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Alimentos  vegetales  Hum  Nutr

DOI  10.1007/s11130­015­0517­2

PAPEL  ORIGINAL

Efectos  antitrombóticos  de  Amaranthus  hypochondriacus
Proteínas  en  ratas

Ana  Clara  Sabbione  1,2  &  Gustavo  Rinaldi3  &  María  Cristina  Añón1,2  &  Adriana  A.  Scilingo1,2

#  Springer  Science+Business  Media  Nueva  York  2015

Resumen  La  enfermedad  cardiovascular  (ECV)  es  una  de  las  principales  causas   Palabras  clave  Alimentos  funcionales.  Proteínas  de  amaranto.
de  discapacidad  y  muerte  prematura  en  todo  el  mundo.  Las  dietas  con   Actividad  antitrombótica.  Ensayos  con  animales
componentes  antitrombóticos  ofrecen  una  forma  cómoda  y  eficaz  de  prevenir  y  
reducir  la  incidencia  de  ECV.  El  objetivo  del  presente  trabajo  fue  evaluar  los  
efectos  in  vivo  y  ex  vivo  de  las  proteínas  de  Amaranthus  hypochondriacus  en  la   abreviaturas

formación  del  tapón  plaquetario  y  la  cascada  de  coagulación.  Las  proteínas  de   AG  Ratas  alimentadas  con  proteínas  de  amaranto
amaranto  se  administraron  por  vía  oral  a  ratas  (AG,  8  animales)  y  se  determinó   APTT  Tiempo  de  tromboplastina  parcial  activada
el  tiempo  de  sangrado  sin  mostrar  diferencias  significativas  en  comparación  con   Tiempo  de  sangrado  BT
las  ratas  de  control  (CG,  7  animales).  Sin  embargo,  los  resultados  muestran  una   CG  Ratas  que  fueron  alimentadas  con  dieta  control
fuerte  tendencia,  lo  que  sugiere  que  las  proteínas  de  amaranto  están  involucradas   ECV  Enfermedad  cardiovascular

en  la  inhibición  de  la  formación  de  trombos.  La  sangre  no  anticoagulada  extraída   HG  Ratas  inyectadas  con  heparina
de  los  animales  se  analizó  con  el  hemostatómetro,  donde  los  parámetros  de  AG   PT Tiempo  de  protrombina

obtenidos  fueron  el  doble  de  los  valores  mostrados  por  CG.  Las  pruebas  de   TT  Tiempo  de  trombina

coagulación,  tiempo  de  trombina  (TT)  y  tiempo  de  tromboplastina  parcial  activada  
(TTPA),  presentaron  un  aumento  de  la  formación  de  coagulación  de  17  y  14  %  
respectivamente  al  comparar  AG  con  GC.  Los  ensayos  ex­vivo  confirman  la   Introducción
hipótesis  que  infiere  que  las  proteínas  del  amaranto  son  un  potencial  agente  
antitrombótico. Las  enfermedades  cardiovasculares  producen  un  número  importante  de  muertes  
en  el  mundo  occidental  [1].  El  consumo  de  alimentos  que  ayuden  al  organismo  
a  disminuir  la  presión  arterial,  la  tendencia  a  la  formación  de  trombos  y  el  estrés  
oxidativo  podría  ser  una  estrategia  interesante  que  conduzca  a  una  disminución  
de  la  morbilidad  y  una  disminución  de  los  costos  en  salud  [2].

Los  alimentos  funcionales  pueden  contener  componentes  con  actividad  
fisiológica  comprobada  llamados  compuestos  bioactivos.  Dentro  de  este  grupo  
*  Adriana  A.  Scilingo
aascilingo@gmail.com de  sustancias  se  encuentran  las  proteínas  y  los  péptidos  alimentarios  encriptados  
en  sus  secuencias.  En  los  últimos  años  se  observa  una  creciente  tendencia  e  

1
interés  en  la  utilización  de  péptidos  derivados  de  proteínas  alimentarias  debido  
Centro  de  Investigación  y  Desarrollo  en  Criotecnología  de  Alimentos  
a  su  variedad  y  notable  multifuncionalidad  [3–5].  Los  péptidos  podrían  realizar  
(CIDCA),  Calle  47  y  116,  1900  La  Plata,  Argentina  
2
diversas  bioactividades  relacionadas  con  el  sistema  cardiovascular;  actividades  
Facultad  de  Ciencias  Exactas,  Universidad  Nacional  de  La  Plata.  
antihipertensivas,  antitrombóticas  y  antioxidantes  entre  ellas  [5].  Recientemente  
CCT,  La  Plata,  CONICET  (Consejo  Nacional  de  Investigaciones  
Científicas  y  Técnicas),  La  Plata,  Argentina   se  ha  demostrado  que  las  proteínas  de  las  semillas  de  Amaranthus,  un  
3 pseudocereal  mesoamericano,  son  capaces  de  realizar  algunas  de  estas  
Centro  de  Investigaciones  Cardiovasculares  (CIC),  Facultad  de  
Ciencias  Médicas,  Universidad  Nacional  de  La  Plata,  Avenida  60  y   actividades  [6–8].
120  2°  piso,  La  Plata,  Argentina  
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La  coagulación  sanguínea  es  un  proceso  complejo  que  implica  la   HCl  2  M  para  precipitar  las  proteínas  en  su  punto  isoeléctrico.  Después  de  
confluencia  de  numerosos  factores  y  fenómenos  y  consta  de  tres  fases   otro  paso  de  centrifugación  (9000xg,  4  °C,  20  min),  el  precipitado  se  suspendió  
superpuestas  que  mantienen  la  integridad  del  sistema  circulatorio:  fase   en  agua  (relación  1:3),  se  neutralizó  y  se  liofilizó.  Se  determinó  la  composición  
vascular,  fase  plaquetaria  y  fase  de  coagulación.  La  fase  plaquetaria,   del  aislado.  El  contenido  de  proteína  se  determinó  por  Kjeldahl  (método  
también  llamada  hemostasia  primaria,  implica  la  adhesión,  activación  y   954.01  AOAC,  1990),  utilizando  como  factor  de  conversión  5.85  [13].  Los  
agregación  de  las  plaquetas.  La  fase  de  coagulación  (hemostasia  secundaria)   métodos  utilizados  para  la  medición  de  carbohidratos,  cenizas,  agua  y  fibra  
involucra  la  participación  de  los  factores  de  coagulación,  muchos  de  los   dietética  total  fueron,  respectivamente,  antrona  después  de  hidrólisis  ácida  
cuales  son  proteasas  sintetizadas  en  el  hígado  como  zimógenos  que  en   completa,  calentamiento  en  mufla  a  550  °C,  secado  en  estufa  a  105  °C  hasta  
orden  secuencial  conducen  a  la  formación  del  coágulo.  Esta  cascada  de   peso  constante  y  digestión  enzimática  secuencial.  por  α­amilasa,  proteasa  y  
coagulación  consta  de  dos  vías  desencadenantes,  la  extrínseca  y  la  intrínseca,   amiloglucosidasa  estables  al  calor  según  AOAC  (métodos  923.03,  925.09  y  
ambas  convergentes  en  la  vía  común. 991.43;  1990).  Cada  determinación  se  realizó  por  duplicado.

