“Año 

de la universalización de la salud”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE
HUANCAVELICA
(Creada por Ley N° 25265)

ESCUELA DE POSGRADO

TESIS

“BIODEGRADACIÓN DE CIANURO A PARTIR DE

MICROORGANISMOS AISLADOS DE AGUAS
RESIDUALES. DREN 4000 - LAMBAYEQUE”

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: GESTIÓN DE LA SEGURIDAD,

SALUD Y MEDIO AMBIENTE EN MINERÍA

PRESENTADO POR:
Bach. GARAY FLORES, JOSÉ ANTONIO

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN:

GESTIÓN DE LA SEGURIDAD, SALUD Y MEDIO AMBIENTE EN
MINERÍA.

HUANCAVELICA – PERU
2020
 DEDICATORIA

El presente trabajo es dedicado a mi familia, a mi esposa y a mis hijos

quienes han sido parte fundamental para desarrollar este proyecto, ellos son
quienes me dieron grandes enseñanzas y los principales protagonistas de
este “sueño alcanzado”.

ii
 AGRADECIMIENTOS

Al:

Doctor Amadeo Enríquez Donaires, por el asesoramiento y apoyo

incondicional durante el proceso de ejecución de la tesis.

La Universidad Nacional de Huancavelica (UNH) y a la Cámara minera del

Perú (CAMIPER) por brindarme las facilidades para la culminación de la
tesis.

iii
 RESUMEN

Actualmente los residuos líquidos industriales sin tratamiento vertidos a la

naturaleza sobrepasan la capacidad de autorecuperación de las aguas
alterando sus características y provocando una eminente contaminación
ambiental. Entre los residuos que generan mayor impacto ambiental están
los llamados no biodegradables o persistentes como el cianuro que puede
destruir ecosistemas y afecta a la salud de la población.
La presente investigación fue realizada con los objetivos de aislar
microorganismos degradadores de cianuro a partir de aguas residuales
procedentes del Dren 4000 de Lambayeque, seleccionar los
microorganismos degradadores de cianuro según su adaptación a
concentraciones crecientes de cianuro, determinar el efecto de la
concentración de sustrato, agitación y tiempo en la biodegradación de
cianuro en laboratorio.
A partir de 35 muestras de aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque
se obtuvieron 97 aislamientos de microorganismos degradadores de cianuro,
de los que el 59% fue identificado como hongos filamentosos y el 41% como
bacterias.
Aspergillus flavus, mostró crecimiento en concentraciones crecientes de
cianuro de hasta 2 400 ppm. En la determinación del efecto de la

concentración de sustrato, agitación y tiempo de biodegradación de cianuro

en laboratorio: La concentración 800 ppm de cianuro, 150 rpm durante 72

horas permitieron alcanzar el valor mayor (91,47%) de eficiencia en la

degradación de cianuro por Aspergillus flavus.

Palabras clave: Residuos líquidos industriales, microorganismos, cianuro,

biodegradación.

iv
 ABSTRACT
Currently, untreated liquid industrial waste discharged into nature surpasses
the self-recovery capacity of water, altering its characteristics and causing
eminent environmental pollution. Among the wastes that generate the
greatest environmental impact are the so-called non-biodegradable or
persistent ones such as cyanide, which can destroy ecosystems and affect
the health of the population.

This research was carried out with the objectives of isolating cyanide-
degrading microorganisms from wastewater from the Drain 4000 of
Lambayeque, selecting cyanide-degrading microorganisms according to their
adaptation to increasing concentrations of cyanide, determining the effect of
substrate concentration, agitation and time in the biodegradation of cyanide
in the laboratory.

From 35 samples of wastewater from the Drain 4000 in Lambayeque, 97

isolates of cyanide degrading microorganisms were obtained, of which 59%
were identified as filamentous fungi and 41% as bacteria.

Aspergillus flavus, showed growth in increasing concentrations of cyanide up

to 2400 ppm. In determining the effect of the substrate concentration,
agitation and biodegradation time of cyanide in the laboratory: The 800 ppm
concentration of cyanide, 150 rpm for 72 hours allowed reaching the highest
value (91.47%) of efficiency in the degradation of cyanide by Aspergillus
flavus.

Keywords: Industrial liquid waste, microorganisms, cyanide, biodegradation.

v
 INDICE GENERAL

DEDICATORIA.................................................................................................ii
AGRADECIMIENTOS......................................................................................iii
RESUMEN.......................................................................................................iv
ABSTRACT.......................................................................................................v
INDICE GENERAL...........................................................................................vi
INDICE DE TABLAS........................................................................................ix
INDICE DE FIGURAS......................................................................................xi
INTRODUCCIÓN............................................................................................xii
CAPÍTULO I......................................................................................................1
EL PROBLEMA................................................................................................1
1.1. Planteamiento del problema...............................................................1
1.2. Formulación del problema..................................................................4
1.2.1. Problema general.........................................................................4
1.2.2. Problemas específicos.................................................................4
1.3. Objetivos de la investigación..............................................................4
1.3.1. Objetivo general...........................................................................4
1.3.2. Objetivos específicos....................................................................4
1.4. Justificación e importancia..................................................................5
1.4.1. Justificación del estudio...............................................................5
1.4.2. Factibilidad del Proyecto..............................................................5
CAPÍTULO II.....................................................................................................7
MARCO TEÓRICO...........................................................................................7
2.1. Antecedentes de investigación..............................................................7
2.1.1. Antecedentes internacionales.........................................................7
2.1.2. Antecedentes nacionales................................................................8
2.2. Bases teóricas........................................................................................9
2.2.1 El cianuro..........................................................................................9

