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Manual Micologia
Manual Micologia
De MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICOLOGÍA
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INDICE
Página
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Prólogo
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REGLAMENTO DEL LABORATORIO
2.-Traer bata blanca limpia, con botones y entrar con ella ya puesta
3.- Las mochilas serán colocadas en los cajones o en el lugar indicado por el
profesor
4.-El lugar de trabajo dentro del laboratorio será opcional para el alumno pero a
partir de la primera practica ese será su lugar de trabajo
5.-En la mesa de trabajo solo tendrá el manual de practicas y los elementos para
trabajar (lápices, plumas, cerillos, maskin tape, etc.)
6.-No se debe comer ni tomar líquidos dentro del laboratorio y mucho menos
durante la realización de la práctica
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Práctica No. 1.
Seguridad en el Laboratorio
Introducción.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
Material a emplear.
Acetatos y diapositivas
Desarrollo de la práctica.
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Reporte.
Cuestionario
4.- De los factores que pueden alterar la seguridad cual considera el más importante
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Práctica No. 2
Introducción.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
1.- Preparar de 4 a 5 tubos con 9 ml de agua destilada, o bien, solución salina isotónica,
esterilizar y numerar del 1 al 5.
2.- Se suspende en el tubo 1, un ml, o bien, un gramo de alimento ó muestra a analizar.
3.- Homogenizar perfectamente la prueba.
4.- con ayuda de una pipeta estéril, tomar 1 ml del tubo 1 y traspasarlo al tubo 2; con otra
pipeta estéril, se toma una alícuota de 1 ml y se lleva al tubo 3; así sucesivamente hasta
llegar al tuvo 5.
5.- De las dos últimas, tomar 1 ml de cada una y depositarlos respectivamente en las
placas de Petri estériles y vacías.
6.- Adicionar aproximadamente 20 ml del medio PDA o SDA, estéril, fundido y enfriado a
45ºC.
7.- Homogenizar por rotación de las placas sobre la mesa.
8.- Dejar solidificar e incubar a 28ºC por 4 a 5 días.
9.- Hacer observaciones cada 48 hrs. hasta la aparición de colonias características de
hongos.
B).- Técnica de siembra por puntos en placa o tubo (sustratos sólidos poco
contaminados).
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3.- Incubar a 28ºC durante 3 a 4 días observando el desarrollo alrededor de los
fragmentos cada 48 hrs.
1.- Distribuir placas con medio SDA o PDA en los sitios donde se desee hacer el
aislamiento.
2.- Destaparlas y exponerlas al ambiente de 5 a 10 minutos, taparlas.
3.- Incubar a 28ºC durante 4 a 5 días y observando cada 48 horas hasta la aparición de
colonias de hongos.
Material a emplear.
1.- Suelo.
2.- Refrescos embotellados.
3.- Granos (arroz, trigo, fríjol, etc.)
4.- Alimento (chocolate, yogurt, queso, etc.)
5.- Placas con medio SDA o PDA.
6.- Tubos con tapón de rosca con medio SDA o PDA.
7.- Tubos con solución salina isotónica, o bien, agua estéril.
8.- Placas de Petri y pipetas de 1 mL estériles.
Desarrollo de la práctica.
Cuestionario
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Práctica No. 3.
Introducción.
- Aspecto
- Consistencia.
- Pigmentación de la colonia.
- Difusión de pigmento al medio.
- Luz reflejada.
- Luz transmitida.
- Bordes.
- Tabicado o septado.
- Cenocítico.
- Hialino.
- Pigmentado ( fugilaginoso, carotenoide )
- Macrosifonado
- Microsifonado.
Objetivo.
El alumno será capaz de diferenciar las colonias de los hongos y los diversos tipos
de estructuras básicas, como por ejemplo, el micelio por medio de técnicas de
observación en fresco o directa y algunas preparaciones facilitadas por el profesor,
valorando estos parámetros como fundamentales en la identificación de los hongos.
