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Instituto Nacional de Estándares y Tecnología

Certificado de análisis
Material de referencia estándar®916a
Bilirrubina

Este Material de Referencia Estándar (MER) consiste en una muestra de bilirrubina no conjugada que está certificada como una sustancia
química de pureza conocida. Está destinado principalmente para su uso en la calibración y estandarización de procedimientos utilizados para
la determinación de bilirrubina en muestras clínicas y para evaluaciones de rutina de los estándares de trabajo diarios utilizados en estos
procedimientos. Este material también se puede utilizar para garantizar la calidad al asignar valores a los materiales de control internos. Una
unidad de SRM 916a consta de un frasco que contiene 100 mg de bilirrubina cristalina.

Debido a la preocupación de que las absortividades molares de la bilirrubina y sus azopigmentos en el certificado original de junio de 1989
fueran inferiores a las de un estudio publicado [1], se llevó a cabo un ejercicio entre laboratorios para reevaluar las absortividades molares.
Los valores revisados resultantes se informan en la Tabla 2 de este certificado; a modo de comparación, los datos originales generados en
1988 se pueden encontrar en Información complementaria.

Pureza e incertidumbre certificadas:La pureza química certificada se basa en los resultados de varias técnicas analíticas
utilizadas en el NIST que están diseñadas para medir impurezas y en el juicio científico de estos resultados. La pureza
química certificada presentada en la Tabla 1 se determinó midiendo las fracciones masivas de impurezas, incluida el agua, y
los residuos de la incineración, sumando las impurezas y restando esta suma del 100 %. Un valor certificado es un valor para
el cual el NIST tiene la mayor confianza en su precisión, ya que todas las fuentes de sesgo conocidas o sospechadas han sido
investigadas o tomadas en cuenta. La pureza química certificada y la incertidumbre estimada presentadas en la Tabla 1 se
basan en el juicio científico y la evaluación de las numerosas pruebas analíticas aplicadas a este SRM en el proceso de
certificación. La incertidumbre pretende aproximar dos límites de desviación estándar para el valor certificado.

Valores de referencia e incertidumbres:Valores de concentración de referencia para la absortividad molar en el reactivo de cafeína
[2] y de los productos azopigmentos azul y rojo, obtenidos mediante el Método de Referencia para la Bilirrubina Total (desarrollado
por el Comité de Estándares de la Asociación Americana de Química Clínica [AACC]) [3 ] se derivaron de los resultados informados por
seis laboratorios colaboradores en 1998 y se enumeran en el Apéndice A. Los valores de referencia para las absortividades molares
se presentan en la Tabla 2. El valor de absortividad molar del azopigmento rojo a 530 nm se obtuvo omitiendo la adición de alcalinos.
tartrato en el Método de Referencia. Los valores de referencia son valores no certificados que son la mejor estimación del valor real;
sin embargo, los valores no cumplen con los criterios de certificación del NIST y se proporcionan con incertidumbres asociadas que
pueden reflejar solo la precisión de la medición, pueden no incluir todas las fuentes de incertidumbre o pueden reflejar una falta de
acuerdo estadístico suficiente entre múltiples métodos analíticos.

Vencimiento de la Certificación:La certificación deSRM 916aes válida, dentro de la incertidumbre especificada, hasta 01
septiembre 2017, siempre que el SRM se manipule y almacene de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en este
certificado (consulte “Instrucciones de uso”). La certificación se anula si el SRM se daña, se contamina o se modifica de otro
modo.

Mantenimiento de la Certificación SRM:El NIST monitoreará este SRM durante el período de su certificación. Si se
producen cambios técnicos sustanciales que afecten la certificación antes de la expiración de este certificado, el NIST
notificará al comprador. La inscripción (ver hoja adjunta o registrarse online) facilitará la notificación.

RG Christensen, A. Cohen, B. Coxon, MJ Welch y DA Becker del NIST realizaron análisis para la
certificación original de pureza y caracterización de SRM 916a en 1988.

Los aspectos de soporte involucrados en la emisión de este SRM se coordinaron a través de la Oficina de Materiales de Referencia del
NIST.