vi
 2.2.3 El cianuro en solución.....................................................................11
2.2.4 Fuentes del cianuro: El carbono y el nitrógeno............................11
2.2.5 Fuentes naturales La síntesis biológica de cianuro (cianogénesis)
.................................................................................................................12
2.2.6 Fuentes antropogénicas.................................................................13
2.2.7. Toxicidad del cianuro.....................................................................13
2.2.8 Degradación del cianuro en el ambiente........................................15
2.3. Definición de términos.........................................................................17
2.4. Formulación de hipótesis.....................................................................19
2.4.1. Hipótesis general...........................................................................19
2.4.2. Hipótesis específico.......................................................................19
2.5. Identificación de variables....................................................................19
2.5.1 Variables independientes...............................................................19
2.6. Operacionalización de variables..........................................................20
CAPÍTULO III..................................................................................................22
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN....................................................22
3.1. Tipo de investigación...........................................................................22
3.2. Nivel de investigación..........................................................................22
3.3. Método de investigación......................................................................23
3.4. Diseño de investigación.......................................................................23
3.5. Población, muestra y muestreo...........................................................24
3.5.1 Población........................................................................................24
3.5.2 Muestra..............................................................................................24
3.5.3 Muestreo.........................................................................................24
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos...............................25
3.6.1 Obtención y procesamiento de las muestras de aguas residuales25
3.6.2 Acondicionamiento de biorreactores tipo tanque, batch con flujo de
aire descendente.....................................................................................25
3.6.3 Enriquecimiento de las muestras de aguas residuales................26
3.6.4 Aislamiento de microorganismos degradadores de cianuro..........26
3.6.5. Adaptación de los microorganismos degradadores a
concentraciones crecientes de cianuro...................................................27
3.6.6. Identificación del microorganismo degradador de cianuro
seleccionado............................................................................................27

vii
 3.6.7 Diseño Experimental.......................................................................28
3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos..................................28
CAPITULO IV.................................................................................................30
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS...........................................................30
4.1. Presentación e interpretación de datos...............................................30
4.1.2 Zona de muestreo...........................................................................30
4.1.3 Microorganismos nativos degradadores de cianuro aislados de
aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque...................................34
4.1.4 Microorganismos adaptados a concentraciones crecientes de
cianuro.....................................................................................................36
4.1.5 Microorganismo degradador de cianuro seleccionado e identificado
.................................................................................................................37
4.1.6 Efecto de la concentración de sustrato, tiempo de incubación y
velocidad de agitación en la degradación de cianuro por Aspergillus
flavus........................................................................................................38
4.2 Proceso de prueba de hipótesis...........................................................41
4.3 Discusión de resultados........................................................................45
CONCLUSIONES...........................................................................................51
RECOMENDACIONES..................................................................................52
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................53
ANEXOS.........................................................................................................58

viii
 INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Operacionalización de variables……………………………………...21

Tabla 2. Diseño Factorial (3x3x3) en DCA para determinar el efecto de

concentración de sustrato, velocidad de agitación y tiempo en la
biodegradación en laboratorio…………………………………………………...23

Tabla 3. Puntos de ubicación de las muestras del Dren 4000 de

Lambayeque
………………………………………………………………………………………33

Tabla 4. Cultivos puros de hongos filamentosos degradadores de cianuro

aislados de aguas residuales, Lambayeque………………..
…………………..34

Tabla 5. Cultivos puros de bacterias degradadores de cianuro aislados de

aguas residuales. Lambayeque…………………………………………….……
35

Tabla 6. Frecuencia de microrganismos aislados del Dren 4000 de

Lambayeque……………………………………………………………………....35

Tabla 7. Cianuro degradado (ppm) y eficiencia (%) de la degradación por

Aspergillus flavus - CLAMH26 en laboratorio por efecto de diferentes
concentraciones de sustrato, tiempo de incubación y velocidad de
agitación…………………………………………………………………………....40

Tabla 8. Análisis de varianza de los valores promedios de la eficiencia (%)

de la degradación de cianuro por Aspergillus flavus - CLAMH26 en
laboratorio por efecto de diferentes concentraciones de sustrato, tiempo de

ix
incubación y velocidad de
agitación…………………………………………………………….41

Tabla 9. Prueba discriminatoria de Tukey (  =0,05) para los valores

promedios de la eficiencia (%) de la degradación de diferentes
concentraciones de cianuro por Aspergillus flavus - CLAMH26 (ppm)
……………………………..42

Tabla 10. Prueba discriminatoria de Tukey ( =0,05) para los valores

promedios de la biodegradación de cianuro por Aspergillus flavus -
CHLAMH26 por efecto de diferentes tiempos de incubación (horas)
………..42

Tabla 11. Prueba discriminatoria de Tukey ( =0,05) para los valores

promedios de la eficiencia (%) de la degradación de cianuro por Aspergillus
flavus - CLAMH26 por efecto de diferentes velocidades de agitación (rpm)
……………………………………………………………………….……….43

Tabla 12. Prueba discriminatoria de Tukey (  =0,05) para la eficiencia de la

degradación de Cianuro por Aspergillus flavus - CLAMH26 por efecto de
diferentes concentraciones de cianuro de sodio (ppm), velocidades de
agitación (rpm) y tiempos (horas)…………………………….…………………44

x
 INDICE DE FIGURAS

Figura 1: Procesos de degradación de los compuestos cianurados.….......16

Figura 2. Toma de muestra de agua residual del Dren 4000 de Lambayeque

……………………………………………………………………………..............31

Figura 3. Puntos de ubicación de la toma de muestras de las aguas

residuales del Dren 4000 de Lambayeque, en coordenadas UTM
……………………..32

Figura 4. Frecuencia de microorganismos degradadores de cianuro aislados

de aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque…………………………36

Figura 5. Porcentaje de hongos filamentosos y bacterias que presentaron

crecimiento en concentraciones crecientes de cianuro………………………37

Figura 6. Aspergillus flavus - CLAMH26 degradador de cianuro aislado de

aguas residuales en el Dren 4000 de Lambayeque…………………………..38

xi
 INTRODUCCIÓN

Actualmente, los desechos del cianuro son tratados por métodos

químicos muy eficientes y con buenos resultados. Sin embargo, la búsqueda
de tecnologías correctivas biológicas para degradar el cianuro, que no
generen productos tóxicos y que sean menos impactantes para el ambiente,
ha impulsado las investigaciones para sustituir los métodos convencionales
como son la adsorción, la conversión química y el tratamiento electrolítico.
Estos son costosos y corrosivos, además de que generan desechos que a
veces son más contaminantes que los iniciales.
La biodegradación de cianuro por microorganismos causa un
impacto menos negativo en el medio ambiente ya que está basada en la
acción de microorganismos autóctonos y modificaciones ambientales de
gran sencillez, como la aplicación de nutrientes y la aireación.
Por ser el cianuro biodegradable, sus desechos pueden ser
tratados por biodegradación, ya que la colonización y crecimiento de los
microorganismos no será inhibida por altas concentraciones.

El presente trabajo de investigación tiene por objetivo aislar e

identificar microorganismos de las aguas residuales del Dren 4000 de
Lambayeque con capacidad de biodegradación de cianuro, para el cual se
realizó pruebas en laboratorio para determinar cuales tienen la mejor
capacidad de biodegradación del cianuro.