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Técnicas a emplear.
1.- Con el asa micológica en ángulo de 90º tomar un pequeño fragmento de loas colonias
con morfología diferente y depositarlo en un tubo con medio inclinado PDA o SDA.
2.- Incubar a 28ºC.
3.- Observar cada 40 horas el desarrollo de las colonias.
1.- Sobre un porta objetos depositar una gota de colorante azul de algodón lactofenol.
2.- Con el asa micológica tomar un pequeño fragmento de la colonia y colocarlo sobre el
porta objetos.
3.- Agregar una gota de alcohol al 70% (esto es necesario solo en el caso de hongos con
esporulación abundante).
4.- Dilacerar el fragmento de la colonia con ayuda da agujas de disección o bien con la
misma asa micológica.
5.- Colocar sobre la preparación un cubre objeto evitando formar burbujas de aire.
6.- Observar al microscopio a seco débil y seco fuerte, nunca usar aceite de inmersión.
Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
a.- Hifa.
b.- Micelio.
c.- Micelio macrosifonado septado.
d.- Micelio macrosifonado cenocítico.
e.- Micelio septado fugilaginoso.
f.- Micelio microsifonado.
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Cuestionario
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Práctica No. 4.
Introducción.
B).- Conidiosporas.
C).- Esporangiosporas.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
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Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
a.- Artrosporas.
b.- Blastosporas.
c.- Clamidosporas.
d.- Esporangiosporas.
e.- Conidiosporas.
f.- Macroconidias.
g.- Dictiosporas.
h.- Fialosporas
Cuestionario
2.- Mencione los grupos de esporas por las cuales se reproducen los hongos
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Práctica No. 5.
Introducción.
Objetivo.
Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
a.- Rhizopus.
b.- Mucor.
c.- Aspergillus.
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d.- Penicillum.
e.- Geotrichum.
f.- Hormodendrum.
Cuestionario
1.-Que parámetros se deben considerar para hacer una identificación microscópica de los
hongos
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Práctica No. 6.
DERMATOFITOS (Tiñas)
Introducción.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
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b).- Se deposita un pequeño fragmento de muestra y se deja reposar por 10
minutos.
c).- Se deposita un cubre objetos sobre la preparación, tratando de no formar
burbujas de aire y se deja reposar la muestra por 15 minutos.
d).- La preparación se observa al microscopio con el objetivo seco débil y seco
fuerte, tratando de buscar la fase parasitaria del hongo.
8.- En zona de esterilidad junto a un mechero, la muestra clínica sobrante se siembra por
la técnica de punto en placa y en tubos con medios de cultivo que contengan SDA, PDA,
Agar microbiótico, etc.
9.- Se encuban las placas a 28ºC durante 4 a 5 días haciendo la revisión de las siembras
cada 48 horas harta la aparición de las colonias características.
Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
1.- Hacer preparaciones en fresco con las muestras de pelo y/o escamas, de piel y/o
uñas.
2.- Buscar artrosporas e hifas ramificadas (fase parasitaria común de los dermatofitos)
3.- Cultivar las muestras clínicas por la técnica de punto en placa o en tubo, empleando
los diversos medios de cultivo.
4.- Hacer microcultivo de las cepas tipo proporcionadas por el profesor.
5.- Hacer la descripción macroscópica de las cepas tipo proporcionadas por el profesor.
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Dibujos.
Cuestionario
4.- ¿Qué solución se emplea para realizar el en fresco de una muestra de tiña?
5.- ¿Qué se debe observar en la preparación en fresco para determinar que se trata de
una tiña?
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Práctica No. 7.
Introducción.
Por examen microscópico las macroconidias son raras o no existen en algunas especies,
a menos que el hongo se desarrolle sobre un medio de cultivo apropiado y se observan
como grandes estructuras fusiformes en mazo, de pared gruesa o lisa de 4 a 6 micras de
ancho por 10 a 50 micras de longitud.