Carlos A. González, Jefe

División Ciencias Químicas

Gaithersburg, MD 20899 Steven J. Choquette, Director Oficina

Fecha de emisión del certificado: 22 de agosto de 2016 de Materiales de Referencia
Historial de revisión de certificados en la página 4

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A. Cohen y E. White V del NIST proporcionaron la dirección general y la coordinación de las mediciones técnicas que
condujeron a la certificación original de pureza y caracterización. La coordinación de las mediciones técnicas que condujeron
al establecimiento de las constantes de absortividad originales en 1988 fue realizada por BT Doumas del Departamento de
Patología del Colegio Médico de Wisconsin (Milwaukee, WI). La coordinación de las mediciones técnicas que llevaron a la
asignación de valor de las absortividades molares revisadas para este SRM en 1998 fueron realizadas por BT Doumas y BW
Perry del Medical College of Wisconsin, Departamento de Patología (Milwaukee, WI) y MJ Welch.

La consulta estadística original fue proporcionada por RC Paule del NIST. El diseño y el análisis estadístico de las mediciones
de absortividad molar realizadas en 1998 fueron realizados por LM Gill de la División de Ingeniería Estadística del NIST.

AVISO Y ADVERTENCIA A LOS USUARIOS

SRM 916a ESTÁ DISEÑADO PARA USO EN INVESTIGACIÓN.

Almacenamiento:El SRM se suministra en un vial tapado con argón. El vial se sella en una bolsa de película de poliéster forrada con
papel de aluminio, también purgada con argón y enviada en hielo seco. Al recibirlo, la temperatura de almacenamiento del SRM 916a
está condicionada al período de tiempo previsto para su uso. Una temperatura del refrigerador entre 2 °C y 8 °C es aceptable para
un almacenamiento de hasta una semana. Si se prevé un tiempo de almacenamiento más prolongado, el material debe almacenarse
a –20 °C o menos. Antes de su uso, se debe permitir que el material alcance la temperatura ambiente (entre 20°C y 25°C) antes de
abrir el envase. Después de abrir, el material debe conservarse en el vial bien cerrado y conservarse en el frigorífico entre 2°C y 8°C, y
protegido de la luz.

INSTRUCCIONES DE USO

El SRM 916a, que consiste en bilirrubina no conjugada, es prácticamente insoluble en agua cerca del pH fisiológico. Sin embargo, es soluble en
una mezcla de dimetilsulfóxido y carbonato de sodio. Se puede obtener una solución estándar de 0,2 g/L para la preparación de una curva de
calibración de la siguiente manera [3]. Pesar 20,3 mg (proporciona corrección de pureza) de SRM 916a en un pequeño plato de plástico.
Transferir cuantitativamente la bilirrubina a un matraz volumétrico de 100 mL con la ayuda de 1 mL de dimetilsulfóxido y agitar el matraz
hasta que los cristales estén uniformemente dispersos. Agregue 2,0 ml de carbonato de sodio acuoso de 0,1 mol/l y agite la mezcla hasta que
se obtenga una solución de color rojo anaranjado, ópticamente transparente. Diluir la solución con una solución de albúmina sérica bovina
(BSA, fracción V de Cohn, 40 g/l, previamente ajustada a pH 7,4) o con un diluyente sérico aceptable para bilirrubina no conjugada [4]. Para
obtener una descripción detallada de la preparación y manipulación de la solución estándar, consulte la referencia [3]. Dado que la bilirrubina
es sensible a la luz, el matraz debe envolverse inmediatamente con papel de aluminio. Se recomienda además que la preparación de la
solución se realice con luz incandescente de baja intensidad y absolutamente lejos de la luz solar. Se pueden preparar soluciones estándar de
menor concentración diluyendo alícuotas apropiadas con la solución de albúmina sérica. Se ha informado [5] que el deterioro de la solución
estándar fue aproximadamente del 1,5 % por mes a –20 °C, y alrededor del 1 % en seis meses a –70 °C.

La absortividad molar de SRM 916a en el reactivo de cafeína [2] y de los productos de azopigmento azul y rojo obtenidos mediante el
método de referencia para la bilirrubina total [3] se determinaron en un estudio colaborativo de turnos. El valor de absortividad
molar del azopigmento rojo a 530 nm se obtuvo omitiendo la adición de tartrato alcalino en el método de referencia. Los valores de
referencia para la absortividad molar se muestran en la Tabla 2.

Fuente, preparación y análisis(1)

Fuente de material:La bilirrubina utilizada para este MER fue suministrada por Pfanstiehl Laboratories, Inc. (Waukegan, IL).
Se preparó a partir de material aislado de bilis de cerdo y cristalizado como ácido. Se purificó adicionalmente mediante
tratamiento en cloroformo con sulfato de sodio como se describe en la referencia [6] y recristalización en cloroformo.