La Hipótesis planteada fue: Existen microorganismos de las aguas

residuales del Dren 4000 de Lambayeque con capacidad de biodegradación
de cianuro.

xii
 CAPÍTULO I
EL PROBLEMA

1.1. Planteamiento del problema

Actualmente los residuos líquidos industriales sin tratamiento

vertidos a cuerpos acuáticos sobrepasan la capacidad de
autorecuperación de las aguas alterando sus características y
provocando una eminente contaminación ambiental.

Entre los procesos que utilizan grandes cantidades de cianuro

están el de recuperación de metales preciosos como el oro y la plata
a partir de yacimientos formados por rocas intrusitas de vetas de

1
cuarzo, el proceso de galvanoplastia de la industria de recubrimientos
metálicos que deposita una capa de zinc sobre las piezas metálicas,
la producción de químicos orgánicos como el nitrilo, el nylon, los
plásticos, la producción de goma sintética y el endurecimiento del
acero.

Las industrias responsables evacuan efluentes conteniendo

cianuro libre y complejos con metales pesados en concentraciones de
50 a 2000 ppm (Logsdo et al., 2003). Los cianuros en cantidades de
0,02 mg/L de HCN (ácido cianhídrico) y 0,2 mg/L como cianuro tienen
efectos nocivos para animales como los peces y son letales para
humanos y animales terrestres en cantidades de 1,0 mg/k y 9,0 mg/k
de peso vivo respectivamente. Los cianuros inhiben la actividad del
sistema respiratorio no permitiendo la utilización del oxígeno por las
células de los tejidos. Sin embargo, debido a que los efluentes
industriales contienen distintas formas de cianuro algunas de ellas
son demasiado tóxicas para los microorganismos, la biodegradación
muchas veces no se puede llevar a cabo en óptimas condiciones.

En nuestro país, hace poco más de dos décadas, el cianuro de

sodio (NACN), era empleado por unas treinta plantas de cianuración
en la recuperación del oro. En 1994 el Ministerio de Energía y Minas
calculó un incremento de 165%, entre 1995 y fines de siglo, en la
aplicación de procesos de cianuración (Perú, MINEN, 1996).

El Dren 4000, se localiza al norte de la Caleta Santa Rosa

(06°52´ S – 79°55´ W), en el litoral de Lambayeque (6°22´- 7°10´ S),
el cual es parte del sistema de drenes de la cuenca Chancay –
Lambayeque. Su cauce recibe aguas que son utilizadas en el riego
agrícola, pero a él también son arrojados desechos industriales
procedentes de 4 destilerías, restos orgánicos procedentes de un
canal aledaño, aguas servidas de la laguna de estabilización de Santa
2
Rosa (24105,6 m3/mes), del terminal pesquero ECOMPHISA y
módulos de procesamiento artesanal de pescado salado del CEPPAR
(Castañeda et al., 2009).

Actualmente, se utiliza una gran variedad de tratamientos físicos

y químicos para eliminar y/o reducir los altos niveles de cianuro
presente en los efluentes industriales. Sin embargo, muchos de estos
tratamientos resultan ser insuficientes y caros, además de generar
otros productos secundarios tóxicos, como ocurre con muchos de los
métodos químicos empleados (Akcil et al., 2003).

Por esta razón la búsqueda de tratamientos alternativos que

sean más eficaces, baratos y amigables con el ambiente resultan ser
de gran importancia e interés para muchas industrias (Baxler y
Cummings, 2006).

A mediados de 1950 se comenzó a estudiar el uso de

microorganismos capaces de biodegradar el cianuro (Pettet y Mills,
1954; Ware y Painter 1955). En la actualidad, existen muchas
investigaciones que demuestran la capacidad de algunos
microorganismos de utilizar el cianuro como fuente de nitrogeno y/o
carbono (Knwles 1976; Raybuck, 1992; Dubey y Holmes 1995; Akcil
et al., 2003; Gupta et al., 2010). El empleo de microorganismos para
tratar los efluentes cianurados provenientes de industrias, ofrece una
solución mucho más eficaz y barata que los tratamientos químicos y
físicos convencionales (Nelson et al., 1998).

3
1.2. Formulación del problema

1.2.1. Problema general

¿Qué microorganismos aislados de las aguas residuales del

Dren 4000 de Lambayeque tendrán capacidad de biodegradación de
cianuro?

1.2.2. Problemas específicos

 ¿Qué microorganismos aislados del Dren 4000 de Lambayeque, se

adaptaran mejor a concentraciones crecientes de cianuro?
 ¿Cuál será la eficiencia de biodegradación de cianuro del
microorganismo aislado del Dren 4000 de Lambayeque, con mejor
adaptación a concentraciones crecientes de cianuro, según el efecto
de la concentración de sustrato, agitación y tiempo de degradación
del cianuro?

1.3. Objetivos de la investigación

1.3.1. Objetivo general

 Aislar microorganismos degradadores de cianuro a partir de las

aguas residuales procedentes del Dren 4000 de Lambayeque.

1.3.2. Objetivos específicos

 Seleccionar un microorganismo degrador según su adaptación a

concentraciones crecientes de cianuro.

4
  Determinar la eficiencia de biodegradación de cianuro, según el
efecto de la concentración de sustrato, agitación y tiempo de
degradación, a partir de un microorganismo seleccionado con
mejor adaptación a concentraciones crecientes de cianuro.

1.4. Justificación e importancia

1.4.1. Justificación del estudio

En el Perú existen regiones en donde es evidente la

contaminación del ambiente con cianuro. En la región de La Libertad,
en Huamachuco la extracción aurífera es desarrollada por empresas y
en forma artesanal con mecanismos de riesgo, informalidad y tráfico
del uso de cianuro que expone a grave riesgo la vida humana, biota
de la región. En la Región de Cajamarca, zonas de Pulán y Santa
Cruz, se observa que los relaves de las minas de Hualgayoc han
afectado drásticamente la vida de los ríos Llaucano y Maygasbamba.
Asimismo en el Valle Chancay-Lambayeque existe una gran
preocupación debido a que el método de minas a “tajo abierto” y la
extracción del mineral por lixiviación con cianuro ocasionan
contaminación de las quebradas que nacen alrededor del proyecto La
Zanja y cuyas aguas finalmente desembocan en el Reservorio de
Tinajones, que a su vez permite el riego de 118 mil hectáreas de
cultivo de agroexportación (Villanueva, 2008)

1.4.2. Factibilidad del Proyecto

Existen varias formas de tratar las descargas de cianuro al

ambiente ya sea por métodos tradicionales de separación o por
métodos de biodegradación. Sin embargo, los métodos tradicionales

5
de separación transfieren la sustancia tóxica de una corriente a otra
por lo cual el problema de fondo persiste.
Por el contrario, los métodos que utilizan entes biológicos
buscan degradar a los contaminantes y transformarlos en otros
compuestos no tóxicos o menos tóxicos. Los microorganismos como
las bacterias y los hongos utilizan el cianuro como fuente de
nitrógeno, oxidable a cianato, el cual puede ser rápidamente
hidrolizado en amoniaco y dióxido de carbono.

