Manual de Procedimientos de Hematología I 2014 v1.1

MLHIv1.
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Manual de procedimientos de laboratorio de Hematología I Página 1/44
Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina
Escuela de Bioanálisis
Cátedra de Hematología
Hematología I
MLHI
Manual de procedimientos de laboratorio de
Hematología I
2014
Versión 1.1
Revisado y aprobado: 01 Febrero 2014
Versión 1. Elaborado, revisado y aprobado por: Versión 1.1. Revisado y aprobado por:
Alfredo Gallardo Alfredo Gallardo
Thais Delgado Lourdes Freitas
Lourdes Freitas
Gabriela Franco
Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Asignatura: Hematología I
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El siguiente manual compila los procedimientos necesarios para realizar las actividades prácticas de la
asignatura de Hematología I.
Estos procedimientos fueron elaborados de manera independiente por los profesores y revisados de
manera conjunta.
En su laboratorio de prácticas le será asignado un sitio de trabajo en el cual dispondrá de un
microscopio y tendrá a su disposición para el desarrollo de las actividades prácticas: tubos de ensayo
de 10 x 75 mm, 12 x 75mm, pipeta de 1ml, 5ml y 10ml, gradilla, cámara de Neubauer, plastilina para
hematocrito, reloj, tapones de goma, entre otros.
Sobre el mesón de trabajo dispondrá de los reactivos, colorantes, algodón, gasa y papel absorbente
de uso común necesarios para la ejecución de la práctica.
El laboratorio cuenta con los instrumentos necesarios para realizar la práctica y un área de lavado
para la limpieza del material empleado en la actividad práctica.
El estudiante debe traer guantes, propipeta, laminas portaobjeto, láminas cubreobjetos, laminilla
hematimétrica, pipetas de sahli (2), entre otros materiales que le serán notificados al inicio del
semestre.
Listado de procedimientos:
Código Nombre del procedimiento Página
PHI-ExV Métodos de extracción de sangre venosa 3
PHI-ExC Método de extracción de sangre capilar 6
PHI-FrotisE Elaboración de frotis sanguíneo 8
PHI-Giemsa Coloración de Giemsa 10
PHI-Wrigth Coloración de Wright 12
PHI-FrotisOM Observación microscópica del frotis sanguíneo (morfología 14
sanguínea)
PHI-FrotisDif Realización del diferencial leucocitario visual 16
PHI-HbM Medición de hemoglobina manual 18
PHI-HbCal Procedimiento de calibración del Spectronic 20 20
PHI-HbCI Control interno de fotómetros 23
PHI-Hto Medición del hematocrito manual 24
PHI-GBR Recuento de leucocitos método directo en hemocitómetro 26
PHI-PlqR Recuento de Plaquetas método directo en hemocitómetro 30
PHI-Cresil Coloración de azul brillante de cresil (ABC) 34
PHI-PlqM Visualización de la morfología y estimación de plaquetas 36
PHI-Ret Recuento de reticulocitos 37
PHI-Eb Recuento de eritroblastos y corrección de leucocitos 38
PHI-FD Fenómeno drepanocítico 40
PHI-VSG Velocidad de sedimentación globular (VSG) 41
Cada procedimiento comienza en una hoja con el código del mismo y su nombre. Contiene seis
apartados que describen su intención: 1.- Objetivo, 2.- Fundamento, 3- Material necesario, 4.-
Procedimiento, 5.- Recomendaciones – precauciones, 6.- Modo de reportar y 7.- Bibliografía.

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PHI-ExV
Métodos de extracción de sangre venosa
1.- Objetivo
Extracción de sangre venosa satisfactoria para la obtención de muestras de la región antebraqueal
anterior por medio de sistemas al vacío, inyectadora o scalp.
2.- Fundamento
Extraer sangre venosa de la región antebraquial anterior por medio de los sistemas al vacío,
inyectadora o scalp, es considerado el método de preferencia para la recolección sanguínea, debido a
las características de las venas en la región antebraquial como: fácil acceso, poco móviles, menos
dolorosas, visibles y palpables que permitirá la obtención de una muestra representativa del estado
real del paciente, como paso pre-analítico fundamental que asegurará adecuadamente el
procedimiento analítico.
3- Material necesario
3.1.- Algodón
3.2.- Gasa estéril
3.3.- Alcohol isopropílico
3.4.- Torniquete de banda ancha
3.5.- Sistema al vacío: aguja y camisa
3.6.- Inyectadora con aguja o Scalp
3.7.- Tubos al vacío con K2EDTA
3.8.- Descartador de bioseguridad
3.9.- Silla de extracción.
4.- Procedimiento
4.1.- Preparación del paciente
4.1.1.- Posición del paciente: El paciente debe encontrarse en posición confortable y cómoda que
facilite el trabajo al Bioanalista. Proceder a sentar al paciente en la Silla de extracción con el brazo a
utilizar extendido y apoyado sobre el apoya brazo de la silla del lado donde se va a producir la
punción.
4.1.2.- Una vez que el paciente se encuentre instalado, preparar el material a utilizar, de modo que
todo esté a su alcance al momento de realizar la punción. Seleccionar los tubos según la orden de
solicitud, preparar un algodón con alcohol, gasa y el torniquete.
4.2.- Preparación del sistema de extracción

4.2.1.- Si se va a realizar la venopunción con sistema al vacío: tomar el sistema de aguja, romper el
precinto de seguridad girando con ambas manos en sentido contrario a nivel de la etiqueta, quitar la
tapa de la aguja que se adaptará a la camisa.
4.2.3.- Si se va a realizar la venopunción con inyectadora o scalp: destapar el sistema de inyectadora
y/o scalp. Proceder a adaptar la aguja o el scalp a la inyectadora.
4.3.- Preparación de la vena

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4.3.1.-Colocar el torniquete por encima del pliegue del codo, aproximadamente a 5 cm de éste.
Inmediatamente seleccionar la vena, palpando suave y firmemente la piel con el dedo índice.
4.3.2.- Quitar el torniquete. Realizar la asepsia de la zona pasando un algodón empapado en alcohol
en el sitio seleccionado de adentro hacia fuera o de arriba hacia abajo. Permitir que éste se evapore.
4.3.3.- Nuevamente colocar el torniquete por encima del pliegue del codo, aproximadamente a 5 cm.
4.3.4.- Tomar el dispositivo de su elección, al cual se le ha insertado la aguja, con la mano más hábil
quitar la tapa de ésta.
4.3.5.- Con la otra mano fijar la vena, colocando el pulgar en sentido lateral externo cercano al sitio de
inserción, presionando ligeramente para que la piel se estire.
4.3.6.-Insertar la aguja con la cara del bisel dirigida hacia arriba en la dirección de la vena
seleccionada, en un ángulo de 15°, con un movimiento seguro y firme. Descanse ligeramente la mano
con la que realiza la inserción en el antebrazo del paciente.
4.4.- Extracción de la sangre propiamente dicha

4.4.1- Si se va a realizar la venopunción con sistema al vacío:
4.4.1.1.-Con la mano con la cual ha fijado la vena, proceder a tomar el tubo al vacío e insertar éste en
el otro extremo de la camisa. Colocar el tubo con la etiqueta hacia abajo para visualizar mejor la
entrada de la sangre.
4.4.1.2.- Atravesar completamente el tapón del tubo con la aguja interna de la camisa. La sangre fluirá
dentro de éste a causa del vacío. Dejar que se llene espontáneamente, extraer el tubo de la camisa y
mezclar por inversión suave y completa aproximadamente dos (2) veces, asegurando la
homogeneidad de la muestra con el anticoagulante o aditivo.
4.4.1.3- Si se requiere introducir un nuevo tubo, extraer el tubo lleno, mezclar e inmediatamente
introducir el nuevo, hasta obtener la cantidad de tubos necesarios en el siguiente ORDEN DE
LLENADO:
1er Tubo para pruebas de coagulación con citrato de sodio, tapa celeste.
2do Tubo sin anticoagulante, tapa roja. Tubo con gel separador, tapa amarilla
3er Tubo para hematología con K2EDTA, tapa morada
4.4.1.4.- Antes de sacar el último tubo, quitar el torniquete y extraer el tubo. El torniquete NO DEBE
permanecer colocado más de un (1) minuto, debido a que causa estasis venosa.
4.4.1.5.- Colocar en el sitio de la punción una gasa estéril y remover la aguja de la vena, sugiriendo al
paciente levantar el brazo por encima de la cabeza por cinco (5) minutos para evitar hemorragia y/o
hematomas.
4.4.1.6.- Con precaución, descartar la aguja insertándola en el orificio del descartador; con un
movimiento seguro ajustar ésta en la zona más angosta del descartador y desenrollarla de la camisa.
4.4.2.- Si se va a realizar la venopunción con inyectadora o scalp:

4.4.2.1.- Proceder a halar lentamente el embolo de la inyectadora, dejar que fluya la sangre. Extraer la
cantidad de sangre necesaria para las pruebas a realizar dependiendo del número de tubos y
capacidad de éstos.
4.4.2.2.- Quitar el torniquete, éste NO DEBE permanecer colocado más de un (1) minuto, debido a que
causa estasis venosa.
4.4.2.3.- Colocar en el sitio de la punción una gasa estéril y remover la aguja de la vena, ordenando
inmediatamente al paciente levantar el brazo por encima de la cabeza por cinco (5) minutos para
evitar hemorragia y/o hematomas.
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4.4.2.4.- Pinchar el tubo y dejar que se llene por presión negativa y mezclar por inversión completa.
Proceder de la misma manera con los tubos sucesivos, en el siguiente ORDEN DE LLENADO:
1º Tubo para pruebas de coagulación con citrato de sodio, tapa celeste.
2º. Tubo sin anticoagulante, tapa roja. Tubo con gel separador, tapa amarilla
3º Tubo para hematología con K2EDTA, tapa morada.
4.4.2.5.- Identificar el (los) tubo(s) con el nombre y apellido del paciente, edad, número de
identificación y fecha.
4.4.2.6- Colocar los tubos en la gradilla y mantenerlos en un lugar fresco, hasta el momento de
procesar las muestras.
4.4.2.7.- Con precaución, descartar la aguja insertándola en el orificio del descartador; con un
movimiento seguro ajustar ésta en la zona más angosta del descartador y desenrollarla de la
inyectadora.
4.4.2.8.- Recoger el área donde se ha realizado la extracción, dejando todo en orden. Descarte los
desechos punzo penetrantes en los descartadores específicos de bioseguridad, y los desechos no
punzo penetrantes en las papeleras específicas de bioseguridad.
5.- Recomendaciones – precauciones

5.1.- Establecer las medidas básicas de bioseguridad y buenas prácticas de laboratorio. Utilizar la bata
de laboratorio, guantes, lentes de protección.
5.2.- Debe lavarse las manos antes y después de cada punción.
5.3.- Descartar correctamente los desechos de riesgo biológico.
6.- Modo de reportar

NO APLICA
7.- Bibliografía
7.1.- Hematología I. Guía Práctica. Cátedra de hematología, Escuela de Bioanálisis, UCV. 2011.
7.2.- Obtención de muestras de sangre. Capítulo I. Gaudens de Fragachan. Manual práctico de morfología
sanguíneo. 1986.
7.3.- Recolección de la muestra. Capitulo 2. Hematología. Fundamentos y aplicaciones clínicas. Rodak. 2ªed. Ed
Panamericana. 2004.