Se  ha  informado  sobre  la  actividad  antitrombótica  de  las  proteínas  de  las  
semillas  de  Amaranthus  mantegazzianus  y  otros  péptidos  de  proteínas  
alimentarias,  por  ejemplo,  carne  de  cerdo  [9],  colza  [10]  y  clara  de  huevo   Ensayo  de  animales
[11] .  Un  trabajo  previo  [9]  confirmó  la  presencia  de  péptidos  antitrombóticos  
potenciales  contenidos  en  proteínas  de  amaranto  o  liberados  después  de   Materials  Male  Wistar  rats  (strain  WKAH/Hok)  aged  11–  12  weeks  (270–340  
una  hidrólisis  de  alcalasa  y  tripsina.  La  fracción  de  glutelina  presentó  la  mayor   g,  LAE  Facultad  de  Ciencias  Veterinarias,  UNLP,  La  Plata,  Argentina).  Diets  
actividad  antitrombótica  (IC50  =  80  ±  3  μg/mL)  mientras  que  el  aislado  de   were  formu  lated  according  to  the  American  Institute  of  Nutrition  using  
amaranto  presentó  menor  actividad  solo  después  de  la  proteólisis  (IC50  =   AIN­93G  as  the  control  diet  [14]  in  the  laboratory  of  Nutrición  y  Bromatología,  
10,87  ±  1,00  mg/mL).  El  trabajo  mencionado  y  la  mayoría  de  las  publicaciones   Facultad  de  Farmacia  y  Bioquímica,  UBA,  Buenos  Aires,  Argentina).  Amaranth  
antes  referidas  corresponden  a  resultados  de  ensayos  in  vitro,  constituyendo   diet  consisted  in  a  partial  replacement  of  the  protein  source,  casein,  for  the  
una  primera  aproximación  al  estudio  de  bioactividad. amaranth  protein  isolate  (Table  1).  Lactic  casein  (Dilsa,  Lanus,  Argentina),  L­
cystine  (Anedra,  San  Fernando,  Argentina),  soy  oil  (Molinos  Río  de  La  Plata,  
Los  ensayos  in  vivo  y  ex  vivo  proporcionan  un  enfoque  más  cercano  a  la   Victoria,  Argentina),  choline  chloride  (Sigma,  St.  Louis,  MO,  USA),  
evaluación  de  esta  actividad  biológica.  En  este  contexto,  el  objetivo  de  este   microcrystalline  cel  lulose  (Sigma),  dextrin  (Cofem,  Lima,  Perú),  vitamins  and  
trabajo  fue  estudiar  la  potencial  actividad  antitrombótica  de  las  proteínas  de   minerals  were  used  for  diets  preparation.  
semillas  de  amaranto,  evaluando  su  efecto  sobre  la  coagulación  sanguínea  
en  ratas  alimentadas  con  proteínas  de  amaranto.  Este  estudio  realizado  por  
primera  vez  brindará  un  avance  en  el  uso  de  proteínas  de  amaranto  como  
ingredientes  funcionales. Veintidós  ratas  Wistar  macho  se  distribuyeron  en  tres  grupos:  grupo  
Control  (CG),  grupo  Amaranto  (AG)  y  grupo  Heparina  (HG).  CG  ingirió  la  
dieta  control,  mientras  que  AG  se  alimentó  con  la  dieta  de  amaranto  (Cuadro  
Materiales  y  métodos 1).  HG  consumió  la  dieta  control  y  después  de  las  dos  semanas  de  
experimento  se  inyectó  a  los  animales  por  vía  intraperitoneal  250  UI  de  
Preparación  de  Muestras  y  Material  Vegetal heparina  sódica  (Fada  Pharma,  CABA,  Argentina).  Los  alimentos  y  el  agua  
se  suministraron  ad  libitum.
Amaranth  Seeds  Amaranthus  hypochondriacus  (cv  Mercado)  seeds  harvested  
at  Río  Cuarto,  Córdoba,  Argentina.  
Extracción  de  sangre  y  preparación  de  plasma  Una  vez  finalizado  el  período  
Preparación  de  Harina  de  Amaranto  Las  semillas  se  molieron  utilizando  un   de  alimentación,  los  animales  fueron  anestesiados  con  inyecciones  
molino  ciclónico  con  malla  de  1  mm.  La  harina  resultante  se  desengrasó  con   intraperitoneales  de  25  mg/kg  de  pentobarbital  sódico  (Sigma)  y  2,5  mg/kg  de  
n­hexano  (10  g  harina/100  mL  n­hexano)  durante  24  h,  las  cinco  primeras   diazepam  (Klonal,  Quilmes,  Argentina)  e  inmovilizados.  Luego,  se  extrajo  la  
horas  con  agitación  constante  y  luego  contacto  nocturno. sangre  por  canulación  de  la  arteria  aorta  abdominal.