6
 CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes de investigación

2.1.1. Antecedentes internacionales

Staton & Colbert (1986), han demostrado que bacterias y hongos

aislados de aguas contaminadas con efluentes cianurados tienen la
capacidad para degradar los cianuros o tienen un alto potencial para
absorber metales pesados.

Terrence & Trepanowski (1987), demostraron que hongos

degradadores de cianuro, como Fusarium lateritium degrada hasta un
98,87% del cianuro presente en suelos contaminados con efluentes
cianurados en una concentración de hasta 200 ppm.

Mariño & Ríos (1996), quienes demostraron que la eficiencia en la

degradación de cianuro por Fusarium moliniforme está en relación inversa

7
en el pH. Para un pH de 9,50 obtuvieron una eficiencia de degradación de
cianuro de 89,08% y a un pH de 11,50 una eficiencia de 84,55%. En cuanto
a la oxigenación, el nivel óptimo fue de 3,92 ppm de oxígeno y en cuanto al
tiempo, en 132 horas se alcanzó 95,23% de eficiencia en la degradación del
cianuro.

En cuanto a bacterias degradadoras de cianuro, Meyers & Pravin

(1991), demostraron que Bacillus pumillus puede degradar hasta 100 mg/L
de cianuro libre después de 2 horas de tratamiento a un pH de 10,5 y una
temperatura de 25 a 30º C.

Missari (1993), en la mina Homestake, Lead South Dakota

Estados Unidos opera desde 1984 una planta de tratamiento de efluentes de
procesos metalúrgicos, basado en la biodegradación de cianuro y
bioadsorción de metales tóxicos pesados y sólidos suspendidos. La bacteria
utilizada es Pseudomonas sp, la cual a pH de 7,0 a 8,5 degrada una
concentración inicial de 6 ppm de cianuro total hasta 0,7 mg de cianuro/dm 3,
originando dióxido de carbono y amoniaco.

2.1.2. Antecedentes nacionales

Castro & Gonzales (2003), identificaron que los microorganismos

degradadores de cianuro también pueden ser utilizados en consorcios,
utilizaron un consorcio microbiano formado por bacterias y hongos aislados
de aguas superficiales expuestas a relaves mineros (Río Llaucano-
Cajamarca) reportando eficiencias degradativas de cianuro de sodio de
87,66%; 83,15% y 79,97% para las concentraciones de 1000, 1500 y 2000
ppm de cianuro de sodio respectivamente, eficiencias promedio de 83,95%;
83,89% y 79,94% para los caudales de 12,24,36 mL/hora respectivamente y
eficiencias de 89,08%; 83,82% y 79,88% para los tiempos de degradación
de 120, 72 y 24 horas respectivamente.

8
 Blas (1998), aisló bacterias degradadoras de cianuro de relaves
de la sierra libertina, Perú. Tres cultivos bacterianos con inóculo inicial de 1,8
x 109 células fueron adaptados a 800 ppm de cianuro a pH 10 y se obtuvo un
consumo de cianuro de 3,348 mg/L/ hora, con 99,79% de eficiencia para
Bacillus freudenreichii y Planococcus sp.

Reyes (1998), informó que Aspergillus sp inoculado en una

concentración final de 106 conidias/mL degrada hasta el 98,87% de cianuro a
pH 9,5.
Guzmán & Obando (1996), determinaron el efecto del pH, tiempo
y concentración de conidias de los géneros Trichoderma y Aspergillus en la
degradación de soluciones de 1000 ppm de cianuro contenidas en
biorreactores aireados, Trichoderma sp en una concentración de 105
conidias/mL degradó el cianuro hasta una concentración final de 0,03 ppm.
Por su parte, Aspergillus sp en una concentración de 106 conidias/mL
degradó el cianuro hasta una concentración final de 0,08 ppm. Para ambos
hongos el pH óptimo fue de 9,5 y el tiempo de 128 horas.

Por su parte, Tremolada & Guerrero (1992), informaron que

una concentración de 0,3% de cianuro a un pH de 11,5 es degradada por
hongos pertenecientes al género Penicillium sp, después de 15 días en un
70% y después de 29 días en un 99%.

2.2. Bases teóricas

2.2.1 El cianuro
El término cianuro sirve para designar a una familia de
compuestos químicos que se caracterizan por la presencia de un átomo de
carbono enlazado a un átomo de nitrógeno mediante un enlace triple
(−C≡N). Más generalmente, se llama cianuro a una variedad amplia de
compuestos que contienen este grupo químico (Álvarez, 2005).

9
2.2.2 Terminologías del cianuro
En general, las distintas especies que incorporan en su
composición al ion cianuro pueden ser agrupadas en alguna de las
siguientes clases:
 Ion cianuro
Este término se refiere únicamente al anión CN‾ en solución.
 HCN (molecular)
Es una molécula neutra a la que se denomina ácido cianhídrico o
cianuro de hidrógeno.
Al grupo formado por el ion cianuro y el ácido cianhídrico se le
conoce como “cianuro libre”. Únicamente el HCN es volátil a partir de
soluciones acuosas y sólo el CN‾ tiene capacidad de formar complejos con
distintos iones metálicos, por esta razón este ion es utilizado en aplicaciones
industriales.

 Compuestos simples de cianuro

Son compuestos iónicos que se disocian directamente en el agua
liberando un catión y un anión (CN‾). Son las sales que provienen de
reacciones ácido-base como por ejemplo, el NaCN y KCN.

 Compuestos complejos de cianuro

Son compuestos iónicos que se disocian directamente en el agua
liberando un catión y un anión que contiene al ion cianuro. El anión,
denominado “complejo”, puede seguir disociándose, produciendo en última
instancia un catión y varios aniones cianuro (por ejemplo, el 2Cu (CN)3.