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PHI-ExC
Método de extracción de sangre capilar
1.- Objetivo
Extracción de sangre capilar para la obtención de muestras de la superficie palmar de los dedos
mediante sistema de lancetas o microtainer.
2.- Fundamento
La extracción de sangre capilar es un método poco utilizado debido a la complejidad de la toma, lo
traumático del procedimiento y el aumento en la probabilidad de errores en la recolección que
afectara directamente el procedimiento analítico. Aun así, bajo una esquematización correcta y la
destreza del operador es requerida la obtención de una muestra por punción capilar, específicamente
en: recién nacidos, pacientes con venas difíciles o la solicitud de exámenes específicos en
micrométodos.
3.1.- Algodón
3.2.- Gasa estéril
3.3.- Alcohol
3.4.- Lanceta
3.5.- Tubos con K2EDTA con capacidad para menor cantidad de muestra (microtainer) o capilares
heparinizados
3.6.- Laminas portaobjetos
3.7.- Frotador
3.8.- Descartador de bioseguridad
3.9.- Marcador indeleble
3.10.- Silla de extracción
4.- Procedimiento
4.1.- Posición del paciente: El paciente debe encontrarse en posición confortable y cómoda que
facilite el trabajo al Bioanalista. Proceder a sentar al paciente en la silla de extracción con el brazo
extendido y apoyado sobre una el apoya brazo de la silla de extracción, permitiendo al Bioanalista
tomar el dedo donde se realizará la incisión.
4.2.-Una vez que el paciente se encuentre instalado, preparar el material a utilizar, de modo que todo
esté a su alcance al momento de realizar la punción, evitando que la sangre se coagule al no ser
utilizada rápidamente.
4.3.- Seleccionar la zona de punción capilar. En niños mayores y adultos la punción puede realizarse
en la superficie palmar de la porción distal del dedo medio o anular; siendo el dedo medio el sitio
recomendado. En recién nacidos, la técnica empleada es la punción capilar de las áreas laterales del
talón, que asegura una zona adecuada para la toma de la muestra.
4.4.- Tomar la lanceta, dependiendo del dispositivo romper el empaque que la contiene o quitar el
precinto que resguarda la aguja.
4.5.- Una vez seleccionado el dedo donde se hará la incisión, sujetar éste con una mano entre los
dedos pulgar e índice y proceder con la mano más hábil, a realizar la asepsia de la zona con un
algodón empapado de alcohol. Permitir que éste se evapore.
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4.6.- Realizar la incisión con un movimiento rápido, firme y profundo, sosteniendo firmemente el
dedo seleccionado de forma tal que el paciente no retire la mano. Descartar la lanceta en el
contenedor de bioseguridad dispuesto para tal fin.
4.7.- Limpiar la primera gota de sangre con una gasa seca. Posteriormente, permitir la salida de la
sangre. Si esta no fluye hacer presión sobre las caras laterales del dedo a cierta distancia de la herida;
la presión no debe ser excesiva porque liberara líquido tisular. Si con esto no obtiene una salida franca
de sangre debe repetir la punción.
4.8.-Colectar la muestra con el tubo microtainer, similar o con el capilar sobre la gota de sangre que
fluye del sitio de la punción, dejando que éste se llene. Realizarse tantas veces como sea necesario, un
movimiento de presión sobre el dedo y luego libérelo para permitir el llenado de la sangre.
4.9.- Entre una toma de muestra y otra se debe secar la gota con una gasa y obtener una nueva, esto
permite evitar la coagulación de la sangre.
4.10.- Si se va realizar un frotis o un cresil referirse a los procedimientos pertinentes PHI-Frotis o PHI-
Cresil.
4.11.- Culminada la recolección de la muestra, prevenir que la sangre siga fluyendo, presionando el
dedo en el sitio de la punción con una gasa seca.
4.12.- Recoger el área donde se ha realizado la extracción, dejando todo en orden. Descarte los
desechos punzo penetrantes en los descartadores específicos de bioseguridad y los desechos no
punzo penetrantes en las papeleras específicas de bioseguridad.

5.1.-Tomar varios capilares en caso de no disponer de los tubos microtainer.
5.2.-Establecer las medidas básicas de bioseguridad y buenas prácticas de laboratorio. Utilizar la bata
de laboratorio, guantes, lentes de protección.
5.3.-Debe lavarse las manos antes y después de cada punción.
5.4.-Descartar correctamente los desechos de riesgo biológico.

No aplica
7.- Bibliografía
7.2.- Obtención de muestras de sangre. Capítulo I. Gaudens de Fragachan. Manual práctico de morfología
sanguíneo. 1986.
7.3.- Recolección de la muestra. Capitulo 2. Hematología. Fundamentos y aplicaciones clínicas. Rodak. 2ªed. Ed
Panamericana. 2004.

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PHI-FrotisE
Elaboración de frotis sanguíneo
1.- Objetivo
Realizar un frotis de sangre periférica en lámina, asegurando que cumpla con los requisitos de calidad
establecidos por organismos internacionales de manera de que pueda ser útil para el diagnóstico y
seguimiento de los pacientes en ciertas enfermedades.
2.- Fundamento
Extender una pequeña gota de sangre en una lámina porta objeto, con la finalidad de que las
diferentes células queden uniformemente distribuidas y suficientemente dispersas para que se
puedan observar las características individuales de cada una.
3.1.- Láminas portaobjeto
3.2.- Frotador (lámina con bordes regulares y lisos)
3.3.- Capilar para microhematocrito no heparinizado
4.- Procedimiento
4.1.- Tomar una lámina portaobjetos perfectamente limpia y colocarla sobre un papel absorbente o
servilleta.
4.2.- Tomar el tubo de la muestra y mezclar por inversión suave y completa mínimo seis (6) veces.
4.3.- Destapar el tubo de la muestra y tomar la sangre con un capilar para microhematocrito no
heparinizado, el cual se debe llenar por capilaridad hasta los 2/3 del mismo.
4.4.- Con la mano más hábil tomar el tubo de microhematocrito con la muestra y mezclar
cuidadosamente, sin derramar.
4.5.- Sostener a lo largo la lámina portaobjeto entre el pulgar y el índice de la otra mano; también
puede colocar la lámina en una superficie plana y sostener el extremo inferior con un dedo.
4.6.- Colocar una gota de sangre de 2 a 3 mm de diámetro en la línea media del portaobjeto a uno (1)
o dos (2) cm del borde de la lámina del extremo cercano al dedo índice, de modo que quede espacio
para la identificación del paciente.
4.7.- Posteriormente, tomar el frotador a lo ancho entre el pulgar y el índice de la mano más hábil,
colocarlo sobre la lámina por delante de la gota de sangre formando con ella un ángulo de 45º tal y
como se ve en la figura de la izquierda (ángulo que debe ser mantenido durante toda la operación).
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4.8.- Mover el frotador hacia atrás poniéndolo en contacto con gota de sangre para permitir que se
extienda por capilaridad a todo lo ancho del borde del frotador. Una vez que se ha extendido la gota
totalmente, deslizar el frotador con un movimiento suave, uniforme y con cierta velocidad hacia el
extremo opuesto de la lámina, sin levantarlo de ella.
4.9.- La sangre se extenderá por detrás del frotador hasta que se agote. Dejar secar sobre un papel
absorbente o servilleta, con el frotis recién elaborado hacia arriba.Identificar el frotis con los datos del
paciente y/o con el número designado.
4.10.- Condiciones macroscópicas de un buen frotis: Criterios de aceptación.

4.10.1.- Debe ser más angosto que el portaobjeto sobre el cual es extendido, con bordes lisos y
continuos. Esto es importante, ya que si la sangre llega a los bordes de la línea, se podrían perder
ciertos elementos celulares, siendo causa de error en el diferencial leucocitario.
4.10.2.- No debe ser muy largo, terminando más o menos a un (1) cm del final de la lámina, ya que se
podrían perder ciertos elementos, ni muy cortos porque se corre el riesgo de que no se encuentren
suficientes células blancas para el diferencial leucocitario.
4.10.3.- Debe tener una transición gradual en el espesor, de áreas gruesas a delgadas, finalizando en
un cuadrado con borde en forma de cohete.
4.10.4.- No debe tener lagunas o agujeros.
4.10.5.- El extremo final, debe hacerse gradualmente delgado y no debe observarse rayas o canales.

5.1.- Se recomienda realizar el frotis de sangre periférica inmediatamente después de haberse
tomado la muestra, en caso de no ser posible, debe hacerse antes de las 4 horas de tomada la
muestra, ya que después de este tiempo se producen alteraciones celulares debido al
anticoagulante (artefactos).
5.2.- Se debe evitar usar gotas de sangre muy grandes ya que los frotis quedan muy gruesos y no se
puede distinguir la morfología celular.
5.3.- Se debe evitar usar gotas de sangre muy pequeñas ya que se corre el riesgo de tener muy baja
cantidad de leucocitos para realizar el diferencial.
5.4.- Asegúrese de identificar el frotis con tinta indeleble al momento de realizarlo, recuerde que
durante el proceso de fijación y coloración se puede perder la identificación si no fue realizada
correctamente.

No aplica.
7.- Bibliografía
7.2.- Franco Gabriela, Thais Delgado. Manual de procedimientos Laboratorio Hematología I, Escuela de
Bioanálisis UCV. 2008.

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7.3.- Raimundo Antonio Gómez Oliveira. Hemograma-cómo hacer e interpretar, editorial AMOLCA, edición
2011. Pág. 96 - 103
7.4.- Shirlyn B McKenzie. Hematología Clínica 2da Edición. 2000. Pág. 731
7.5.- Williams Hematology, sixth edition. 2001. Pág. 9 -16
7.6.- M. L Turgeon. Hematología Clínica Teoría y procedimientos. 4taed. 2006. Capítulo 2 Pág 21.

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PHI-Giemsa
Coloración de Giemsa
1.- Objetivo
Aplicar la técnica de coloración de Giemsa adecuada, basada en la disociación de colorantes tipo
Romanowsky, que permita lograrla identificación y clasificación de los componentes celulares
sanguíneos.
2.- Fundamento
Las coloraciones tipo Romanowsky son ampliamente utilizadas en los laboratorios clínicos
justificándose su aplicabilidad al permitir la identificación morfológica de las células hematopoyéticas
que orientarán de manera satisfactoria y certera un diagnóstico hematológico.
Las coloraciones de tipo Romanowsky como la coloración de GIEMSA se fundamentan en la propiedad
que tiene sus principales componentes: el azul de metileno y la eosina de formar sales insolubles en
agua, pero solubles en ácido metílico. Dichas sales en medio acuoso se disocian electrolíticamente en
sus componentes activos. El azul de metileno en presencia de ácido bicromático da lugar a los azures,
componentes básicos que colorearán de un tinte azul-violeta los componentes ácidos celulares, por
ejemplo los ácidos nucléicos y nucleoproteínas. Por el contrario, la eosina reaccionará con los
componentes básicos celulares, por ejemplo la hemoglobina y los componentes citoplasmáticos.
Las coloraciones de tipo Romanowsky permiten evaluar en frotis de sangre periférica las
características celulares de forma, tamaño, color, presencia o no de inclusiones celulares,
granularidad, características cromatínicas, lobulaciones nucleares, características citoplasmáticas,
además de la estimación en número y distribución de los elementos celulares.
3.1.- Bandeja de coloración
3.2.- Tapones de goma
3.3.- Láminas portaobjetos
3.4.- Reloj
3.5.- Copa graduada
3.6.- Metanol
3.7.- Agua destilada
3.8.- Colorante de Giemsa
3.9.- Solución Buffer de Giemsa
4.- Procedimiento
4.1.- Fijación
4.1.1.- Colocar las láminas portaobjetos con la preparación sobre la bandeja de coloración o los
tapones de goma. SE DEBE cuidar que la superficie esté totalmente horizontal.
4.1.2.- Verter sobre las láminas unas gotas de metanol en volumen suficiente para cubrir muy bien el
frotis, dejar actuar por tres (3) minutos. Durante la fijación vigilar que el alcohol no se evapore ni se
derrame antes del tiempo requerido, ya que la preparación quedará mal fijada.
4.1.3.- Transcurrido el tiempo de fijación, descartar el alcohol en exceso o dejar evaporar totalmente.
4.1.4.- Antes de comenzar la coloración el frotis debe estar completamente seco.