La  sangre  fue  inmediatamente  destinada  a  ensayos  con  hemostatometría.  
Preparación  de  Aislados  de  Proteínas  Los  aislados  de  amaranto  se   Una  alícuota  de  la  sangre  de  los  animales  se  colocó  en  tubos  cónicos  con  
2,5  g/100  mL  de  solución  de  citrato  de  sodio  (1  parte  de  citrato  de  sodio  y  9  
obtuvieron  mediante  la  metodología  previamente  utilizada  en  nuestro  laboratorio  [12].
Brevemente,  la  harina  desgrasada  de  amaranto  se  suspendió  en  agua   partes  de  sangre).  El  plasma  se  separó  de  las  células  sanguíneas  mediante  
destilada  (10  g  de  harina  desgrasada/100  mL),  pH  9,  1  h  de  agitación,   centrifugación  a  2500  ×  g  durante  15  min  a  20  °C  y  se  almacenó  a  ­20  °C  
temperatura  ambiente).  Luego  se  realizó  una  etapa  de  centrifugación  (9000×g,   hasta  su  posterior  análisis.
10  °C,  20  min)  y  el  sobrenadante  se  ajustó  a  pH  5  con
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Tabla  1  Formulación  de  dietas  según
recomendado  por  los  americanos Ingredientes  (g/1000  g  alimento)
Instituto  de  Nutrición,  AIN­93G
Caseína  Amaranto Minerales  L  cistina Soja Colina  Fibra  Dextrina
[14]
aislar aceite

Dieta  de  control 140.0 ­ 35,0 1.8 40,0 7.1 50.0 716.1

(dieta  C)
Dieta  de  amaranto 64.7 89.8 35,0 1.8 39.1 7.1 50.0 702.5

(Una  dieta)

Determinación  de  la  actividad  antitrombótica Pruebas  de  coagulación  Las  pruebas  de  coagulación  se  realizaron  con  kits  
comerciales  de  uso  clínico  (Wiener  Lab.,  Rosario,  Argentina).
Tiempo  de  Sangrado  El  tiempo  de  sangrado  (BT)  es  una  medida  que El  plasma  citrado  utilizado  (relación  sangre:citrato  9:1)  se  obtuvo  a  partir  de  una  
estudia  específicamente  la  hemostasia  primaria.  Las  medidas  se  realizaron   cánula  colocada  en  la  aorta  abdominal  de  las  ratas.
utilizando  el  protocolo  descrito  por  Stenberg  et  al.  [15].  A La  sangre  extraída  se  centrifugó  (2500  ×  g,  15  min,  20  °C)
se  realizó  un  pequeño  corte  en  la  punta  de  la  cola  de  los  animales y  congelada  a  ­20  °C  hasta  su  uso.
mientras  estaba  bajo  anestesia.  Después  de  hacer  la  herida,  se  registró  el  
sangrado  tocando  el  área  de  la  incisión  con  un Prueba  de  tiempo  de  tromboplastina  parcial  activada  (APTT)
°
tira  de  papel  filtro  cada  30  s.  BT  se  definió  como  el  tiempo  necesario  para   Se  incubó  plasma  de  rata  citrado  (100  μL)  durante  1  min  a  37  C.  Se  añadió  el  
detener  por  completo  el  sangrado,  sin  dejar reactivo  APTT  (100  μL)  a  la  mezcla.
manchas  de  sangre  en  el  papel  de  filtro. y  se  incubó  durante  3  min  a  37  °C.  El  tiempo  de  coagulación  se  determinó  
después  de  agregar  100  μ  L  de  CaCl2  25  mM.
Hemostatómetro  Para  estudiar  diferentes  parámetros  de  coagulación
mientras  la  sangre  fluye,  de  forma  dinámica,  se  colocó  un  hemostatómetro Prueba  de  tiempo  de  protrombina  (PT)  Plasma  de  rata  (100  μL)  y  el
hecho  a  la  medida  por  el  Dr.  Gustavo  Rinaldi  en  la  Facultad  de  Ciencias El  reactivo  PT  se  preincubaron  durante  2­3  min  a  37  °C.  Entonces
Médicas  de  la  Universidad  Nacional  de  La  Plata  following  the   el  plasma  se  añadió  al  tubo  que  contenía  200  μL  de  reactivo
detalles  descriptivos  dados  por  varios  autores  [9,  16–18]. Se  registró  el  PT  y  el  tiempo  de  coagulación.
El  principio  de  la  hemostatometría  se  muestra  en  la  Fig.  1.  El
El  hemostatómetro  consiste  en  una  bomba  Harvard  que  infunde  parafina  líquida,   Prueba  de  tiempo  de  trombina  (TT)  Para  determinar  TT,  200  μL
a  un  flujo  constante  (0,2  ml/min),  en  un  recipiente  a  37  °C. de  plasma  de  rata  se  incubaron  2  min  a  37  °C  e  inmediatamente
cámara  termostatizada  donde  la  sangre  no  anticoagulada el  tiempo  de  coagulación  se  determinó  después  de  inducir  la  coagulación  por
previamente  se  colocó  la  muestra  extraída  de  los  animales. añadiendo  200  μL  del  reactivo  TT  2.3  NIH/mL.
La  sangre  es  desplazada  por  la  parafina  líquida,  lo  que  resulta  en  sangre Cada  determinación  se  realizó  por  triplicado.
flujo  a  través  del  tubo  de  polietileno  (di  1,6  mm).  una  presion
el  transductor  registra  los  cambios  de  presión  en  el  sistema  a  lo  largo  del  tiempo Análisis  estadístico
generar  los  hemostatogramas.  Para  mantener  la  base
presión  del  sistema  a  unos  60  mmHg,  el  tubo  de  salida  es Los  resultados  se  evaluaron  estadísticamente  mediante  el  uso  de  análisis  de  varianza.