Pueden verse también otras estructuras como micelio en raqueta, clamidosporas y
cuerpos nodulares o hifas en espiral.
Por examen microscópico solo producen grandes macroconidias de pared delgada, lisas,
multitabicadas y en mazo. En el micelio se ven clamidosporas e hifas en raqueta, este
género solo incluye una especie (E. floccosum )
Objetivo.
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Material a emplear.
Desarrollar la práctica.
Dibujos.
Cuestionario
4.- ¿Que poseen los Dermatofitos para poder degradar este sustrato?
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Práctica No. 8.
Pitiriasis versicolor
Introducción.
Micosis superficial causada por Malassezia furfur, afecta sobre todo tronco y raìces
de extremidades, se caracteriza por manchas lenticulares asintomáticas de color rosado,
marrón o hipocromicas cubiertas de escama fina y de evolución crònica.
Su distribución es cosmopolita , afecta a ambos sexos con ligero predominio en mujeres,
es rara en niños y ancianos pero se ha observado desde antes de las dos semanas de
edad hasta después de los 90 años , con predominio de los 20 a los 30 años de edad, se
manifiesta en cualquier raza y nivel socioeconómico.
Se consideran como factores predisponentes desnutrición, infeccioines crónicas,
embarazo, administración de glucocorticoides, aplicación de aceites y lubricantes en la
piel , uso de prendas sinteticas, no se ha demostrado contagio.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
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8.- En zona de esterilidad junto a un mechero, la muestra clínica sobrante se siembra por
la técnica de punto en placa y en tubos con medios de cultivo que contengan SDA, PDA,
Agar Micobiótico, etc a los cuales se les agrega 5% de aceite de oliva
9.- Se encuban las placas a 37ºC durante 4 a 5 días haciendo la revisión de las siembras
cada 48 horas harta la aparición de las colonias características.
Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
Cuestionario
4.- ¿Qué solución se emplea para realizar el en fresco de una muestra de Pitiriasis?
5.- ¿Qué se debe observar en la preparación en fresco para determinar que se trata de
una Pitiriasis?
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Práctica No. 9
CROMOMICOSIS Y ESPOROTRICOSIS
(MICOSIS SUBCUTÁNEAS)
Introducción.
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El género Fonsecae comprende a las especies siguientes: F. pedrosoi, F.
compacta, F, dermatitidis, especialmente F. pedrosoi esporula de tres maneras diferentes:
acrotecas, cladosporios y por fiálides.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
Dibujos.
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Cuestionario
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CRIPTOCOCOSIS
(MICOSIS OPORTUNISTAS)
Introducción.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
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2.- Con pipeta Pasteur estéril separar cuidadosamente el sobrenadante y pasarlo a un
tubo estéril.
3.- Utilizar el sedimento para las pruebas diagnósticas de rutina.
Material a emplear.
Desarrollo de la práctica.
Dibujos.
Cuestionario
3.- ¿Cuáles son los cuadros clínicos mas graves que puede ocasionar este hongo?
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CANDIDIASIS
(MICOSIS OPORTUNISTA)
Introducción.
La Candidiasis, por los diversos cuadros clínicos que presenta, puede causar desde
una micosis superficial, una subcutánea, hasta una profunda o bien comportarse como
oportunista. Candida albicans puede causar infección aguda o subaguda, produciendo
lesiones en boca, vagina, piel, uñas, bronquios, pulmones y ocasionalmente, septicemia,
endocarditis o meningitis.
Como pueden aislarse cepas patógenas de Candida albicans en piel normal,
mucosa oral y vaginal normales y en la materia fecal de individuos sanos, salta a la vista
que la mayor parte de las infecciones tienen un origen endógeno y la determinación de la
fuente de infección constituye un problema tan difícil como en el caso de infecciones de
Staphylococcus aureus.
La presencia de Candida en el individuo normal explica la diseminación durante las
enfermedades debilitantes, padecimientos malignos del sistema hamatopoyético,
diabetes, lupus eritemetoso, enfermedades granulomatosas, etc...
