Cadmio

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA UNIDAD DE POSTGRADO
Evaluacin del riesgo por toxicidad crnica a la exposicin de Cadmio en animales de experimentacin
TESIS para optar al grado acadmico de Doctor en Farmacia y Bioqumica
AUTOR Mesas Moiss Garca Ortiz
ASESOR Eloisa M. Hernndez Fernndez
Lima Per 2008
RECONOCIMIENTO
Muy en especial a la asesora del presente trabajo:
Dra. Eloisa M. Hernndez Fernndez
Asimismo a todas las personas que han hecho posible la realizacin del mismo: Q. F. Haydee Zuiga Q. F. Elena Naucapoma Bch. Marina Marin Q. F. Anglica Yacsavilca Q. F. Alfonso Apesteguia Srta. Elizabeth Nuuyero
Asimismo a los miembros del jurado examinador y calificador: Dr. Pedro Cotillo Zegarra Dr. Ernesto Raez Acosta Dra. Nancy Lozano Reyes Dra. Elizabeth Gonzles Loayza Dra. Eloisa Hernndez
A mis padres Germn e Irene a quienes dedico el presente trabajo con mucho amor.
A mi esposa Leonor por su apoyo y agradeciendo a la vida por los continuos xitos que compartimos.
A adoracin.
Tatiana
que
es
mi
A Gustavo y Joanna por compartir mis anhelos.
CONTENIDO
RESUMEN SUMARY
1 I. INTRODUCCIN
3 II. 2.1. Cadmio: Fuentes y Vas de Exposicin 2.2. Toxicocintica del Cadmio 2.3. Toxodinamia del Cadmio 2.4. Informacin y Trabajos Realizados Sobre el Cadmio 2.5. Estudios del Material Biolgico 2.5.1. Teratognesis 2.6. Clnica 2.6.1. Manifestaciones Agudas 2.6.2. Manifestaciones Crnicas 2.6.3. Manifestaciones Especficas 3 5 9 11 13 13 16 17 18 19 GENERALIDADES
23 III. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Materiales 3.1.1. Material Biolgico 3.1.2. Material , Equipos y Reactivos 23 23 23
3.2. Mtodos 3.2.1. Ensayos Preliminares 3.2.2. Evaluacin de la Toxicidad Crnica 3.2.3. Control de Toxicidad 3.2.4. Observacin de rganos Internos (Macroscpico) 3.2.5. Observacin Macroscpica Externa 3.2.6. Estudio Histopatolgico 3.2.7. Anlisis Estadstico
24 24 25 33 34 34 35 35
36 IV. RESULTADOS 4.1. Evaluacin de la Toxicidad Crnica 4.2. Resultados de Control de Toxicidad 36 50
78 V. DISCUSIN
85 VI. CONCLUSINES
86 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
97 IX. ANEXOS
RESUMEN
El cadmio es un metal que esta tomando importancia en los ltimos aos como principal contaminante ambiental; por el cual es necesario evaluar el movimiento que tiene en el ecosistema, en las poblaciones expuestas y no expuestas ocupacionalmente.
El presente trabajo fue realizado para determinar probables efectos txicos crnicos tras administrar cadmio en ratas albinas de la especie rattus novegicus, Cepa Holtzman; utilizando el mtodo directo de administracin en el agua bebida. Los niveles de cadmio administrados se encuentran en un rango donde se pueden manifestar toxicidad crnica.
Se realiz la evaluacin de teratogenicidad, pruebas bioqumicas y estudio histopatolgico. A fin de corroborar los efectos txicos atribuidos a la exposicin de cadmio. Entre los efectos txicos encontrados menciono: efectos teratognicos como hemangioma (manchas en la piel) y acondroplasia; cambios bioqumicos funcionales significativos, como el aumento de la fosfatasa alcalina srica y glumato oxalacetato transaminasa srica, cambios estructurales histopatolgicos en el hgado y riones.
Se observo que el cadmio produce cambios conductuales como sensibilidad al sonido, comportamiento agresivo; disminucin en el peso de las cras al nacer y mayor mortalidad.
Palabras Claves: Cadmio, Teratogenia, Fosfatasa Alcalina Srica
Evaluacin del Riesgo por Toxicidad Crnica a la Exposicin de Cadmio en Animales de Experimentacin
I.- INTRODUCCIN
El cadmio est distribuido en toda la corteza terrestre, no existe en su estado puro, sino asociado a otros minerales como el plomo, cobre y zinc. El cadmio se encuentra en pequeas cantidades en casi todos los organismos, aunque no se sabe si tiene importancia para la fisiologa de los organismos vivos. La presencia natural del cadmio en el medio, aparentemente, no ha causado problemas significativos en la salud, pues se encuentra en bajas concentraciones. En la actualidad, existe una amplia utilizacin del cadmio en la industria, lo cual puede convertirlo en uno de los ms contaminantes del ambiente.
El conocimiento de sus efectos sobre la salud ha ganado terreno con el reconocimiento de la enfermedad ITAI ITAI, la cual fue descrita a consecuencia de la contaminacin de los animales por cadmio, a causa de una mina cercana a la ciudad de Toyama, Japn. Los estudios de la correlacin entre la contaminacin del ambiente por cadmio y la salud han logrado evidenciar que las concentraciones encontradas en aire, agua y alimentos han sido mucho ms altas en los lugares en donde se conocen episodios de intoxicacin de la poblacin.
Recientemente se ha comenzado a poner inters en la contaminacin por cadmio en las grandes ciudades, como en el aire y los alimentos, originado por el desarrollo industrial del hombre. Se ha comenzado a realizar estudios sobre los efectos de este
Mg. Mesas Moiss Garca Ortiz
Facultad de Farmacia y Bioqumica - UNMSM
componente en la contaminacin ambiental y la salud humana como: disfuncin y dao renal, efectos en huesos, efectos hipertensivos, efectos sobre la funcin respiratoria, reproductiva, inmunitaria, carcinognesis y mutagnesis; pero sus resultados an no estn totalmente disponibles.
El presente trabajo ha sido planteado para evaluar el riesgo de toxicidad por cadmio, con el siguiente objetivo: caracterizar teratognesis y posibles efectos sobre algunas variables bioqumicas, hematolgicas y alteraciones histopatolgicas en ratas.
II.- GENERALIDADES
2.1. CADMIO, FUENTES Y VAS DE EXPOSICIN a. Cadmio.- Elemento qumico relativamente raro, smbolo cd, nmero atmico 48; tiene relacin estrecha con el zinc, con el que se encuentra asociado en la naturaleza, es un metal dctil, de color blanco con un ligero matiz azulado. Es ms blanco y maleable que el zinc. Peso atmico de 112.40, su punto de fusin de 320.9 C. El Cadmio es miembro del grupo II b (zinc, cadmio, mercurio) en la tabla peridica de los elementos. El Cadmio es divalente en todos sus compuestos estables y su in es incoloro.
b. Fuentes y Vas de Exposicin.- La principal fuente de exposicin al cadmio para la poblacin general esta constituida por la ingestin con los alimentos, aproximadamente un 70% de todo el cadmio internalizado por el organismo, porcentaje que se modifica en personas fumadoras, en las que el cadmio que entra por la va respiratoria procedente del tabaco es tambin importante (1).
La principal fuente de contaminacin ambiental por cadmio es la roca fosfrica con alto contenido de metal y usado para la fabricacin de fertilizantes. Se ha detectado en alimentos, tales como moluscos, crustceos, granos (especialmente arroz y el germen de trigo) t y caf. (3)
El cadmio es un elemento ubicuo que esta presente en mayor o menor grado en todos los alimentos. En general, la concentracin de este metal en los alimentos es baja, siendo en los alimentos de origen vegetal en los que se encuentran las concentraciones mas altas, que no suelen superar los 200 ug/kg de peso fresco; las carnes y pescados contienen niveles de cadmio del orden de 50 ug/kg y en los productos lcteos y huevos la concentracin de cadmio es mucho menor. Sin embargo, algunos alimentos pueden contener
concentraciones excepcionalmente altas de cadmio, entre los que se encuentran los rganos internos de los animales de abasto, principalmente el hgado y los riones, que pueden llegar a contener ms de 1 ug/kg. En los crustceos y moluscos se encuentran niveles altos de cadmio, y as, en aquellos procedentes de aguas no consideradas como contaminadas, se pueden encontrar concentraciones superiores a 1 ug/kg. Los championes y algunas setas tambin pueden contener niveles altos de cadmio. (1)
Todos estos alimentos, son generalmente consumidos de una forma espordica y por ello la dosis tolerable de cadmio propuesta provisionalmente por la Organizacin Mundial de la Salud (World Health Organization 1989), que es de 400 a 500 ug por semana para un adulto normal, no se ingiere habitualmente y por lo tanto, no existe un alto riesgo para la salud.
Los sistemas acuticos tambin son una cadena de acumulacin biolgica del cadmio a travs de los crustceos y moluscos, que ingieren plancton que puede contener cadmio y lo acumulan en su organismo. (1)
En condiciones normales, la leche y sus productos derivados contienen unos niveles bajos de cadmio, aunque estos pueden variar considerablemente en funcin del origen geogrfico de la leche. Tambin hay que tener en cuenta que la carga medio-ambiental de cadmio se ha incrementado ltimamente conforme lo ha hecho su utilizacin industrial.
En la leche humana la concentracin de cadmio puede estar influida por el hbito de fumar en la madre y por la carga medio-ambiental de su zona de residencia, siendo superior la concentracin en la leche de madres que residen en reas urbanas respecto a las que lo hacen en zonas rurales. (1)
2.2. TOXICOCINTICA.La vida media del cadmio en el organismo total es de 30 a 40 aos (4). El contenido corporal de cadmio se incrementa con la edad hasta los 50 aos. En los adultos, la carga corporal de cadmio puede llegar a 40 miligramos, dependiendo de la situacin geogrfica y sobretodo del hbito de fumar, pues en un fumador la carga alcanza el doble. (1)
Absorcin: Es relativamente lenta, con un promedio de 14 das en exposiciones prolongadas. Esto puede no ser importante cuando se calcula concentracin de cadmio en rganos de trabajadores o individuos expuestos crnicamente, pero s influencia los clculos para perodos cortos de exposicin. (4)
La absorcin por el tracto gastrointestinal es de aproximadamente 10%. Las dietas deficientes en Ca, Fe o protena incrementa la velocidad de su absorcin.