sumergido  a  la  profundidad  requerida  en  un  tubo  lleno  de  mercurio.
Mientras  fluye  la  sangre,  se  perfora  el  tubo  con  una  aguja  fina.
a  los  90  s  después  de  la  extracción  de  sangre,  lo  que  resulta  en  "sangrado"  de  la
tubo  en  la  solución  salina  tibia  circundante,  lo  que  lleva  a  una  disminución  
abrupta  de  la  presión  inicial  (Fig.  1b).  Eventualmente,  los  fenómenos
tendiendo  a  ocluir  la  lesión  del  tubo  detener  la  hemorragia
debido  a  la  formación  de  plaquetas  tapón  hemostático  en  los  agujeros,
provocando  una  recuperación  de  la  presión  inicial  en  el  sistema  (primero
aumento  de  presión,  Fig.  1b).  Posteriormente,  el  flujo  en  el  tubo
se  detuvo  y  la  presión  aumentó,  lo  que  indica  la  coagulación  total
(segundo  aumento  de  presión,  Fig.  1b).  La  presión  registrada
cambios  reflejaron  tanto  la  formación  del  tapón  plaquetario  como
procesos  de  coagulación.  El  área  de  recuperación  de  presión  se  utilizó  para
evaluar  la  activación  plaquetaria  y  el  tiempo  necesario  para  alcanzar
Se  definió  como  tiempo  de  coagulación  100  mmHg  de  presión.
(ANOVA)  con  la  prueba  post­hoc  de  Tuckey  (α  =  0,05).
Resultados  y  discusión
Se  determinó  la  composición  porcentual  del  aislado  proteico  utilizado  para  la  
elaboración  de  la  dieta  de  amaranto  (Cuadro  1).  El  contenido
de  proteínas,  agua,  cenizas,  carbohidratos  y  fibra  expresada  como
%  (p/p)  fue  71,3  ±  1,5  %  (f  =  5,85),  6,4  ±  0,6  %,  3,6  ±  0,1  %,
9,0  ±  0,8  %,  13,1  ±  0,9  %,  respectivamente.
Durante  el  ensayo  con  animales,  el  consumo  medio  de  alimento  por
rata  por  día  se  calculó  para  los  tres  grupos  control,  amaranto  y  heparina  (Fig.  
2a).  GC  consumido  18,7  ±  2,2  g
dieta/rata/día,  mientras  que  AG  ingirió  18,3  ±  3,1  g  dieta/rata/día,
y  HG  consumió  17,2  ±  1,2  g  de  dieta/rata/día.  Los  resultados  muestran  que
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Figura  1  a.  Esquema  del  
hemostatómetro  utilizado  para  ensayos  ex  
a
sangre  nativa
vivo  con  sangre  de  animales  y  b.  
Hemostatograma  obtenido  con  una  de  las   37°C
ratas.  El  área  de  recuperación  y  el  tiempo  
de  coagulación  se  muestran  en  esta   Transductor  de  presión
figura.

0,2  mm

Aguja
2,0  mm
1,6mm
Parafina

0,2  ml/min  60  
mm  Hg Salino  37  °C
sangre  nativa
Columna  de  Hg

b
120
tiempo  de  coagulación

100

80 Área  de  recuperación

60
Presión  
(mmHg)

40

20

0
Punción

­20
0 100  200  300  400  500  600  700  800

Tiempo  (s)

el  consumo  promedio  de  alimentos  no  presentó  diferencia  significativa  entre  los   sangrado  generado  por  una  lesión  intencional.  Este  parámetro  aumenta  cuando  
grupos,  y  los  valores  fueron  similares  a  los  informados  por  Kalyani  et  al.  [19].  Se   existe  una  deficiencia  o  inhibición  de  las  plaquetas,  alteraciones  en  su  adhesión  
calculó  el  peso  promedio  de  animales/semana  para  los  tres  grupos  (Fig.  2b). al  vaso  sanguíneo  o  alteraciones  en  su  agregación  [22],  fenómenos  todos  ellos  
de  hemostasia  primaria.  La  figura  3a  muestra,  a  modo  de  ejemplo,  tres  tiras  de  
Se  observó  un  ligero  aumento  del  peso  promedio  para  todos  los  grupos  durante   papel  filtro  que  corresponden  a  los  tiempos  de  sangrado  registrados  para  los  tres  
el  ensayo,  variando  entre  300  y  400  g. grupos.  HG  exhibió  el  mayor  tiempo  de  sangrado  (420  s),  seguido  de  AG  (330  s)  
Este  rango  de  peso  es  coincidente  con  los  datos  de  Cossio  Bolaños  et  al.  [20] ,   y  CG  (210  s).  Esta  tendencia  se  observó  en  todas  las  determinaciones  realizadas  
donde  se  evaluaron  las  curvas  de  crecimiento  de  ratas  Wistar.  Los  autores   en  los  grupos  (Fig.  3b).  El  tiempo  medio  de  sangría  fue  de  230  ±  10  s  para  GC,  
encontraron  pesos  promedio  entre  350  y  380  g  para  animales  de  11  a  13  semanas   270  ±  21  s  para  AG  y  360  ±  24,5  s  para  HG.
de  edad.  La  Figura  2b  muestra  aumentos  significativos  de  peso  promedio  al  final  
del  ensayo  en  todos  los  grupos  (Tukey,  α  =  0,05),  lo  que  denota  un  ligero  
crecimiento  de  los  animales,  que  debe  continuar  hasta  la  semana  15  [20] . Aunque  HG  exhibió  un  tiempo  de  sangrado  significativamente  diferente  en  
comparación  con  los  grupos  de  amaranto  y  control,  no  hubo  diferencia  significativa  
entre  GC  y  AG  (Tukey,  α  =  0.05).

Tiempo  de  sangrado Lavelle  y  MacIomhair  [22]  obtuvieron  tiempos  de  sangrado  de  340,9  ±  25,7  s  
en  un  grupo  de  ratas  control,  y  de  551,0  ±  31,8  s  para  un  grupo  de  heparina  (200  
El  tiempo  de  sangrado,  un  ensayo  clínico  ampliamente  utilizado  que  estudia  la   UI/kg  rata).  Ambos  tiempos  fueron  superiores  a  los  detectados  en  este  trabajo.  
actividad  plaquetaria  [21],  se  define  como  el  tiempo  necesario  para  detener  el La  diferencia  puede  deberse  a  la
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Fig.  2  Alimentación  animal.  a. a b
Ingesta  promedio  de  alimentos  por  día  por   25 400 b
abdominales

rata  del  grupo  de  control  (CG),   a
a a
20 a
grupo  de  amaranto  (AG)  y  grupo   300
de  heparina  (HG).  Peso  promedio  por   15 promedio  
Peso  
(g)

semana  de:  b.  grupo  de  control,  c.  grupo   200
amaranto,  y  d.  grupo  de  heparina.  Las   10
barras  de  error  corresponden  al   alimento/
rata.día  
Ingesta  
media  
de  
(g)

100
5
error  estándar  de  la  media.  n  =  5–7  por  
grupo  de  ratas.  Letras  diferentes  sobre  las   0 0
barras  indican  diferencia  significativa  (Tukey,   1 2 3
C.G. AG HG
α  =  0.05)  en  cada  gráfico Semanas

C d
400 b 400
b
a
abdominales

a abdominales

300 300

promedio  
Peso  
(g)
promedio  
Peso  
(g)