La Candidiasis ataca a personas de todas las edades y razas y en ambos sexos,
habiéndose reconocido ciertos factores predisponentes. Los antibióticos de amplio
espectro y las drogas citotóxicas favorecen la infección por Candida albicans y otras
especies de Candida.
Actualmente, Candida albicans y Candida stellatoidea son los agentes etiológicos
que se presentan con mayor frecuencias es casos de candidiasis, pero existen otras
especies también capaces de producir enfermedad en el hombre: Candida krusei;
Candida tropicalis; Candida guillemondii; Candida pseudotropicalis; Candida parakrusei.
Objetivo.
El alumno será capaz de seleccionar las tácticas de trabajo que lo lleven a la identificación
de Candida albicans a partir de diversos especímenes clínicos.
Técnicas a emplear.
1.- El paciente debe presentarse si haber tomado alimentos, con aseo bucal hecho al
menos 12 horas antes de tomar la muestra.
2.- Se coloca al paciente sentado en posición odontológica. Auxiliarse con una lámpara
adecuada para visualizar perfectamente la cavidad oral.
3.- Mediante un abatelenguas estéril sujetar la lengua e introducir un hisopo estéril,
raspando con la punta del algodón las partes más afectadas de las amígdalas, sin tocar
úvula.
4.- Repetir la operación con otro hisopo estéril.
5.- Se colocan los hisopos dentro de un tubo con solución salina estéril.
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1.- La paciente debe presentarse sin aseo o aplicación de medicamentos vaginales por lo
menos 24 horas antes de la toma de la muestra y sin estar mestruando, a menos que sea
estrictamente necesario.
2.- Se coloca a la paciente en posición ginecológica y se introduce en la vagina un espejo
vaginal en posición paralela a los labios; se debe ir rotando el espejo con mucho cuidado
hasta tenerlo en posición horizontal. Se localiza con cuidado el cuello y se fija el espejo
(de preferencia evitar el uso de sustancias lubricantes).
3.- Se toma la muestra con dos hisopos estériles del sitio donde se localice la lesión (de
preferencia del fondo del saco y cuello de la matriz).
4.- Uno de los hisopos se rota sobre un porta objetos, para tinción de Gram.
5.- Se introducen los dos hisopos en un tubo con solución salina isotónica.
Tinción de Gram.
1.- Depositar suavemente el inóculo del hisopo rotándolo sobre la superficie del medio de
cultivo, en la zona periférica de uno de los sectores de la placa.
2.- Extenderlo con el asa bacteriológica (prevenir flameada y enfriada en el medio), sin
separarla de la superficie del medio: dibujar de 4 a 5 trozos en zig-zag continuo y
separado.
3.- Quemar el asa y enfriar dentro del medio.
4.- Repetir la operación anterior cuidando de tocar solamente los extremos de las últimas
estrías.
5.- La siguiente estría se lleva hasta el centro del medio sin tocar en ningún momento las
estrías de los otros sectores.
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Identificación rápida de Candida albicans.
1.- Inocular una pequeña cantidad de células en 0.5 ml del suero (de preferencia de
pacientes diabéticos).
2.- Incubar a 37ºC en agitación durante 30 a 60 minutos o en condiciones estacionarias
durante 2 horas.
3.- Montar entre portada y cubre objetos una gota de la suspensión y observar al
microscopio a seco débil y seco fuerte.
1.- Marcar en dos partes iguales el reverso de las placas de Petri con medio Oxgall y
Clamidosporas o bien Harina de Maíz.
2.- En uno de los sectores de cada medio, descargar el inóculo de la cepa problema,
trazando un zig-zag abierto con el asa, procurando no sobrepasar la superficie de 2 cm
cuadrados.
3.- Flamear el asa y repasar la estría en sentido contrario.
4.- Flamear el cubre objetos y colocarlo sobre la siembra, presionándolo ligeramente con
el extremo contrario del asa.
