

FUENTE: Adaptado de SALDIVAR (1996)

Estos nutrientes se encuentran distribuidos en las diversas áreas del grano de trigo, y
algunos se concentran en regiones determinadas. El almidón está presente
únicamente en el endospermo, la fibra cruda está reducida casi exclusivamente al
salvado y la proteína se encuentra por todo el grano. Aproximadamente la mitad de los
lípidos totales se encuentran en el endospermo, la quinta parte en el germen y el resto
en el salvado. Más de la mitad de las sustancias minerales totales están presentes en
el pericarpio, testa y aleurona (SALDIVAR, 1996).

2.2.3 Clasificación. El trigo puede ser clasificado según sus diferentes usos,
propiedades, métodos de cultivo. Sin embargo, para fines de comprender el tema de
este estudio, la clasificación más relevante se basa en su dureza, pudiéndoseles
clasificar en:

a) Trigos duros: son aquellos capaces de producir harina gruesa, arenosa, fluida y fácil
de cernir, compuesta por partículas de forma regular, muchas de las cuales son células
completas de endospermo (FEILLET, 2000).
b) Trigos blandos: son aquello con los que se produce harina muy fina compuesta por
fragmentos irregulares de células de endospermo (incluyendo una proporción de
fragmentos celulares muy pequeños y granos sueltos de almidón) y algunas partículas
 8

aplastadas que se adhieren entre sí, se cierne con dificultad y tiende a obturar las
aberturas de los cedazos. La lesión que se produce en los granos de almidón al moler
el trigo duro, es mayor que en el trigo blando (FEILLET, 2000).

2.3 Proteínas

En su estructura primaria las moléculas de proteína están formadas por cadenas de

aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo (COOH) de
un aminoácido y el grupo amino (BADUI, 2006).

En las proteínas de los cereales se encuentran unos 18 aminoácidos diferentes. Las

proporciones en que se encuentran y su orden en las cadenas, determinan las
propiedades de cada proteína. La porción proteica del grano de trigo está localizada en
el endospermo, embrión y escutelo en mayor abundancia (BADUI, 2006).

2.3.1 Propiedades funcionales. Las propiedades funcionales de las proteínas

corresponden a propiedades físicas o físico-químicas que influyen sobre el
comportamiento sensorial de las mismas en un sistema alimentario durante los
procesos de elaboración y conservación.

La funcionalidad de las proteínas corresponde a la interacción molecular entre ellas y

otras moléculas, así también es un efecto a las condiciones externas a las cuales son
sometidas; tales como temperatura, humedad, pH y presión (ALAIS et al., 2003). Estas
propiedades son clasificadas comúnmente en tres grupos:

- Propiedades de hidratación: que están directamente relacionadas con la interacción

entre las proteínas y el agua. Integrando las propiedades de absorción, retención,
adherencia, dispersión y viscosidad (ALAIS et al., 2003).

- Propiedad de estructuración: que están directamente relacionadas con la interacción

proteína-proteína. Integrando los fenómenos de precipitación, coagulación y
gelificación (ALAIS et al., 2003).

- Propiedades de superficie: que están directamente relacionadas con la interacción

entre proteínas y otras moléculas polares o apolares en fase líquida o gaseosa.
Integrando las propiedades de emulsificación y espumosidad (ALAIS et al., 2003).

2.3.2 Proteínas vegetales. El grano de trigo está constituido por numerosas proteínas
que representan el 7 a 18% de su peso total. OSBORNE en 1907 clasificó las
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proteínas del trigo en cuatro categorías, atendiendo a sus características de

solubilidad: globulinas, albúminas, gluteninas y gliadinas. En la FIGURA 1 se muestra
en síntesis la clasificación de las proteínas del trigo entregada por Osborne, junto al
porcentaje que representan en el grano (WRIGLEY et al., 1988).

FIGURA 1 Clasificación de las proteínas del trigo

FUENTE: Adaptado de FEILLET (2000).

2.3.2.1 Proteínas citoplasmáticas. Están constituidas por las albúminas y globulinas;

generalmente son proteínas globulares de baja masa molecular que oscilan entre 10 y
100 kDa. Representan hasta el 20% de las proteínas totales del grano donde las
albúminas alcanzan hasta un 9%, mientras las globulinas un 6%. Se caracterizan
principalmente por tener bajos porcentajes de ácido glutámico (20%) y prolina (7%),
pero ricas en lisina e histidina. En el CUADRO 3 se presentan la composición y el
porcentaje de cada aminoácido constituyente en las proteínas citoplasmáticas
(FEILLET, 2000).

Se trata de proteínas monoméricas, metabólicamente activas y/o estructurales que se

ubican en las capas más externas del grano de trigo. La fracción de albúminas y
globulinas incluye las proteínas solubles en cloroformo-metanol (CM-proteínas),
enzimas, albúminas de alta masa molecular (HMW-albúminas), proteínas triples y otras
proteínas que no son de almacenamiento (FEILLET, 2000).
 10

CUADRO3 Composición porcentual de aminoácidos en globulinas y albúminas.

Aminoácidos Albúmina (%) Globulina (%)

Triptófano 1,1 1,1

Lisina 3,2 5,9
Histidina 2,0 2,6
Arginina 5,1 8,3
Acido aspártico 5,8 7,0
Treonina 3,1 3,3
Serina 4,5 4,8
Acido glutámico 22,6 15,5
Prolina 8,9 5,0
Glicina 3,6 4,9
Alanina 4,3 4,9
Cistina 6,2 5,4
Valina 4,7 4,6
Metionina 1,8 1,7
Isoleucina 3,4 2,9
Leucina 4,0 3,5
FUENTE: Adaptado de FEILLET (2000).

2.3.2.2 Proteínas reserva. Están constituidas por las gliadinas y gluteninas, proteínas
de masa molecular que oscila entre 30- 75 y 500– 10.000 kDa, respectivamente.
Representan hasta el 85% de las proteínas totales del grano, donde las gluteninas
alcanzan hasta un 45%, mientras las gliadinas un 40% (FEILLET, 2000).

2.3.2.2.1 Gliadinas. La fracción de gliadinas contiene principalmente cadenas

polipeptídicas simples (monómeros) asociados por enlaces de hidrógeno e
interacciones hidrofóbicas con una masa molecular que varía entre 30 y 75 kDa, se
caracterizan por ser solubles en soluciones de etanol al 70% (TATHAM, 1995).

Inicialmente las gliadinas se clasificaron en cuatro grupos: alfa, beta, gamma y omega
(α, β, γ y ω), basándose en su movilidad electroforética a pH bajo (la primera con
mayor y la última con menor movilidad) (WIESER, 2007).

Las gliadinas α, β y γ representan 45 a 60% de la gliadina total, tienen seis cisteínas

implicadas en los enlaces intramoleculares. Su estructura está dada por un dominio N-
terminal, constituida por una secuencia no repetitiva, seguida por una cadena repetitiva
rica en glutamina y prolina que representan el 30-50% de la proteína. Posteriormente,
 11

continúa un dominio no repetitivo. El dominio repetitivo contiene la mayoría de los

codos β que contribuyen a la formación de una estructura en espiral, mientras que el
resto de la proteína se compone de hélices α y sería más compacto. La diferenciación
entre α y β gliadinas puede parecer artificial. Mientras que la diferenciación con las
gliadinas está dado por que estas presentan ocho cisteínas en el dominio no repetitivo
(TATHAM et al., 1995).