 Organocianuros
Corresponden a compuestos orgánicos que contienen el grupo
ciano (R-C≡N), se les denominan nitrilos o cianuros. Los nitrilos son
producidos de forma natural o artificial. En esta clase podemos encontrar a
las cianhídricas, los glucósidos cianogénicos, el acetonitrilo, el acrilonitrilo,
etc.
10
 Cianuro Total (CNT)
Se denomina así a todos los compuestos de cianuro (disueltos o
no) existentes en una solución acuosa.

 Cianuro disociable en ácido débil o cianuro WAD (Weak Acid

Dissociable)
Es un término analítico utilizado para designar a los compuestos
de cianuro que se disocian bajo reflujo con un ácido débil, normalmente a pH
4,5.

 Cianuro disociable en ácido fuerte o cianuro SAD (Strong Acid

Dissociable)
Es otro término analítico utilizado para designar a compuestos
cianurados que resisten el ataque de un ácido débil, pero se disocian en
presencia de un ácido fuerte a bajo pH.
Compuestos derivados del cianuro (Cyanide related compounds).
Son compuestos esencialmente no tóxicos que proceden de las
transformaciones de compuestos cianurados. Los más importantes son el
tiocianato, el cianato, los iones nitrato, nitrito y el amoníaco.

2.2.3 El cianuro en solución

Entre los compuestos de cianuro presentes en las disoluciones
y/o efluentes mineros u otros procesos de cianuración, figuran el cianuro
libre, las sales alcalinotérreas y los complejos cianurados metálicos
formados con oro, mercurio, cinc, cadmio, plata, cobre, níquel, hierro y
cobalto (Smith y Mudder, 1991).

2.2.4 Fuentes del cianuro: El carbono y el nitrógeno

Los dos elementos que forman el cianuro, están presentes a
nuestro alrededor. Juntos forman casi el 80% del aire que respiramos y
ambos están presentes en las moléculas orgánicas que son la base de todas
11
las formas de vida. El cianuro de hidrógeno se formó en las primeras etapas
del desarrollo de nuestro planeta como precursor de los aminoácidos, a
partir de los cuales evolucionó la vida sobre la tierra (Logsdon et al., 1999).
El cianuro se produce de forma natural en la biósfera y además es
sintetizado y utilizado en una gran variedad de industrias.

2.2.5 Fuentes naturales La síntesis biológica de cianuro (cianogénesis)

Fue descubierta por primera vez en plantas en 1802. En la

actualidad se sabe que los compuestos cianogénicos pueden encontrarse en
más de 3000 especies de plantas, animales, algas, bacterias y hongos. En la
mayoría de los organismos, el cianuro se utiliza como un mecanismo para
regular procesos bioquímicos específicos (Dzombak et al., 2006).

Aproximadamente 2650 especies de plantas, pertenecientes a

alrededor de 550 géneros y más de 130 familias, producen cantidades
significativas de glucósidos cianogénicos que se almacenan en vacuolas
celulares (Lechtenberg y Nahrstedt, 1999).

Entre las plantas se encuentran cultivos de gran importancia

económica como la alfalfa, el sorgo, la linaza, el bambú, la papa, el algodón
y el frijol, así como diferentes árboles frutales (Luque-Almagro, 2006;
Dzombak et al., 2006). En el reino animal la síntesis biológica de cianuro
está restringida a artrópodos; algunos centípedos, milípedos e insectos
(coleópteros, heterópteros y lepidópteros) capaces de producir cianuro
(Duffey, 1981; Nahrstedt, 1988).

En bacterias, la cianogénesis se encuentra limitada a

Chromobacterium violaceum y varias especies del género Pseudomonas (P.
chlorophis, P. aeruginosa y P. fluorecens) (Dubey y Holmes, 1995). En estos
microorganismos la biosíntesis de cianuro tiene lugar durante la transición de
la fase exponencial de crecimiento y la fase estacionaria, lo que indica que
12
este proceso forma parte del metabolismo secundario (Askeland y Morrison,
1983; Knowles, 1976).
Sólo algunas algas (Chlorella vulgaris, Anacystis nidulans, Nostoc
muscorum y Plectonema boyanum) son capaces de producir cianuro (Dubey
y Holmes, 1995).
Aproximadamente 300 especies de hongos, pertenecientes a 52
géneros, son cianogénicos (Luque-Almagro, 2006).

2.2.6 Fuentes antropogénicas

El cianuro se utilizó comercialmente por primera vez en 1889 en

Nueva Zelanda, en la extracción y recuperación de oro y plata. Debido a sus
características químicas, disponibilidad, efectividad y costo, actualmente
este compuesto se utiliza ampliamente en diversos tipos de industrias y es
considerado esencial en el mundo moderno (Logsdon et al., 1999).

Las principales formas de cianuro producidas por el hombre son el

cianuro de hidrógeno gaseoso, el cianuro sólido de sodio y el cianuro de
potasio (Mudder y Botz, 2004).

Las industrias mineras emplean típicamente soluciones de NaCN

entre 100 a 500 mg/L (Logsdon et al., 1999).Anualmente se utiliza más de un
millón de toneladas de cianuro, que representan el alrededor del 80% de la
producción total, en la producción de químicos orgánicos, como nitrilos,
nylon y plásticos acrílicos, así como en la fabricación de pinturas, adhesivos,
cosméticos, colorantes, medicamentos, insecticidas, agentes quelantes, etc.
Otras aplicaciones industriales incluyen la galvanoplastia, endurecimiento del
acero. El 20% restante de la producción de cianuro es empleado en la
fabricación cianuro de sodio, muy utilizado en la minería de todo el mundo
(Logsdo et al., 1999).

2.2.7. Toxicidad del cianuro

13
 El cianuro, a pesar de ser un producto químico industrial
indispensable, es conocido por sus características tóxicas potencialmente
mortales. La toxicidad del cianuro depende básicamente de su forma
química, su estabilidad y su biodisponibilidad (Kunz y Casey, 1980). La
forma más tóxica es el cianuro libre (HCN y CN‾), y las menos tóxicas son
los complejos cianurometálicos fuertes (Dubey y Holmes, 1995).

Existen al menos tres mecanismos conocidos de toxicidad para el

cianuro: (a) quelación con metales di o trivalentes en los sitios activos de las
metaloenzimas, (b) reacción con bases Schiff intermediarias para formar
derivados de nitrilo estables y (c) la formación de cianhidrinas por reacción
con grupos ceto (Solomonson, 1981).