En exposiciones laborales, la inhalacin es la ruta principal de ingreso y la absorcin a partir de esta va depende del tipo de compuesto inhalado, del tamao de las partculas y de su retencin en el pulmn.
En grandes fumadores se ha encontrado valores adicionales de absorcin por inhalacin de hasta el 50%. Las partculas de cadmio depositadas en la nasofaringe, trquea y bronquios son transportadas por mecanismo mucociliar a la faringe, desde donde son parcialmente ingeridas. La absorcin percutnea ocurre solamente por contacto con los compuestos orgnicos del cadmio. (1)
Se considera que de un 80 a un 90% de la dosis total de cadmio que entra en el organismo se presenta unido a la metalotioneina. Esto evita que los iones de cadmio libres ejerzan su efecto txico. Es probable que exista un transporte
continuo por va hemtica desde el hgado al rin de pequeas cantidades de metalotioneina unida al cadmio. El complejo metalotioneina-cadmio se filtra a travs de los glomrulos a la orina primaria. Al igual que en el caso de otras protenas y aminocidos de bajo peso molecular, las clulas de los tbulos proximales reabsorben el complejo metalotioneina-cadmio de la orina primaria; en estas clulas, las enzimas digestivas degradan las protenas en pptidos de menor tamao y aminocidos. Los iones de cadmio libres que se liberan tras la degradacin de la metalotioneina inician una nueva sntesis de metalotioneina, que se une al cadmio y protege a la clula de los efectos sumamente txicos de los iones libres de cadmio. Se piensa que cuando se supera la capacidad de produccin de metalotionena en las clulas de los tbulos, se produce la insuficiencia renal. Los riones y el hgado presentan las concentraciones de cadmio ms elevadas, puesto que contienen cerca del 50% de la carga corporal de cadmio. La concentracin de cadmio en la corteza renal, antes de que se produzcan lesiones renales inducidas por este metal, es aproximadamente 15 veces superior a la concentracin heptica. (2)
En condiciones normales de distribucin, el cadmio absorbido se excreta principalmente por orina y en menor cantidad con la bilis, aunque pequeas porciones puedan eliminarse con sudor, pelo y an secrecin gastrointestinal, pero el Cd que sale con heces en su mayor parte es el que no se absorbi. En exposicin no laboral, la alimentacin es la fuente ms importante de ingesta de cadmio.
El cadmio atraviesa la barrera placentaria fcilmente, induciendo all la sntesis de metalotionena, con la que forma el complejo cadmio-metalotionena, que se acumula progresivamente en la placenta durante el embarazo, actuando como mecanismo protector frente al transporte de cadmio al feto. Al trmino del embarazo, la concentracin de cadmio en la placenta es aproximadamente 10 veces ms que en la sangre materna. Por el contrario, la concentracin de cadmio en el cordn umbilical es alrededor de 2 a 3 veces ms baja que en la sangre materna. Por ello, se infiere que el cadmio puede interferir la evolucin del embarazo por accin directa sobre el metabolismo de la placenta, pero no por accin directa sobre el feto. En el recin nacido el cadmio sanguneo es de 30 a 50% menor que el cadmio en la sangre materna. La leche materna slo secreta pequea cantidades. (1)
La eliminacin del cadmio es muy lenta y por ello se acumula en el organismo, aumentando su concentracin con la edad y el tiempo de exposicin. Tomando como base la concentracin en un mismo rgano a diferentes edades, se ha calculado que la semivida biolgica del cadmio en el hombre oscila entre 7 y 30 aos. (2)
Una parte se reabsorbe en el tbulo, contribuyendo as a su acumulacin. El excedente se excreta con la orina.
Excrecin: Las principales vas de excrecin son orina y heces. Por orina, diariamente se elimina 0,007% del contenido corporal y por heces 0,03%. La vida media de excrecin urinaria es de hasta 40 aos. Tan slo una pequea fraccin del cadmio del compartimento sanguneo y otra del hgado, a travs de la va biliar, se elimina por heces. (4)
2.3. TOXICODINMICA.El cadmio es un xenobitico y, por tanto, un metal txico y no esencial para el organismo, que se acumula en los tejidos humanos. Los rganos blandos son rin y pulmn. En exposicin laboral o ambiental, sus principales efectos txicos son: neumonitis qumica, disfuncin renal con proteinuria, micro proteinuria, micro albminas y enfisema.
El rin es ms sensible al cadmio que pulmn e hgado y el epitelio del tbulo renal proximal es el punto blanco. Su deterioro se pone de manifiesto por el incremento de protenas de peso molecular bajo, lo que causa proteinuria de peso molecular bajo. Concomitantemente, hay alteracin de la filtracin glomerular, por cambios en la restriccin electrosttica para la filtracin de las protenas polianinicas, lo que disminuye su reabsorcin y conduce a incrementar la excrecin urinaria de protenas de peso molecular alto, que origina proteinuria de peso molecular alto. Tericamente, pues no se ha demostrado in vivo, la accin txica del cadmio se debera a su afinidad por radicales de los grupos SH, OH,
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carboxilo, fosfatil, cisteinil e histidil y a su accin competitiva con otros elementos funcionalmente esenciales, Zn, Cu, Fe y Ca. Sus principales interacciones seran:
Unin fuerte del Cd a los grupos SH de las protenas intracelulares, que inhibira a las enzimas que poseen estos grupos
Desplazamiento del Zn de los enlaces -S- y la consiguiente alteracin enzimtica y de sus procesos bioqumicos, que se refleja en su deficiencia relativa.
De las metalotionenas, se sabe ahora que existen dos tipos, que se comportan de forma distinta respecto a acumulacin del xenobitico y a su excrecin urinaria. La fraccin de cadmio en plasma se encuentra unida en forma inestable a la metalotionena 1 y es la que se transfiere rpidamente al rin. En el tejido renal, en cambio, el cadmio acumulado se encuentra unido en forma relativamente estable a la metalotionena 2 y su vida media se estima hasta en 68 aos. En el hgado, la mayor cantidad de cadmio acumulado se encuentra unido tambin a la metalotionena 2, con una vida media estimada hasta en 19 aos. La vida media en sangre es aproximadamente de 2,5 meses. No tenemos datos sobre vida media en otros rganos o tejidos; sin embargo, puede afirmarse que 50% del contenido total corporal de cadmio est en riones, hgado y sangre, por lo que a estos 3 rganos se les denomina compartimiento de depsito. (4)
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2.4. INFORMACIN Y TRABAJOS REALIZADOS SOBRE EL CADMIO.Estudios analticos sobre niveles de cadmio en sedimentos de aguas demuestran una gran variabilidad de valores, as en sedimentos y lagos la concentracin es relativamente baja (0.05 10 mg/Kg) los marinos en zonas de estuarios generalmente orden 0.3 mg/Kg. (1)
Existe una Transposicin del cadmio en los ecosistemas hacia los organismos acuticos y terrestres, presentado una predisposicin a una bioacumulacin en la cadena alimentara, principalmente en los moluscos, peces, aves marinas y mamferos presentan incremento de cadmio en los riones e hgado, posiblemente por hbitos alimentarios. (2)
Algunos vegetales como el arroz y trigo asimilan cantidades considerables de cadmio a partir de suelos contaminados. Por ejemplo el contenido de cadmio en avena producida en suelos sin fertilizar fue de 0.02 ug/g, mientras que la avena producida en suelos con fertilizante fue de 0.28 ug/g. (3)
Se informa que el arroz cultivado en suelos contaminados del Japn se encuentran concentraciones de cadmio superiores a 1 ug/g, en otra regin donde ocurri la epidemia de la enfermedad ITAI ITAI, dichas concentraciones variaban entre 1.72 y 4.12 ug/g , con una media de 2.5 ug/g. (3)
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La composicin acida de las aguas pueden movilizar depsitos minerales como el cadmio, coincidentemente con una gran acidificacin accidental de el agua del estuario de Huelva en 1987, fue seguida de una gran mortandad de peces, los mismos que fueron estudiados y en las cuales se destaco la presencia de cadmio en los moluscos con valores de 50 % superiores a un patrn de referencia. (4)
En general la concentracin es baja, as los productos lcteos, huevos son los que presentan la menor concentracin, seguido por pescado, carnes y alimentos de origen vegetal en las que se encuentran las concentraciones ms altas. (9)
Existen alimentos que pueden contener elevadas concentraciones de cadmio, como hgado, riones, crustceos, moluscos, algunos championes y setas. Estudios epidemiolgicos han determinado que la cantidad mxima tolerada es de 1 ug/da. (6)
El tabaco es fuente importante que absorbe el cadmio que contamina el suelo, un cigarrillo contiene aproximadamente 1 a 20 ug de cadmio; los niveles de cadmio son mayores en individuos fumadores, parece que fumar afecta la densidad del semen y el cadmio puede ser el agente causal. (7), (32), (38).
El cncer de prstata es una neoplasia comnmente diagnosticada en America del Norte. En Mxico representa la segunda causa de muerte por cncer en hombres; estudios ambientales, nutricionales sugieren una potencial participacin del
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cadmio, posiblemente acta por medios indirectos, ya que es un elemento antagonista del Zn In Vitro, se ha demostrado que el zinc esta involucrado en la conformacin estructural del p 53. Trabajo de investigacin realizado en muestras de tejido prosttico en pacientes con diagnostico de cncer de prstata se determino alta concentracin de cadmio. (8)
En 1999 el cadmio fue clasificado como carcingeno humano de categora I, por la Agencia Internacional para la Investigacin del Cncer (IRAC). (9)(17).
El cadmio produce aborto espontneo y teratogenicidad en especies como el ratn, rata y hmster. (10)