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4.2.- Coloración propiamente dicha:

4.2.1.- La preparación de la solución colorante de trabajo DEBE hacerse momentos antes de su uso,
durante el proceso de fijación.
4.2.2.- Medir en una copa graduada la cantidad necesaria de solución buffer de Giemsa según la
cantidad de frotis a colorear. Por cada lámina portaobjetos agregar cuatro (4) ml de solución buffer.
4.2.3.- Agregar el colorante de Giemsa, gota a gota, en una proporción de dos (2) gotas de colorante
por cada ml de solución buffer medida, agitar por rotación la copa o con un aplicador de vidrio
durante el tiempo que se agrega el colorante.
4.2.4.- Cubrir las láminas o laminillas de los frotis con el colorante recién preparado. Dejar actuar por
quince (15) minutos, en posición horizontal para evitar disparidad de coloración en el frotis, derrame
y precipitación del colorante.
4.2.5.- Culminado el tiempo de coloración y manteniendo la posición horizontal, lavar las láminas o
laminillas con agua destilada permitiendo que ésta arrastre totalmente la solución colorante.
4.2.6- Dejar secar colocando las láminas inclinadas verticalmente sobre un papel absorbente. Escurrir
bien el agua destilada, ya que si ésta permanece sobre las láminas dañará la coloración debido al
grado de acidez.
5.- Recomendaciones - precauciones

5.1.- Puede emplearse alcohol etílico, como fijador, dejando actuar por lo menos cinco (5) min.
5.2.- Cada vez que se prepare el colorante se debe probar el tiempo de fijación y coloración para
obtener resultados óptimos.
5.3.- La solución de Giemsa puede prepararse utilizando una (1) gota de colorante por cada ml de
solución buffer o agua neutra. Dejar actuar la solución preparada por treinta (30) min, fijando
previamente las extensiones.
5.4.- Colocar los frotis coloreados en posición inclinada (45°) para su secado (a temperatura ambiente
o con dispositivos de secado) Si el agua permanece sobre las láminas en posición horizontal, durante
el proceso de secado, dañará la coloración provocando artefactos.
5.5.- Es de suma importancia la valoración macroscópica y microscópica de la coloración de Giemsa,
asegurando la calidad del frotis para la observación.
Características del frotis con Coloración de Giemsa

Macroscópicas:
A simple vista las preparaciones se observan de color morado grisáceo.
Microscópicas:
Los hematíes se verán de color grisáceo.
La cromatina nuclear se verá de color azul púrpura.
En otras células el color del citoplasma puede variar desde los tonos azules muy oscuros de
las células plasmáticas y de los eritroblastos basófilos, hasta el tono azul celeste de los
linfocitos.
El citoplasma de los monocitos se colorea de azul gris.
Las granulaciones de los polimorfonucleares se definen con los siguientes
colores:

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Neutrófilos, lila.
Eosinófilos, rojo naranja.
Basófilos, casi no se observan, ya que sus gránulos son solubles y se disuelven en la solución
buffer.
6.-Modo de reportar
No aplica.
7.- Bibliografía

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PHI-Wright
Coloración de Wright
1.- Objetivo
Aplicar una técnica de coloración adecuada basada en la disociación de colorantes tipo Romanoswsky,
con el objeto de lograr la identificación y clasificación de los componentes de las células sanguíneas.
2.- Fundamento
Las coloraciones de tipo Romanowsky como la coloración de WRIGHT se fundamentan en la
propiedad que tiene sus principales componentes: el azul de metileno y la eosina de formar sales
insolubles en agua, pero solubles en ácido metílico. Dichas sales en medio acuoso se disocian
electrolíticamente en sus componentes activos. El azul de metileno es convertido en sus formas
activas, los azures de metileno en presencia de bicarbonato de sodio, componentes básicos que
colorearán de un tinte azul-violeta los componentes ácidos celulares, por ejemplo los ácidos nucléicos
y nucleoproteínas. Por el contrario, la eosina reaccionará con los componentes básicos celulares, por
ejemplo la hemoglobina y los componentes citoplasmáticos.
Las coloraciones de tipo romanowsky permiten evaluar en frotis de sangre periférica las
características celulares de forma, tamaño, color, presencia o no de inclusiones celulares,
granularidad, características cromatínicas, lobulaciones nucleares, características citoplasmáticas,
además de la estimación en número y distribución de los elementos celulares.
3.1.- Bandeja de coloración
3.2.-Tapones de goma
3.3.-Láminas portaobjetos
3.4.-Reloj
3.5.-Agua destilada
3.6.-Colorante de Wright
3.7.-Solución Buffer de Wright
4.- Procedimiento
4.1.- Fijación:
4.1.1.-Colocar las láminas portaobjetos o laminillas cubreobjetos con la preparación hacia arriba sobre
los tapones de goma en la bandeja de coloración. SE DEBE cuidar que la superficie esté totalmente
horizontal.
4.1.2.- Cubrir el frotis con la solución colorante de Wright, agregando aproximadamente 10 gotas del
colorante por laminilla cubreobjeto y 50 gotas de colorante por lámina portaobjeto, cuidando que la
laminilla o lámina quede completamente cubierta evitando la precipitación. Dejar actuar por tres (3)
minutos.
4.1.3- Tener la precaución que no se evapore el colorante porque causa precipitación.
4.2.- Coloración propiamente dicha:

4.2.1.- Sin descartar el colorante agregado, colocar cuidadosamente la solución buffer en igual
número de gotas de colorante. Soplar suavemente por encima del frotis preferiblemente con una

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pipeta para que se mezclen los reactivos, hasta observar una película verde metálica en la superficie
de la preparación.
4.2.2.- Dejar actuar en posición horizontal para evitar precipitación del colorante. (el profesor le
indicará el tiempo que hay que dejar actuar debido a que varía de lote a lote el colorante)
4.2.3- Culminado el tiempo de coloración y manteniendo la posición horizontal, lavar las láminas o
laminillas con agua destilada permitiendo que ésta arrastre totalmente la solución colorante.
4.2.4.- Posteriormente, inclinar las láminas para permitir que escurra toda el agua destilada de la
superficie de la preparación. Es importante que no quede agua sobre la preparación, ya que su pH
ácido puede dañarla.
4.2.5.- Dejar secar las láminas o laminillas colocándolas inclinadas en un ángulo de 45° sobre un papel
absorbente.

5.1.- Cada laboratorio debe estandarizar los tiempos para cada uno de los pasos de coloración. Una
vez que se prepare colorante se debe probar el tiempo de fijación y coloración para obtener
resultados óptimos.
5.2.- Realizar todo el procedimiento de coloración en posición horizontal, evitando la evaporación de
los reactivos, para disminuir la posibilidad de precipitación del colorante.
5.3.- Colocar los frotis coloreados en posición inclinada (45°) para su secado (a temperatura ambiente
o con dispositivos de secado) Si el agua permanece sobre las láminas en posición horizontal, durante
el proceso de secado, dañará la coloración provocando artefactos.
5.4.- Es de suma importancia la valoración macroscópica y microscópica de la coloración de Wright,
asegurando la calidad del frotis para la observación.
Características del frotis con Coloración de Wright
Macroscópicas:
En una buena tinción, la preparación DEBE presentar un color rosado.
Microscópicas:
Los hematíes se verán de color rosa.
Los núcleos de los leucocitos azul púrpura.
El citoplasma de los leucocitos neutrófilos maduros, de color rosa pálido.
En otras células el color del citoplasma puede variar desde los tonos azules muy oscuros de las
células plasmáticas y de los eritroblastos basófilos, hasta el tono azul celeste de los linfocitos.
El citoplasma de los monocitos se colorea de azul gris.
Las granulaciones de los polimorfonucleares se definen con los siguientes colores:
Neutrófilas, lila. Eosinófilas, rojo naranja. Basófilas, azul-negro o violeta.

No aplica.
7.- Bibliografía
MLHIv1.1
PHI-FrotisOM
Observación microscópica del frotis sanguíneo (morfología sanguínea)
1.- Objetivo
Realizar la observación de un frotis sanguíneo de calidad con la finalidad depoder detectar posibles
alteraciones en la morfología y distribución de cualquiera de las células sanguíneas.
2.- Fundamento
Se basa en realizar, en la zona adecuada de un frotis de sangre periférica coloreado, la observación
cuidadosa y con un recorrido ordenado, de las células que se encuentren presentes a fin de estimar
cualitativamente, en diferentes campos microscópicos la cantidad de leucocitos y plaquetas, además
de apreciar la morfología y distribución de todas las células sanguíneas.
Usualmente la observación microscópica se realiza en conjunto con el diferencial leucocitario (Ver
PHI-FrotisDif)
3- Materiales
3.1.- Frotis de sangre periférica coloreado con algún colorante Romanowsky perfectamente secos.
3.2.-Aceite de inmersión o resina (para la conservación prolongada del frotis)
3.3.- Laminillas cubreobjetos
3.4.-Gasa
3.5.- Microscopio óptico
4.- Procedimiento
4.1.- Montaje de la preparación: agregar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado y
completamente seco sobre ella colocar una laminilla cubreobjetos (protege los objetivos del
microscopio del aceite).
4.2.- El frotis deber ser revisado inicialmente con el objetivo de 10X, a fin de evaluar su calidad
(distribución de las células y resultados de la coloración satisfactorias).
4.3.-Ubicar la zona donde se encuentren los elementos bien distribuidos (cuerpo del frotis) y pasar a
40X.
4.4.- Buscar un campo apropiado para la observación en 40X.

4.5.- El frotis puede ser revisado de manera cualitativa y/o cuantitativa; la observación debe estar
dirigida hacia:
4.5.1.- Eritrocitos: Forma, tamaño, color, distribución y presencia o no de inclusiones celulares.
4.5.2.- Plaquetas: Forma, tamaño, granularidad, estimación en número y distribución.
4.5.3.- Glóbulos Blancos: Forma, tamaño, características cromatínicas, lobulaciones nucleares, color
del citoplasma, granulaciones e inclusiones celulares entre otros.

MLHIv1.1

5.1.-En caso de necesitar preservar los frotis en el tiempo es aconsejable utilizar resina en vez de
aceite de inmersión.
5.2.-La observación en 40X es la recomendada para la visualización del frotis y el diferencial
leucocitario.
5.3.- Para visualizar la presencia de aglutinados de glóbulos rojos o plaquetas, cuando la clínica o las
alarmas del instrumento lo sugieren, se debe emplear el objetivo de 40X.
5.4.- Cuando se requiere un mayor nivel de detalle se recomienda emplear el objetivo de 100X
(observar con más detalle elementos pequeños dentro o fuera de las células), para ello colocar una
gota de aceite de inmersión entre la laminilla cubreobjetos y el objetivo y proceder al enfoque
moviendo el tornillo micrométrico.

Será discutido en la actividad práctica.
7.- Bibliografía
7.2.- Franco Gabriela. Manual de procedimientos Laboratorio Hematología I, Escuela de Bioanálisis UCV. 2008.
2011. Pág. 96 - 103
7.4.- Shirlyn B McKenzie. Hematología Clínica 2da Edición. 2000. Pág. 727 y 734
7.5.- Williams Hematology, Sixth Edition. 2001. Pág. 9 -16
7.6.- Recomendaciones para la elaboración, observación, terminología y reporte del frotis sanguíneo en la
rutina hematológica A. Gallardo, A. López, L.E. Fernández, L. Freitas, N.Briones, T. Delgado y V. Díaz. Cátedra de
Hematología. Escuela de Bioanálisis. UCV (2009)

MLHIv1.1
PHI-FrotisDif
Realización del diferencial leucocitario visual
1.- Objetivo
Realizar la observación de un frotis sanguíneo con la finalidad de realizar un recuento diferencial de
leucocitos.
2.- Fundamento
Se basa en realizar, en la zona adecuada de un frotis de sangre periférica coloreado, la enumeración
y clasificación cuidadosa y, con un recorrido ordenado, de las células que se encuentren con relación
a un mínimo de cien leucocitos contados. Simultáneamente se realiza la observación de la morfología
sanguínea.
3- Materiales
3.1.- Frotis de sangre periférica coloreado con algún colorante Romanowsky perfectamente secos.
3.2.- Aceite de inmersión o resina (para la conservación prolongada del frotis)
3.3.- Laminillas cubreobjetos
3.4.-Gasa
3.6.- Contador celular.
4.- Procedimiento
4.1.- Montaje de la preparación: agregar una gota de aceite de inmersión sobre el extendido
coloreado y completamente seco sobre ella colocar una laminilla cubreobjetos (protege los objetivos
del aceite).
4.2.- El frotis deber ser revisado inicialmente con el objetivo de 10X, a fin de evaluar su calidad
(distribución de las células y resultados de la coloración satisfactorias).
4.3.- Ubicar la zona donde se encuentren los elementos bien distribuidos (cuerpo del frotis) y pasar a
40X.
4.4.- Buscar un campo apropiado para la observación en 40X.