La principal metaloenzima afectada en los seres vivos es la

citocromo oxidasa, enzima terminal de la cadena respiratoria mitocondrial,
esencial para la utilización del oxígeno durante la respiración celular. La
inhibición de esta enzima bloquea la fosforilación oxidativa, disminuyendo la
concentración de ATP en la célula y provocando la muerte celular (Donato et
al., 2007).
El cianuro, también puede inhibir la actividad de otras enzimas
como la catalasa, la peroxidasa, la fosfatasa, la ribulosa 1,5 bisfosfato
(Rubisco) (Vasil’ev et al., 2007).

En microorganismos, además de inhibir el crecimiento, se ha

descrito que el cianuro altera la morfología celular en Bacillus pumillus,
modifica la motilidad de Spirillum volutans, aumenta el tiempo de generación
de E. coli y causa mutaciones en Neurospora crassa (Dubey y Holmes,
1995). En plantas, el cianuro es capaz de inhibir la fotosíntesis (Wishnick y
Lane 1969, Vasil’ev et al., 2007).

En animales y humanos el cianuro puede ser absorbido por la

piel, ingerido o inhalado. Posteriormente, el cianuro es distribuido por todo el
14
cuerpo a través de la sangre, provocando hipoxia citotóxica en todos los
tejidos. Uno de los principales órganos sobre los que actúa el cianuro es el
sistema nervioso central. Debido a la importancia de la respiración celular en
este órgano, su inhibición provoca graves alteraciones neurológicas,
ocasionando en último término la muerte del individuo. Concentraciones de
HCN de 200 mg/L son letales para muchos animales (Montenegro, 2003).
La dosis letal para humanos es, en caso que sean ingeridos, de 1
a 3 mg/Kg del peso corporal; en caso sea absorbido, de 100 a 300 mg/Kg; y
de 100 a 300 mg/L si son inhalados (Ruiz, 2004).
En ambientes acuáticos, concentraciones muy bajas como 0,1
mg/L afectan la biota más sensible, peces y aves migratorias (Henny et al.,
1994). Por lo tanto, el cianuro y sus derivados pueden afectar la
biodiversidad y la biomasa activa del ecosistema, provocando graves
problemas en el ambiente.
Con el fin de proteger la salud de la población y el ambiente, la
mayoría de los países han establecido límites estrictos de concentración de
cianuro sobre las aguas destinadas al consumo humano y los efluentes de
ciertos sectores de producción. En nuestro país, los LMP de cianuro en
aguas de consumo es de 0,070 mg/L (DS N° 031- 2010-SA) y en los
efluentes de las actividades Minero-Metalúrgicas es de 1 mg/L de Cianuro
Total (DS N° 010-2010-MINAM).

2.2.8 Degradación del cianuro en el ambiente

Por ser un compuesto natural, el cianuro es biodegradable

(Knowles, 1976). Los procesos de degradación natural pueden reducir a
largo del tiempo la concentración de las formas tóxicas del cianuro en
soluciones a valores muy bajos.
El principal mecanismo de degradación natural del cianuro es la
volatilización, con posteriores transformaciones atmosféricas a sustancias
químicas menos tóxicas. Otros factores como la oxidación biológica, la

15
hidrólisis, la precipitación y los efectos de la luz solar (fotólisis), también
contribuyen a la degradación del cianuro (Figura 1).
En algunos casos, la combinación de estos procesos de
degradación natural es suficiente para satisfacer los requisitos que
reglamentan la descarga de soluciones que contienen cianuro (Logsdo et al.,
1999).
Figura 1: Procesos de degradación de los compuestos cianurados, Dzombak et al.,
(2006)

A pesar de que estos procesos son efectivos, no siempre tienen

una cinética tan rápida como para ser considerados en propósitos
industriales (20 mg/L de cianuro total puede degradarse en
aproximadamente 100 días), por lo que es necesario trabajar con otros
sistemas de detoxificación (Longsdo et al., 1999). Además, los porcentajes
de degradación varían según las formas y concentraciones del cianuro, la
temperatura, el pH, la población microbiana presente, la exposición a la luz,
por lo que resulta difícil de medir y controlar (Álvarez, 2005)

16
2.3. Definición de términos

 Aguas residuales
Son cualquier tipo de agua cuya calidad se vio afectada
negativamente por influencia antropogénica. Las aguas residuales
incluyen las aguas usadas, domésticas, urbanas y los residuos
líquidos industriales o mineros eliminados, o las aguas que se
mezclaron con las anteriores (aguas pluviales o naturales).

 Bacterias
Son microorganismos procariotas que presentan un tamaño de
unos pocos micrómetros (por lo general entre 0,5 y 5 μm de longitud)
y diversas formas, incluyendo filamentos, esferas (cocos), barras
(bacilos), sacacorchos (vibrios) y hélices (espirilos).

 Biodegradación
La biodegradación es un proceso natural, ventajoso no sólo por
permitir la eliminación de compuestos nocivos impidiendo su
concentración, sino que además es indispensable para el reciclaje de
los elementos en la biosfera, permitiendo la restitución de elementos
esenciales en la formación y crecimiento de los organismos
(carbohidratos, lípidos, proteínas).

 Biorreactor
Es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que
involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas
de dichos organismos.
Este proceso puede ser aerobio o anaerobio. Estos biorreactores
son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos
mililitros hasta metros cúbicos.

17
 Cianuro
Es un anión monovalente de representación CN-. El mismo
contiene el grupo cianuro (:C≡N:), formado por un átomo de carbono y
un átomo de nitrógeno unidos por un enlace triple.

 Concentración de sustrato
Es la cantidad de sustrato (alimento) presente en el medio de
cultivo que permite el crecimiento de un microorganismo.

 Medio de cultivo
Es una técnica de laboratorio (véase microbiología) que consta de
un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el
crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o
incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el
medio requerirá unas u otras condiciones.

 Microorganismos
Son organismos unicelulares vivos que no pueden ser observados
a simple vista y por ello se utilizan equipos especializados como
microscopios. Son considerados esenciales para la vida debido a su
amplia diversidad y distribución en el planeta. Mayoral (2018).

 Medio de cultivo
Es una técnica de laboratorio que consta de una solución o un gel
que tienen condiciones óptimas de pH, temperatura y concentración
de sustrato óptimas para el crecimiento de microorganismos como
bacterias y hongos.
 Pruebas bioquímicas de identificación microbiana
Son técnicas de laboratorio de microbiología que permiten
identificar a un microorganismo en específico, mediante la aplicación
de un test químico en los cuales es conocida su reacción.
18
  Sustrato
Es el medio en el que el microorganismo se desarrolla, brinda
nutrientes necesarios para desarrollo.