(1)Ciertos instrumentos, materiales o procesos comerciales se identifican en este certificado para especificar adecuadamente el

Procedimiento experimental. Dicha identificación no implica recomendación o respaldo por parte del Instituto Nacional de Estándares y
Tecnología, ni implica que los instrumentos, materiales o procesos identificados sean necesariamente los mejores disponibles para ese
propósito.

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Análisis para determinaciones de absortividad molar revisadas:En el protocolo para reevaluar la absortividad molar de la
bilirrubina y sus azopigmentos, cada uno de los seis laboratorios participantes preparó tres soluciones a 200 mg/L en tres días
diferentes y realizó mediciones en cuatro longitudes de onda: 423 nm, 457 nm, 530 nm y 598 millas náuticas. Cada solución se midió
en tres días diferentes y por triplicado cada día, es decir, cada laboratorio realizó nueve mediciones para cada longitud de onda.

Análisis relacionados con la caracterización original de SRM 916a en 1988:SRM 916a consiste en una mezcla de tres isómeros de
bilirrubina no conjugada [7]. Las cantidades relativas de los isómeros se determinaron mediante dos métodos. Las fracciones
molares de los isómeros de bilirrubina IIIα, IXα y XIIIα medidas mediante cromatografía en capa fina (TLC), usando ácido acético al 1
% en cloroformo [7] sobre gel de sílice G fueron 5,3 %, 83,1 % y 11,5 %, respectivamente; y medidas por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) sobre sílice usando aproximadamente 1 % de ácido acético en diclorometano fueron 7,5 %, 83,2 % y 9,3 %,
respectivamente. Mediciones LC recientes realizadas en 1996 para evaluar la estabilidad de las concentraciones de isómeros
encontraron que las concentraciones relativas de isómeros no cambiaron. La absortividad del material en cloroformo (grado reactivo
que contiene 0,75 % de estabilizador de etanol) a 453 nm fue (104,8±0,2) L⋅cm-1⋅gramo-1a 20°C. Una solución preparada por
separado, cuyo volumen y absorbancia se determinaron a 25 °C dio (105,0±0,1) L⋅cm-1⋅gramo-1. Ambos valores no están corregidos
para el 1,2 % de cloroformo y otras impurezas en los cristales. La absortividad refleja las contribuciones de los tres isómeros de la
bilirrubina presentes.

Las muestras del SRM se disolvieron en dimetilsulfóxido-d6y medido por1Resonancia magnética nuclear (RMN) H. La cantidad de
cloroformo detectada fue del 1,2 %. La RMN no detectó ni biliverdina, un producto de oxidación de la bilirrubina, ni mesobilirrubina,
el análogo dietílico. El cloroformo presente queda firmemente retenido en los cristales. La pérdida de peso a 60 °C durante 71 h al
vacío fue sólo del 0,03 %. Dado que el cloroformo se retiene tan firmemente, recomendamos utilizar el material tal como se
suministra. La mesobilirrubina no fue detectada por espectrometría de masas. La biliverdina no se detectó mediante HPLC (límite de
detección del 0,1%) ni mediante espectrofotometría de absorción visible (límite de detección del 0,01%).

Las impurezas más ácidas que la bilirrubina se determinaron cuantitativamente extrayendo muestras con bicarbonato de
sodio al 5 %, lavando con cloroformo, acidificando, extrayendo con cloroformo, lavando con agua y concentrando el extracto
de cloroformo. La masa seca de los extractos fue del 0,20 %. El examen por cromatografía en capa fina y por espectrometría
de masas después de la sililación indicó que algún material similar o idéntico a la bilirrubina había pasado por el
procedimiento de extracción y estaba en el extracto y, por lo tanto, la cantidad de impureza más ácida que la bilirrubina es
inferior al 0,20 %. Las impurezas no ácidas fueron del 0,013 %. Se determinaron mezclando una solución de 100 mg de
bilirrubina disuelta en cloroformo con 0,1 mol/l de carbonato de sodio. La bilirrubina forma una sal de sodio que es soluble
en agua. Esta solución se extrajo con cloroformo, el extracto se lavó con agua, el cloroformo se eliminó por evaporación y se
determinó la masa del residuo.