4.5.- Una vez escogida la zona para realizar el diferencial (glóbulos rojos aislados pero cerca unos de
los otros) proceder a mover la preparación accionando los tornillos encargados de mover la platina,
de modo tal de describir una línea quebrada. Como las células más pequeñas se colocan en el centro
del frotis y las más grandes en los márgenes, el mejor método para revisarlos es moviendo el lente
objetivo de un margen a otro, avanzando poco a poco y repitiendo este movimiento de subir y bajar
en forma de línea quebrada hasta haber contado mínimo 100 células blancas.

MLHIv1.1
4.6.- Recorrer el frotis a fin de reconocer, identificar y clasificar cada leucocito a medida que se van
encontrando, hasta contar un mínimo de 100 leucocitos.

5.1 En caso de necesitar preservar los frotis en el tiempo es aconsejable utilizar resina en vez de
aceite de inmersión.
5.2 Si no cuenta con un contador celular, diseñar una tabla de 10 x 10, en cada cuadro irá anotando
las iniciales de los leucocitos que va encontrando.
5.3 Cuando esté haciendo el recorrido en línea quebrada evite los bordes extremos donde suelen
agruparse irregularmente los neutrófilos y monocitos y las partes más gruesas del comienzo de la
preparación donde se mantienen los linfocitos. Sin embargo si está buscando constatar la presencia
de inclusiones de glóbulos rojos o parásitos intracelulares es recomendable utilizar estos lados
gruesos del frotis.

Sistema internacional de unidades (SI) Unidades convencionales (UC)
Línea celular 0,XXX XX,X %
Ejemplo: Neutrófilos 0,560 56,0 %
7.- Bibliografía
2011. Pág. 96 - 103
7.5.- Williams Hematology, Sixth Edition. 2001. Pág. 9 -16
7.6.- Recomendaciones para la elaboración, observación, terminología y reporte del frotis sanguíneo en la
rutina hematológica A. Gallardo, A. López, L.E. Fernández, L. Freitas, N.Briones, T. Delgado y V. Díaz. Cátedra de
Hematología. Escuela de Bioanálisis. UCV (2009)

MLHIv1.1
PHI-HbM
Medición de hemoglobina manual
1.- Objetivo
Realizar la medición de la hemoglobina (Hb) mediante la metodología manual, empleando el método
de la cianometahemoglobina.
2.- Fundamento
El método recomendado para la determinación de la hemoglobina es el método de
cianometahemoglobina, el cual permite medir casi todas las formas de hemoglobina presentes en la
sangre, como son la hemoglobina, oxihemoglobina, carboxihemoglobina y metahemoglobina,
transformándolos en un derivado estable que permite medirlo de forma adecuada. Solo la
sulfohemoglobina no es evaluada, la cual se encuentra muy rara vez en cantidades significativas.
El método de la cianometahemgolobina se basa en poner en contacto la sangre con el reactivo de
Drabkin, la hemoglobina se transforma en metahemoglobina por acción del ferricianuro de potasio, y
éste por acción del cianuro de potasio se transforma en cianometahemoglobina de color rosado
estable, el cual se puede comparar espectrofotométricamente con soluciones de referencia de
cianometahemoglobina. El color es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina.
Las ventajas del método de la cianometahemoglobina son:
- Determina todas las formas de hemoglobina circulante, excepto la sulfohemoglobina.
- La banda de absorción de la cianometahemoglobina en la región de 540 nm es amplia.
- Las soluciones estándar de cianometahemoglobina son las más estables y precisas.
- La técnica es rápida y reproducible con cierta práctica y habilidad.
- El reactivo de Drabkin utilizado en la dosificación es estable por varios meses, si se conserva en
frasco ámbar
- La máxima transformación de hemoglobina a cianometahemoglobina se realiza en 10 minutos y el
color es estable.
3.1.- Tubos de 13 x 100 mm
3.2.- Gradilla
3.3.- Pipeta de 5 ml
3.4.- Reactivo de Drabkin
3.5.- Pipeta de Sahli
3.6.- Muestra de sangre total
3.7.- Control de hemoglobina
3.8.- Tubos de Spectronic.
4.- Procedimiento
4.1.- Marcar los tubos de 13 x 100 mm como: “B” (blanco), “C” (control) y "M #" (# numeración
correspondiente de la muestra) según el número de muestras a procesar. Colocarlos en una gradilla.
4.2.- Dispensar en cada tubo cinco (5) ml de reactivo de Drabkin.
4.3.- Mezclar por inversión la muestra de sangre total un mínimo de 8 veces, abrir el tubo y tomar la
muestra con la pipeta de Sahli hasta la marca que indica 20 µL de sangre. Con una gasa limpiar
externamente la pipeta y proceder a enrasar la misma en caso de haber sido sobrellenada la pipeta.
MLHIv1.1
4.4.- Llevar la pipeta al fondo del tubo con reactivo de Drabkin y soplar, evitando derramar el líquido.
Enjuagar la pipeta unas tres veces en el reactivo para que quede completamente limpia. Esto se
realiza para el control y la muestra.
4.5.- Esperar al menos diez (10) minutos para proceder a efectuar la lectura.
4.6.- Antes de realizar la lectura en el Spectronic, ajustar la longitud de onda a 540 nm, llevar al cero
mecánico con la perilla de cero mecánico, finalmente ajustar el cero de absorbancia con el blanco
(tubo “B”).
4.7.- Realizar la lectura de la muestra o control, según el caso. Para ello trasvase a un tubo de
espectronic el contenido del tubo, abra la tapa del Spectronic e introduzca el tubo, cierre la tapa.
Realice la lectura y anote la absorbancia.
4.9.- Mediante el empleo del factor de calibración obtenga la concentración de Hb.
4.10.- Cálculos
Para obtener la concentración de Hb de la muestras emplee la siguiente fórmula
Hbx = FC x Absx
Donde:
Hbx: concentración de Hb de la muestra en g/L o gr/dl, según la calibración realizada.
FC: factor de calibración
Absx: absorbancia de la muestra

5.1.- La pipeta de sahli debe estar limpia y seca antes de realizar la actividad práctica.
5.2.- Solo dispone de dos pipetas de sahli, una para el paciente y otra para el control.
5.3.- Solo dispone de dos tubos de Spectronic para efectuar las lecturas.
5.4.- Asegúrese de que al enrasar la pipeta de sahli, no queden burbujas de aire en la misma y de
limpiar con una gasa la parte externa de la pipeta. Si al enrasar la pipeta de sahli se llena más allá de la
marca, puede eliminar el exceso de sangre pasando una gasa por el extremo de llenado de la pipeta a
fin quitar sangre.
5.5.- El Spectronic debe estar caliente antes de realizar la lectura, se recomienda encenderlo al menos
15 minutos antes de realizar las lecturas.
5.6.- Para una lectura adecuada el Spectronic debe cumplir con lo indicado en el punto 4.6. Puede
repetir este paso cuando siente dudas sobre la medición.
5.7.- Al momento de leer la absorbancia debe reportarse con tres cifras decimales X,XXX.

Hb: XXX g/L XX,X g/dl
Ejemplo: 120 g/L 12.0 g/dl
7.- Bibliografía
7.2.- Lewis SM. Bain BJ, Bates I. Dacie and Lewis Practical Haematology. Ed 10. Elsevier - Churchill Livington.
2006

MLHIv1.1
PHI-HbCal
Procedimiento de calibración del Spectronic 20
1.- Objetivo
Realizar la calibración del Spectronic 20 para la medición de la hemoglobina.
2.- Fundamento
Realizar diluciones del material de referencia de cianometahemoglobina en 4 ó 5 patrones de
concentraciones diferentes de Hb que abarquen el intervalo biológico de referencia y los valores
críticos o de decisión clínica de la misma, contemplando además, la linealidad y el límite inferior de
detección del método de cianometahemoglobina.
El compuesto de cianometahemoglobina es capaz de absorber luz a una longitud de onda de 540 nm,
la cual es directamente proporcional a la cantidad de Hb presente en la muestra. La relación
matemática que permite la conversión de absorbancia a g/L es dada por la función de calibración,
mediante el uso de gráficas de calibración o de manera más sencilla por el factor de calibración.La
calibración le proporciona al instrumento una medición exacta y trazable a la unidad SI (g/L), de
acuerdo al material de cianometahemoglobina empleado.
3.1.- Material de referencia de cianometahemoglobina
3.2.- Tubos de 12 x 75 mm
3.3.- Pipetas de 2, 5 y 10 ml
3.4.- Papel Parafilm
4.- Procedimiento
4.1.- Establecer a partir de la concentración del material de referencia de cianometahemoglobina la
cantidad y concentraciones de los patrones de trabajo. Ver punto 4.6.1.
4.2.- Realizar el trabajo volumétrico de preparación de los patrones.
4.3.- Una vez preparados los patrones tapar con papel parafilm y homogeneizar por inversión.
4.4.- Proceder a la medición de las absorbancias, siguiendo los lineamientos descritos en el protocolo
de medición de Hb manual. Ver punto 4 del procedimiento Medición de hemoglobina manualPHI-
HbM.
4.5.- Realizar los cálculos necesarios a fin de obtener la gráfica de calibración, la ecuación de la recta o
el factor de calibración. Ver punto 4.6.2.
4.6.- Cálculos
4.6.1.- Preparación de patrones
Por conveniencia el material de referencia de cianometaheblogobina tiene una concentración entre
600 y 800 mg/L de cianometahemoglobina, lo cual corresponde a una concentración de Hb en la
muestra de
150 y 200 g/L respectivamente, debido a la dilución usual en el método de la cianometahemoglobina
(0,2 ml de sangre + 5 ml del reactivo de Drabkin).El empleo de cianometahemgolobina como material
de referencia en vez de Hb, se basa en la alta estabilidad de la cianometahemoglobina, así mismo
permite su uso en métodos que empleen una dilución distinta a la habitual.