2.5. ESTUDIO DEL MATERIAL BIOLGICO.2.5.1. Teratognesis.- La teratologa es el estudio de las anormalidades estructurales o funcionales que se producen durante el desarrollo embrionario. Se manifiesta durante el embarazo (en el feto), en el nacimiento o pasado algn tiempo. La teratos: perteneciente a un monstruo. palabra proviene del griego,
La Teratognesis se manifiesta principalmente es malformaciones congnitas las cuales pueden ser menores denominadas anomalas con poca o ninguna significacin funcional (por ejemplo un pezn o un dedo
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extra) y las mayores que generalmente dificultan o comprometen la supervivencia; denominadas monstruosidades (por ejemplo cclopia). La mayor parte de las malformaciones congnitas se pueden impedir mediante prevencin primaria, evitando los factores de riesgo. La teratogenicidad no slo se reduce a las malformaciones congnitas, en un sentido amplio, si no que incluyen alteraciones del desarrollo que pueden manifestarse por:
Muerte en el tero. Dficit y desviaciones funcionales. Neoplasias, que a veces solo aparecen muchos aos despus de la contaminacin.
a. Antecedente de la Teratologa.- Hasta principios de los aos 40 se aceptaba usualmente que el embrin humano estaba protegido de los agentes procedentes del ambiente por sus membranas fetales y la pared abdominal de su madre as como de la pared del tero. Gregg (1941) presento el primer dato bien documentado de que los agentes procedentes del ambiente (el virus de la rubola) podia producir anormalidades congnitas si es que actuaban en las etapas crticas del desarrollo.
No obstante los que pusieron la atencin mdica sobre la importancia del medicamento en el determinismo de las malformaciones congnitas en el ser humano fueron Lenz (1961) y Mc Bride (1961).
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Ahora se estima que alrededor del 10% de las anomalas del desarrollo visibles en humanos tienen como causa la accin de medicamentos, virus, y otros factores procedentes del ambiente (Persaud, 1979).
Alrededor del 20% de las muertes en el perodo perinatal se atribuyen a malformaciones congnitas (Mac malformaciones en aproximadamente en: 2.7% de los neonatos (MacKeown, 1976) y durante la lactancia se descubren en un 3% adicional. Vicar, 1976). Se observaron
b. Efectos Teratognicos ms frecuentes.- Dentro del estudio teratolgico se observan malformaciones que su mayora ponen en riesgo la vida, mientras que otras pueden ser corregidas quirrgicamente y no comprometan la supervivencia. Las manifestaciones teratognicos ms comunes son: (37), (36).
Anomalas en ele Esqueleto: Espina bifda con cierre incompleto de vertebrales, Anancefalia (falta de bveda craneana y hemisferios cerebrales no formados), Craneosquisis (fisura en el crneo), Craneostenosis (cierre prematuro de suturas craneales y retardo mental), Hidrocefalia (cabeza de Gran volumen por acumulacin de lquido cfalo raqudeo), Talipes (deformaciones fijas en articulaciones de tobillo y pie), Polidactilia (luxacin Congnita de Cadera Dedos
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supernumerarios) y Acondroplasia (paro prematuro del desarrollo seo que origina enanismo).
Ausencia Congnita o Cierre de Orificios u rgano Tubular: atresia en tubo digestivo (esfago, ploro, deudeno, conducto biliar, ilen, o ano), atresia genitourinaria, atresia vascular y atresia nasofaringea en coanas.
Deformaciones
Faciales:
labio
leporino,
paladar
hendido
hemangiomas con manchas en la piel
Defectos Cardiacos Congnitos: tabique intraventricular, falta de cierre de agujero oval, orificios incompletos en grandes vasos y alineacin inadecuada de vasos
Defectos del Sistema Genitourinario: agenesia renal con malformacin de los riones, hipospadia (el meato uretral se presenta a cualquier nivel entre la punta del pene y el perineo) y malformaciones de genitales externos (difcil determinacin del sexo).
2.6. CLNICA.Las manifestaciones clnicas de las intoxicaciones con este metal pueden ser agudas o crnicas, habitualmente de carcter sistmico. Las intoxicaciones que se
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puedan presentar en la poblacin general, salvo situaciones de accidentes o contaminaciones masivas, por ejemplo de alimentos, en general suelen ser de carcter crnico. En la poblacin ocupacional es frecuente encontrar tanto intoxicaciones agudas como crnicas muy caractersticas. (9)
Los variados aspectos clnicos que se sealan a continuacin, especialmente en los cuadros crnicos, deben tenerse presentes para cuando, para los fines de notificacin, se elaboren las definiciones de casos y de sospechosos.
La clnica de las intoxicaciones por cadmio es variable, segn su va de penetracin, la cantidad absorbida, el tiempo de exposicin y las caractersticas propias del individuo expuesto. Adems, tiene relacin con el tipo de exposicin, ocupacional o ambiental. (9)
2.6. 1. Manifestaciones Agudas.a. Inhalacin.- La inhalacin de altas cantidades de cadmio puede determinar la aparicin de una sintomatologa no muy bien definida al principio, pero luego se presentan fiebre, alteraciones digestivas, dolor torcico, disnea y edema agudo de pulmn, el que puede determinar la muerte por insuficiencia respiratoria. Pueden Tambin aparecer anemia, albuminuria, hepatitis y anuria; stas pueden determinar la muerte por hepatonecrosis.
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b. Ingestin.- Los sntomas son nuseas, vmitos, dolores abdominales y cefalea. En muchos caos hay una diarrea intensa con colapso. Estos sntomas aparecen con la presencia del cadmio en agua o en alimentos en concentraciones de alrededor de 15 ppm. (9)
2.6.2. Manifestaciones Crnicas.- La inhalacin prolongada del cadmio por trabajadores expuestos puede determinar la aparicin de un sndrome que incluye enfisema pulmonar y enfermedad de los tbulos renales, con proteinuria. En estos casos se han observado tambin otros efectos como anemia, alteraciones hepticas y cambios en el metabolismo de los minerales.
La ingestin prolongada del cadmio, aunque no es muy frecuente, se puede presentar en la poblacin general. El ejemplo ms conocido es el de Japn, donde se observ una gastrointestinales, anemia, dao renal y trastornos hepticos (enfermedad Itai - Itai). (9) grave enfermedad sea, problemas
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2.6.3. Manifestaciones Especficas.- Tanto la inhalacin como la ingestin del cadmio han sido causa de variados daos al organismo, entre los cuales tenemos:
a. Riones.- Uno de los efectos ms tpicos y precoces de la larga exposicin al cadmio es el dao que sufre la funcin renal. La reabsorcin en los tbulos renales proximales est afectada y se manifiesta con una intensa proteinuria tubular, que puede resultar en una excrecin de protenas 10 veces superior a lo normal para protenas totales y hasta 1 000 veces para las de bajo peso molecular, como la beta 2 macroglobulina
Otras alteraciones descritas son el aumento de la creatinina y de la urea en el plasma y la alteracin de algunas pruebas funcionales renales (inulina, cido rico, reabsorcin de fsforo y calcio y prueba de concentracin de la orina). Estos daos y las alteraciones observadas pueden llevar a un cuadro grave con insuficiencia renal.
b. Pulmones.- Los pulmones son considerados rganos crticos en la exposicin de polvo de cadmio. Se han publicado casos de neumonitis qumica, con disnea, tos, expectoracin, molestias torcicas y disfuncin pulmonar.
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Concentraciones de cadmio de ms de 5 mg/m3 de aire, durante ocho horas, pueden causar un edema pulmonar tardo de carcter mortal.
Otras alteraciones pulmonares son el enfisema, la bronquitis obstructiva crnica y la fibrosis pulmonar.
c. Aparato Gastrointestinal.- La administracin oral de 10 mg de cadmio pueden originar trastornos gastroduodenales con nuseas y vmitos como respuesta inmediata, aunque la dosis oral aguda con efectos mortales para un adulto es superior a 350 mg. Se han descrito alteraciones en las actividades enzimticas del hgado.
Aparentemente el cadmio no tiene efecto directo en la d. Sangre.hematopoyesis. Ms bien parece tener efecto de interferencia en la absorcin del hierro de los alimentos. Estos efectos se manifiestan principalmente por una disminucin de los niveles de hemoglobina; son de carcter reversible.
e. Aparato Cardiocirculatorio.- Se han observado tasas elevadas de hipertensin arterial en regiones en donde el ndice de contaminacin por cadmio es alto, aun cuando no se ha podido precisar todava si en esas comunidades el cadmio es uno de los agentes causales de la hipertensin.
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Estudios hechos en trabajadores y en poblacin general expuestos prolongadamente al cadmio, han demostrado asociaciones
estadsticamente significativas entre el tiempo de exposicin y el desarrollo de hipertensin arterial.
No obstante, no se dispones de una decisin concluyente al respecto y el tema es an motivo de controversia.
f. Huesos.- En la enfermedad Itai Itai se han comprobado, adems de las lesiones renales, osteomalacia y grados variables de osteoporosis. Estas lesiones ocasionan dolores de intensidad variable, observndose que pequeos traumatismos son capaces de producir fracturas en varias partes del esqueleto.
El mecanismo por el cual se producen stas no est del todo esclarecido, pero se supone que se debe a trastornos del metabolismo de calcio, fsforo y vitamina D, originados en las lesiones renales y acompaados de una baja ingestin de calcio y protenas.
g. Efectos Carcinognicos.- Se ha atribuido al cadmio un incremento en la incidencia del cncer de prstata y del aparato respiratorio en trabajadores expuestos prolongadamente, principalmente a xido de cadmio.