200 200

100 100

0 0
1 2 3 1 2 3
Semanas Semanas

hecho  de  que  Lavelle  y  MacIomhair  usaron  ratas  Sprague  Dawley  machos  
y  hembras.  Sin  embargo,  ambos  trabajos  muestran  que  la  heparina  produce  
a 0 tiempos  de  sangrado  más  prolongados.  La  heparina  es  un  anticoagulante  
0
que  inhibe  la  enzima  trombina,  mientras  que  el  tiempo  de  sangrado  está  
0
relacionado  con  la  función  plaquetaria.  Liu  et  al.  [23]  encontraron  tiempos  
de  sangrado  entre  120  y  180  s  para  el  grupo  control,  y  de  400  a  1200  s  
para  ratas  a  las  que  se  les  administró  diferentes  concentraciones  de  un  
fármaco  antiplaquetario  llamado  Prasugrel,  usando  una  sonda  esofágica.  
Dado  que  Prasugrel  inhibe  la  función  plaquetaria,  los  resultados  informados  
por  Liu  et  al.  [23]  no  son  comparables  a  los  obtenidos  en  este  trabajo.
Los  tiempos  de  sangrado  mostrados,  así  como  los  informados  por  
Lavelle  y  MacIomhair  [22],  indican  una  mayor  inhibición  de  la  agregación  
plaquetaria  cuando  los  animales  son  heparinizados.  Otros  autores  
confirmaron  el  hecho  de  que  la  heparina,  reconocida  por  inhibir  las  
210  segundos
330  segundos
420  segundos reacciones  involucradas  en  la  cascada  de  la  coagulación,  genera  

A H prolongaciones  del  tiempo  de  sangrado  [22,  24].  La  heparina  inhibe  la  
C
trombina  y  se  ha  demostrado  que  hay  receptores  de  la  familia  PAR  en  la  
b superficie  de  las  plaquetas  escindidos  y  activados  por  la  trombina,  lo  que  
400 b
sugiere  que  esta  enzima  activa  las  plaquetas  humanas  [25].  Otra  explicación  
a para  este  comportamiento  podría  ser  que  se  corte  una  arteriola  de  la  cola  
300
en  el  método  de  transección  de  la  cola.  La  arteriola  contiene  una  capa  de  
a
músculo  liso  que  causa  vasoconstricción  después  de  una  lesión  [26].  La  
sangrado  
Tiempo  
de  
(s)

200
vasoconstricción  podría  provocar  una  ligera  acumulación  de  sangre  previa  
100 a  su  salida;  por  tanto,  la  hemostasia  secundaria  y  la  inhibición  de  la  
trombina  también  estarían  implicadas  en  el  ensayo.  Según  Fritz  et  al.  [27],  
0 el  amaranto  tiene  un  efecto  vasodilatador  que  podría  contrarrestar  
C.G. AG HG parcialmente  la  vasoconstricción  de  la  lesión.
Fig.  3  Tiempo  de  sangrado  en  ratas.  a.  Registros  reales  correspondientes  a  un  animal  de  cada  
grupo:  control  (C),  amaranto  (A)  y  heparina  (H).  b.  Tiempos  de  sangrado  promedio  por  grupo:   Aunque  los  tiempos  de  sangría  de  AG  no  presentaron  diferencia  
grupo  control  (GC),  grupo  amaranto  (AG)  y  grupo  heparina  (HG).  Las  barras  de  error  
significativa  en  comparación  con  GC,  los  resultados  muestran  una  fuerte  
corresponden  al  error  estándar  de  la  media.  n  =  5–7  por  grupo  de  ratas.  Letras  diferentes  sobre  
las  barras  indican  diferencia  significativa  (Tukey,  α  =  0.05)
tendencia,  sugiriendo  que  las  proteínas  de  amaranto  están  involucradas  en  
la  inhibición  de  la  formación  del  tapón  plaquetario.
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Alimentos  vegetales  Hum  Nutr

hemostatómetro aislado  incorporado  en  la  dieta  (9  %,  p/p),  ingerido,  digerido  y  
absorbido  en  el  intestino,  contiene  compuestos  bioactivos  que  
A  cada  animal  se  le  entregó  un  hemostatograma  (Fig.  1b)  y  se   afectan  el  comportamiento  de  la  sangre  extraída.  Sin  embargo,  no  
obtuvieron  parámetros  relacionados  con  el  proceso  de  coagulación.   se  puede  descartar  un  efecto  sinérgico  entre  la  caseína  y  las  
El  área  de  recuperación  (Fig.  4A)  corresponde  al  área  encerrada   proteínas  del  amaranto,  ya  que  se  han  descrito  péptidos  liberados  
entre  el  registro  y  un  trazado  de  línea  base  desde  el  tiempo  cero,   de  la  к­caseína  capaces  de  inhibir  la  agregación  plaquetaria,  debido  
cuando  se  realizó  la  perforación  del  tubo  (Fig.  1),  hasta  el  momento   a  las  homologías  de  secuencia  que  existen  en  la  cadena  γ  del  
en  que  la  presión  inicial  del  se  alcanzó  el  sistema  (60  mmHg).  Este   fibrinógeno  y  la  к­caseína  [29] . .  Por  lo  tanto,  la  dieta  control  puede  
parámetro  está  asociado  a  la  formación  del  tapón  plaquetario,  lo   ejercer  una  actividad  antitrombótica  sobre  los  animales  GC,  efecto  
que  genera  el  cese  del  'sangrado'  del  tubo  al  cerrar  el  orificio  y   ya  demostrado  en  humanos  [30].
provoca  un  aumento  de  la  presión  del  sistema.  El  tiempo  de   El  parámetro  del  tiempo  de  coagulación  está  asociado  a  la  
coagulación  (Fig.  4B)  se  define  como  el  tiempo  necesario  para   hemostasia  secundaria,  donde  se  generan  monómeros  de  fibrina  a  
alcanzar  los  100  mmHg  de  presión  en  el  hemostatómetro,  momento   partir  del  fibrinógeno  por  acción  de  la  enzima  trombina  para  alcanzar  
en  el  que  se  observa  bloqueo  total  del  flujo  sanguíneo. la  coagulación  total  de  la  sangre.  El  HG  presentó  el  mayor  tiempo  
de  coagulación  (828,5  ±  46,8  s),  comportamiento  esperable  debido  
El  área  de  recuperación  promedio  de  los  animales  AG  resultó   a  que  la  heparina  es  un  anticoagulante  muy  utilizado,  ya  que  inhibe  
significativamente  mayor  en  comparación  con  CG  (Fig.  4A),  mientras   la  trombina  (fig.  4B) .  El  tiempo  de  coagulación  del  AG  fue  de  612,1  
que  no  se  observaron  diferencias  significativas  entre  AG  y  HG.  Los   ±  32,4  s,  mientras  que  el  GC  presentó  el  valor  más  bajo,  330,9  ±  
resultados  indican  que  la  inclusión  de  aislado  de  amaranto  en  la  dieta 49,5  s  (fig.  4B).  Los  tres  tiempos  promedio  de  coagulación  fueron  
provocó  un  aumento  de  este  parámetro,  similar  al  generado  por  el   significativamente  diferentes  (Tukey,  α  =  0,05).
uso  de  un  anticoagulante  (heparina). Satake  et  al.  [18]  encontraron  diferencias  entre  los  tiempos  de  
Las  áreas  de  recuperación  de  hemostatogramas  han  sido   coagulación  del  grupo  control  de  animales  y  el  grupo  al  que  se  
informadas  por  diferentes  autores.  Shimizu  et  al.  [9]  obtuvieron   administró  los  extractos  de  Centella  asiática  más  activos  (500  y  600–
valores  del  área  de  recuperación  de  5000  a  7000  mmHg/s  para   750  s,  respectivamente).  Cuando  las  muestras  potencialmente  
sangre  de  rata  de  control,  y  valores  entre  10  000  y  12  000  mmHg/s   antitrombóticas  se  mezclaron  con  la  sangre,  no  se  detectaron  
cuando  se  analizó  sangre  mezclada  con  un  hidrolizado  de  proteína   diferencias  en  comparación  con  los  controles  [9,  28].
de  músculo  de  cerdo.  Otros  autores  [28]  reportaron  valores  del  área  
de  recuperación  en  un  rango  de  7500–10,000  mmHg/s  con  sangre   Pruebas  de  coagulación