MLHIv1.1
Para conocer la correspondencia entre la cianometahemoglobina y la cantidad de hemoglobina

correspondiente, se deben ajustar los valores en base a la cantidad de real de muestra y la cantidad
real de patrón.
Ejemplo:
Si se parte de un material de referencia de 800 mg/L de cianometahemoglobina, en 1000 ml de
material de referencia hay 800 mg de cianometahemoglobina.En 5 ml de material de referencia (que
corresponde a la cantidad de material de referencia a ser leída en el Spectronic 20 y al volumen usual
de la reacción) habrá 4 mg de cianometahemoglobina, que corresponde a la concentración real de
patrón (CRP)
1000 ml de material de referencia -------------- 800 mg de cianometahemoglobina

5 ml de material de referencia ------------------ X
X = 4 mg (es la concentración real de patrón (CRP))
Como en la técnica realizada en el laboratorio se utilizan 5 ml de reactivo de Drabkin + 20 uL de

sangre, entonces el volumen total en el tubo es de 5,02 ml, de los cuales solo 0,02 ml son de sangre, y
constituyen la concentración real de sangre (CRS). Entonces sí:
En 5 ml de material de referencia hay 4 mg de cianometahemoglobina (CRP)
En 5 ml de solución de reacción hay 0,02 ml de sangre (CRS).
Nota: en realidad el volumen de reacción es de 5,02 ml de solución pero se toma 5 para simplificar los
cálculos.
Por lo tanto:
20 x10-6 L de sangre se corresponden con ---------------- 4 x10-3 g de hemoglobina.
1 L de sangre se corresponden con ---------------- X
4 x10-3 g x 1 L
X = --------------------------- = 200 g
20 x10-6 L
200 g/L es la concentración de hemoglobina en el material de referencia sin diluir, que hay en 5 ml,
cuando se realiza una dilución de la sangre 1:250 con reactivo de Drabkin.
Para obtener los patrones de menores concentraciones, se realizan diluciones del material de
referencia con reactivo de Drabkin. Se recomienda emplear valores enteros y pipeteables de la forma
más exacta, para ello es recomendable tomar volúmenes de 4 ml, 3 ml, 2 ml o fracciones de 0,5 ml
(3,5 ml, 2,5 ml)
4.6.2.- Obtención de la calibración

4.6.2.1.- Gráfica de calibración
En un gráfico XY, se grafica en el eje de las X la concentración del patrón, mientras que en el eje y se
grafican las lecturas de absorbancia que corresponden a los patrones preparados. Mediante una recta

MLHIv1.1
se puede extrapolar el valor en absorbancia de la muestra de un paciente y así obtener la

concentración de hemoglobina.
4.6.2.2.- Ecuación de la recta

Mediante el método de los mínimos cuadrados se puede obtener una ecuación de la recta de la
forma:
X=mxy±b
Donde:
X: concentración de Hb en la muestra
m: pendiente
y: valor de la absorbancia de la muestra
b: intercepto.
4.6.2.3.- Método del factor de calibración (FC)

Mediante la sencilla ecuación derivada de la de ley de Lambert y Beer, se puede obtener un factor que
al multiplicarlo por la absorbancia de la muestra se obtiene la concentración de Hb de la muestra.
Cx = Absx x FC
Donde:
Cx: concentración de la muestra
Absx: valor de la absorbancia de la muestra
FC: factor de calibración
El factor de calibración se obtiene a partir de las concentraciones conocidas y las lecturas de las
absorbancias medidas de los diferentes patrones preparados a partir del material de referencia, de la
siguiente manera:
FC = C / Abs
Usualmente se emplea la media de los factores de calibración de los patrones.

5.1.- Realizar adecuadamente las mediciones en el espectrofotómetro, según los descrito en el
apartado 4.7 del protocolo Medición de hemoglobina manual.
5.2.- Solo dispone de dos tubos de espectronic para efectuar las lecturas, uno para el blanco y otro
para los patrones y muestras. Realice las lecturas comenzando con el patrón de menor concentración,
luego el control y finalmente la muestra.
5.3.- Realizar de manera adecuada los cálculos.
5.4.- Es indispensable que el Spectronic 20 se encuentre en perfectas condiciones de funcionamiento
antes de proceder a la calibración.
5.5.- El material de referencia de cianometahemoglobina tiene un volumen de 10 ml. Considere este
volumen al momento de realizar los cálculos de los patrones.
5.6.- Emplee el siguiente modelo para preparar los patrones, anotar las lecturas y realizar los cálculos

MLHIv1.1
Tubo Material de Reactivo de Concentración Lectura en Abs Factor

referencia (ml) Drabkin (ml) de Hb (g/l)
P1
P2
P3
P4
P5
Blanco 0 5 0 0

Puede emplearse la gráfica de calibración, la ecuación de la recta o el factor de calibración.
7.- Bibliografía
2006

MLHIv1.1
PHI-HbCI
Control interno de fotómetros
1.- Objetivo
Controlar la medición manual de Hb por el Spectronic 20.
2.- Fundamento
Problemas en la ejecución técnica (en especial el pipeteo), pérdida en la estabilidad de los reactivos,
el uso de material volumétrico defectuoso e incluso el desgaste de los componentes del Spectronic
pueden causar una alteración en la medición de las Hb realizadas en el equipo, razón por la cual se
debe contar con un mecanismo capaz de detectarlo, llamado control de la calidad interno.Para
controlar el equipo, se empela un material de control, que es procesado como una muestra cuando se
realiza una tanda analítica, definida ésta como un lote de muestra o un intervalo de tiempo
(usualmente una vez al día).
Material de control con valores asignados para la medición de Hb.
4.- Procedimiento
4.1.- Procesar el control como una muestra. Para ello seguir el protocolo Medición de hemoglobina
manual PHI-HbM.
4.2.- Interpretar el valor del control obtenido. Se puede emplear los gráficos de levey-Jennings y las
reglas de control habitual.
4.3.- Si la interpretación del control es favorable, se reportan los resultados.
4.4.- Si la interpretación del control indica un fuera de control, debe buscarse y corregirse el problema
antes de reportar los resultados. Luego se procesa nuevamente el control (punto 4.1) y se sigue lo
estipulado en este procedimiento.

5.1.- Se recomienda realizar una gráfica de Levey-Jennings a partir de los valores asignados al control.
5.2.- Se recomienda aplicar reglas de control usual para mediciones manuales (1:3s, 2:2s, R4s).
5.3.- Luego de detectado y corregido un estado de fuera de control, se vuelve a procesar el material
de control a fin de conocer si el problema fue solucionado.

El valor del control debe ser guardado, incluyendo su interpretación.
No se reporta en el informe de resultados del paciente, pero debe ser reportado en la cara posterior
de la hoja de reporte con fines docentes.
7.- Bibliografía
2006

MLHIv1.1
PHI-Hto
Medición del hematocrito manual
1.- Objetivo
Realizar la medición del hematocrito (Hto) mediante la metodología manual, empleando el método
del microhematocrito.
2.- Fundamento
El hematocrito expresa la relación entre la cantidad de masa globular y el plasma de una sangre hecha
incoagulable, la cual se expresa en términos absolutos (Unidades Sistema Internacional SI) o en
términos relativos (%) (Unidades Convencionales UC).
Para su medición se observa la cantidad de paquete globular con respecto al volumen total de sangre
que ha sido tomada con anticoagulante y centrífugada durante 5 minutos a 15.000 r.p.m. en tubos de
microhematocrito, a lo que se conoce como método del microhematocrito.
3.1.- Microcentrífuga.
3.2.- Placa de plastilina.
3.3.- Tubos capilares no heparinizados (borde azul).
3.4.- Tablas para la lectura del microhematocrito
3.5.- Muestra de sangre total.
3.5.- Gasa
4.- Procedimiento
4.1.- Mezclar la muestra de sangre venosa por inversión completa un mínimo ocho (8) veces.
4.2.- Quitar el tapón e inclinar el tubo de muestra lentamente hasta que la sangre llegue al borde del
tubo inclinado, con cuidado para no derramar la sangre.
4.3.- Colocar el tubo de microhematocrito no heparinizado (marcado azul) por el extremo no
marcado, en el borde del tubo de muestra.
4.4.- Llenar el capilar por capilaridad hasta completar 3/4 partes del tubo de microhematocrito o
hasta la marca coloreada impresa en éste.
4.5.- Sellar con plastilina el capilar para microhematocrito por el lado seco (contrario al empleado
para la toma de la muestra), inclinando éste levemente para evitar derrame de la sangre.
4.6.- Colocar en posición vertical el tubo de microhematocrito, en los espacios de la placa de plastilina
dispuestos para ello.
4.7.- Para la centrifugación de los tubos, abra la tapa de la centrífuga y retire la tapa interna.
4.8.- Coloque los capilares en posición horizontal en la microcentrífuga, teniendo la precaución de
ubicar la porción sellada hacia la periferia de la centrífuga.
4.9.- Adapte y cierre la tapa interna de la microcentrífuga, luego cierre la tapa exterior de la
microcentrífuga.
4.10.- Gire el reloj a cinco (5) minutos o apriete el botón de inicio de la microcentrífuga, según el
modelo.
4.11.- Una vez culminada la centrifugación, abra la tapa externa e interna, retire inmediatamente los
tubos y colóquelo en posición vertical, en los espacios de la placa de plastilina dispuestos para ello.
MLHIv1.1
4.12.- Tome una tabla para microhematocrito y efectué la lectura haciendo coincidir el nivel inferior
del paquete globular con el cero (0) de la escala y el nivel superior del plasma con la línea superior de
la escala (100). Leer entonces el nivel superior alcanzado por el paquete globular, para obtener el
valor del hematocrito en términos porcentuales.
4.13.- Anotar los resultados obtenidos y proceder a reportar.

5.1.- Una vez centrifugado el hematocrito debe sacarse inmediatamente y colocar en posición vertical
hasta su lectura.
5.2.- Evite forzar el cierre y atornillamiento de la tapa interna de la microcentrífuga, ya que podrían
quedarse atascadas y perder todo el trabajo realizado.
5.3.- Existe mucha variación en la forma de ajustar el tiempo y dar inicio a la centrifugación en los
diferentes modelos de microcentrífugas. En las microcentrífugas ADAMS MICRO-HEMATOCRIT
CENTRIFUGE hay a justar el tiempo y comienza la centrifugación. En las microcentrífugas AUTOCRIT II
solamente se aprieta el botón y se inicia la centrifugación.
5.4.- Por defecto las microcentrífugas tienen establecida una velocidad de 15.000 rpm, razón por la
cual no hay que ajustar este valor.
5.5.- Microhematocrito capilar. El hematocrito puede ser obtenido de una muestra capilar y ser
procesado de la misma manera a la descrita en este protocolo, con la excepción de emplear tubos de
microhematocrito con heparina (borde rojo) a fin de evitar que la muestre se coagule. Recuerde que
al obtener una muestra capilar, siempre se debe descartar la primera gota de sangre.

Hto: 0,XXX L/L o sin unidades XX,X %
Ejemplo: 0,442 44,2
7.- Bibliografía
2006
7.5.- Fragachan Lola. Manual de Morfología Sanguínea. Cátedra de Hematología. Escuela de Bioanálisis, UCV.
1986.