5.- Repetir la misma operación en el sector contrario y con cepa testigo.
6.- Incubar las placas a 28ºC durante 48 a 96 horas.
7.- Destapar las placas y observar al microscopio directamente sobre el agar y cubre
objetos a seco débil y seco fuerte.
De la cepa problema hacer una suspensión en solución salina estéril para sembrar los
medios para la fermentación y asimilación de carbohidratos.
Zimograma:
1.- Utilizar una serie de tubos de hemólisis conteniendo cada uno 4 ml de medio base de
Wickerham y 1 ml de los azúcares a probar al 6%. Adicionar una campana de Durham
como indicador de la producción de gas.
2.- Inocularlos con dos gotas de la suspensión.
3.- Incubar a 28ºC durante 72 horas.
4.- Hacer las lecturas de producción de ácido y gas.
Auxonograma.
1.- Utilizar una serie de tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca, conteniendo cada uno
4.5 ml del medio base y 0.5 ml de los azúcares a probar al 5%.
2.- Inocular con dos gotas de la suspensión.
3.- Incubar a 28ºC y observar el crecimiento cada 48 horas.
Material a emplear.
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3.- Exudado vaginal.
4.- Suero humano.
5.- Placas Petri con:
- Gelosa sangre.
- Saboraud dextrosa.
- Clamidospora.
- Oxgall y Biggy.
6.- Tubos de medio de:
- Saboraud inclinado.
- Micobiotico inclinado.
7.- Medio base de Wickerham.
8.- Medio base para asimilación de carbohidratos.
9.- Solución salina estéril.
10.- Abate lenguas e hisopos estériles.
11.- Pipetas Pasteur estériles.
12.- Equipo de tinción de Gram.
13.- NaOH o KOH al 10%.
14.- Preparaciónes fijas.
Desarrollo de la práctica.
Dibujos.
Cuestionario
2.-¿Cuáles son los cuadros clínicos que con mayor frecuencia produce Candida albicans?
3.-Para la producción de Clamidosporas, ¿en qué medio de cultivo se debe hacer crecer a
Candida?
5.- ¿Qué pruebas de laboratorio se utilizan para determinar la especie de este hongo?
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GEOTRICOSIS
(MICOSIS OPORTUNISTAS)
Introducción.
Objetivo.
Familiarizar al alumno con la búsqueda de la fase parasitaria del hongo a través del
examen en fresco y que a la vez conozca la morfología colonial macroscópica del agente
etiológico.
Técnicas a emplear.
Material a emplear.
1.- Frascos de boca ancha estériles, placas Petri esteriles, medio de transporte
2.- KOH al 10%.
3.- Asa micologica.
4.- Porta y cubre objeto.
5.- Agar Saboraud y/o Agar Papa Dextrosa.
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Desarrollo de la práctica.
Dibujos.
Cuestionario
3.- ¿Cuáles son los cuadros clínicos mas graves que puede ocasionar este hongo?
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ASPERGILOSIS
(MICOSIS OPORTUNISTAS)
Introducción.
Objetivo.
Familiarizar al alumno con la búsqueda de la fase parasitaria del hongo a través del
examen en fresco y que a la vez conozca la morfología colonial macroscópica del agente
etiológico.
Técnicas a emplear.
Material a emplear.
1.- Frascos de boca ancha estériles, placas Petri esteriles, medio de transporte
2.- KOH al 10%.
3.- Asa micologica, lancetas estériles
4.- Porta y cubre objeto.
5.- Agar Saboraud y/o Agar Papa Dextrosa.
Desarrollo de la práctica.
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2.- Hacer preparaciones en fresco con KOH AL 10% o SSI.
3.- Buscar la fase parasitaria de las especies de Aspergillus
4.- Observar las características coloniales de las especies de Aspergillus en el agar
correspondiente.
Dibujos.
Cuestionario
2.- ¿Qué técnica de coloración se utiliza para observar a los agentes etiológicos de la
Aspergilosis?