Las gliadinas ω difieren de α, β y γ gliadinas por su alto peso molecular que varía entre
60-80 kDa y por composición en aminoácidos; debido a su alto contenido de glutamina,
prolina, fenilalanina, y la ausencia de aminoácidos azufrados (cisteína y metionina) y
son por lo tanto desprovistas de puentes disulfuro e incapaces de participar en la
formación de una red de proteínas de enlace no covalente (TATHAM et al., 1995).

En el CUADRO 4 se especifica la composición de aminoácidos en cada grupo descrito

de gliadinas.

CUADRO 4 Composición porcentual de aminoácidos en gliadinas.

Aminoácidos Α (%) Β (%) γ (%) Ω (%)

Triptófano 3 4 6 0
Lisina 5 6 7 3
Histidina 25 13 14 6
Arginina 24 16 15 3
Acido aspártico 30 24 18 2
Treonina 16 15 20 17
Serina 52 54 49 56
Acido glutámico 372 389 391 437
Prolina 155 169 189 300
Glicina 25 25 27 10
Alanina 29 27 30 4
Cistina 19 23 19 0
Valina 40 46 34 4
Metionina 12 6 17 0
Isoleucina 41 42 37 16
Leucina 81 71 72 39
Tirosina 31 33 5 15
Fenilalanina 39 35 32 90
FUENTE: Adaptado de FEILLET (2000).
 12

2.3.2.2.2 Gluteninas. La fracción de gluteninas comprende a una mezcla de proteínas

poliméricas asociadas por enlaces disulfuro, que se caracterizan por presentar diversos
tamaños y cuya masa molecular varía entre 500 y 10.000 kDa. En base a su masa
molecular y por tanto a su movilidad se pueden encontrar dos grupos de gluteninas;
sub-unidades de gluteninas de bajo peso molecular, que presentan una masa que
oscila entre 30- 70 kDa y sub-unidades de gluteninas de alto peso molecular, que varía
entre 65- 90 kDa (WIESER, 2007). En el CUADRO 5 se muestran las composiciones
en aminoácidos de cada grupo de gluteninas.

Las gluteninas de bajo peso molecular pueden ser divididas en tres grupos según su
velocidad de migración en electroforesis de gel (SDS- PAGE). Estas son: tipo A, B y C,
cuya masa molecular varía entre: 40-50, 30-40 y 55-70 kDa respectivamente (WIESER,
2007).

CUADRO 5 Composición porcentual de aminoácidos en las subunidades de

gluteninas
Gluteninas bajo peso Gluteninas alto peso
Aminoácidos
molecular (%) molecular (%)
Triptófano 0,0-0,6 0,6-1,2
Lisina 0,2-0,9 0,6-1,4
Histidina 1,3-1,9 0,5-2,1
Arginina 1,2-2,4 1,1-2,4
Acido aspártico 0,3-1,5 0,4-0,8
Treonina 1,8-2,9 2,9-3,8
Serina 5,4-9,5 5,7-8,8
Acido glutámico 34,0-39,5 35,5-37,9
Prolina 13,7-16,2 10,8-13,2
Glicina 1,0-3,3 17,6-20,0
Alanina 1,7-4,8 2,0-3,7
Cistina 1,9-2,6 0,5-1,1
Valina 3,8-5,0 1,4-2,5
Metionina 0,9-1,6 0,1-0,6
Isoleucina 3,6-4,5 0,5-1,3
Leucina 5,3-8,7 2,9-4,9
Tirosina 1,0-2,2 5,3-7,0
Fenilalanina 3,5-5,5 0,1-0,4
FUENTE: Adaptado de FEILLET (2000).
 13

3 MATERIAL Y MÉTODO

Los análisis del presente estudio fueron realizados en los laboratorios del UMR
IATE (l’ Unité Mixte de Recherches Ingénierie des Agropolymères et Technologies
Emergentes), ubicados en el Campus La Gallarde de la Universidad Montpellier
SupAgro en la ciudad de Montpellier, Francia.

3.1 Materiales

Los utensilios y materiales utilizados para el proceder de la investigación fueron

otorgados por el UMR IATE.

3.1.1 Materia prima. Se utilizó como materia prima trigo blando (Triticum aestivum) de
la variedad Haussman, adquiridas por el laboratorio del UMR IATE. La materia prima
fue revisada y seleccionada con el fin de eliminar restos de material orgánico,
inorgánico y granos en condiciones poco favorables. Posteriormente, se almacenó en
el laboratorio a temperatura refrigeración (4±1°C) en un recipiente cerrado hasta su uso
para análisis y tratamientos.

3.1.2 Equipos y otros materiales. Se utilizaron los siguientes equipos y materiales,

todos ellos proporcionados por el laboratorio del UMR IATE: balanza NILEMA- LITRE
de marca Renaud, Molino marca Brabender Quadrumat Senior, centrifuga marca
Beckman J-30I, osmómetro marca Keller Druckmesstechnik, termostato con circulación
marca Julabo F25, agitador rotatorio marca Heidoloh Reax 2, agitador magnético, rota-
vapor modelo Sorbonne, liofilizador marca Alpha 2-4 LSC Christ y otros materiales
menores de laboratorio.

3.1.3 Solvente. Los solventes requeridos en este estudio fueron: diclorometano,

cloruro de sodio (0,4 M), solución de etanol (55% v/v), poli-etilénglicol (20.000 Da) y
agua destilada.

3.2 Método

El estudio contempla la caracterización del trigo a utilizar para posteriormente realizar

la molienda y obtención de la harina, continuando con el proceso de optimización del
protocolo de extracción de proteínas, recuperación de gliadinas y secado del extracto.
 14

Finalizando con la caracterización de la gliadina, una de las proteínas de reserva del

trigo.

3.2.1 Determinación de la calidad del trigo. El proceso de comercialización requiere

criterios de calidad medibles a través de métodos aprobados por la Asociación
Americana de Químicos Cerealeros (AACC, 2000) y así clasificar a las variedades de
acuerdo a su calidad física y molinera. Para la determinación de la calidad del trigo con
el que se trabajó, se sometió la materia prima a diferentes análisis. Cada una de las
prueba se realizó en triplicado.

3.2.1.1 Peso hectólitro. Corresponde a una de las especificaciones más importantes

del comercio de trigo por su relación significativa con el rendimiento harinero. El peso
hectólitro está relacionado a su vez, con la densidad del grano, su textura y contenido
de proteínas.

Según la Norma Oficial Chilena 1237. Of. 2000, para la certificación del trigo harinero
se requiere de un peso hectólitro mínimo de 70 kg/HL.

Para realizar la medición se requirió de una balanza NILEMA-LITRE de marca Renaud,

conocida normalmente como balanza volumétrica, que relaciona peso/volumen del
grano de trigo expresado en hectolitros de llenado (kg/HL).

Los materiales utilizados son de alta precisión, específicos para la determinación del
peso hectólitro de la muestra.

El proceso se medición se realizó de acuerdo a la metodología de la norma NCh 1.237,

sobre la muestra limpia, en triplicado y se tomó el valor promedio.