de  rata  control,  y  15000–45000  mmHg.s  con  sangre  mezclada  con  
extractos  de  tomate  en  una  relación  9:1  (sangre:extracto).  Satake   El  tiempo  de  trombina  (TT)  estudia  la  fase  de  fibrinoformación  ya  
et  al.  [18]  obtuvieron  áreas  de  aproximadamente  5000  mmHg/s   que  mide  el  tiempo  de  coagulación  de  un  plasma  citrado  en  presencia  
cuando  se  estudió  sangre  de  ratas  control,  y  áreas  de  7500  mmHg/ de  trombina;  el  tiempo  de  protrombina  (PT)  detecta  alteraciones  de  
s  cuando  analizaron  sangre  de  ratas  a  las  que  se  les  administró   los  factores  de  la  vía  extrínseca  ya  que  registra  el  tiempo  de  
extractos  purificados  de  Centella  asiática  a  través  de  una  sonda   coagulación  de  un  plasma  citrado  en  presencia  de  tromboplastina  
intragástrica  oral.  Los  valores  del  área  de  recuperación  obtenidos   y  Ca+2;  El  tiempo  de  tromboplastina  parcial  activada  (APTT)  detecta  
en  este  trabajo  (CG:  6422  ±  1208  mmHg/s)  resultaron  comparables   cambios  en  los  componentes  de  la  vía  intrínseca  y  consiste  en  la  
a  los  informados  en  la  bibliografía  para  sangre  de  ratas  control  y   medición  del  tiempo  de  coagulación  de  un  plasma  citrado  en  
valores  superiores  cuando  se  estudió  sangre  de  ratas  alimentadas   presencia  de  componentes  de  fosfolípidos  de  tromboplastina  
con  dieta  de  amaranto  (AG:  13,618  ±  1,454  mmHg.s).  Los  resultados  sugieren  
que  la  proteína  
(tromboplastina   de  aumaranto
parcial),   n  activador  y  Ca+2 .

A B1000  _
20000 C

b 800
15000 b
b
coagulación  
Tiempo  
de  
(s)
600
10000
a a
recuperación  
(mmHg.s)
Área  
de  
400

5000
200

0 0
C.G. AG HG C.G. AG HG

Fig.  4  Parámetros  obtenidos  de  hemostatogramas.  A  Áreas  de  recuperación  promedio  por   grupo  amaranto  (AG)  y  grupo  heparina  (HG).  Las  barras  de  error  corresponden  al  error  estándar  
grupo:  grupo  control  (GC),  grupo  amaranto  (AG)  y  grupo  heparina  (HG).  B  Tiempos  de   de  la  media.  n  =  5–7  por  grupo  de  ratas.  Letras  diferentes  sobre  las  barras  indican  diferencia  
coagulación  promedio  por  grupo:  grupo  de  control  (GC), significativa  (Tukey,  α  =  0.05)
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Alimentos  vegetales  Hum  Nutr