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h. Efectos Mutagnicos y Teratognicos.- Se han descrito alteraciones cromosmicas en estudios experimentales y en observaciones de personas expuestas prolongadamente al cadmio. No se han descrito hasta ahora alteraciones teratognicos en los hijos de personas expuestas. (9)
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III.- PARTE EXPERIMENTAL
3.1. MATERIALES.3.1. 1. Material Biolgico.- El material biolgico est comprendido por: Doce ratas albinas, especie rattus novegicus, Cepa Holtzman, empleadas para el ensayo preliminar. Cincuentitres ratas albinas, Cepa Holtzman, para los ensayos bioqumicos, teratolgicos, patolgico y hematolgicos.
Todas adquiridas en el Centro Nacional de Productos Biolgicos del Instituto Nacional de Salud.
3.1. 2. Materiales, Equipos y Reactivos. Los principales materiales usados fueron de vidrio y plstico en condiciones aspticas y grado reactivo: Beakers, erlenmeyer, matraces aforados, micropipetas, jaulas metablicas con bebedero y comedero, fiolas, equipo de diseccin, tubos de ensayo, cmara de neubaver.
Los principales equipos usados; balanza analtica de 250 g de capacidad, espectrofotmetro Genesys 20, microscopio elctrico Bestec Scientific, bao mara Memmert a 37 C, micro centrifuga Hematocrit Mod KHT-400, centrifuga tubos Hetettich Universal II.
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Los reactivos utilizados ms importantes son; solucin estndar de cadmio, centipur, batch HC784320 Merck (conc 1000 mg / 1 cd), fenilfosfato de sodio, (2,4 - DNFH), 2.4 dinitro fenilhidrarina Merck, solucin de D. glucosa en cido benzoico saturado 100 mg / dl, cido ficrico, solucin estandar de calcio 10 mg / dl, solucin de Gower, solucin diluyente de Drabxin, colorante Wright, etilediamino tetracetico, etc.
3.2. MTODOS.-
3.2.1. Ensayos Preliminares.
3.2.1.1 Ensayo para estandarizar ingesta de alimentos agua de bebida y dosis de cadmio a administrar. Se emplearon 12 ratas albinas especie Rattus novegicus, Cepa Holtzman, distribuidas en tres grupos:
Control: 4 ratas, con alimentacin usual y cero dosis de cadmio. Dosis mnima: 4 ratas, con alimentacin usual y 40 ug/da. Dosis mxima: 4 ratas, con alimentacin usual y 80 ug/da.
El cadmio fue administrado en el agua de bebida.
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3.2.2. Evaluacin de la Toxicidad Crnica.3.2.2.1. Teratogenecidad.- Todas las pruebas de teratogenicidad fueron realizados en el Centro de Informacin y Control Toxicolgico (CICOTOX) de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM).
Se tomo como referencia las guas para la evaluacin de la OECD: Organizacin para la Cooperacin Econmica y Desarrollo.
OECD N 414.2001: Estudio de la toxicidad para el desarrollo prenatal. (60)
OECD N 415.1983: Estudio de la toxicidad para la reproduccin de la primera generacin (61)
OECD N 416.2001: Reproduccin toxicidad para el desarrollo / prueba de seleccin. (62)
3.2.2.1. Seleccin e Identificacin de las Ratas.- Para la determinacin de los efectos de teratognicos se separaron 18 ratas y fueron distribuidos en 3 grupos.
26
Grupo 1: Control: 6 ratas con alimentacin y bebida normal exento de cadmio. Grupo 2: Dosis mnima: 6 ratas con alimentacin y bebida normal y se le administro 40 ug. de cadmio por da en el agua bebida. Grupo 3: Dosis mxima: 6 ratas con alimentacin y bebida normal y se le administro 80 ug. de cadmio por da en el agua bebida.
Para las determinaciones bioqumicas, hematolgicas y patolgicas se separaron 35 ratas y se distribuyeron en 4 grupos:
Grupo 1: Control hembras: 5 ratas. Grupo 2: Control machos: 10 ratas. Grupo 3: Dosis mxima hembras: 10 ratas con alimentacin y bebida normal y se le administro 80 ug. de cadmio por da en el agua bebida. Grupo 4: Dosis mxima machos: 10 ratas con alimentacin y bebida normal y se le administro 80 ug. de cadmio por da en el agua bebida.
27
Para facilitar la identificacin de las ratas ambos grupos se les asigno un color representativo y se individualiz con una marca externa; tal como la muestra la siguiente figura:
FIGURA N 1 Leyenda: NUMERO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NOMBRE Nariz Cabeza Cuello Lomo Base de Cola Oreja Derecha Oreja Izquierda Pata Delantera Derecha Pata Delantera Izquierda Pata Trasera Derecha SMBOLO N Ca Cu L BC OD OI PDD PDI PTD
28
3.2.2.3. Control de la Teratogenecidad.- esto se lleva a cabo en las cras desde su nacimiento y hasta los 120 das de edad, periodo en que alcanza el estado adulto.
Cuyo objetivo es comparar la variacin anatmica morfolgica de las cras expuestas al cadmio con respecto a las cras control.
3.2.2.4. Apareo y Determinacin del Estado de Gravidez.- Se procedi al apareamiento utilizando el sistema de lotes polgamos, los cuales consistieron en una rata macho con 6 hembras. Las ratas utilizadas deben haber cumplido los 90 das de edad o alcanzar un peso mnimo de 180 gramos. Se realiz lo siguientes pasos para la identificacin de dicho estado:
Presencia del tapn copulatorio. Monitoreo citolgico vaginal. Observacin del aumento de peso con apreciable abalonamiento abdominal y desarrollo significativo de las mamas.
29
FIGURA N 2 Modelo de jaula utilizada, material de metal galvanizado con bebedero y comedero
FIGURA N 3 Observacin del tapn copulatorio y monitoreo citolgico vaginal
30
FIGURA N 4 Observacin de presencia de espermatozoides de la muestra vaginal.
3.2.2.5. Registro Calendarizado del Peso de Ratas.- El control del peso de las ratas se realiz diariamente desde el inicio del apareamiento hasta el final de gestacin y posteriormente en las cras hasta los 120 das.
31
FIGURA N 5 Control diario del peso de las ratas.
3.2.2.6. Observaciones de las Ratas Durante la Gestacin.- Se observaron parmetros de actividades espontneas, reactividad, pasividad, exaltacin a los ruidos, tono corporal y muscular, color de la oreja, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, sensibilidad al dolor, cola anormal, convulsiones.
32
FIGURA N 6 Observacin del comportamiento de las ratas. (rea 1)
3.2.2.7. Observacin Pre y Post Natal.- Este control nos permite conocer datos sobre tasa de mortalidad neonatal, porcentaje de fertilidad, casos de abortos, pesos promedios al nacer y destete. Se efecta mediante el conteo del nmero de cras por parto, siempre teniendo presente los nacidos vivos y muertos pre o post natal.
33
3.2.3. Control De Toxicidad.- Teniendo el conocimiento terico sobre la accin del cadmio en el ser humano, se efecto el control de toxicidad de la siguiente manera:
3.2.3.1. Pruebas Bioqumicas.- Todas las pruebas realizadas en los laboratorios del Centro Asistencial de Anlisis Clnicos de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), empleando los mtodos ya validados por dicho servicio.
Se realizaron diez determinaciones bioqumicas que permitieron evaluar:
A nivel del sistema cardiovascular y heptico: Fosfatasa Alcalina Srica en suero. Mtodo colorimtrico (57), Transaminasa Glutmico Oxalactica (GOT) y Transaminasa Glutmico Piruvato en suero: Mtodo colorimtrico (57).
A nivel del sistema renal (excretor): Glucosa: Mtodo colorimtrico (58 ), Creatina en suero: Mtodo enzimtico (58), Calcio en suero: Mtodo colorimtrico (58).
34
A nivel del sistema hematopoytico: Hemoglobina: Mtodo colorimtrico (58), (59) Recuento de glbulos rojos: Mtodo Hematimetra (58), (59) Recuento de glbulos blancos: Mtodo Leucometra (58), (59) Hematocrito: Mtodo Wintrobe (58), (59) Diferenciacin Celular: Mtodo hemograma Shilling (58), (59)
3.2.4. Observacin de rganos Internos (Macroscpico).- Mediante observacin directa, se realiza la diseccin de ratas grvidas de cada uno de los grupos (control, dm y DM), para observar toxicidad y probable teratogenecidad al da 18 de gestacin.
Se observa, que existen cambios en: hgado, riones, testculos, ovario, tero y rganos anexos, corazn, pulmones, asimismo la vascularizacin.
3.2.5. Observacin Macroscpica Externa.- Se observan en la madre durante la gestacin algunas variaciones externas y conductuales tales como actividad, reacciones extraas, interaccin social, comportamiento agresivo, respuesta somtica, coloracin de la piel, ojos, orejas.
35
3.2.6. Estudio Histopatolgico.- Los estudios histopatolgicos en hgado, rin y testculos fueron realizados en el laboratorio de Histologa, Embriologa y Patologa Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). Por mtodo descriptivo, mediante microscopio ptico.
Al trmino de 120 das se sacrifico las ratas cuyas dosis de administracin con cadmio fue de 80 ug/da, conjuntamente con las del grupo control.
Se retiraron los rganos (hgado, rin, testculo) y se guardaron en un recipiente hermtico con formol al 40 %. (39)
3.2.7. Anlisis Estadstico.- Se ha aplicado la Estadstica descriptiva y cuando fue necesario los modelos matemticos T Student, Tukey, Anova.
36
IV.- RESULTADOS
4.1. 4.1.1. Teratogenecidad.4.1.1.1. Ensayo Preliminar.- Los resultados que se obtuvieron en el ensayo preliminar se presentan en el siguiente cuadro: EVALUACIN DE LA TOXICIDAD CRNICA
CUADRO N 1
GRUPO Control Dosis Mnima Dosis Mxima 22 20 19 20 18 18
X AGUA (ml/da)
X COMIDA (g/da)
X: Promedio
4.1.1.2. Diferencia De Peso Entre El Inicio Y Final Del Periodo De Gestacin.CUADRO N 2 N RATA 1 2 3 4 5 6 102 99 115 * ---70 93 74 * ---76 35 64 46 * ---58 17 60 48 27 CONTROL D. MNIMA D. MXIMA
A variacin (Inicio a Final de la Gestacin) * ---- Rata Sacrificada a los 18 das de gestacin.
37
Los valores observados de las diferencias de peso se presentan en el siguiente cuadro:
CUADRO N 3
GRUPO Control Dosis Mnima Dosis Mxima 95.8 59.0 42.0
X PESO
4.1.1.3. Resultados En Las Cras.-
4.1.1.3.1. Grupo Control.-
CUADRO N 4