3.2.1.2 Peso de mil granos de trigo. Es un fuerte indicador de rendimiento de harina

ya que el porcentaje de endospermo en granos de trigo es una misma variedad es
normalmente mayor en granos más grandes (FEILLET, 2000).

El procedimiento consiste en pesar 30 g de trigo por medio del uso de una balanza de
precisión a 0,01 g. Posterior a ello se lleva la muestra a un contador compuesto de dos
partes que forman un solo bloque; la primera un vibrador el cual permite el movimiento
de los granos y los dirige a la segunda parte correspondiente a una celda fotoeléctrica
que cuenta los granos.
 15

Una vez terminado el proceso, se conoce la cantidad exacta de granos que existen en
30g de trigo y usando la Ecuación 1 se obtiene la masa de mil granos de trigo.

El proceso se medición se realizó de acuerdo a la metodología de la norma NCh 1.237,

sobre la muestra limpia, en triplicado y se tomó el valor promedio.

Ecuación 1

Dónde:
PMG : peso se mil granos secos, g
m : masa de producto contado, g

N : número de granos contados

H : contenido de agua de la muestra, %

La diferencia de resultados entre las repeticiones no debe ser mayor a un 6% para las
muestras de masa superior a 25g.

3.2.1.3 Contenido de humedad del trigo. Corresponde a un parámetro fundamental

pues esta propiedad es determinante al definir el proceso de molienda y el
almacenamiento del trigo, debido que a humedades superiores a 14% pueden
generarse agentes que dañen y contaminen el producto. La medida de la cantidad de
agua en el grano se logra determinar, sometiendo al grano a un proceso de secado,
para posteriormente determinar su masa final y por diferencia de masa se logra
obtener la masa de agua que contiene (FEILLET, 2000).
El contenido de agua se determinó por diferencia de pesos. Se procedió a triturar 5g de
trigo, los que se pesan antes y después de someterlos a secado a 130 ± 3°C durante 2
horas a presión atmosférica. El porcentaje de humedad se determinó usando la
ecuación 2.
 16

Ecuación 2

Dónde:
%H : Humedad del grano, %
m : masa de agua en gramos
M : masa de producto seco en gramos
La reproducción de los resultados es igual a 0,15% del valor absoluto.

3.2.1.4 Dureza del grano. La dureza del grano tiene la influencia en la capacidad de
absorción de agua de las harinas, ya que los trigos de endospermo duro se asocian a
un alto nivel de absorción de agua. En la industria de la panificación se requiere harina
de trigo harinero semiduro o duro, porque favorece el desarrollo y maduración del
gluten durante la fermentación (FEILLET, 2000)

El método utilizado para determinar la dureza PSI (Pounds per Square Inch) es una
adaptación de la norma AACC 55-30 (2000) debido a los materiales disponibles en el
laboratorio.

Una masa de trigo conservada a temperatura ambiente de 21-22g, libre de material

extraño e impurezas, se deposita en un molino KT3303. El producto triturado es
recuperado y depositado sobre un tamiz de 75µm de abertura. Posteriormente se
deposita todo en una cinta que está conectada a un sistema de aspiración. El proceso
se mantiene durante 10 minutos. El producto recuperado en el tamiz es pesado
nuevamente y la dureza del grano se puede obtener según la Ecuación 3.

Ecuación 3

Dónde:
PSI : dureza del grano de trigo, %
m : masa de producto inicial, g

m1 : masa de producto final, g

El CUADRO 6 presenta la clasificación del trigo en función de su dureza (PSI).

3.2.1.5 Vitrosidad y opacidad. La medida de vitrosidad permite determinar si un

trigo será capaz de producir más o menos harina durante la molienda. Un grano es
vítreo, debido a una compacidad elevada entres sus constituyentes del albumen.
 17

Mientras que un grano harinoso que no es translúcido debido a la presencia de aire

entre los granos de almidón. En un lote siempre se presentan estos dos tipos de
granos (FEILLET, 2000). Los granos de trigo duro presentan un gran contenido de
granos opacos, mientras que los granos de trigo blando están formados
particularmente por granos vítreos y ricos en proteínas (FEILLET, 2000).

CUADRO 6 Clasificación de trigo en función de su dureza PSI.

Clasificación PSI (%)

Extra duro <7
Muy duro 8 – 11
Duro 12 – 15
Medio duro 16 – 19
Medio blando 20 – 25
Blando 26 – 30
Muy blando 31 – 35
Extra blando > 35
Fuente: Adaptado deFEILLET (2000)

La metodología de análisis consiste en introducir granos de trigo en un cortador de

granos destinados para el ensayo. El cual permite un control rápido y simple de los
granos dependiendo si son harinosos o vítreos mediante el denominado ensayo de
corte.

3.2.1.6 Granulometría. Esta medida permite tener un perfil del tamaño del grano con
el cual se va a trabajar y de esta manera solamente se tiene en consideración el
tamaño que ha sido encontrado en mayor cantidad.

El protocolo para determinar la granulometría de un lote de grano consiste en pesar

100g de muestra, seleccionar los tamices a utilizar; para efecto del caso se utilizó un
juego de tamices marca Tyler con: 3,5; 2,9; 2,4; 2,2; 2,0 y 1,7 mm de abertura.

La operación de tamizado se realizó en ciclos de 5 min, al final de la cual se pesó cada

tamiz determinando así la cantidad de material retenido en cada uno.

3.2.2 Proceso de obtención de harina. Según KENT y AMOS (1956), se entiende por
molienda la separación del endospermo de la cubierta externas en forma lo más
efectiva y eficiente posible, de modo que la harina acabada, es decir, el endospermo
triturado y pulverizado sea de tamaño fino y uniforme, de buen color y exento de
 18

partículas de salvado. En el proceso de molienda se despoja al grano en mayor o

menor medida de sus partes exteriores, obteniéndose así la harina que se compone
principalmente de endospermo.

El índice de extracción es el porcentaje de harina en la totalidad de los productos que

salen en el molino.

3.2.2.1 Acondicionamiento. La finalidad de esta etapa consiste en que la materia

prima alcance una humedad final de 17%, para así lograr una trituración adecuada del
grano. Para ello se determina la humedad inicial del grano, como ha sido explicado
anteriormente, posterior a ello se sumerge el trigo en una cantidad determinada de
agua como lo muestra la Ecuación 4, previamente calculada y se introduce en un
agitador rotatorio durante una noche. A continuación se determina nuevamente la
humedad final de la materia prima.

Ecuación 4

Dónde:
Mf: agua a agregar en mL/ bidón
m0: masa de agua inicial en porcentaje

m1: masa de agua final en porcentaje

Mg: masa de grano en g/ bidón

3.2.2.2 Molienda. Corresponde a la trituración del grano de trigo hasta ser

transformado en un fino polvo conocido como harina. Para ello se utilizó un molino
Brabender Quadrumat Senior, que permite la obtención del producto deseado; el
proceso tarda aproximadamente cuatro horas para 15 kg de materia prima. Terminado
el proceso se procede al cálculo del rendimiento obtenido a partir de la molienda tal
como lo muestra la Ecuación 5.

Ecuación 5

Donde R: rendimiento del proceso de molienda en porcentaje

mi: masa inicial de trigo en gramos

mf: masa final obtenida de harina en gramos

 19

3.2.3 Proceso de extracción de gliadinas. Se procedió a la elaboración de un

protocolo de extracción con la finalidad de optimizar el proceso de extracción y evitar la
contaminación del producto a extraer (ANEXO 1).