 Tiempo de degradación
Se considera al tiempo que demora en degradarse una molécula
de cianuro.

 Potencial de hidrogeno (pH)

El potencial de hidrogeno, es la medida de acidez o alcalinidad de
una disolución. El pH indica la concentración de iones hidrógeno
presentes en determinadas disoluciones. La sigla significa potencial
de hidrógeno o potencial de hidrogeniones.

2.4. Formulación de hipótesis

2.4.1. Hipótesis general

En las aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque, existen

microorganismos capaces de utilizar el cianuro como fuente de carbono y
energía, generando su biodegradación.

2.4.2. Hipótesis específico

Los microorganismos aislados del Dren 4000 de Lambayeque,

tendrán una mejor capacidad degradadora de cianuro dependiendo de la
concentración de sustrato, velocidad de agitación y tiempo de
biodegradación.

19
2.5. Identificación de variables

2.5.1 Variables independientes

Las variables independientes son:

 La concentración de sustrato
 Velocidad de agitación
 Tiempo de degradación del cianuro

2.5.2 Variable dependiente

Los microorganismos aislados del Dren 4000 de Lambayeque.

2.6. Operacionalización de variables

Para explicar la operacionalización de las variables, se procede a

elaborar una tabla que demuestre lo siguiente:

20
Tabla 1. Operacionalización de variables

21
 Unidad Instrumento
Tipos de Definición
Variables de Indicador de
variables conceptual
medida medición

mL de NaCN
Es la "ppm" Indicador
Concentr consumido/
concentración de Partes químico:
ación de en 100 mL de
NaCN, presente en por Nitrato de
sustrato medio de
el medio de cultivo millón plata
cultivo

Velocidad de
Es la velocidad de "rpm" agitación en
Velocidad
agitación del medio Revoluci 50, 100 y 150 Agitador
de
de cultivo con los ones por rpm / en 100 eléctrico
Agitación
microorganismos minuto mL de medio
Variable de cultivo.
Independiente

Es el tiempo que Concentració

se pone a demora n de NaCN,
Tiempo
el microorganismo consumido en
de "h" Reloj -
en degradar el 24; 48 y 72
degradaci Horas cronometro
cianuro presente horas/ en 100
ón
en el medio de mL de medio
cultivo. de cultivo

Son los
microorganismos, Unidades
"UFC"
como: hongos y formadoras
unidades Nefelómetr
Variable Micoorga bacterias, aislados de colonia
formador o de Mc
dependiente nismos a de las aguas UFC / 100 mL
as de Farland
residuales del Dren de medio de
colonias
4000 de cultivo
Lambayeque.

22
 CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1. Tipo de investigación

De acuerdo al fin que se persigue el presente trabajo de
investigación es del tipo experimental.

3.2. Nivel de investigación

El presente trabajo de investigación es de nivel experimental ya

que se pretende controlar las variables para interpretar los resultados
obtenidos.

23
3.3. Método de investigación
La investigación se realizó en dos fases, la primera de ellas fue
mediante una metodología de investigación descriptiva, hasta obtener el
microorganismo con mayor capacidad de biodegradación del cianuro; En la
segunda fase se expondrá al microrganismo seleccionado a variables como
concentración del sustrato, agitación y tiempo de biodegradación de cianuro,
para determinar la eficiencia de biodegradación.

Ambas fases de la investigación fueron realizadas en laboratorio

es decir “in vitro”.

3.4. Diseño de investigación

El estudio de la biodegradación de cianuro por microorganismos,
fue llevado a cabo según un experimento factorial (3x3x3) conducido como
diseño completo al azar (DCA), Las variables independientes o factores
fueron tres, de los cuales el factor A correspondió a la concentración de
sustrato con tres niveles (800 ppm, 1 600 ppm y 2 400 ppm), el factor B al
tiempo de degradación con tres niveles (24 horas, 48 horas, 72 horas) y el
factor C a la velocidad de agitación con tres niveles (50 rpm, 100 rpm y 150
rpm).

Tabla 2. Diseño Factorial (3x3x3) en DCA para determinar el efecto de

concentración de sustrato, velocidad de agitación y tiempo en la
biodegradación en laboratorio.

Velocidad de Tiempo de degradación (horas)

Variables independientes
agitación (rpm) 24 48 72
50 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1
800 100 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2
150 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3

Concentración 50 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1
de sustrato 1600 100 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2
(ppm) 150 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3
50 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1 r1
2400 100 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2 r2
150 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3 r3

24
 M: Muestra
O: Observación

M O

3.5. Población, muestra y muestreo

3.5.1 Población

La población está constituido por todos los microoganismos

degradadores de cianuro aislados de aguas residuales de tipo industrial que
son vertidas en el Dren 4000 de Lambayeque.

3.5.2 Muestra
La muestra está constituido por las bacterias y hongos
degradadores de cianuro aislados de las muestras de las aguas residuales
recolectadas del Dren 4000 de Lambayeque.

3.5.3 Muestreo

El número de muestras fue calculado de acuerdo a la formula

expuesta por Alvitres (2000):

Donde:

n= Tamaño de la muestra
Z= 1,96 (=0.05) valor estándar
p= Presencia de microorganismos degradadores de cianuro (0.90)
q= Ausencia de microorganismos degradadores de cianuro (1-p); (0.10)
25
 T= Error estimado 10%
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos
Primera fase

La primera fase correspondió al método de investigación

descriptivo donde se realizó el aislamiento, identificación y selección de
microorganismos nativos degradadores de cianuro de las muestras de aguas
residuales obtenidas del Dren 4000 de Lambayeque.

3.6.1 Obtención y procesamiento de las muestras de aguas residuales

Se recolectaron 35 muestras de aguas residuales cada 1 km

aproximadamente, iniciando desde la Carretera Panamericana Norte hacia el
Océano Pacífico en el Dren 4 000 de Lambayeque durante las 16 semanas
de muestreo comprendidas entre los meses de junio a setiembre de 2019, a
razón de dos a tres muestras por semana.

Las muestras en cantidad de 100 mL se depositaron en frascos

de vidrio de boca ancha estériles debidamente rotulados, se dejaron 10
minutos en reposo y a continuación se ajustó el pH a 11 con NaOH 0,1N
para evitar la formación del gas ácido cianhídrico, HCN (Reyes, 1 998).
Posteriormente las muestras se depositaron en cajas herméticas a una
temperatura de 4ºC para su traslado al laboratorio de Microbiología y
Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional “Pedro Ruiz Gallo” donde se realizó su procesamiento.