Se detectó una impureza no identificada mediante cromatografía en capa fina con poliamida como adsorbente e hidróxido de
amonio acuoso con metanol 3:1 (v/v) (3,3 %) como revelador [8]. Cien microgramos de bilirrubina SRM 916a disueltos en cloroformo
dieron una única mancha de color amarillo anaranjado en RF0,63, pero bajo radiación de 365 nm, se desarrolló una mancha rosa
fluorescente, apenas detectable, encima de la mancha de bilirrubina en RF0,76. La cantidad de material se estimó comparando la
intensidad de la mancha con manchas de cantidades conocidas de bilirrubina después de rociar con un reactivo que consiste en
ácido fosfomolíbdico-fospotungstico (reactivo de Folin-Denis) y exposición a vapor de amoníaco. Se estimó que la cantidad de
material desconocido era del 0,2 %.

Tabla 1. Pureza e incertidumbre de las fracciones de masa certificadas(a)de bilirrubina

Pureza 98,3% ±0,3 %

(a)La pureza química certificada y la incertidumbre estimada se basan en el juicio científico y la evaluación de las numerosas pruebas analíticas aplicadas a
este SRM en el proceso de certificación. La incertidumbre pretende aproximar dos límites de desviación estándar para el valor certificado. El
mensurando es el valor de pureza de la fracción de masa total de la bilirrubina. La trazabilidad metrológica es la unidad derivada del SI para la fracción
de masa (expresada como porcentaje).

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Tabla 2. Valores de referencia para las absortividades molares de la bilirrubina SRM 916a y sus azopigmentos a 200 mg/L

Longitud de onda Absortividad molar(a,b) Dakota del Sur(C)

(Nuevo Méjico) (l⋅moles-1⋅cm-1) (l⋅moles-1⋅cm-1)

Azopigmento alcalino en 598 76 641 ± 631 601

Azopigmento neutro en 530 Bilirrubina 57 079 ± 765 729
en reactivo de cafeína en 432 Bilirrubina 50 091 ± 891 849
en reactivo de cafeína en 457 49 241 ± 466 444

(a)Corregido por pureza de bilirrubina.

(b)Losvalores de referencia son la media igualmente ponderada de los resultados obtenidos en seis laboratorios participantes. La
incertidumbre en los valores de referencia se expresa como incertidumbre expandida,Ud., con un nivel de confianza del 95 % y se calcula
según el método descrito en la Guía ISO/JCGM [9]. La incertidumbre expandida se calcula comoUd.=kuC, dóndetuCpretende representar, al
nivel de una desviación estándar, el efecto combinado de la pureza entre laboratorios, dentro del laboratorio y. El factor de cobertura, k=
2.57, se determina a partir de lat-distribución correspondiente a 5 grados de libertad y un nivel de confianza del 95 % para cada longitud de
onda. El mensurando es el coeficiente de extinción molar determinado por el método indicado. La trazabilidad metrológica se realiza en
unidades SI de volumen, cantidad de sustancia y longitud (expresada como L·mol-1·cm).
(C)Una desviación estándar de una sola medida.

REFERENCIAS

[1] Doumas, BT; Perry, BW; McComb RB; Kessner, K.; Vader, HL; Vink, KLJ; Koedam, JC; Paula, RC;Absortividades
molares de la bilirrubina (NIST SRM 916a) y sus azopigmentos neutros y alcalinos; Clínico. Química, vol.
36, págs. 1698-1701 (1990).
[2] Vink, KLJ; Schuurman, W.; Vangansewinkel, R.;Uso del reactivo de cafeína en espectrofotometría directa de bilirrubina;
Clínico. química., vol. 32, págs. 1389-1393 (1986).
[3] Doumas, BT; Kwokcheung, PP; Perry, BW; Jendrzejczak, B.; McComb, RB; Schaffer, R.; Casa, LL;Método
de referencia candidato para la determinación de bilirrubina total en suero: desarrollo y validación;
Clínico. química., vol. 31, págs. 1779-1789 (1985).
[4] Desarrollado conjuntamente por AAP, CAP, AACC y NIH. Recomendación sobre un estándar uniforme de bilirrubina. Clínico.
química., vol. 8, págs. 405–407 (1962).
[5] Doumas, BT; Perry, BW; Sasse, EA; Straumfjord, JV, Jr.;Estandarización en ensayos de bilirrubina: evaluación de métodos
seleccionados y estabilidad de soluciones de bilirrubina; Clínico. química., vol. 19, págs. 984–993 (1973).
[6] Niebla, J.;Bilirrubina-Purificación-Pureza; Escanear. J.Clin. Laboratorio. Invertir., vol. 16, págs. 49–54 (1964).
[7] McDonagh, AF; Asís, F.'Bilirrubina comercial: una trinidad de isómeros; FEBS Lett., vol. 18, págs. 315–317
(1971).
[8] Petryka, ZJ; Watson, CJ;Separación de pigmentos biliares mediante cromatografía en capa fina; J. Chromatogr., vol.
37, págs. 76–82 (1968).
[9] JCGM 100:2008;Evaluación de datos de medición: guía para la expresión de la incertidumbre en la medición (GUM 1995
con correcciones menores); Comité Conjunto de Guías de Metrología (2008); disponible en http://www.bipm.org/utils/
common/documents/jcgm/JCGM_100_2008_E.pdf (consultado en agosto de 2016); véase también Taylor, BN; Kuyatt,
CE;Directrices para evaluar y expresar la incertidumbre de los resultados de las mediciones del NIST; Nota técnica NIST
1297; Imprenta del Gobierno de Estados Unidos: Washington, DC (1994); disponible en http://www.nist.gov/pml/pubs/
tn1297/index.cfm (consultado en agosto de 2016).