El proceso de extracción consta de distintas etapas, tal como lo muestra la FIGURA 2,

que tienen como finalidad separar cada componente de la harina utilizando la
solubilidad de los mismos en distintos solventes, de manera de obtener la gliadina
pura.

Para realizar la extracción se utilizó la harina obtenida en el proceso de molienda, la

cual ha sido almacenada a temperatura ambiente en un recipiente cerrado. La harina
se distribuyó en recipientes de centrifugación, cada extracción se conformó por seis
recipientes de 37,5 g de materia prima aproximadamente y es sometida a un proceso
continuo de extracción utilizando la solubilidad de los componentes de la harina por
medio de una extracción liquido- liquido (L- L) con la finalidad de extraer cada uno de
los componentes que la conforman.

La primera etapa consiste en la extracción de lípidos, mediante el uso de

diclorometano, seguida por un proceso de eliminación de albúminas y globulinas; cuyo
procedimiento se repite tres veces y se utiliza como solvente una solución de Cloruro
de Sodio (0,4M). Finalmente, se procede a la solubilización de las gliadinas del
extracto, mediante el uso de etanol (55% v/v) como solvente y se separa de las
gluteninas mediante la refrigeración y centrifugación de las muestras; debido a la
propiedad de precipitación de gluteninas a bajas temperaturas. Terminado el proceso
de extracción de la proteína, se procede a eliminar el etanol y cloruro de sodio que
contiene la solución, para ello se deposita la muestra en un rota-vapor de modelo
Sorbonne durante 12 horas aproximadamente y luego se somete a diálisis. La muestra
resultante continúa con el proceso de secado, mediante liofilización, obteniendo el
producto en estudio, es decir, las gliadinas.
 20

FIGURA 2 Proceso de extracción de gliadinas

FUENTE: Elaboración propia

3.2.4 Técnica de estrés osmótico. Esta técnica permite estudiar el comportamiento

de la interacción proteína-proteína cuando es sometida a cambios termodinámicos. Se
escogió un enfoque termodinámico que consiste en variar el potencial químico de la
solución de etanol utilizando la metodología de estrés osmótico. En este método, el
etanol es removido desde la dispersión de gliadina por medio de una diálisis con una
solución de polímero de conocida presión osmótica (BOUCHOUX et al., 2009).
 21

3.2.4.1 Determinación del correcto funcionamiento del osmómetro. El objetivo es

verificar el buen funcionamiento del osmómetro, para ello se prepararon diferentes
concentraciones de PEG en dilución con agua destilada (CUADRO 7). Posteriormente,
se procedió a inyectarlos en el osmómetro realizando la medición durante 20 horas.
Posterior a ello se ingresa la nueva solución de PEG (ANEXO 2).La finalidad de este
procedimiento es determinar la presión osmótica a diferentes concentraciones de PEG
en el tiempo y verificar que los resultados concuerden con los datos de la literatura
(RAND, 1992)

CUADRO 7 Soluciones de referencia PEG 20.000 Da en agua destilada.

Masa
Masa Masa Volumen Concentración Concentración
solución
PEG (g) agua (g) total (ml) PEG (% m/v) PEG (% m/m)
final (g)
18,01 - - 200 9,01 -
34,00 - - 200 17,00 -
37,01 168,42 205,43 200 18,51 18,02
37,01 168,49 205,50 200 18,51 18,01
40,00 - - 200 20,00 -
44,00 - - 200 22,00 -
FUENTE: Elaboración propia.

3.2.4.2 Calibración de PEG en solución de etanol. El objetivo es determinar el

comportamiento de PEG en la solución de etanol (55% v/v), lograr la estabilidad de la
presión ejercida por el polímero en el curso del tiempo y verificar si los datos obtenidos
son los mismos que se obtienen cuando el polímero es disuelto en agua destilada
(ANEXO 2).

La metodología consiste en preparar soluciones de PEG, incorporarlas al osmómetro y

medir la presión osmótica durante 20 horas, como lo muestra el CUADRO 8. A partir de
los resultados obtenidos, se verifica la concordancia con los datos obtenidos en la
bibliografía y se determina el procedimiento estándar para la obtener la presión
osmótica.
 22

CUADRO 8 Soluciones de PEG 20.000 Da diluidas en solución de etanol (55%

v/v).
Masa Masa
Masa Volumen Concentración Concentración
solución solución
PEG (g) total (ml) PEG (% m/v) PEG (% m/m)
etanol (g) final (g)
10,05 195,07 205,12 200,00 5,02 4,90
20,07 166,07 186,14 200,00 10,03 10,78
30,01 159,62 189,63 200,00 15,01 15,83
40,05 151,96 192,01 200,00 20,03 20,86
FUENTE: Elaboración propia.

3.2.4.3 Determinación del efecto de la presión osmótica sobre la concentración

de gliadinas. Esta técnica se basa en el intercambio de agua entre la muestra y un
medio que ejerce una presión osmótica conocida. La gliadina se coloca en una bolsita
de diálisis, la que se sumerge en un depósito que contiene una presión osmótica
determinada, luego de una semana se espera que se haya alcanzado el equilibrio del
potencial químico del agua en ambos lados de la membrana y por lo tanto la presión
osmótica de la muestra será igual a la del polímero en el depósito (PEG) (BOUCHOUX
et al, 2009).

Se trabajó con diversas concentración de PEG, a saber, 5-10- 15,9–20-27,4 –30 –40-
41,2 –50- 57,2 –60 –80 –100 –110- 134,7 y 240,1 gL-1, las cuales fueron disueltas en
una solución de etanol al 55% v/v. Posterior a ello se prepararon las muestras de
gliadinas las cuales fueron introducidas en una bolsita de diálisis de 1mLcm-1,
depositándolas en las soluciones de PEG.

Luego de una semana se determinó la absorbancia de la concentración de PEG y de

las proteínas contenidas en cada bolsita de diálisis (ANEXO 4) y a partir de ello se
logró obtener el perfil de concentración de gliadinas respecto a la presión osmótica.

3.2.5 Análisis de SE- HPLC. La cromatografía liquida de alta resolución de exclusión

molecular (SE- HPLC) es un método apropiado para aislar, caracterizar y comparar
proteínas de granos, harinas o productos de cereales procesados, siendo una de sus
ventajas en comparación con otras técnicas (SDS- PAGE y RP- HEPLC) (ECKERT et
al., 2006).
 23

El principio de la separación en cromatografía de exclusión molecular, se basa en la

exclusión de las proteínas por su peso molecular o volumen hidrodinámico en los
gránulos de gel dependiendo de su porosidad (ECKERT et al., 2006).

El procedimiento consiste en tomar 0,005g de proteína y diluirlo en 10 mL de solución

de etanol (55% v/v). Posteriormente se retira 0,5 mL de la solución madre, se introduce
en un tubo Eppendorf y se agrega 0,5 mL SDS, luego se llevan las muestras a la
columna de HPLC durante 30 minutos por muestra.
 24

4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1 Caracterización del grano de trigo.