Las  ratas  han  sido  un  modelo  animal  ampliamente  utilizado  en  los  últimos
años  para  estudiar  diferentes  parámetros  de  coagulación  [31–36],  mostrando
gran  variabilidad  en  los  resultados  dependiendo  especialmente  de  los  kits
y  ratas  usadas.  Valores  de  PT,  APTT  y  TT  obtenidos  con  CG
el  plasma  de  los  animales  en  este  trabajo  se  muestra  en  la  Tabla  2.
El  TT  presentó  un  aumento  significativo  de  HG  (Tukey,
α  =  0,05),  este  era  un  resultado  esperado  ya  que  la  heparina  inhibe
específicamente  la  enzima  trombina.  Este  TT  es  similar  a  ese
informado  en  el  trabajo  de  Prezoto  et  al.  [32]  donde  el  plasma  de
ratas  heparinizadas  (300  UI/Kg)  fue  mayor  en  comparación  con  el  TT
registrado  al  analizar  el  plasma  de  las  ratas  de  control.  Plasma
de  AG  también  presentó  un  incremento  en  el  TT  (Tukey,
α  =  0.05),  sin  embargo  este  incremento  no  fue  comparable  al
detectado  en  el  HG.  TT  de  AG  mostró  un  incremento  del  17  %
en  comparación  con  animales  del  GC;  mayor  extensión  que  esa
informado  por  You  et  al.  [34],  que  estudiaron  el  efecto  de  la
enzima  batroxobin,  del  veneno  de  Bothrops  atrox
moojeni,  mezclándolo  directamente  con  el  plasma  de  los  animales,  mientras  que
Cho  y  Choi  [33]  reportaron  una  duplicación  del  TT  en  ratas  que
recibió  una  inyección  intravenosa  de  una  proteasa  de  Spirodela
poliriza.  Debe  tenerse  en  cuenta  que  la  sustancia  bioactiva  estudiada  por  estos  
autores  fue  administrada
de  manera  más  directa,  mientras  que  en  el  presente  estudio  el  amaranto
proteínas  fueron  ingeridas  por  los  animales.
Los  APTT  detallados  en  la  Tabla  2  de  animales  HG  y  AG
presentaron  diferencias  significativas  entre  ellos,  y  también  en  comparación   sangre  fluye  y  las  plaquetas,  así  como  los  factores  séricos
con  los  obtenidos  cuando  se  estudió  el  plasma  GC
(Tukey,  α  =  0,05);  los  valores  de  HG  se  correlacionan  favorablemente  con
Prezoto  et  al.  [32].  En  nuestros  experimentos  APTT  mostró  un  14  %
incremento  sobre  CG,  y  aunque  fue  un  aumento  significativo,  fue  ligeramente   el  hecho  de  que  el  método  de  la  cola  de  corte  implica  el  corte  de  un
inferior  en  comparación  con  los  valores  formados  por  Cho  y  Choi  [33],  donde   arteriola  de  irrigación;  en  los  demás  ensayos,  ex  vivo  e  in  vitro,  la
los  resultados  de  APTT  se  duplicaron
cuando  el  plasma  de  animales  inyectados  con  la  proteasa
Se  analizó  Spirodela  polyrhiza.
El  PT  de  ratas  AG  presentado  en  la  Tabla  2  no  mostró
diferencia  significativa  (Tukey,  α  =  0.05)  en  comparación  con  GC,
mientras  que  PT  de  HG  resultó  significativamente  diferente.  Estos  datos
es  consistente  con  lo  informado  por  Prezoto  et  al.  [32].
Los  datos  de  las  pruebas  de  coagulación  presentados  indicarían  que  los   Conclusiones
péptidos  del  amaranto,  liberados  durante  la  digestión  de  las  proteínas,
alterar  de  alguna  manera  la  vía  común  de  la  coagulación  (fibrina
fase  de  formación),  y  también  podría  generar  cambios  a  lo  largo  del
camino  intrínseco.  Los  resultados  confirmarían  la  inhibición
efectos  de  coagulación  de  los  péptidos  de  amaranto  debido  a  un  aumento  en
el  tiempo  de  formación  del  coágulo  de  los  animales  AG  en  comparación  con  CG,
sin  embargo,  los  efectos  de  la  agregación  plaquetaria  no  pueden  descartarse  
de  acuerdo  con  los  hallazgos  del  área  de  recuperación  y  el  tiempo  de  sangrado.
Estudios  recientes  en  nuestro  laboratorio  confirmaron  los  efectos  antitrombóticos  
de  los  hidrolizados  de  proteína  de  amaranto  obtenidos  realizando  un
método  de  digestión  gastrointestinal  simulada  (resultados  no  mostrados)  y  con  
proteasas  comerciales  usando  el  método  in  vitro
método  de  microplacas  [8­11].
En  conclusión,  basándonos  en  estudios  in  vitro,  in  vivo  y  ex  vivo,  nuestro  
trabajo  sugiere  la  presencia  de  péptidos  bioactivos
encriptado  en  proteínas  de  amaranto.  Los  péptidos,  liberados  de
sus  proteínas  durante  la  digestión  gastrointestinal,  podría  ejercer  un  efecto  
antiplaquetario  o  anticoagulante,  lo  que  confirma  la
hecho  de  que  las  proteínas  del  amaranto  tienen  una  posible  aplicación  como
muestra  antitrombótica.  Cabe  destacar  que  el  aislado  de  proteína  se  administró  
incorporándolo  a  la  dieta  de
los  animales,  lo  que  implica  que  los  péptidos  activos  liberados
durante  la  digestión  se  absorbían  en  el  intestino  y  pasaban
a  través  del  sistema  circulatorio  para  ejercer  su  efecto  antitrombótico.
Otros  autores  informaron  que  los  hidrolizados  de  amaranto  generaron  la  
vasodilatación  del  músculo  liso  aórtico  aislado  [28].
La  vasodilatación  es  un  fenómeno  que  afecta  colateralmente
los  eventos  circulatorios  obstructivos.  Cuando  la  vasoconstricción  disminuye,  la  
se  moverá  más  libremente  que  cuando  los  vasos  están  contraídos.
El  potencial  efecto  vasodilatador  de  las  proteínas  de  amaranto  podría
tener  un  impacto  en  este  trabajo  solo  en  el  tiempo  de  sangría,  debido  a
la  actividad  del  músculo  liso  no  mostró  efecto.  A  pesar  de
nuestros  hallazgos  indicaron  que  el  tiempo  de  sangrado  de  AG  no
presentan  diferencia  significativa  en  comparación  con  GC,  una  tendencia
se  observa  y  el  efecto  de  vasodilatación  informado  por  Fritz
et  al.  [27]  no  se  puede  descartar.
Nuestros  hallazgos  sugieren  que  las  proteínas  de  amaranto  contienen
péptidos  que,  una  vez  liberados  por  la  digestión  gastrointestinal,  son
capaz  de  realizar  un  efecto  antiplaquetario  y/o  anticoagulante.  En

Tabla  2  Pruebas  de  coagulación  realizadas
Tiempo  de  protrombina tiempo  de  trombina Tromboplastina  parcial  activada
con  el  plasma  de  ratas  que
dieta  de  control  consumida  (Grupo  C tiempo  (TTPA,  s)
(PT,  s) (TT,  págs.)

y  Grupo  H)  y  dieta  de  amaranto
(Grupo  A) Grupo  C 20,6  ±  2,3a 96,4  ±  4,3a   43,3  ±  2,9a

Grupo  A 22,6  ±  2,0a   113,1  ±  5,6b 49,4  ±  6,0b

Grupo  H 36,3  ±  11,0b >  600c 89,8  ±  8,0c

Diferente  letra  en  superíndice  en  una  misma  columna  correspondió  a  diferentes  valores  (Tukey,  α  =  0.05)
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Alimentos  vegetales  Hum  Nutr