3.- ¿Cuáles son los cuadros clínicos mas graves que puede ocasionar las diferentes
especies de este hongo?
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BLASTOMICOSIS Y PARACOCCIDIODOMICOSIS
(MICOSIS PROFUNDAS)
Introducción.
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redondeados parecidos a los vistos en cultivos de Blastomyces dermatitidis conservados
solo a temperatura ambiente.
Objetivo.
Técnicas a emplear.
A).-Obtención de esputo.
1.- Con el borde de una lanceta para grupos sanguíneos, levantar las costras de las
lesiones.
2.- Presionar el tejido y aspirar con una jeringa o pipeta Pasteur estéril el líquido
suerosanguinolento.
3.- Depositar la muestra en tubos estériles para efectuar el diagnóstico.
Material a emplear.
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3.- Hacer la descripción macroscópica de las cepas de hongos causantes de la
blastomicosis y paracoccidiodomicosis.
Dibujos.
Cuestionario
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Introducción.
La terapia contra los hongos ha estado presente desde que se tiene conciencia de
las micosis, algunos tratamientos han perdurado a través del tiempo, por su efectividad,
escasos efectos colaterales y bajo costo, tal es es el caso de la solución yodada. Con el
advenimiento de la griseofulvina como primer antimicótico oral se desencadenó la
búsqueda de nuevos productos propios del metabolismo antagónico de hongos así se
obtuvo a finales de la década de los 50’s la nistatina y anfotericina B, si bien es cierto que
estos antifungicos tienen gran efectividad y amplio espectro, presentan muchos efectos
colaterales y su absorción es deficiente.
Los imidazoles son derivados del núcleo imidazol , todos ellos tienen un mecanismo de
acción similar, son fungistaticos e inhiben la formación de la membrana celular,
interrupiendo la síntesis de ergosterol, dando paso a lanosterol y como consecuencia
dejan una membrana celular defectuosa.
La mayoría se utilizan en forma de cremas y soluciones a concentraciones de 1-2% tienen
un espectro amplio son efectivos para la mayoría de los agentes etiologicos .
En general son fármacos bien tolerados por la piel y pocas veces provocan sensibilización
dérmica los más comunes son : Clotrimazol, Isoconazol, Miconazol, Ketoconazol,
Sulconazol, Bifonazol, Oxiconazol, Tioconazol, Econazol
Objetivo.
Técnicas a emplear.
Material a emplear.
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Desarrollo de la práctica.
1.- Previamente las placas fueron preparadas con una mezcla entre los antimicóticos y el
agar correspondiente
2.- Sembrar las diferentes cepas a probar en las cajas Petri con la mezcla previa
3.- Deberan prepararse 2 placas por cada una de las cepas, una solo con agar, la
segunda con agar y el imidazol
4.- Los imidazoles deberán encontrarse a una concentración conocida, la primera placa
será la relación del imidazol con el agar correspondiente de uno a uno, la segunda sin
ninguna concentración del agente
5.- Diariamente por aproximadamente una semana será medido el crecimiento radial de
cada una de las placas, para poder llevar así un control de crecimiento
Reporte.
Todas las mediciones serán graficadas para denotar la relación de crecimiento entre
estas, para poder identificar así el mejor imidazol
Cuestionario
2.- De los imidazoles conocidos cual o cuales son los más efectivos
5.- Los hongos pueden crear resistencia a los imidazoles y a otros antimicoticos
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EVALUACION
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BIBLIOGRAFIA BASICA
2.- Conant, N.F., D. Trillerson smith, R. Denia Baker, J. Lamar. 1994. Micología. Nueva
Editorial Interamericana.
3.- Velasco, C.O., J.Tay Zavala. 1995. Introducción a la Micología Médica. Ed. Francisco
Méndez Cervantes.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
6.-Torres, R.J. Micosis que afectan piel y mucosas. 3ª Ed; Ed. DOYMA. (1996)
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