Se realizó una caracterización física de un lote de trigo con el cual se trabajó a lo largo
de la experiencia, con la finalidad de determinar su calidad y poder tener una idea del
rendimiento esperado en la obtención de harina y de proteínas. Las variables
estudiadas fueron: peso hectólitro, peso de mil granos de trigo, contenido de agua,
dureza del grano, vitrosidad del grano y su granulometría. En el CUADRO 9 se puede
observar una síntesis de los resultados obtenidos en cada una de las variables
estudiadas.

CUADRO 9 Resumen de los promedios obtenidos para la caracterización del

grano de trigo.
Variables Muestra variedad Haussman
Contenido de agua (%) 12,90
Peso hectólitro (kg/HL) 80,37
Peso de mil granos (kg) 30,21
Granulometría (%) 98,06 > 2 mm
Vitrosidad del grano (%) 36,40~ vítreo
63,60~ harinoso
Dureza del grano (PSI%) 10
Cada uno de los análisis de un lote de trigo de la variedad Haussman fueron realizados
en triplicado y los resultados obtenidos fueron muy similares (ANEXO 5), lo que
muestra que se trabajó con un lote homogéneo a lo largo del estudio.

Los resultados obtenidos fueron comparados por lo establecido en la Norma Chilena

NCh 1.237 (ANEXO 6), para determinar con qué tipo de grano se trabajó y si cumple
con los requisitos de certificación. A partir de la presente base, se determinó que el
trigo de variedad Haussman con el que se desarrolló el proceso de extracción y
caracterización de gliadinas, cumple con los estándares de calidad para trigo harinero
ya que presenta un contenido de agua inferior a 14% y el peso hectólitro se encuentra
entre los parámetros establecidos (77- 80 kg/HL).
 25

A su vez, según los parámetros de calidad que expresa FEILLET (2000), el trigo
presenta una dureza comprendida entre 8 y 10 %PSI, por lo tanto se puede clasificar
como un trigo muy duro.

En general, mediante las pruebas realizadas al trigo de la variedad Haussman, se

puede esperar un alto nivel de proteínas, de endospermo duro que permite la
absorción adecuada de agua en el acondicionamiento y optimo proceso de trituración
y molienda.

4.2 Proceso de obtención de harina de trigo.

Se procedió a determinar la cantidad de agua presente en el grano, según los métodos

descritos anteriormente. Obteniéndose como resultado un 12,9% de agua. Teniendo
esta referencia, se procedió con los procesos de acondicionamiento y molienda. El
CUADRO 10 muestra los resultados obtenidos en este proceso.

CUADRO 10 Resultados obtenidos, a partir del proceso de molienda de trigo.

Condición Acondicionamiento Molienda

inicial
Masa de Cantidad agua Cantidad Masa de Masa Rendimiento
trigo (kg) inicial (%) agua final (%) harina (kg) residuos (kg) (%)
15 12,9 14,9 11,25 3,75 75

Según FEILLET (2000), el rendimiento ideal y esperado en el proceso de obtención de

harina corresponde al 75%, por lo tanto se realizó un proceso satisfactorio que cumple
con las expectativas establecidas a partir de la literatura.

4.3 Proceso de extracción de gliadinas.

Se estableció un protocolo de extracción en base a la solubilidad de los componentes

de la harina, de manera de eliminar cada uno de ellos hasta llegar a la obtener gliadina
(ANEXO 1). Para fines del caso, se elaboró a su vez una carta Gantt, como la que se
presenta en la FIGURA 3, en donde se señala la duración de cada proceso y la
totalidad de días que se necesitan para realizar una extracción.
 26

FIGURA 3 Carta Gantt del proceso de extracción de gliadinas

Como es posible observar en la Carta Gantt (FIGURA 3), se requieren 4 días para
completar una extracción, en donde logra obtener aproximadamente 1,5g de gliadina,
sin embargo, se pueden realizar procesos en paralelo de manera de optimizar el
tiempo de extracción y reducir el periodo de esta etapa del estudio.

Finalizada esta etapa, se logró obtener 14g de extracto seco correspondiente a

gliadinas, con el que se continuó el estudio y se elaboró un protocolo de extracción de
proteínas, el cual ha sido verificado y autorizado para ser utilizado eventualmente en el
laboratorio de UMR IATE.

4.4 Determinación del efecto de la presión osmótica sobre la concentración de

gliadinas.

A continuación, se muestran los resultados obtenidos en el proceso de estudio de la

presión osmótica ejercida por el polímero PEG (20.000 Da) y el comportamiento de la
gliadina a diferentes presiones.

4.4.1 Determinación de la presión osmótica a diferentes concentraciones PEG. Se

realizó un estudio de osmometría con la finalidad de determinar la presión ejercida por
el polímero PEG (20.000 Da). Se ha comenzado con la verificación del correcto
funcionamiento del osmómetro y determinación si los resultados obtenidos concuerdan
con la información obtenida del polímero en solución con agua destilada. Posterior a
ello, se continuo trabajando con el polímero, pero ahora, en solución con etanol al 55%
v/v, determinando su comportamiento y presión (ANEXO 2). Sin embargo, se debió
establecer un método específico de realización ya que a lo largo del estudio se observó
que la solución en etanol es sensible a la variación de temperatura (ANEXO 3), por lo
tanto se procedió a regular la temperatura de trabajo del osmómetro a 20°C y la
 27

temperatura de las soluciones a inyectar. Para ello las soluciones se prepararon en

paralelo, una de ella conteniendo PEG, luego se agitaron durante 2 horas en frascos
cerrados a 20°C para evitar la pérdida de etanol y se inyectaron al osmómetro que se
encuentra a la misma temperatura durante 20 horas.

En la FIGURA 4 se permite observar claramente la presión ejercida por el polímero en

solución en agua destilada y en solución con etanol al 55%, así también se permite
visualizar la concordancia existente entre los resultados obtenidos y la literatura de
referencia.

FIGURA 4 Comparación de los resultados de presión osmótica obtenidos en

función de la concentración en PEG en solución con agua (círculos
rojos) y en solución con etanol (círculos negros), con los datos
entregados por la bibliografía.

Mediante los resultados obtenidos, se verificó que el comportamiento de la solución de

PEG en agua destilada es constante en el tiempo y las curvas obtenidas reflejan este
comportamiento. A su vez, se logra concluir que el osmómetro funciona correctamente,
 28

que las mediciones efectuadas han sido convenientes, concordándose perfectamente

con la bibliografía estudiada.

A partir de los resultados representados en la FIGURA 4, se puede establecer que la

solución de PEG en etanol al 55% v/v puede entregar resultados válidos para la
determinación del efecto de la presión sobre la concentración de gliadinas. A su vez, la
presión ejercida por la solución de PEG en etanol concuerda con los datos obtenidos a
partir de la biografía y por tanto la representación de datos es fidedigna.

4.4.2 Determinación del efecto de la presión osmótica sobre la concentración de

gliadinas. Una vez determinadas la absorbancia de cada una de muestras dializadas
se logró determinar la concentración de cada muestra (ANEXO 4). Los resultados
obtenidos del comportamiento de cada dilución de gliadina se muestran en la FIGURA
5.