PESOS PESO X DE RATA LAS CRAS AL NACER AL NACER LOS 21 DAS LAS CRAS A N DE CRAS GLOBALES PESO X DE
1 2 3 *4 5 6
8 10 4 ---8 7
7.18 8.76 6.98 ---7.50 5.70
51.75 41.40 77.25 ---70.02 44.57
57.44 87.60 27.92 ---60.08 39.90
* Rata sacrificada a los 18 das de gestacin.
38
4.1.1.3.2. Grupo Dosis Mnima
CUADRO N 5
1 *2 3 4 5 6
9 ---6 7 6 3
6.35 ---6.23 5.72 5.81 5.22
33.20 ---42.80 39.50 40.33 ----
57.15 ---37.38 40.04 34.86 15.66
Rata sacrificada a los 18 das de gestacin.
4.1.1.3.3. Grupo Dosis Mxima
CUADRO N 6
*1 2 3 4 5 6
---7 3 7 5 8
---4.80 4.81 5.48 5.70 5.72
---------35.67 ---38.00
---33.60 14.43 38.36 28.50 45.76
* Rata sacrificada a los 18 das de gestacin.
39
Los valores promedios del peso de las cras en los tres grupos se observaron en los siguientes cuadros:
CUADRO N 7
PESO X DE LAS CRAS PESO X DE LAS CRAS
GRUPO
AL NACER (g) A LOS 21 DAS (g)
Control Dosis Mnima Dosis Mxima
7.22 5.86 5.30
56.99 38.90 36.83
Las diferencias entre los pesos de las cras al nacer y los 21 das con respecto al grupo control se presentan en el siguiente cuadro as como el porcentaje de disminucin.
CUADRO N 8
DIFEREN% DE CIA DEL DISMINUPESO AL CIN GRUPO RESPECTO RESPECTO AL AL CONTROL CONTROL Dosis Mnima Dosis Mxima 1.36 1.92 18.83 26.59 18.09 20.16 31.74 35.37 CONTROL CONTROL AL AL RESPECTO RESPECTO NACER 21 DAS CIN PESO A LOS DISMINUCIA DE % DE
DIFEREN-
40
En este cuadro se presenta en la segunda columna el nmero de cras por grupo, en la tercera columna las cras nacidas por grupo y en la cuarta columna el nmero de cras nacidas muertas por grupo. CUADRO N 9 NACIDAS GRUPO VIVAS Control Dosis Mnima Dosis Mxima 37 31 30 37 29 20 ---2 10 MUERTAS N DE CRAS NACIDAS
40 35
37
37 31 29 30
Num ero de ratas
30 25 20 15 10 5 0 control N crias
20
10 2 Dosis mnima Nacidas vivas Nacidas muertas Dosis mximo
FIGURA N 7 Se observa la disminucin de las cras nacidas vivas y el aumento de las cras nacidas muertas de los grupos experimentales respecto al control.
41
En este cuadro se observa el porcentaje de disminucin de las cras al nacer respecto al control.
CUADRO N 10 GRUPO Control Dosis Mnima Dosis Mxima 37 31 30 ---16.22 18.92 N DE CRAS % DE DISMINUCIN
20
18.92 16.22
P o rcen taje d e d ism in u ci n
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 control 0
Dosis mnima
Dosis mximo
FIGURA N 8 Se observa aumento del porcentaje de las cras nacidas de los grupos experimentales respecto al control.
42
En este cuadro se observa la diferencia de porcentaje de las cras nacidas vivas y muertas de los grupos experimental respecto al control.
CUADRO N 11 % DE NACIDOS GRUPO VIVOS Control Dosis Mnima Dosis Mxima 100 93.54 54.05 0 6.46 45.95 MUERTOS % DE NACIDOS
En este cuadro se tiene en la segunda columna el nmero de las cras nacidas vivas, en la tercera columna se tiene el nmero de cras muertas antes de los 21 das y en la cuarta columna el porcentaje de mortalidad.
CUADRO N 12 MUERTOS NACIDOS GRUPO VIVOS 21 DAS Control Dosis Mnima Dosis Mxima 37 29 20 ---0 5 0 0 25 MORTALIDAD ANTES DE LOS % DE
43
4.1.2. Anlisis Estadsticos De Las Diferencias De Peso De Las Cras.- En el cuadro se observa que existen diferencias significativas en el peso de las madres y de las cras al nacer.
CUADRO N 13 Anova de los Pesos al Nacer y 21 Das del Grupo de Estudio Segn Control, Dosis Minima y Dosis Mxima Prueba de Tukey Media N Dosis Grupos Control estndar mxima Control Diferencia del peso de Dosis mnima las madres Dosis mxima control Peso de las Dosis mnima cras al dosis mxima nacer control Peso de las cras los 21 Dosis mnima dosis mxima das 4 2 38.96 36.84 4.09 1.65 0.07 5 57.00 15.85 5 5.302 0.46 5 5.866 0.45 0.004* 5 5 5 59 42 7.224 17.92 19.14 1.10 **P<0.05 **P<0.05 0.001* 5 95.8 16.51 **P<0.05 **P<0.05 mnima g. Dosis Desviacin P+
+P anova ** prueba Tukey ,P<0.05 significativo
44
4.1.3. Registros Fotogrficos.- Las incidencias del efecto teratognico se captan mediante registros fotogrficos que se presentan a continuacin:
FIGURA N 9 Cras de la rata control color rosado
FIGURA N 10 Cra de la rata experimental. Manchas oscuras en la piel (hemangiomas), dosis mnimas
45
FIGURA N 11 Cras de la rata experimental. Manchas oscuras en la piel (hemangiomas). Cianticas. La rata viva muri al tercer da. Dosis mxima.
FIGURA N 12 Cambios conductuales. Agresividad, pelos erizados. Rata experimental Dosis mxima.
46
FIGURA N 13 Cambios conductuales. Falta de atencin a las cras. Rata experimental. Dosis mxima. Nota: Las cras murieron al quinto da.
FIGURA N 14 Se observa el saco embrionario normal. Color rosado. Rata de control sacrificada a los 18 das de gestacin.
47
FIGURA N 15 Se observa el saco embrionario con manchas oscuras cianticas. Rata Experimental: dosis mnima sacrificada a los 18 das de gestacin.
FIGURA N 16 Se observa el saco embrionario color vinoso oscuro, junto con los riones y el hgado. Rata experimental: dosis mxima, sacrificada a los 18 das de gestacin.
48
FIGURA N 17 Comparacin del tamao de las cras, control con las del grupo experimental (dm, DM). Se observa diferencias significativas y coloracin de la piel.
FIGURA N 18 Comparacin del tamao de las cras, grupo control y dosis mnima, a los 12 das de nacidos.
49
FIGURA N 19 Comparacin del tamao de las cras grupo control y dosis mnima, a los 21 das de nacido (destete). Nota: sta diferencia se mantiene hasta los 120 das
50
4.2. RESULTADOS DE CONTROL DE TOXICIDAD
PRUEBAS BIOQUMICAS.- Los resultados se presentan en los cuadros 4.2.1. N 14 al N 21 y las figuras N 20 al N 25.
Sistema Cardio Vascular y Heptico.-
CUADRO N 14 Comparacin de Medias Segn Fosfatasa Alcalina Srica Segn Grupo Control y Experimental
CONTROL P TIEMPO N MEDIA+ SD N MEDIA+ SD EXPERIMENTAL
24/7 28/8 22/9 13/10 28/10
2 2
114.93 106.48 121.40
10.55 15.48 9.85 10.56 14.07
2 2
152.28 178.78 196.85
5.62 11.42 8.41 22.78 15.81
0.04* 0.03* 0.01* 0.002* 0.001*
2 2
119.91 117.42
4 3
246.99 312.38
*P<0.05 existe diferencias significativas +T student
51
Comparacin de Medias Segn Fosfatasa Alcalina Srica Segn Grupo Control y Experimental
350 312.38 300 250 178.78 200 152.275 150 114.93 100 50 0 24/7 28/8 22/9 13/10 28710 106.48 121.40 119.91 117.42 196.85 246.99
Control
Experimental
FIGURA N 20 En la figura se observa un aumento en las concentraciones de las medias del grupo control y el experimental en funcin del tiempo de exposicin al cadmio.
52
CUADRO N 15 Anlisis de Varianza de la Fosfatasa Alcalina Srica Segn Tiempo por Grupo Experimental
DESVIACIN N ESTNDAR 27/4 28/8 22/9 13/10 28/10 Total 2 2 2 4 3 13 152.28+ 178.78+ 196.85+ 246.99+ 312.38+ 229.3+ 5.6215 11.42 8.4146 22.775 15.805 60.087 148.3 170.7 190.9 225.2 298.25 148.3 156.25 186.85 202.8 0.00* 271.73 329.45 329.45 MEDIA MNIMO MXIMO P
*p<0.05 se encontr diferencias significativas, segn F +Prueba tukey : FA(27/4) < FA(28/8) < FA(22/9) < FA(13/10) < FA(28/10) significativamente P<0.05
Se observa que la FA aumenta respecto al tiempo estadsticamente significativa P<0.05 con respecto al tiempo
53
Los resultados obtenidos para la Glutamato Oxalacetato Transaminasa (GOT) cuadro N 16, indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre el grupo control y experimental.
CUADRO N 16
Comparacin de Medias de la Glutamato Oxalacetato Transaminasa Srica (GOT) Segn Grupo Control y Experimental
CONTROL P TIEMPO N MEDIA+ SD N MEDIA+ SD
EXPERIMENTAL
28/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2
57.55 55.7 64 67.8
3.04 1.56 8.06 12.73
2 2 4 2
132.68 165.18 208.31 247.73
5.05 21.25 26.83 31.71
0.03* 0.01* 0.002* 0.01*
*P<0.05 existe diferencias significativas +T student
54
Comparacin de Medias de la Glutamato Oxalacetato Transaminasa Srica (GOT), Segn Grupo Control y Experimental
300.00 247.73 250.00 208.31 200.00 165.18 132.68 150.00 100.00 57.55 50.00 0.00 55.7 64 67.8
28/8
22/9
13/10
28/10
Control
Experimental
FIGURA N 21 En la figura se observa un aumento de la concentracin de las medias del grupo control y el experimental en funcin del tiempo de exposicin.
55
CUADRO N 17
Anlisis de Varianza de la Glutamato Oxalacetato Transaminasa Srica (GOT), Segn Tiempo por Grupo Experimental
DESVIACIN N ESTNDAR MEDIA MNIMO MXIMO P
28/8 22/9 13/10
2 2 4
132.68 165.18 208.31
5.05 21.25 26.83
129.11 150.15 181.90
136.25 180.20 0.01* 240.12
28/10
247.73
31.71
225.30
270.15
*p<0.05 se encontr diferencias significativas, segn F +Prueba tukey : la media GOT (28/8) < GOT (22/9) < GOT (13/10) < GOT (28/10) significativamente P<0.05
Se observa que la GOT aumenta respecto al tiempo estadsticamente significativa P<0.05 con respecto al tiempo
56
Los resultados obtenidos para la Glutamato Piruvato Transaminasa Srica (GPT), cuadro N 18 y figura N 22 no indican diferencias significativas cuanto se comparan las concentraciones entre el grupo control y experimental.
CUADRO N 18
Comparacin de Medias Segn de Glutamato Piruvato Transaminasa Srica (GPT) Segn Grupo Control y Experimental
29/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2
33.29 28.74 25.74 28.51
0.60 1.49 0.33 1.36
2 2 3 2
24.9 27.75 28.46 26.20
5.26 1.06 3.56 3.13
0.15 0.52 0.38 0.44
P> 0.05 no existe diferencias significativas +T student
57
Comparacin de Medias Segn de Glutamato Piruvato Transaminasa Srica (GPT) Segn Grupo Control y Experimental
35 30
33.29 28.74 27.75 24.9 25.74 28.46 28.51 26.2
25 20 15 10 5 0
29/8
22/9
13/10
28/10
Control
Experimental
FIGURA N 22 En la figura no se observa ninguna diferencia sustancial en las concentraciones de las medias del grupo control y el experimental en funcin del tiempo de exposicin.
58
Aparato Excretor.Los resultados obtenidos en Creatinina Srica (cuadro N 19 y figura N 23) no indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre el grupo control y experimental.
CUADRO N 19
Comparacin de Medias de la Creatinina Segn Grupo Control y Experimental