MLHIv1.1
PHI-GBR
Recuento de leucocitos método directo en hemocitómetro
1.- Objetivo
Obtener la concentración de leucocitos, de manera manual, en una muestra de sangre completa
siguiendo los criterios establecidos de calidad, bioseguridad y bioética.
2.- Fundamento
Consiste en la determinación de la concentración de leucocitos (número de leucocitos por litro, mm 3
o uL de sangre) en un hemocitómetro después de diluir la muestra de sangre total con ácido acético al
3% para promover la lisis de eritrocitos y plaquetas, de manera de facilitar la visualización y conteo de
los leucocitos para, después de realizar los cálculos correspondientes, obtener la concentración de
leucocitos.
3- Materiales y muestra
3.1.- Tubos 12x75
3.2.- Pipetas de 1ml graduada
3.3.- Hemocitómetro
3.4.- Pipeta de Sahli
3.5.- Laminilla hematimétrica
3.6.- Tubos de microhematocrito no heparinizados
3.7.- Microscopio óptico.
3.8.- Líquido de Turk
4.- Procedimiento
4.1.- Dilución de la sangre:
4.1.1.- Colocar en un tubo de 12 x 75 mm 0,38 ml de líquido de Turk.
4.1.2.-Mezclar la muestra por inversión por lo menos seis (6) veces
4.1.3.-Medir muestra, con la pipeta de Sahli llevándola a la marca de 20 µL, limpiar muy bien por
fuera la pipeta. En caso de sobrepasar la sangre la marca del enrase (20 µL) realizar ligeros toques a
la punta de la pipeta con una gasa.
4.1.4.-Introducir la pipeta dentro del líquido de dilución y enjuagar varias veces la pipeta evitando la
formación de espuma.
4.1.5.-Tapar la dilución con papel parafilm hasta el momento justo en que se montará en el
hemocitómetro.
4.2.- Carga de la Cámara de Neubauer:

4.2.1.-Se debe colocar sobre el mesón el hemocitómetro y sobre este la laminilla hematimétrica la
cual quedará ubicada en el centro del mismo y cubrirá los retículos donde se realizará el recuento.
4.2.2-Mezclar muy bien la dilución, previamente realizada, con golpes suaves sobre una gasa.
4.2.3-Tomar un capilar de microhematocrito no heparinizado cargarlo con la dilución de la sangre.
4.4.4.-Se coloca la punta de este microhematocrito en uno de los rectángulos centrales de la cámara
de Neubauer (donde está grabado el retículo) a nivel del borde de la laminilla hematimétrica, (el
microhematocrito debe hacer un ángulo aproximado de 35° con la cámara). Dejar salir pequeñas
cantidades, de modo que se llene todo el rectángulo donde se encuentra grabado el retículo. El
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líquido se extenderá por capilaridad, debajo de la laminilla hematimétrica.El rectángulo debe quedar
completamente lleno y sin presencia de burbujas.
NO DEBE haber quedado líquido fuera del borde de la laminilla, ni en el surco transversal ni en los
laterales. (Ver figura 1)
Figura 1: Ejemplo de Cámara de Neubauer con laminilla hematimétrica (izquierda), y mal cargada
(izquierda)
4.3.- Recuento de células:

4.3.1-Si la cámara queda bien montada se procede al recuento de las célula.
Se coloca la cámara sobre la platina del microscopio que debe estar completamente horizontal. Se
debe esperar 3 minutos para que las células se sedimenten.
4.3.2- Colocar la cámara en la platina del microscópio. Reducir la luz bajando el condensador y
cerrando el diafragma, para poder distinguir mejor los leucocitos.
4.3.3.-Enfocar la preparación: girar el tornillo macrométrico para bajar el objetivo 10X hasta que casi
toque la laminilla. Luego rotar el tornillo hacia arriba hasta enfocar. Contar las respectivas células con
objetivo de 10X.Para distinguir los glóbulos blancos de artefactos (cristales u otras partículas) es
necesario girar suavemente el tornillo micrométrico durante toda la realización del recuento, lo cual
permite observar a los leucocitos (redondeados y el núcleo oscuro).
4.3.4.-Antes de iniciar el recuento se debe inspeccionar los cuatro (4) cuadrados grandes de las
esquinas del retículo de Neubauer para observar la distribución de las células: una distribución
desigual se debe a inadecuada mezcla, si ello sucede proceda a lavar y secar la cámara, mezclar de
nuevo las diluciones y volver a montar la cámara. Si la distribución es aparentemente uniforme
proceder a contar las células.
4.3.5.-Los leucocitos se cuentan en cada uno de los 16 cuadrados medianos en que están divididos los
cuatro cuadrados grandes de los extremos. Primero se enfoca uno de los cuadrados grandes: por
ejemplo el izquierdo superior y en él se empieza a contar por el cuadrado mediano del extremo
izquierdo de la primera fila y se sigue hacia la derecha hasta llegar al final de los cuatro cuadrados
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medianos ; se baja hacia la segunda fila y se cuentan los cuatro cuadrados medianos de esa fila
dirigiéndose hacia la izquierda, se baja a la tercera fila y así sucesivamente hasta haber contado los 16
cuadrados medianos, describiendo una línea quebrada en el movimiento. En cuanto a las células que
están situadas en las líneas limítrofes, sólo se contarán las que tocan las líneas izquierda y superior
como perteneciente a ese cuadrado mediano, siendo omitidas las que tocan las líneas derechas e
inferior; esto para evitar contar dos veces la misma célula.
Los leucocitos contados en ese cuadrado grande representan la cifra de leucocitos en 1 mm2. Luego
se hace lo mismo con cada uno de los tres cuadrados grandes restantes y se suman los resultados.
Por lo que el número leucocitos contados en los 4 cuadrados grandes serán los leucocitos en 4 mm2
lo que representa la superficie contada de la cámara; para obtener el volumen se debe tener en
cuenta la altura a la que llegó la dilución cuando se cargó la cámara y esta altura, delimitada por la
laminilla hematimétrica, es de 0,1mm. De manera que el volumen (V) que resulta de multiplicar el
área (A) por la altura (h) será de 0,4mm3. (V=A x h). Si decimos que “N” es el número de células
contadas tenemos:
Superficie contada…...................... 4 mm2
Altura de cámara…....................... 0,1 mm
Volumen contado…................... 4 x 0,1=0,4mm3Se contaron “N” células en un volumen de 0,4 mm3
Como realmente nos interesa saber cuántas células hay en 1mm3 realizamos una simple regla de tres:
Se cuentan en
0,4 mm3 de la dilución…................ “N” leucocitos X = “N” x 1mm3/ 0,4mm3=2,5 x “N”
1 mm3de la dilución……………….. X ¿Cuántos leucocitos hay?
Este resultado es la cantidad de células por mm3 de la dilución, sin embargo nosotros debemos
entregar el resultado de la concentración de leucocitos en sangre periférica. Recordemos que la
sangre periférica fue diluida 1/20 con líquido de Turk por lo que este resultado debe ser multiplicado
por 20.
Leucocitos en sangre periférica por mm3= 2,5 x “N” x 20 = “N” x 50

Leucocitos en sangre periférica por mm3= “N” x 50
50 es el factor por el cual hay que multiplicar las células contadas en la cámara de Neubauer, siempre
y cuando se mantengan las condiciones de área contada y la dilución.
Para expresar el resultado en unidades del sistema internacional (USI = x 10 9/L), se hace la siguiente
relación: Si sabemos que 1L = 106 mm3, multiplicamos la cifra de glóbulos blancospor 106.
Ejemplo: GB x 109/L = “N” x 50 x106

5.1.- Se debe asegurar que la cámara y la laminilla hematimétrica estén bien limpias. Se sugiere
limpiar la cámara y la laminilla hematimétrica utilizando jabón y abundante agua. No se debe utilizar
ácidos o álcalis fuertes.
5.2.-Evite tocar las superficies de la cámara y la laminilla ya que las huellas dactilares son difíciles de
remover y pueden ser causa de error.
5.3-Se debe tapar la dilución con papel parafilm hasta el momento justo en que se montará en el
hemocitómetro.
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5.4.-Asegúrese de que la cámara este bien cargada

5.5.-El recuento celular debe hacerse relativamente rápido para evitar que se seque la preparación, si
nota que esto está sucediendo, debe desmontar y cargar nuevamente la cámara e iniciar de nuevo el
conteo.
5.6.-La diferencia del recuento entre un cuadrado de 1 mm2 y otro no debe ser mayor de 12 células, si
esto sucede quiere decir que las células están mal distribuidas y debe cargarse de nuevo la cámara y
realizar todo el proceso.
5.7.-El factor “50” se utiliza siempre y cuando la dilución sea 1:20 y se cuenten los cuatro cuadrados
de los extremos a una altura de 0,1 mm.
5.8.-Es recomendable realizar los recuentos celulares por duplicado.
5.9-Si las cifras de glóbulos blancos son muy bajas o muy altas se pueden variar las diluciones o la
superficie de recuento, pero en estos casos debe hacerse los cálculos correspondientes tomando en
cuenta la nueva dilución o el área de superficie contada, tomando en cuenta que la altura de la
cámara es siempre la misma.

Glóbulos blancos: XX,X x109/L XX,X x103/mm3
Ejemplo: 10,5 x109/L 10,5 x103/mm3
7.- Bibliografía
2011. Pp 96 - 103
Williams Hematology, sixth edition. 2001. Pág. 9 -16

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PHI-PlqR
Recuento de Plaquetas método directo en hemocitómetro
1.- Objetivo
Obtener la concentración de plaquetas de un individuo, de manera manual, en una muestra de
sangre completa; siguiendo los criterios establecidos de calidad, bioseguridad y bioética.
2.- Fundamento
Determinar la concentración de plaquetas (número de plaquetas por litro, mm3 o uL de sangre) en
un hemocitómetro después de diluir la muestra de sangre total con oxalato de amonio al 1% con lo
cual se promueve la lisis de los eritrocitos y la dispersión de las plaquetas, de manera tal que se
facilite la visualización y el conteo de las mismas. El número de plaquetas puede ser convertido a
concentración mediante los cálculos correspondientes.
3.1.- Equipo Unopette o equivalente para recuento de plaquetas por metodología manual
3.2.- Hemocitómetro
3.3.- Laminilla hematimétrica
3.4.- Capsulas de Petri
3.5.- Reloj de tiempo
3.6.-Microscopio óptico.
3.7.- Oxalato de amonio al 1%
4.- Procedimiento
4.1.- Descripción del unopette
Es un dispositivo de material plástico no contactable y
descartable que consta de: a) un capilar calibrado para
tomar 20 ul de muestra , el cual viene protegido con una cápsula
o capuchón y b) Un reservorio que contiene oxalato de amonio
estéril al 1%.
4.2.- Dilución de la sangre:

4.2.1.- Tomar el Unopette y quitar el capilar con su capuchón e invertirlo y con la punta del capuchón
perforar el diafragma que se encuentra en el cuello del reservorio (ver figura 1B).

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4.2.2.- Quitar el capuchón y proceder a llenar el capilar con la muestra previamente mezclada (6-8
inversiones completas del tubo), para ello acerque el capilar a la boca del tubo el cual debe estar en
posición casi horizontal lo que permite que la sangre se disponga en la punta del tubo y entre en
contacto con el capilar, ladee éste último un poco hacia abajo con lo que logrará un llenado completo.
Si la muestra es capilar (DÉRMICA) asegúrese de descartar la primera gota y tome la muestra de una
gota que fluya libremente, acercando el capilar a la misma. Limpiar, de manera inmediata, los restos
de sangre del exterior del capilar con una gasa limpia.
4.2.3.- Presionar el reservorio, entre los dedos pulgar e índice de la otra mano, e introducir el capilar
en éste por la perforación realizada al inicio, liberar suavemente la presión ejercida para que salga la
sangre dentro del reservorio. Realizar presiones suaves sobre el recipiente de manera de que se
limpie bien el capilar y se mezcle la sangre contenida con la solución diluente contenida en el
reservorio. Sacar el capilar y colocarlo en su lugar sobre el reservorio, tapar con el capuchón y dejar
15 minutos para permitir la total lisis de los eritrocitos.
4.3.- Carga de la Cámara de Neubauer:

4.3.1.-Colocar sobre el mesón el hemocitómetro y sobre este la laminilla hematimétrica la cual
quedará ubicada en el centro del mismo y cubrirá los retículos donde se realizará el recuento.
4.3.2.- Mezclar muy bien la dilución por rotación.
4.3.3.- Quitar el capuchón y desechar las primeras gotas de sangre
diluida, montar la cámara manteniendo el reservorio con la micropipeta
en un ángulo de 35° en uno de los rectángulos centrales donde se
encuentra grabado el retículo, a nivel del borde de la laminilla. El líquido
se extenderá por capilaridad, por debajo de la laminilla hematimétrica.
4.3.4.- Dejar salir pequeñas cantidades, de modo que se llene todo el
rectángulo donde se encuentra grabado el retículo. El líquido se extenderá por capilaridad, debajo de
la laminilla hematimétrica. El rectángulo debe quedar completamente lleno y sin presencia de
burbujas.
No debe haber quedado líquido fuera del borde de la laminilla, ni en el surco transversal ni en los
laterales. Si ello sucede debe proceder a limpiar y cargar la cámara de nuevo.