FIGURA 5 Concentración de gliadinas en función de la presión osmótica ejercida

por la solución de PEG externa
 29

La compresión osmótica de la dispersión de gliadina produce cambios estructurales en

las proteínas. Las dispersiones equilibradas a bajas presiones osmóticas (~100 Pa)
son fluidos con una viscosidad reducida, mientras que a altas presiones osmóticas (~
3.000 Pa), la viscosidad aumenta en función de la concentración de gliadina y las
dispersiones se comportan como un líquido de moderada viscosidad. Para presiones
que están sobre 10.000 Pa, la viscosidad aumenta considerablemente y se aprecian
pequeñas proporciones de gliadinas en estado sólido.

Mediante la FIGURA 5, es posible observarque al aumentar gradualmente la presión

osmótica la concentración de gliadina aumenta, en consecuencia el volumen disminuye
hasta alcanzar un punto en el cual la presión se mantiene prácticamente constante
mientras, la concentración de la solución proteica continua progresando, en este
intervalo, la solución pasa gradualmente de la fase liquida a la sólida. Según se logró
determinar a partir de la FIGURA 5, este punto se produce a una presión osmótica
aproximada de 1.000 kPa, donde la solución de gliadina ha alcanzado una
concentración de 140 gL-1. Posterior a este intervalo, cualquier aumento de presión
generará un leve y poco significativo aumento en la concentración de gliadinas (la
solución es casi incompresible), por lo que la curva tiende a subir con gran pendiente.
El área bajo la curva, del proceso a presión semi-constante, representa la región en la
cual coexisten en equilibrio las fases líquido-sólido.

4.5 Análisis por SE- HPLC.

La FIGURA 6 muestra los cromatogramas obtenidos por SE- HPLC de la gliadina

extraída a partir de trigo, en donde se observan tres regiones: gluteninas, gliadinas y
albúminas/globulinas, respectivamente. Se observa también, que cada una de las
muestras obtenidas presenta un patrón similar en todos sus peaks y no se observan
diferencias notables entre ellos.

La razón de que el peak correspondiente a gluteninas tenga un tiempo de retención

menor (tiempo de detección más rápido), se debe a que las gluteninas por ser
proteínas poliméricas tienen una masa molecular mayor y eluyen primero según el
principio de separación cromatografía basada en masas moleculares. Las gliadinas por
tener una masa molecular media en comparación con las otras clases de proteínas, se
 30

eluyen después de las gluteninas y por último, las albúminas y globulinas se eluyen al
final por tener una masa molecular mucho menor que las proteínas anteriores.

FIGURA 6 Resultados obtenidos por el análisis SE-HPLC

Como es posible apreciar en la FIGURA 6, los peaks de gliadinas se mantienen

normales, mientras que se observa una gran diferencia en los peaks de gluteninas,
albúminas y globulinas. Si se les compara con un cromatograma de una muestra de
trigo sin tratar (ANEXO 7), se aprecia claramente la disminución proporcional de sus
proteínas, lo cual indica que el proceso de extracción de proteína se ha realizado
exitosamente obteniéndose un producto de alta concentración de gliadinas.
 31

En el CUADRO 11 se presentan los porcentajes de gliadinas obtenidos en cada una de

las muestras extraídas. Los valores oscilan entre 79,5% y 87,6%.

CUADRO 11 Fracción de proteína soluble en etanol 55% v/v, obtenidas con SE-
HPLC.
Muestra variedad Haussman Fracción de gliadina (%)
Muestra 1 81,05
Muestra 2 86,94
Muestra 3 79,52
Muestra 4 85,74
Muestra 5 83,83
Muestra 6 87,64

A pesar de que no se presentan diferencias notables en la comparación de los

cromatogramas, porcentualmente los valores son determinantes ya que sólo se utilizan
como muestras de estudio las muestras que hayan alcanzado un nivel de gliadina
superior al 80%.

Los valores obtenidos, indican que las gliadinas son el tipo de proteínas con mayor
solubilidad en soluciones alcohólicas, según la clasificación de OSBORNE (1907), pero
no así para las otras proteínas ya que según este tipo de clasificación no debiesen ser
solubles.
 32

5 CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados de esta investigación, es posible concluir lo siguiente:

1. El trigo analizado tuvo un contenido de agua de 12,9%, un peso hectólitro de

80,37 kg/HL, un peso de mil granos igual a 30,21 kg, una dureza del grano igual
a 10% PSI y los resultados obtenidos en granulometría muestran que en el lote
utilizado el 98,06% presenta un tamaño superior a 2µm; la vitrosidad indica que
el 36,4% del lote corresponde a granos vítreos.
2. El grano de trigo con el que se trabajó corresponde a trigo duro, con
características aceptables, que permitió deducir que el comportamiento durante
la molienda y extracción de gliadinas sería el adecuado y a su vez permitió
obtener un rendimiento adecuado de productos.
3. Respecto al proceso de molienda, se determinó que a partir de 15 kg de grano
de trigo, se puede obtener 11,25 kg de harina, por lo que, el rendimiento de
harina a partir de trigo fresco es de 75%, aproximadamente, lo que significa que
el comportamiento del grano en el proceso de trituración fue satisfactorio y se
logró tener una masa de harina suficiente para realizar la extracción necesaria
de gliadinas.
4. Se logró estandarizar un protocolo de extracción de gliadinas de 4 días de
duración con el que a partir de 250g de harina para obtener 1,5 g de proteína,
se obtuvo 14g de extracto en un periodo de un mes, el cual presenta sobre un
80% de gliadinas, según lo demostró el análisis realizado por SE- HPLC.
5. La aplicación de la técnica de estrés osmótico entregó resultados satisfactorios
que permitieron visualizar claramente el comportamiento de la gliadinas en
función de la presión osmótica, pudiéndose concluir que la dispersión de
gliadinas actúa según las leyes termodinámicas, que suponen que a
temperatura constante la concentración aumenta en función a la presión
ejercida, hasta alcanzar un punto en que se genera un gradual cambio de fase
(liquido-sólido) a presión constante y posteriormente alcanza la compresibilidad
máxima de la solución donde se detiene paulatinamente el aumento de la
concentración de gliadinas.
 33

6 BIBLIOGRAFÍA

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 35

7 ANEXOS

ANEXO 1 Protocolo de extracción de extracción de gliadinas.

Preparación de solventes
Solución de sal:
NaCl 3,56g
H2O 800 ml
H2O Total 1000 ml

Solución de etanol:
C2H6O 83,3g
H2O 62,7g

Las cantidades establecidas satisfacen a la realización de una extracción

1. Extracción de lípidos
Duración: 2h 20 minutos
Metodología:
Depositar 500 gramos de harina en un vaso precipitado de 3 litros.
Adicionar 1 litro de diclorometano
Mezclar los sustratos utilizando un agitador magnético durante 30 minutos
Filtrar la dispersión con un equipo de vacío
Repetir la operación tres veces
2. Extracción de albúminas y globulinas
Duración: 4 horas
Metodología:
a) Etapa 1:

Pesar 37.5 g de harina

Adicionar 150 ml de NaCl (0.4M) a 37.5 g de harina
Agitar la solución durante 30 minutos utilizando un agitador rotatorio
Centrifugar la solución a 20°C durante 10 minutos a 6000 rpm
Mantener el sedimento obtenido a partir de la centrifugación
 36

b) Etapa 2:

Dispersar el sedimento manualmente con 150 ml de solución de NaCl (0.4M)