29/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2
10.32 9.74 11.44 12.26
0.19 0.36 2.51 0.74
2 2 4 2
7.59 11.17 12.63 11.44
1.09 0.79 1.74 0.18
0.07 0.14 0.52 0.26
P> 0.05 no existe diferencias significativas +T student
59
Comparacin de Medias de la Creatinina Segn Grupo Control y Experimental

14 11.44 12 10.32 10 8 6 4 2 0 29/8 22/9 13/10 28/10 7.59 9.74 11.17
12.63
12.26 11.44
Control
Experimental
FIGURA N 23 En la figura no se observa diferencia sustancial en las concentraciones de las medias del grupo control y experimental.
60
Los resultados obtenidos en Glucosa (cuadro N 20 y figura N 24) no indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre el grupo control y experimental.
CUADRO N 20
Comparacin de Medias de la Glucosa Segn Grupo Control y Experimental
CONTROL P TIEMPO N MEDIA SD N MEDIA SD
EXPERIMENTAL
24/7 29/8 13/10 28/10
2 2 2 2
76.76 87.16 67.67 64.75
13.53 15.66 7.05 3.9
2 2 4 2
90.70 132.56 76.13 57.98
18.38 9.97 8.37 9.87
0.53 0.07 0.29 0.46
P> 0.05 no existe diferencias significativas
61
Comparacin de Medias de la Glucosa Segn Grupo Control y Experimental
140 120 90.7 100 76.76 80 87.16
132.56
76.13 67.67 64.75 57.98
60 40 20 0 24/7 29/8 13/10 28/10
Control
Experimental
62
Los resultados obtenidos en Calcio (cuadro N 21 y figura N 25) no indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre el grupo control y experimental.
CUADRO N 21
Comparacin de Medias del Calcio Segn Grupo Control y Experimental