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4.3.5.-Dejar sedimentar la preparación sobre un plano horizontal y en el interior de una placa de Petri
en la cual se introduce un pequeño algodón húmedo alejado de la cámara de Neubauer (cámara
húmeda) durante 10 - 15 minutos.
Tomar la cámara de Neubauer y colocarla sobre la platina del microscopio

óptico. Enfocar el retículo grabado girando el tornillo macrométrico para
bajar el objetivo de 10X hasta que casi toque la laminilla. Esto debe realizarse
sin perder de vista la cámara y el objetivo de manera de bajar lo suficiente
sin romper la laminilla. Luego rotar el tornillo hacia arriba hasta enfocar el
retículo. Pasar al objetivo de 40X para observar las plaquetas depositadas
sobre el fondo de la cámara, que destacan como puntos negro rodeados de
un halo refringente. Para distinguir las plaquetas de interferentes y otras
partículas es necesario mantener la mano sobre el tornillo micrométrico
durante toda la realización del recuento. Realizar el recuento en cinco (5)
cuadrados medianos del retículo central, el cual posee 80 cuadritos de
0,0025 mm2 de superficie, describiendo una línea quebrada en el
movimiento, tal y como se realizó para el recuento de leucocitos.
4.4.- Cálculos
Para obtener la concentración de ´plaquetas debemos realizar los cálculos como sigue:
Se contaron 80 cuadritos de 0,0025 mm2 = por lo tanto el área total contada (A) es de 0,2 mm2; para
obtener el volumen se debe tener en cuenta la altura de la cámara (h) que es de 0,1mm. De manera
que el volumen (V) que resulta de multiplicar el área (A) por la altura (h) será de 0,02 mm 3. (V=A x h).
Si decimos que “N” es el número de células contadas tenemos:
Área contada ................................. 0, 2 mm2
Altura de cámara .......................... 0,1 mm
Volumen contado ......................... 0,2 x 0,1= 0,02 mm3
Se contaron “N” células en un volumen de 0,02 mm3

Como realmente nos interesa saber cuántas células hay en 1 mm3 realizamos una simple regla de
tres:
Se cuentan en
0,02 mm3 de la dilución ................... “N” plaquetas X = “N” x 1 mm3 / 0,02 mm3 = 50 x “N”
1 mm3 de la dilución ……………….. X ¿Cuántas plaquetas hay?
Este resultado es la cantidad de células por mm3 de la dilución, sin embargo nosotros debemos
entregar el resultado de la concentración de plaquetas en sangre periférica. Recordemos que la
sangre periférica fue diluida 1:100 con oxalato de amonio por lo que este resultado debe ser
multiplicado por 100.
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Plaquetas en sangre periférica / mm3 = 50 x “N” x 100 = “N” x 5000

5000 es el factor por el cual hay que multiplicar las células contadas en la cámara de Neubauer,
siempre y cuando se mantengan las condiciones de área contada y de dilución.
Actualmente la concentración de plaquetas se expresan x 109/L. Conociendo que 1L = 106 mm3, para
obtener la cifra de plaquetas x 109/L se multiplica por 106.
Ejemplo: Plaquetas x 109/L = “N” x 50 x 106

5.1- Asegure que la cámara y la laminilla hematimétrica estén bien limpias. Se sugiere limpiar la
cámara y la laminilla hematimétrica utilizando jabón y abundante agua. NO SE DEBE utilizar ácidos o
álcalis fuertes. Se debe eliminar el agua sumergiendo la cámara y la laminilla en alcohol, secar con
una gasa para no rayar el retículo.
5.2- Evite tocar las superficies de la cámara y la laminilla ya que las huellas dactilares son difíciles de
remover y pueden ser causa de error.
5.3- El recuento celular debe hacerse relativamente rápido para evitar que se seque la preparación, si
nota que esto está sucediendo, debe desmontar y cargar nuevamente la cámara y continuar con el
proceso.
5.4- El factor 5000 se utiliza siempre y cuando la dilución sea 1:1000 y se cuenten los cinco cuadrados
medianos del retículo central.
5.5- Es recomendable realizar los recuentos celulares por duplicado o sea cuando se cargue la cámara
deberían cargarse los dos retículos centrales a la vez.
5.6- Si la cifra de plaquetas es muy baja se aconseja aumentar el área de recuento, generalmente se
realiza un recuento por duplicado y en cada uno se cuenta todo el retículo, como es de suponer se
debe realizar los cálculos correspondientes para obtener el factor a usar.

Plaquetas: XXX* 109/L 325*103/mm3
Ejemplo: 325 * 109/L 325 *103/mm3
7.- Bibliografía
2011. Pág. 101
7.3.- Franco Gabriela, Delgado Thais. Manual de procedimientos Laboratorio Hematología I, Escuela de
7.4.- Shirlyn B McKenzie. Hematología Clínica 2da Edición. 2000. Pág. 733
7.6.- Gaudens de Fragachan, Lola. Manual de hemostasia y coagulación sanguínea. 1984. Pág. 137 - 141

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PHI-Cresil
Coloración de azul brillante de cresil (ABC)
1.- Objetivo
Elaborar láminas coloreadas con la tinción supravital de azul brillante de cresil (ABC).
2.- Fundamento
Las coloraciones supravitales en hematologías permiten:
a) Observar estructuras intracelulares que no han sido sometidas a procesos de fijación,
b) Realizar el recuento de reticulocitos,
c) Visualizar morfología y distribución de plaquetas y estimar su concentración
d) Ejecutar el fenómeno drepanocítico.
Primero se colorea la lámina portaobjeto con el colorante azul brillante de cresilde manera de que al
colocar una muestra de sangre sobre ella, el colorante de la lámina penetre dentro de la célula y tiña
estructuras internas sin que ni las células ni las estructuras sean dañadas o alteradas.
3.1.- Láminas portaobjetos
3.2.- Laminillas
3.3.- Tubos capilares no heparinizados
3.4.- Colorante azul brillante de cresil (ABC).
4.- Procedimiento
4.1.- Colocar dos gotas de ABC en una lámina portaobjeto escrupulosamente limpia.
4.2.- Dejar caer suavemente una lámina limpia sobre el colorante y dejar que este se extienda
uniformemente entre las láminas colocadas por aposición, quitar el exceso de colorante de los lados,
inclinando las dos láminas yuxtapuestas sobre una gasa o papel absorbente. Con un movimiento
rápido y horizontal separar las laminas de manera que se deslicen una sobre la otra, dejar secar.
4.3.- Sobre una lámina cubreobjeto bien limpia, agregar una pequeña gota de sangre con un tubo
capilar no heparinizado y dejar caer invertida sobre la lámina de ABC. La gota de sangre se extenderá
espontáneamente; si esto no sucede, hacer una ligera presión.
4.4.- Montar la lámina sobre la platina y proceder a enfocar con objetivo de 10X para localizar la
preparación; logrado esto pasar a objetivo de 40X. Se debe buscar el sitio donde los eritrocitos se
puedan ver lo suficientemente separados como para distinguir su morfología individual y la
distribución de los mismos se vea regular.
5.- Recomendaciones y precauciones

5.1.- Asegúrese de que las láminas están perfectamente limpias y pulidas para que la sangre se
distienda con facilidad y se obtenga una preparación adecuada.
5.2.- Asegure una distribución uniforme del colorante y que no queden espacios sin colorear en la
lámina
5.3.- En el momento del montaje de la preparación, verifique que la lámina portaobjetos este
colocada por el lado correcto de la coloración, puede verificar esto, tocando con un dedo de la mano
una esquina de la lámina coloreada, si el guante queda coloreado es porque la lámina está ubicada
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por el lado correcto de la coloración o puede tomar el borrador de un lápiz hacer presión sobre la
lámina coloreada y si el borrador se tiñe usted tiene la lámina por el lado correcto de la coloración.
5.4.- Cuando tome la lámina cubreobjeto y proceda a colocar la gota de sangre, asegúrese que la
gota dispensada sea pequeña para que ésta se distienda con facilidad y queden bien distribuidas las
células en la preparación.
6.-Modo de reporte
No aplica.
7.- Bibliografía
7.3.- Shirlyn B McKenzie. Hematología Clínica 2da Edición. 2000. Pág. 736 - 737

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PHI-PlqM
Visualización de la morfología y estimación de plaquetas
1.- Objetivo
Lograr apreciar tanto la morfología, tamaño y distribución de las plaquetas como apreciar su cantidad
en el frotis sanguíneo con tinción de Romanowsky o tinciones supravitales.
2.- Fundamento
En determinadas ocasiones es necesaria la revisión de la morfología plaquetaria o la distribución de
las mismas solamente, esta labor puede ser realizada en un frotis sanguíneo con tinción de
Romanowsky o mediante una coloración supravital.
3.1.- Frotis sanguíneo coloreado con tinción de Romanowsky o un frotis teñido con azul brillante de
cresil (ABC)
4.- Procedimiento
4.1.- Montar la lámina sobre la platina y proceder a enfocar con objetivo de 10X para localizar la
preparación; logrado esto pasar a objetivo de 40X. Se debe buscar el sitio donde los eritrocitos se
puedan ver lo suficientemente separados como para distinguir su morfología individual y la
distribución de los mismos se vea regular.
4.2.- Recorrer la lámina de manera ordenada y observar las plaquetas como discos pequeños con
punteado interno color azul. Dirigir la observación hacia la búsqueda de agregación plaquetaria,
satelitismo plaquetario, plaquetas agranulares, o macroplaquetas. Cualquiera de estos hallazgos debe
reportarse.
Para apreciar la concentración de plaquetas en un campo de 100X, se puede tomar como “normal”
cuando se ven entre 5 a 10 plaquetas por cada campo que tenga aproximadamente 100 glóbulos
rojos, “aumentadas” si sobrepasan las 10 por campo de aproximadamente 100 glóbulos rojos y
“disminuidas” si están por debajo de 5 por campo de aproximadamente 100 glóbulos rojos
5.- Recomendaciones y precauciones

5.1.-Se debe contar con un adecuado frotis sanguíneo coloreado con tinción de Romanowsky o un
frotis teñido con azul brillante de cresil (ABC)

Cualquier alteración cualitativa, cuantitativa o de distribución de las plaquetas debe reportarse.
La estimación de la concentración se realiza como: Plaquetas normal, altas o bajas al frotis sanguíneo
o cresil.
7.- Bibliografía
7.3.- Shirlyn B McKenzie. Hematología Clínica 2da Edición. 2000. Pág. 736 - 737
7.4. -Williams Hematology, sixth edition. 2001. Pág. 9 -16

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PHI-Ret
Recuento de reticulocitos
1.- Objetivo
Obtener la concentración relativa de reticulocitos en la preparación supravital de Azul Brillante de
Cresil (ABC).
2.- Fundamento
La observación y el reconocimiento de los glóbulos rojos jóvenes que contienen ARN residual, puede
realizarse por medio de la coloración supravital (ABC), la cual penetra en la célula sin dañarla y
permite colorear in vivo el ARN residual, con la finalidad de conocer de modo indirecto la capacidad
de eritropoyesis de la médula ósea.
3.1.- Laminas de azul brillante de cresil (ver Coloración de azul brillante de cresil (ABC)PHI-Cresil)
3.2.- Muestra de sangre
4.- Procedimiento
4.1.- Refiérase al procedimiento Coloración de azul brillante de cresil (ABC) PHI-Cresil para la
preparación de láminas con azul brillante de cresil (ABC).
4.2.- Enfocar en microscopio con objetivo de 40X, posteriormente observar con objetivo de
inmersión, colocando una gota de aceite sobre la laminilla y el objetivo de 100X.
4.3.- Seleccionar los campos donde los eritrocitos conserven una distribución uniforme, es decir que
los glóbulos rojos se puedan apreciar individualmente sin empaquetarse unos sobre los otros.
4.4.- En la preparación los leucocitos y plaquetas se colorean de azul y los glóbulos rojos de verde
amarillento. Los reticulocitos se ven por lo general de mayor tamaño que los glóbulos rojos maduros y
dentro se les observa el material granulo-filamentoso de ARN residual teñido de azul.
4.5.- Realizar el recorrido de la lámina en sentido de línea quebrada, de modo de tener orientación y
evitar contar un campo microscópico varias veces.
4.6.- Contar tanto glóbulos rojos como reticulocitos, hasta un total 1.000 elementos (glóbulos +
reticulocitos)
4.7.- Cálculos
La cifra total de reticulocitos se lleva a porcentaje, o a la unidad, aplicando la siguiente regla de tres:
1000 elementos ---------- 100
1 reticulocito ---------- X = %