Equilibrar los tubos
Agitar la solución durante 30 minutos
Equilibrar los tubos
Centrifugar la solución a 20°C durante 10 minutos a 6000 rpm
Mantener el sedimento obtenido a partir de la centrifugación
c) Etapa 3:

Dispersar el sedimento manualmente con 150 ml de solución de NaCl (0.4M)

Equilibrar los tubos
Agitar la solución durante 30 minutos
Equilibrar los tubos
Centrifugar la solución a 20°C durante 10 minutos a 6000 rpm
Mantener el sedimento obtenido a partir de la centrifugación
3. Extracción de gliadinas
Duración: 1 hora
Metodología:
Dispersar el sedimento manualmente con la solución de etanol (96%)
Equilibrar los tubos
Agitar la solución durante 30 minutos
Equilibrar los tubos
Centrifugar la solución a 20°C durante 10 minutos a 6000 rpm
Mantener el sobrenadante obtenido a partir de la centrifugación
Equilibrar los tubos
4. Precipitación de gluteninas
Duración: 2h 15 minutos.
Metodología:
Conservar el sobrenadante a 4°C durante 2 horas
Equilibrar los tubos
Depositar los contenedores en hielo durante 15 minutos
Equilibrar los tubos
Pre- enfriar la centrifuga a 0°C durante 15 minutos a 100 rpm
 37

Centrifugar la solución a 2°C durante 10 minutos a 25000 g

Mantener el sobrenadante obtenido a partir de la centrifugación
5. Eliminación de etanol y NaCl
Duración: 6h 30 minutos.
Metodología:
Introducir la solución de gliadina en una membrana de diálisis
Depositar la membrana con la solución en cubetas con agua desionizada
Realizar el cambio de agua 2 veces cada 3 horas en una proporción 1:10
6. Liofilización
Duración: 26 horas
Metodología:
Congelar la solución proveniente de la diálisis
Liofilización
 38

ANEXO 2 Determinación de la presión osmótica ejercida a diferentes

concentraciones de PEG 20.000 Da.

La solución de PEG ha sido estudiada utilizando dos solventes, el agua destilada para
colaborar el correcto funcionamiento del osmómetro y la concordancia de los
resultados obtenidos con la bibliografía estudiada. El segundo solvente etanol (55% v/v
a 20°C), debido a su afinidad con la gliadina. En las siguientes figuras se representan
el comportamiento del polímero en el tiempo a diferentes concentraciones y en
solución con agua y con etanol, respectivamente.
39
 40

ANEXO 3 Estudios del comportamiento de PEG en solución etílica (55%v/v) sin

regulación de temperatura.

La solución de PEG ha sido estudiada a diferentes situaciones, debido a que se ha

comprobado que el polímero en solución con etanol al 55% v/v, es sumamente
sensible a la variación temperatura, por este motivo se realizaron mediciones a
temperatura ambiente con la finalidad de comprobar la hipótesis y realizar controles
para mantener constante la presión osmótica en el tiempo.

La siguiente figura, representa los resultados obtenidos de tres soluciones de PEG a

diferente concentración, expuestos a temperatura ambiente.
 41

ANEXO 4 Determinación de la presión osmótica y concentración de gliadinas

mediante espectrometría

Determinación de la presión
Determinación de la concentración de PEG
osmótica
Presión
[PEG] [PEG] log P
[PEG] i A600nm Promedio Osmótica Promedio
Eppendorf real (dynes/cm2)
(kPa)
5 A 0,401 0,685 5,302 20,059
5 A 0,376 0,642 0,69 4,3 5,252 17,873 20,46
5 A 0,437 0,747 5,37 23,459
5 B 0,414 0,707 5,327 21,252
5 B 0,409 0,699 0,7 4,4 5,318 20,789 20,67
5 B 0,4 0,683 5,3 19,969
5 C 0,38 0,649 5,26 18,213
5 C 0,386 0,659 0,65 4,1 5,273 18,731 18,19
5 C 0,373 0,637 5,246 17,62
10 A 0,4 0,683 5,885 76,712
10 A 0,399 0,682 0,67 8,4 5,883 76,312 73,75
10 A 0,378 0,646 5,834 68,219
10 B 0,432 0,738 5,955 90,191
10 B 0,398 0,68 0,74 9,2 5,88 75,914 90,23
10 B 0,463 0,791 6,019 104,58
10 C 0,407 0,695 5,901 79,545
10 C 0,519 0,887 0,76 9,5 6,127 134,099 98,56
10 C 0,413 0,706 5,914 82,024
30 A 0,507 0,866 7,142 1387,916
30 A 0,591 1,01 0,96 32 7,325 2111,928 1860,7
30 A 0,588 1,005 7,319 2082,247
30 B 0,452 0,772 7,01 1022,346
30 B 0,403 0,689 0,74 24,6 6,88 758,733 911,25
30 B 0,44 0,752 6,979 952,682
30 C 0,483 0,825 7,086 1218,718
30 C 0,482 0,824 0,83 27,5 7,084 1212,001 1218,73
30 C 0,484 0,827 7,088 1225,461
40 - 0,394 0,673 7,325 2111,928
40 - 0,547 0,935 0,84 41,9 7,735 5434,486 4155,56
40 - 0,529 0,904 7,692 4920,279
 42

(Continuación ANEXO 4)
Determinación de la presión
Determinación de la concentración de PEG
osmótica
Presión
[PEG] [PEG] log P
[PEG] i A600nm Promedio Osmótica Promedio
Eppendorf real (dynes/cm2)
(kPa)
41,2 A 0,501 0,856 7,622 4192,495
41,2 A 0,477 0,815 0,82 40,9 7,56 3634,119 3686,23
41,2 A 0,458 0,783 7,509 3232,088
41,2 B 0,37 0,632 7,249 1775,119
41,2 B 0,349 0,596 0,61 30,4 7,18 1513,443 1600,67
41,2 B 0,349 0,596 7,18 1513,443
41,2 C 0,39 0,666 7,312 2052,867
41,2 C 0,406 0,694 0,68 33,9 7,361 2296,417 2153,74
41,2 C 0,394 0,673 7,325 2111,928
50 A 0,44 0,752 7,46 2881,931
50 A 0,315 0,538 0,69 34,7 7,061 1149,484 2455,33
50 A 0,463 0,791 7,523 3334,583
50 B 0,427 0,73 7,423 2646,712
50 B 0,527 0,9 0,82 41,2 7,687 4865,437 3845,25
50 B 0,494 0,844 7,605 4023,601
50 C 0,65 1,111 7,963 9175,238
50 C 0,628 1,073 1,04 52,2 7,917 8252,026 7690,67
50 C 0,554 0,947 7,752 5644,734
57,2 - 1,478 2,525 7,837 6864,168
57,2 - 1,454 2,484 2,46 49,3 7,815 6532,514 6383,95
57,2 - 1,394 2,382 7,76 5755,162
60 - 1,733 2,961 8,05 11209,472
60 - 1,853 3,166 3,14 62,7 8,141 13846,212 13538,18
60 - 1,922 3,284 8,192 15558,857
80 - 2,168 3,704 8,687 48688,627
80 - 2,458 4,2 3,88 97 8,878 75433,959 58046,29
80 - 2,185 3,733 8,699 50016,295
100 - 1,855 3,169 8,887 77111,007
100 - 1,988 3,397 3,28 109,4 8,994 98694,811 87757,38
100 - 1,922 3,284 8,942 87466,319
 43