CONTROL P TIEMPO N MEDIA SD N MEDIA SD EXPERIMENTAL
25/7 28/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2 2
13.84 12.3 11.05 10.54 12.33
1.64 1.06 0.16 0.34 1.64
2 2 2 4 2
10.54 10.77 10.95 11.64 11.93
1.11 1.24 0.43 0.99 1.14
0.14 0.30 0.79 0.22 0.80
P> 0.05 no existe diferencias significativas
63
Comparacin de Medias del Calcio Segn Grupo Control y Experimental
16 13.84 14 12 10 8 6 4 2 0 25/7 28/8 22/9 13/10 28/10 10.54 12.3 11.05 10.77 10.95 11.64 10.54 12.33 11.93
Control
Experimental
64
4.2.2. SISTEMA HEMATOPOYTICO.- Los resultados obtenidos para los Hemates no indican diferencias significativas, como se presentan en los cuadros N 22 al N 27 y las figuras N 26 al N 31.
CUADRO N 22
Comparacin de Medias de los Hemates Segn Grupo Control y Experimental
EXPERIMENTAL
29/8 22/9 13/10
2 2 2
4235000 4070000 4180000
700035 31112.9 155563
2 2 4
4615000 4125000 4372500
459619 77781.7 526584.9
0.58 0.83 0.66
P> 0.05
65
Comparacin de Medias de los Hemates Segn Grupo Control y Experimental
4700000 4600000 4500000 4372500 4400000 4300000 4200000 4100000 4000000 3900000 3800000 3700000 29/8 22/9 13/10 4070000 4235000 4125000 4180000 4615000
Control
Experimental
66
Los resultados obtenidos para los Leucocitos indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre Leucocitos del Grupo control y experimental (cuadro N 23 y figura N 27).
CUADRO N 23
Comparacin de Medias de los Leucocitos Segn Grupo Control y Experimental
EXPERIMENTAL
29/8 22/9 13/10
2 2 2
11.87 4.8 13.52
3.71 0.35 0.31
2 2 4
10.05 9.52 8.72
0.84 0.67 1.32
0.56 0.01* 0.03*
*P<0.05 + T stundent Se encontr diferencias significativas en el tiempo 29/8 y el tiempo 13/10
67
Comparacin de Medias de los Leucocitos Segn Grupo Control y Experimental
16 14 11.87 12 10.05 10 8 6 4 2 0 29/8 22/9 13/10 4.8 9.52 8.72 13.52
Control
Experimental
FIGURA N 27 En la figura se observa diferencia sustancial en las concentraciones de las medias del grupo control y experimental.
68
Los resultados obtenidos para la Hemoglobina no indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre Hemoglobina del Grupo control y experimental (cuadro N 24 y figura N 28).
CUADRO N 24
Comparacin De Medias de la Hemoglobina Segn Grupo Control y Experimental
EXPERIMENTAL
25/7 29/8 22/9 13/10
2 2 2 2
10.45 13.07 12.57 12.88
0.49 2.19 0.98 0.54
2 2 2 4
8.4 14.3 12.73 13.47
5.7 1.22 0.33 1.61
0.67 0.60 0.84 0.65
P> 0.05
69
Comparacin De Medias de la Hemoglobina Segn Grupo Control y Experimental
16 14 12 10.45 10 8 6 4 2 0 25/7 29/8 22/9 13/10 8.4 13.07 14.3 12.57 12.73 12.88 13.47
Control
Experimental
70
Los resultados obtenidos para el Hematocrito no indican diferencias significativas cuando se comparan las concentraciones entre Hematocrito del Grupo control y experimental (cuadro N 25 y figura N 29).
CUADRO N 25
Comparacin de Medias del Hematocrito Segn Grupo Control y Experimental
EXPERIMENTAL
25/7 29/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2 2
31 38.5 37 38 37.5
1.41 6.36 2.82 1.41 3.53
2 2 2 4 2
32.5 41.5 37.5 39.7 38.5
6.36 3.53 0.7 4.78 0.7
0.77 0.61 0.83 0.65 0.73
P> 0.05
71
Comparacin de Medias del Hematocrito Segn Grupo Control y Experimental
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 25/7 32.5 31 38.5
41.5 37 37.5 38
39.7
37.5
38.5
29/8
22/9
13/10
28/10
Control
Experimental
72
Los resultados obtenidos para los mononucleares indican una diferencia significativa cuando se comparan las concentraciones entre los mononucleares del grupo control y experimental en el tiempo 28/10, como se muestra en el cuadro N 26 y la figura N 30.
CUADRO N 26
Comparacin de Medias de los Mononucleares Segn Grupo Control y Experimental
EXPERIMENTAL
25/7 29/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2 2
78 80.5 77.5 74.5 75.5
12.7 2.12 2.12 3.53 2.12
2 2 2 4 2
73 79 76 77.6 64
3.5 2.87 15.5 7.37 1.41
0.67 0.60 0.90 0.60 0.02*
*P< 0.05 +T student
73
Comparacin de Medias de los Mononucleares Segn Grupo Control y Experimental
90 78 80 70 60 50 40 30 20 10 0 25/7 29/8 22/9 13/10 28/10 73 80.5 79 77.5 76 74.5 77.6 75.5 64
Control
Experimental
FIGURA N 30 En la figura se observa una disminucin significativa en la concentracin de la media en el tiempo 28/10.
74
Los resultados obtenido para la polimorfonucleares indican una diferencia significativa cuando se comparan las concentraciones entre los polimorfonucleares del grupo control y experimental en el tiempo de 28/10, como se muestra en el cuadro N 27 y la figura N 31.
CUADRO N 27
Comparacin de Medias de los Polimorfonuclear Segn Grupo Control Y Experimental