Historial de revisión de certificados:22 de agosto de 2016 (Cambio de fecha de vencimiento; cambios editoriales); 12 de agosto de 2014 (Prórroga del período de
certificación; cambios editoriales); 30 de noviembre de 2009 (instrucciones de almacenamiento actualizadas y ampliación del período de certificación); 30 de diciembre
de 2005 (Esta revisión técnica informa una extensión del período de certificación); 5 de diciembre de 2001 (Esta revisión técnica informa la adición de valores de
referencia revisados para la absortividad molar); 01 de junio de 1989 (fecha del certificado original).

Los usuarios de este SRM deben asegurarse de que el Certificado de análisis que poseen esté actualizado. Esto se puede
lograr comunicándose con el Programa SRM: teléfono (301) 975-2200; fax (301) 948-3730; correo electrónico
rminfo@nist.gov ; o a través de Internet en http://www.nist.gov/srm.

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 APÉNDICE A

Laboratorios colaboradores para las absortividades molares revisadas (1998). Agradecemos las contribuciones de los
participantes en este ejercicio interlaboratorio.

Doumas, BT; Perry, BW; Departamento de Patología, Facultad de Medicina de Wisconsin (Milwaukee, WI, EE. UU.).
colina, B.; Laboratorio de Higiene del Estado de Wisconsin (Madison, WI, EE. UU.).
Külpmann, WR; Institut fur Klinische Chemie I, Medizinische Hochschule Hannover (Hannover, Alemania).
Nealon, DA; Ortho Clinical Diagnostics, Inc., Johnson and Johnson (Rochester, NY, EE. UU.).
Schlebusch, H.; der Universitats-Frauenklinik (Bonn, Alemania).
Vader, HL; Laboratorios Clínicos, Hospital St. Joseph (Veldhoven, Países Bajos).

Información suplementaria

Valores de absortividad molar generados en el Round Robin original de 1988

Longitud de onda (nm) Absortividad molar(a,b)(l⋅moles-1⋅cm-1)

Azopigmento alcalino en 598 76 500

Azopigmento neutro en 530 Bilirrubina 56 700
en reactivo de cafeína en 432 Bilirrubina 50 100
en reactivo de cafeína en 457 49 000

(a)Corregido por pureza de bilirrubina.

(b)Una desviación estándar de la media de los resultados del round robin es 300; una desviación estándar de una sola medida es 700.

Laboratorios colaboradores para análisis originales (1988) de absortividades molares. Agradecemos las
contribuciones de los participantes en el estudio round robin.

Doumas, BT; Perry, BW; Jendrzejczak, B.; Hubbard, L.; Facultad de Medicina de Wisconsin (Milwaukee, WI, EE. UU.).
McComb, RB; Okorodudu, AO; Hartford Hospital (Hartfort CT, EE. UU.).
Navazi, W.; Kessner, A.; Beckman Instruments, Inc. (Brea, CA, EE. UU.).
Vander, HL; Vink, KLJ; Hospital St. Joseph (Eindhoven, Países Bajos).
Koedam, HC; Steentjes, director general; Wikkeling, RH; Phielix-Strubbe, CJ; Instituto Nacional de Salud Pública y
Protección del Medio Ambiente (Bilthoven, Países Bajos).

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