(Continuación ANEXO 4)

Determinación de la concentración de PEG Determinación de la presión osmótica

Presión
[PEG] [PEG] log P
[PEG] i A600nm Promedio Osmótica Promedio
Eppendorf real (dynes/cm2)
(kPa)
134,7 A 1,545 2,64 9,237 172699,045
134,7 A 1,575 2,691 2,73 136,3 9,268 185488,743 196044,55
134,7 A 1,668 2,85 9,362 229945,849
134,7 B 1,465 2,503 9,152 141957,249
134,7 B 1,473 2,517 2,52 125,9 9,161 144821,746 144959,1
134,7 B 1,482 2,532 9,171 148098,317
134,7 C 2,016 3,444 9,678 476352,665
134,7 C 2,032 3,472 3,36 167,9 9,691 491359,831 435575,55
134,7 C 1,847 3,156 9,53 339014,16
240,1 - 1,885 3,221 10,817 6560722,67
240,1 - 1,87 3,195 3,14 314,3 10,801 6330680,73 5926030
240,1 - 1,764 3,014 10,689 4886686,62

Determinación de la concentración de gliadinas

[PEG] i A280nm [gliadinas] Eppendorf Promedio [gliadinas] real
5 A 0,1 0,137
5 A 0,1 0,141 0,143 14,3
5 A 0,1 0,151
5 B 0,1 0,114
5 B 0,1 0,125 0,133 13,3
5 B 0,1 0,158
5 C 0,1 0,135
5 C 0,1 0,12 0,127 12,7
5 C 0,1 0,127
10 A 0,1 0,255
10 A 0,1 0,25 0,252 25,2
10 A 0,1 0,25
10 B 0,1 0,255
10 B 0,1 0,215 0,231 23,1
10 B 0,1 0,223
10 C 0,1 0,245
10 C 0,1 0,252 0,246 24,6
10 C 0,1 0,241
 44

(Continuación ANEXO 4)

Determinación de la concentración de gliadinas

[PEG] i A280nm [gliadinas] Eppendorf Promedio [gliadinas] real
30 A 0,6 1,112
30 A 0,7 1,179 1,215 121,5
30 A 0,8 1,354
30 B 0,6 0,989
30 B 0,5 0,959 1,01 101
30 B 0,6 1,084
30 C 0,9 1,555
30 C 0,7 1,291 1,394 139,4
30 C 0,8 1,337
40 - 1,4 2,503
40 - 1,4 2,478 2,516 251,6
40 - 1,5 2,566
41,2 A 0,8 1,356
41,2 A 0,7 1,266 1,314 131,4
41,2 A 0,8 1,319
41,2 B 0,6 1,112
41,2 B 0,6 1,115 1,079 107,9
41,2 B 0,6 1,01
41,2 C 0,7 1,277
41,2 C 0,8 1,339 1,295 129,5
41,2 C 0,7 1,268
50 A 1,7 2,902
50 A 1,5 2,725 2,963 296,3
50 A 1,9 3,263
50 B 1,7 2,966
50 B 1,6 2,872 2,854 285,4
50 B 1,5 2,725
50 C 1,7 2,997
50 C 1,7 2,992 2,996 299,6
50 C 1,7 2,997
57,2 - 1,5 2,588
57,2 - 1,4 2,45 2,463 246,3
57,2 - 1,3 2,352
60 - 1,6 2,785
60 - 1,5 2,588 2,729 272,9
60 - 1,6 2,814
 45

(Continuación ANEXO 4)

Determinación de la concentración de gliadinas

[PEG] i A280nm [gliadinas] Eppendorf Promedio [gliadinas] real
80 - 1,7 3,017
80 - 1,6 2,86 2,976 297,6
80 - 1,7 3,052
100 - 1,9 3,407
100 - 2,3 4,028 3,99 399
100 - 2,6 4,535
134,7 A 2,2 3,875
134,7 A 2,4 4,292 4,178 417,8
134,7 A 2,5 4,366
134,7 B 2,4 4,236
134,7 B 2,2 3,863 4,031 403,1
134,7 B 2,3 3,995
134,7 C 2,2 3,954
134,7 C 2,3 3,998 3,937 393,7
134,7 C 2,2 3,858
240,1 - 2,4 4,195
240,1 - 2,3 4,13 4,009 400,9
240,1 - 2,1 3,703
240,1 - 0,6 1,129
240,1 - 0,6 1,073 0,827 82,7
240,1 - 0,2 0,278
240,1 - 0,2 0,278
240,1 - 0,2 0,322 0,308 30,8
240,1 - 0,2 0,325
 46

ANEXO 5 Resultados obtenidos en la caracterización del grano de trigo

1. Contenido de agua en el grano

Masa inicial trigo Masa trigo seco Masa de agua evaporada Contenido agua en
(gr) (gr) (gr) base seca (%)
5,00 4,35 0,65 12,93
5,01 4,37 0,64 12,77
5,02 4,37 0,64 12,84

2. Peso hectolitrico (kg/HL)

Muestras Peso hectolitro (kg/HL) Promedio Desviación estándar

Muestra 1 76,9
Muestra 2 83,1 80,37 3,16
Muestra 3 81,1

3. Peso de mil granos (kg)

Masa de Numero Contenido Desviación

Muestras PMG (gr) Promedio
producto (gr) de granos de agua (%) estándar
Muestra 1 30,054 678 12,9 38,61
Muestra 2 30,097 669 12,9 39,18 39,21 0,62
Muestra 3 30,006 656 12,9 39,84
 47

4. Granulometría (%)
Tamaño Muestra 1 Muestra 1 Muestra 1 Desviación Fracción de
Promedio
tamiz (mm) (gr) (gr) (gr) estándar producto (%)
3,5 0,7 0,7 0,7 0,70 0,00 0,70
2,9 50,5 50,5 47,4 49,47 1,79 49,63
2,4 43,7 43,4 46,9 44,67 1,94 44,82
2,2 2,5 2,4 2,5 2,47 0,06 2,47
2 0,5 0,5 0,3 0,43 0,12 0,43
1,75 1,4 1,7 1,3 1,47 0,21 1,47
Base 0,5 0,4 0,5 0,47 0,06 0,47
Total 99,8 99,6 99,6 99,67 4,17 100

5. Vitrosidad del grano (%)

Muestras Vitro Ligeramente harinoso Harinoso
Muestra 1 37 41 25
Muestra 2 41 39 28
Muestra 3 39 39 32
Total 117 119 85
Total (%) 36,4 37,1 26,5

6. Dureza del grano (PSI%)

Muestras Masa inicial (gr) Masa final (gr) Dureza PSI Clasificación
Muestra 1 21,6 19,5 10
Muestra 2 21,8 19,7 10 Muy Duro
Muestra 3 21,8 19,8 9
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ANEXO 6 Norma Chilena NCh 1.237

La presente Norma de Calidad ha sido elaborada por la Bolsa de Productos de Chile y

su objetivo consiste en establecer las características y requisitos que debe cumplir el
trigo harinero.
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ANEXO 7 Perfil típico de una muestra de harina por SE- HPLC