CONTROL P TIEMPO N MEDIA SD N MEDIA SD EXPERIMENTAL
25/7 29/8 22/9 13/10 28/10
2 2 2 2 2
22 19.5 22.5 25.5 24.5
12.72 2.12 2.12 3.53 2.12
2 2 2 4 2
26 21 24 22.3 36
3.53 2.82 15.5 7.36 1.41
0.67 0.6 0.90 0.60 0.02*
*P< 0.05 +T student
75
Comparacin de Medias de los Polimorfonuclear Segn Grupo Control y Experimental
40 36 35 30 26 25 22 20 15 10 5 0 25/7 28/8 22/9 13/10 28/10 19.5 21 22.5 22.3 24 25.5 24.5
Control
Experimental
FIGURA N 31 En la figura se observa un aumento significativo en la concentracin de la media en el tiempo 28/10.
76
4.2.3. OBSERVACIN DIRECTA DE RGANOS INTERNOS.-
CUADRO N 28
CONTROL Coloracin signos de Normal HGADO hemorragia y de Tamao Normal Hepatomegalia VASCULA hemorrgicos RIZACIN Engrosamiento de venas y arterias Envoltura del embrin limpias. TERO vasos fetales Embrin de color rosado coloracin de vasos fetales Embriones de color rojo vinoso coloracin de vasos fetales. Embrin de color rojo vinoso con manchas negras Aspecto normal de Envolturas de embrin poco opacas Variacin en la Envolturas del embrin con alto contenido de cadmio. Variacin en la Anormal envoltura hemorrgicos Normal, sin focos Aumento anormal Focos Hepatomegalia Hepatoxicidad por DOSIS MEDIA DOSIS MXIMA
INTESTINOS Y RGANOS ANEXOS Coloracin rosada Coloracin gris Coloracin gris
77
4.2.4. ESTUDIO HISTOPATOLGICO.-
a. Testculos: Edema intertubular, el resto del corte de tejido sin cambios aparentes.
b. Hgado: Se conserva la citoarquitectura del tejido heptico sin lesiones aparentes, sin embargo; la zona III se observa leve congestin pericentrolobulillar pericentrolobulillares. y degeneracin de los hepatocitos
c. Rin: Glomrulos dilatados, ausencia total de la cpsula de Bowman, leve degeneracin hidrpica del epitelio tubular.
78
V.- DISCUSIN
En estudios sobre toxicidad crnica se ha observado que concentraciones de 10 mg Cd/L en el agua de bebida causaron cambios funcionales y estructurales (10), por lo que se toma este dato como referencia para establecer la dosis mnima (40 ug) y la dosis mxima (80 ug); ensayados a efectos de disear el modelo que permitiera el estudio de toxicidad crnica planteado.
Los Resultados obtenidos en la exposicin crnica pueden atribuirse a la acumulacin, si bien no se encuentran con datos de investigacin para la dosis utilizadas, indican que la administracin de 80 ug/da/0.2 kg de peso corporal es la de mayor impacto toxicolgico a la luz de los resultados, teratognicos, bioqumicos e histopatolgicos obtenidos en ratas albinas especie Rattus novegicus Holtzman, que pasamos a discutir.
De los resultados obtenidos en cuanto al periodo de gestacin de las ratas se observo disminucin del promedio de pesos en relacin a la concentracin de dosis administradas, como se detalla en los cuadros N 2 y 3, estudios recientes han demostrado que exposicin crnica de cadmio altera el metabolismo de los minerales esenciales en el hgado, causando disminucin del fierro y selenio, y por
79
otro lado un aumento de magnesio y zinc hepticos. La deficiencia dietaria provoca una mayor absorcin del cadmio y capacidad de detoxificacin. (47)
La administracin de Cloruro de Cadmio en concentraciones de 50, 100, 150 m/da/kg en ratones albinos en el agua de bebida ocasiona dao heptico y alteracin de su funcionabilidad, como vacualizacin Citoplasmtica, liberacin de lisosomas, condesaccin de la cromatina y dilatacin mitocondrial (40), lo que explicara los resultados obtenidos (35), (36).
Existen diferencias en los resultados obtenidos de los pesos al nacer (cuadros N 4, 5, 6 y 7) y de las cras nacidas vivas y/o muertas (cuadro N 9), comparando el grupo control con el experimental.
Estudios recientes con aplicacin de cadmio en ratones albinos a dosis de 50, 100, 150 ug/kg de peso por via oral, observaron en los expuestos a nivel del epitelio degeneracin en la corteza, aumento del nmero de folculos atrsicos, disminucin del nmero de folculos en los diferentes estadios de maduracin, gran vaso dilatacin sangunea, tendiente a la hemorragia. (49)
Esto genera trastornos en la irrigacin, origina dficit de oxigenacin y producen alteraciones como el desarrollo folicular con grandes reas de desorganizacin celular (50). Esta existencia de un trastorno de tipo circulatorio nos estara explicado los resultados obtenidos.
80
En la comparacin del peso de las cras a los 21 das de nacido (cuadros N 7 y 8) se observa una disminucin del grupo experimental en relacin al control. La restriccin dietaria del calcio por la deficiencia de fierro resulta en un efecto aditivo en la disminucin de la densidad mineral del fmur, la resistencia sea y la maduracin violenta del colgeno y su posible accin sobre la hormona del crecimiento (48); explicara la disminucin en la capacidad de desarrollo, llamado acondroplasia.
Los ensayos de toxicidad crnica requieren la aplicacin de tcnicas analticas para determinar efectos sobre la qumica de la sangre y las clulas sanguneas, asimismo estas pruebas pueden desarrollarse en ratas a intervalos de 2 a 4 semanas. Las pruebas analticas y funcionales empleadas, ensayos crnicos se relacionan a la toxicogentica.
Se sabe que el cadmio al exponerse por va oral realiza una funcin inicial de induccin de sntesis de las metalothioneinas y sus centros de accin, son principalmente el hgado, riones y testculos. (9)
Para las pruebas del funcionalismo heptico se recomienda evaluar la fosfatasa alcalina srica y la glutamato piruvato transaminasa srica. (56)
81
Los resultados obtenidos en la fosfata alcalina srica, comparando el grupo control y experimental (cuadro N 14) se observa el aumento de las medias en funcin del tiempo que estadsticamente es significativa. Estudios relacionados indican que el cadmio parece no generar directamente radicales libres en condiciones fisiolgicas sin embargo estos pudieran formarse por interaccin del cadmio y lugares celulares crticos como la mitocondrial, (33). El cadmio a exposicin aguda incrementa el stress oxidativo; que explicara la fisiopatologa heptica y los resultados obtenidos. (55).
Por produccin del anin superoxido y xido ntrico, induciendo la peroxidacin lipdica y excrecin de metabolitos lipdicos (45), (41), (42), (43), (40), que podra explicar el resultado obtenido.
Para determinar clulas de tejidos lesionados, la prueba analtica recomendada es la determinacin de la glutamato oxalacetato transaminasa srica (56), de los resultados obtenidos del G.O.T. comparando el grupo control y experimental (cuadro N 15) se observa un aumento de la concentracin de las medias en funcin del tiempo, estadsticamente significativo. La citotoxicidad en la alteracin funcional y estructural (40) explicara los resultados.
En el aparato excretor (riones), las pruebas analticas principalmente recomendadas son la creatinina glucosa y el calcio srico. (56).
82
Estudios realizados en clulas renales expuestos a bajas concentraciones de cadmio, observaron en las organelas, condensacin de las mitocondrias, vacuolizacin citoplasmtica (52). Tambin evidencia alta toxicidad para el PX 15 (51). Otros investigadores determinaron alteraciones funcionales (parmetros bioqumicos) administrando en ratas cadmio 50 mg/kg/da I.P.; durante 9 semanas observaron aumento de creatinina, glucosa, fosfata alcalina srica. Tambin midieron aldheido malnico, como ndice de peroxidacin lipdica, concluyendo que son citotxicos. (53).
De los resultados obtenidos (cuadros N 19, 20 y 21) de creatinina, glucosa, calcio, comparando los grupos controles y experimentales se encontr que no existe diferencias significativas, que explicaran que a la dosis de 80 ug/da/0.2 kg, todava no produce efectos txicos manifiestos, considerando que el cadmio en su toxodinamia produce toxicidad renal. (19).
Existen trabajos de investigacin para relacionar la toxicidad crnica del cadmio con el sistema hematopoytico:
Al administrar 1 mg kg de cloruro de cadmio en ratones isognicos de la cepa Swiss, por va intraperitonal durante 21 das, observaron que afecta la hematopoyesis en la mdula sea y esplnica. Atribuyeron la accin del cadmio a un proceso inflamatorio mediados por molculas como el xido ntrico o citoqunonas (54), tambin manifestando clulas hipostticas y necrticas. (55)
83
De los resultados obtenidos en los ensayos hematopoyticos (Cuadros N 22, 23, 24, 25, 26 y 27) no existe diferencias significativas. En la mayora de los ensayos salvo en los ensayos mononucleares y polimorfonucleares que el tiempo 20/10 existen diferencias significativas, en estos casos tambin la concentracin y va de administracin explicara los resultados obtenidos.
Los ensayos de toxicidad crnica incluyen evaluacin en cuanto a los efectos patolgicos e histolgicos cuanto menos al final de los experimentos. La orientacin de estos estudios es comnmente llevados a cabo en relacin a su comportamiento toxocintico.
En nuestro caso se estudi rganos como el hgado, riones y testculos.
Las observaciones halladas en otros trabajos de investigacin citan: hiperplasias de las clulas de Leydig, aumento de vasos sanguneo en el intersticio, proliferacin en ratas tratandas con cadmio durante 8 meses a una concentracin de 80 mg /kg peso (34); estress oxidativo en tejido testicular como consecuencia de la disminucin flujo sanguneo, perdida del endotelio vascular (44); hipotrofia testicular a dosis, retardo del desarrollo en clulas hepiteliales (31); hiperplasia, aumento de vasos sanguneos en el intersticio, adenocarcinomas testiculares (29), (30); condensacin cromtica, dilatacin mitocondrial en el hgado (40); aumento de folculos atresicos, disminucin folculos en el ovario (49). En nuestra investigacin a exposicin de 4
84
meses y 80 ug/da, en comparacin con el grupo control observamos en el hgado citoarquitectura del tejido heptico sin lesiones aparentes; sin embargo existe leve congestin perilentrolobulellar y degeneracin tubular, en los testculos presentan edema intertubular, que confirma la toxicidad del cadmio en su centro de accin.
Con respecto al aspecto externo de las cras del grupo experimental se observo desde el da del nacimiento manchas vinosas en la piel (hemangiomas), adems a los 21 das se pudo observar atresia genito urinario y disminucin de la capacidad del desarrollo (acondroplasia).
85
VI.- CONCLUSIONES
1. La evaluacin realizada despus de administrar cadmio a ratas durante el periodo de gestacin determin:
a. Efectos teratognicos con presencia de hemangiomas y acondroplasia.
b. Toxicidad reproductiva con presencia de bajo peso al nacer, bajo porcentaje de fertilidad con reducido nmero de cras por camada y mortalidad elevada.
2. La evaluacin realizada despus de administrar cadmio durante 120 das determin:
a. Alteracin de la concentracin plasmtica de fosfatasa alcalina srica y glutamato oxalacetico srico.
b. En el estudio histopatolgico dao funcional y estructural en el hgado y rin.
86
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56. LOOMIS TA. Fundamentos de Toxicologa ED. Acribia Zaragosa. Espaa 1989. 229-243. 57. FRANKEL Diagnostics Edit. Acribia. Zaragosa. Espaa; 1970 (1): 123. S. Gradwohls Clinical Laboratory Methods and
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58. BERNARD J. Diagnstico y Tratamiento Clnico por el Laboratorio Ediciones Cientficas Tcnicas. Barcelona. Espaa 1993.
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60. OECD. Guideline for Testing of Chemicals. Organization for Economic Cooperation and Development - Guide N 414. 2001.
61. OECD. Guideline for Testing of Chemicals. Organization for Economic Cooperation and Development - Guide N 415. 1983.
62. OECD. Guideline for Testing of Chemicals. Organization for Economic Cooperation and Development - Guide N 416. 2001
97
VIII.- ANEXOS
FIGURA N 32 Se observa saco embrionario, hgado, rin, con vasodilatacin. Rata experimental, dosis mnima
FIGURA N 33 Se observa al equipo de Investigacin en momento de la diseccin y toma de muestra.
98
FIGURA N 34 Cras del grupo control, a las 24 horas de nacidos, conformacin anatmica normal.
FIGURA N 35 Momento de nacimiento de cras cianticas, grupo dosis mxima.
99
FIGURA N 36 Cras de dosis mxima, 2 nacidas muertas.

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA UNIDAD DE POSTGRADO

TESIS para optar al grado acadmico de Doctor en Farmacia y Bioqumica

AUTOR Mesas Moiss Garca Ortiz

ASESOR Eloisa M. Hernndez Fernndez

Lima Per 2008

Muy en especial a la asesora del presente trabajo:

Dra. Eloisa M. Hernndez Fernndez

A Gustavo y Joanna por compartir mis anhelos.

86 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Palabras Claves: Cadmio, Teratogenia, Fosfatasa Alcalina Srica

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hemangiomas con manchas en la piel

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estadsticamente significativas entre el tiempo de exposicin y el desarrollo de hipertensin arterial.

No obstante, no se dispones de una decisin concluyente al respecto y el tema es an motivo de controversia.

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III.- PARTE EXPERIMENTAL

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3.2.1. Ensayos Preliminares.

El cadmio fue administrado en el agua de bebida.