En  los  ensayos  ex  vivo,  el  efecto  antiplaquetario  se  observó  al   Péptidos  bioactivos  en  semilla  de  amaranto  (Amaranthus  hypochondriacus).  J  
Agric  Food  Chem  56:1233–1240  7.  Orsini  Thin  
analizar  el  área  de  recuperación,  asociada  a  la  fase  de  formación  
MC,  Galleano  M,  Year  MC,  Tironi  VA.
del  tapón  plaquetario,  mostrando  diferencias  significativas  entre  
Péptidos  de  amaranto  de  digestión  gastrointestinal  simulada:  actividad  
AG  y  GC  (13.618  ±  1.454  y  6.422  ±  1.208  mmHg/s,  respectivamente) .   antioxidante  contra  especies  reactivas.  Alimentos  vegetales  Hum  Nutr  70:27–  34
El  efecto  anticoagulante  se  detectó  en  los  valores  del  tiempo  de  
coagulación,  donde  el  tiempo  de  coagulación  AG  resultó  mayor  que   8.  Sabbione  AC,  Scilingo  A,  Añón  MC  (2015)  Potencial  actividad  antitrombótica  
detectada  en  proteínas  de  amaranto  y  sus  hidrolizados.
el  GC  (612,1  ±  32,4  y  330,9  ±  49,5  s  respectivamente).  Este   LWT  Food  Sci  Technol  60:  171–177
parámetro,  asociado  con  la  cascada  de  la  coagulación,  sugiere  que   9.  Shimizu  M,  Sawashita  N,  Morimatsu  F,  Ichikawa  J,  Taguchi  Y,  Ijiri  Y,  Yamamoto  J  
las  proteínas  del  amaranto  tienen  efectos  inhibitorios  sobre  la  fase   (2009)  Péptidos  hidrolizados  de  papaína  antitrombótica  aislados  de  carne  de  

de  coagulación  de  la  hemostasia.  Este  resultado  se  correlaciona   cerdo.  Thromb  Res  123:753–757  10.  Zhang  SB,  Wang  Z,  Xu  
SY  (2008)  Actividades  antioxidantes  y  antitrombóticas  de  los  péptidos  de  colza.  J  Am  
con  los  obtenidos  con  los  resultados  del  ensayo  in  vitro  informados  
Oil  Chem  Soc  85:521–527  11.  Yang  WG,  Wang  Z,  Xu  SY  (2007)  Un  nuevo  
por  Sabbione  et  al.  [8]  y  con  las  pruebas  de  coagulación  realizadas,   método  para  la  determinación  de  la  actividad  antitrombótica  del  hidrolizado  de  proteína  
donde  se  observaron  aumentos  significativos  de  la  formación  de   de  clara  de  huevo  mediante  un  lector  de  microplacas.  Chin  Chem  Lett  18:449–

coágulos  para  el  ensayo  TT  con  el  plasma  de  los  animales   451  12.  Martínez  NE,  Añón  MC  (1996)  Composición  y  
caracterización  estructural  de  aislados  de  proteínas  de  amaranto.  Un  estudio  
alimentados  con  la  dieta  de  amaranto.  Aunque  el  tiempo  de  
electroforético  y  calorimétrico  J  Agric  Food  Chem  44:2523–2530  13.  Paredes­
sangrado  en  el  ensayo  in  vivo  no  mostró  diferencias  significativas   López  O  (1994)  Amaranto:  biología,  química  y  tecnología
entre  AG  y  CG,  los  resultados  apoyan  la  idea  de  que  las  proteínas  
de  amaranto  ejercen  actividad  antitrombótica.  En  este  sentido,   nología  CRC  Press,  Boca  Ratón,  Florida
14.  Reeves  PG,  Nielses  FH,  Fahey  GC  (1993)  Dietas  purificadas  AIN­93  para  roedores  
parece  probable  confirmar  que  las  proteínas  del  amaranto  son  un  potencial  agente  antitrombótico.
de  laboratorio:  informe  final  del  comité  de  redacción  ad  hoc  del  Instituto  Americano  
de  Nutrición  sobre  la  reformulación  de  la  dieta  para  roedores  AIN­76A.  J  Nutr  
123:  1939–1951
Agradecimientos  Este  trabajo  fue  apoyado  por  PIP  11220110101109.
También  queremos  agradecer  a  Mariana  M.  González  de  la  Facultad  de  Ciencias   15.  Stenberg  PE,  Barrie  RJ,  Pestina  TI,  Steward  SA,  Arnold  JT,  Murti  AK,  Hutson  NK,  
Jackson  CW  (1998)  Tiempo  de  sangrado  prolongado  con  formación  defectuosa  
Exactas,  por  ayudarnos  durante  la  realización  de  las  pruebas  de  coagulación.
de  filopodios  plaquetarios  en  la  rata  wistar  Furth.  Sangre  91:  1599–1608

Cumplimiento  de  Normas  Éticas 16.  Görög  P,  Ahmed  A  (1984)  Hemostatómetro:  una  nueva  técnica  in  vitro  para  evaluar  
la  actividad  hemostática  en  sangre.  Tromb  Res  34:  341–357
Conflicto  de  intereses  Los  autores  AC  Sabbione,  G.  Rinaldi,  MC  Añón  y  A.  Scilingo  
declaran  no  tener  ningún  conflicto  de  intereses. 17.  Yamada  K,  Naemura  A,  Sawashita  N,  Noguchi  Y,  Yamamoto  J  (2004)  Una  variedad  
de  cebolla  tiene  un  efecto  antitrombótico  natural  según  lo  evaluado  por  modelos  
Aprobación  ética  Todos  los  procedimientos  experimentales  se  realizaron  de  acuerdo  con   de  trombosis/trombolisis  en  roedores.  Thromb  Res  114:213–220  18.  Satake  T,  
las  normas  éticas  aprobadas  por  el  Comité  de  Ética  de  la  Facultad  de  Ciencias  Médicas   Kamiya  K,  An  Y,  
de  la  Universidad  Nacional  de  La  Plata,  CICUAL.  Se  hicieron  todos  los  esfuerzos  para   Oishi  Nee  Taka  T,  Yamamoto  J  (2007)
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