Reticulocitos relativo 0,XXX XX,X %
Reticulocitos relativo 0,030 3,0 %
7.- Bibliografía
MLHIv1.1
PHI-Eb
Recuento de eritroblastos y corrección de leucocitos
1.- Objetivo
Obtener la cantidad de eritroblastos en un frotis de sangre periférica. Reconocer, reportar
adecuadamente los eritroblastos y aplicar la corrección de leucocitos.
2.- Fundamento
En diversos casos clínicos se evidencia la presencia de eritroblastos en el frotis de sangre periférica
teñidos con coloraciones de tipo Romanowsky. Por ello, es necesario el reconocimiento de estos
elementos, la diferenciación con respecto a otras células y el recuento de los eritroblastos por cada
100 leucocitos.
El hallazgo de eritroblastos en el frotis de sangre periférica refleja la producción exacerbada de la
serie roja ante una disminución importante de eritrocitos y/o procesos neoplásicos. El
reconocimiento, clasificación y recuento de eritroblastos permite realizar la corrección en el recuento
total de leucocitos, necesaria ante la resistencia de estos elementos nucleados a la lisis con los
reactivos empleados en la metodología manual y automatizada, reportando una falsa leucocitosis.
3.1.- Frotis de sangre periférica coloreado.
3.2.- Microscopio óptico.
4.- Procedimiento
4.1.- Proceder a visualizar el frotis de la muestra problema bajo todas las pautas correcta para su
observación al microscopio.
4.2.- Enfocar en objetivo de 10X y recorrer el cuerpo del frotis hasta obtener una zona adecuada para
la realización del diferencial leucocitario, una vez seleccionada la zona de observación enfocar con
objetivo de 40X.
4.3.- Identificar en el frotis de sangre periférica los eritroblastos en sus diversos estadios de
maduración. Conjuntamente, realizar el diferencial leucocitario y el recuento de los eritroblastos,
obteniéndose el número de eritroblastos por cada 100 células blancas.
4.4.- Cálculos
Con el valor del recuento de leucocitos y el valor de eritroblastos obtenido al realizar el diferencial
leucocitario proceder a la corrección del recuento de leucocitos.
Ejemplo: Recuento de eritroblastos en el frotis sanguíneo: 94 eritroblastos/100 GB
Recuento de leucocitos 20 x 109 /L
100 GB + 94 eritroblastos = 194 células nucleadas
194 células -------------------- 100 leucocitos

20 x 109 /L células -------------- X
X= 20 x 109/L X 100 = 10,3 x 109/L Leucocitos

194
Valor real de Leucocitos: 10,3 x 109/L

MLHIv1.1
Esta corrección debe hacerse independientemente de que el recuento haya sido realizado de forma
manual o automatizada, siempre y cuando el autoanalizador no posea el modo de corrección
automático.
Es considerada la corrección:
 Cuando el número de eritoblastos esté por encima de 10/100GB, con un recuento de
leucocitos normal o elevado.
 Cuando el recuento de leucocitos esté por debajo de 3 x 109/L, la corrección debe hacerse
cuando el número de eritroblastos este sobre 5/100GB.

5.1.- Diferenciar correctamente los eritroblastos de linfocitos, haciendo énfasis en las características
morfológicas de la cromatina nuclear de ambas células y sus características diferenciales con respecto
al citoplasma.
5.2.- Realizar conjuntamente el diferencial leucocitario y el recuento de eritroblastos. Ya que la forma
de reporte contempla la cantidad de eritroblastos por cada 100 leucocitos, además de la utilización
de los datos para los cálculos en corrección de leucocitos.
Eritroblastos XX / 100 GB
Ejemplo: 25 / 100 GB
GB corregidos XX,X x109/L XX,X x103/mm3
Ejemplo 10,5 x109/L 10,5 x103/mm3
7.- Bibliografía

MLHIv1.1
PHI-FD
Fenómeno drepanocítico
1.- Objetivo
Identificar la presencia de drepanocitos a través de la preparación supravital azul brillante de cresil
(ABC).
2.- Fundamento
El fenómeno drepanocítico se basa en colocar una gota de sangre sobre una lámina preparada con
ABC y la cual se sellará para crear un ambiente de hipoxia que permita evidenciar la formación del
drepanocito.
3.- Material necesario

3.1.-Láminas preparadas con ABC.
3.2.-Láminas cubreobjetos.
3.3.-Vaselina.
3.4.-Aplicadores.
4.- Procedimiento
4.1.- Tomar la lamina portaobjeto coloreada con ABC.
4.2.- En una lamina cubreobjetos bien limpia, agregar una gota de sangre (utilizando un tubo capilar
no heparinizado) y sin hacer presión dejar caer invertido sobre la preparación de ABC. La gota de
sangre se extenderá espontáneamente; si esto no sucede, hacer una ligera presión.
4.3.- Observar al microscopio con objetivo de inmersión, colocando una gota de aceite sobre la
laminilla y el objetivo de 100X.
4.4.- Proceder a observar la preparación inmediatamente. Si no están presentes colocar la
preparación en reposo y observar a los 30 minutos y a las 2 horas los drepanocitos, sellar los bordes
de la laminilla con vaselina utilizando un aplicador de madera o similar para disminuir la tensión de
oxígeno y así poder identificar los casos heterocigotos o de homocigotos que no estén en crisis.
4.5.- Si no se observan drepanocitos a las 2 horas sellar los bordes de la laminilla con vaselina
utilizando un aplicador de madera o similar para disminuir la tensión de oxígeno y así poder identificar
los casos heterocigotos o de homocigotos que no estén en crisis a las 24 horas del sellado
5.- Modo de reporte

5.1.-Positividad en la observación:
Se observó drepanocitos a los 30 minutos
Se observó drepanocitos a las 2 horas
Se observó drepanocitos a las 24 horas
5.2.-Negatividad en la observación:
No se observó drepanocitos a las 24 horas.

MLHIv1.1

6.1.- Realizar una observación cuidadosa de la preparación en busca de los drepanocitos, que se
visualizarán como células en forma de hoz
7.- Bibliografía
7.2.- Fragachan Lola. Manual de Morfología Sanguínea. Cátedra de Hematología. Escuela de Bioanálisis, UCV.
1986.

MLHIv1.1
PHI-VSG
Procedimiento para Velocidad de Sedimentación globular (VSG)
1.- Objetivo
Realizar la VSG por el Sistema Dispette bajo las condiciones estandarizadas en la cátedra.
2.-Fundamento
Medir la distancia, en mm, con que los glóbulos rojos de la sangre de un individuo, anticoagulada con
EDTA y diluida con SSF 0,86%, sedimentan en la pipeta Dispette en una (1) hora.
3.- Material necesario

3.1.- Pipetas plásticas del Sistema Dispette (Long. 200 mm; Ø int. 2 mm; Esc. grad. 0-190 mm).
3.2- Reservorio de polietileno (2 líneas de nivel): Inferior: 0,25 ml - Superior: 1,25 ml.
3.3.- Soporte especial de plástico para 10 pipetas en posición vertical.
3.4.- Pipetas automáticas con capacidad máxima de 1000 microlitros (µl).
3.5.- Puntas azules para pipetas automáticas
3.6.- Solución salina fisiológica (SSF) al 0,85 %.
3.7.- Un Nivel de burbuja
4.-Procedimiento
4.1.- Revisar las condiciones ambientales del área donde se realizará la prueba: temperatura (18-
25ºC), lejos de la luz directa, de vibraciones y corrientes de aire.
4.2.- Verificar que no existe ningún grado de inclinación en el mesón donde se llevará a cabo la
prueba mediante la utilización de un nivel de burbuja.
4.3.- Extraer la muestra de sangre con EDTA en las proporciones conocidas y con el menor éxtasis
venoso posible. Montar la prueba dentro de las cuatro horas de extraída la muestra.
4.4.- Llenar el reservorio azul del sistema Dispette con 0,25 ml de SSF al 085% empleando una pipeta
automática.
4.5.- Mezclar la muestra por un mínimo 12 inversiones completas (180° x 2).
4.6.- Agregar 1 ml de sangre, utilizando una pipeta automática.
4.7.- Insertar la pipeta del sistema Dispette suavemente dentro del reservorio, rotar la pipeta en un
movimiento circular hacia abajo y hacia arriba 4 veces completa para asegurar el mezclado de la
sangre con el diluente.
4.8.- Enrasar a cero el nivel de sangre
4.9.- Colocar la pipeta en el soporte en posición vertical (90°) en un lugar protegido de la luz directa,
de corrientes de aire y vibraciones, a un rango de temperatura entre 18º a 25º C.

MLHIv1.1
4.10.- Colocar el reloj a 60 minutos.

4.11.- Leer a los 60 minutos los milímetros recorridos por los glóbulos rojos hasta la separación entre
el plasma y el paquete globular.

5.1.- No deben quedar burbujas en la columna de sangre.
5.2.- Revisar de modo visual que la SSF al 0,85% no esté contaminada.

Velocidad de sedimentación globular = X,X mm/h
Intervalo de referencia: Sexo y edad: XX – XX mm/h
Se empleará el intervalo de referencia establecidos por la cátedra para la población de la escuela de

Bioanálisis por la metodología Dispette:
Mujeres: 18 a 25 años: 1-21 mm/h
Hombres: 18 a 25 años: 1-8 mm/h
7.- Bibliografía
7.3.-Farina Elisa, Vierma Herimar, Freitas Lourdes. Intervalo de Referencia para la Velocidad de Sedimentación
Globular de una población femenina entre 18y 28 años empleando el Sistema Dispette®. Trabajo especial de
grado. , Escuela de Bioanálisis. UCV. 2002.
7.4.- Saavedra Meybe, Sojo Yuleima, Freitas Lourdes. Intervalo de Referencia para la Velocidad de
Sedimentación Globular de una población masculina entre 18y 28 años empleando el Sistema Dispette®.
Trabajo especial de grado. Escuela de Bioanálisis. UCV. 2002.


Manual de Procedimientos de Hematología I 2014 v1.1

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Universidad Central de Venezuela

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

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4.2.- Preparación del sistema de extracción

4.3.- Preparación de la vena

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

4.4.- Extracción de la sangre propiamente dicha

4.4.2.- Si se va a realizar la venopunción con inyectadora o scalp:

5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

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5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

4.10.- Condiciones macroscópicas de un buen frotis: Criterios de aceptación.

5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

4.2.- Coloración propiamente dicha:

5.- Recomendaciones - precauciones

Características del frotis con Coloración de Giemsa

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

4.2.- Coloración propiamente dicha:

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

4.4.- Buscar un campo apropiado para la observación en 40X.

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5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

4.4.- Buscar un campo apropiado para la observación en 40X.

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Para conocer la correspondencia entre la cianometahemoglobina y la cantidad de hemoglobina

1000 ml de material de referencia -------------- 800 mg de cianometahemoglobina

X = 4 mg (es la concentración real de patrón (CRP))

Como en la técnica realizada en el laboratorio se utilizan 5 ml de reactivo de Drabkin + 20 uL de

4.6.2.- Obtención de la calibración

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

se puede extrapolar el valor en absorbancia de la muestra de un paciente y así obtener la

4.6.2.2.- Ecuación de la recta

4.6.2.3.- Método del factor de calibración (FC)

5.- Recomendaciones - precauciones

Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Hematología.

Tubo Material de Reactivo de Concentración Lectura en Abs Factor

6.- Modo de reportar

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5.- Recomendaciones - precauciones

6.- Modo de reportar

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5.- Recomendaciones – precauciones

6.- Modo de reportar

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