3.6.2 Acondicionamiento de biorreactores tipo tanque, batch con flujo

de aire descendente

Se acondicionaron 35 biorreactores tipo tanque, batch, con flujo de

aire descendente constituidos cada uno por frascos de vidrio de 500 mL de
capacidad, cuyo extremo superior estuvo cubierto por una tapa de goma que
presentó dos orificios. A través del primer orificio ingresó una cánula de
plástico taponada en el extremo superior con algodón para permitir la salida
de gases y a través del segundo orificio ingresó un difusor de aire con 1

26
volumen/volumen/minuto (v/v/m) generado por una bomba ELITE 803 de 4,0
watts y esterilizado por un sistema de burbujeo en solución de cloruro de
sodio al 20%. Los frascos de vidrio fueron esterilizados en el horno y el
material de plástico y goma fueron remojados en hipoclorito de sodio al 1%
durante 24 horas y posteriormente fueron irradiados con luz ultravioleta
durante 60 minutos.

3.6.3 Enriquecimiento de las muestras de aguas residuales

En cada uno de los biorreactores tipo tanque batch, con flujo de

aire descendente conteniendo 200 mL de caldo Ms9b - 4 ppm NaCN se
inocularon 10 mL de la muestra de agua residual correspondiente. Después
todos los biorreactores fueron incubados a 28ºC, con aireación constante (1
vvm) durante 24 horas.

3.6.4 Aislamiento de microorganismos degradadores de cianuro

De cada una de las muestras de aguas residuales previamente

enriquecidas se tomó una alícuota y se procedió a sembrar por el método de
estría y agotamiento sobre agar Ms9b - 4ppm NaCN contenido en placas de
Petri. Todas las placas de Petri fueron incubadas en aerobiosis a 28ºC por
48 horas para bacterias y 5 días para los hongos. Una vez desarrolladas las
colonias microbianas fueron cultivadas por tres veces consecutivas en agar
Ms9b - 4ppm NaCN contenido en placas de Petri incubándolas en aerobiosis
a 25ºC por 48 horas.

La resiembra continuada permitió eliminar los contaminantes que

se podían desarrollar sobre los restos de materia orgánica existentes en el
medio de enriquecimiento, asegurando de ésta manera el crecimiento de
microorganismos que sólo utilizaron el NaCN como fuente de nitrógeno.
Estos últimos fueron repicados hacia tubos conteniendo agar Ms9b - 4 ppm
NaCN, los cuales fueron incubados a 28ºC en aerobiosis por 48 horas y
posteriormente fueron mantenidos en refrigeración (4ºC).

27
3.6.5. Adaptación de los microorganismos degradadores a
concentraciones crecientes de cianuro

Cada uno de los microorganismos degradadores de cianuro

aislados fueron cultivadas en frascos de vidrio (500 mL de capacidad)
conteniendo 100 mL de caldo Ms9b - 8 ppm NaCN y fueron incubados en
agitación constante (140 rpm) durante 48 horas. A partir de cada uno de los
frascos de vidrio en donde se observó crecimiento se tomaron 5 mL y se
inocularon en frascos de vidrio (500 mL de capacidad) conteniendo 100 mL
de caldo Ms9b con concentraciones crecientes de NaCN: 16 ppm, 32 ppm,
64 ppm, 128 ppm, 256 ppm, 512 ppm, 1 024 ppm, 2 048 ppm y 2 400 ppm.
Del caldo Ms9b conteniendo 2 400 ppm se tomó una alícuota y se resembró
mediante la técnica de agotamiento y estría con placas de Petri conteniendo
agar Ms9b – 2 400 ppm.

El cultivo puro del microorganismo que presentó crecimiento en la

concentración 2 400 ppm de NaCN fue el seleccionado para determinar el
efecto de la concentración de sustrato, agitación y tiempo en la degradación
de cianuro en laboratorio.

3.6.6. Identificación del microorganismo degradador de cianuro

seleccionado

El microorganismo degradador de cianuro que resultó

seleccionado fue identificado de acuerdo a sus características
macroscópicas de las colonias desarrolladas en agar Papa Dextrosa (PDA) y
las características microscópicas presentes en microcultivos en láminas. Las
claves de identificación utilizadas fueron las de Barnet y Hunter (1972) y del
COMMON WEALTH MYCOLOGICAL INSTITUTE (2003).

28
Segunda fase
La segunda fase correspondió al estudio experimental donde se
realizó la determinación del efecto de la concentración de sustrato, agitación
y tiempo de biodegradación de cianuro en laboratorio.

3.6.7 Diseño Experimental

Para la determinación del efecto de la concentración de sustrato,

velocidad de agitación y tiempo en la biodegradación de cianuro, el estudio
fue experimental con tres repeticiones por tratamiento y la hipótesis fue
contrastada a través del Diseño con Estímulo Creciente.

El estudio de la biodegradación de cianuro en laboratorio, fue

llevado a cabo según un experimento factorial (3x3x3) como se mencionó en
el ítem 3.4 Diseño de la investigación.

En el presente trabajo de investigación, se confrontaron las

variables independientes entre sí. Las variables los denominamos factores y
estos fueron tres, de los cuales el factor A correspondió a la concentración
de sustrato con tres niveles (800 ppm, 1600 ppm y 2400 ppm), el factor B al
tiempo de degradación con tres niveles (24 horas, 48 horas, 72 horas) y el
factor C a la velocidad de agitación con tres niveles (50 rpm, 100 rpm y 150
rpm).

3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos

Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza

(ANAVA) para determinar las diferencias estadísticas entre tratamientos
(concentración de sustrato, agitación y tiempo de biodegradación de cianuro)
y se empleará la prueba discriminatoria de Tukey (a=0.05) para evaluar la

29
significación de los tratamientos (¿Cuál es el efecto de la concentración de
sustrato, agitación y tiempo en la biodegradación de cianuro?).

30
 CAPITULO IV

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

4.1. Presentación e interpretación de datos

4.1.2 Zona de muestreo

En los alrededores de la zona de muestreo correspondiente al

recorrido del Dren 4000 (altura del km. 764 de la carretera Panamericana
Norte), habitan pobladores del sector Chosica del Norte. El cual no cuenta
con una infraestructura pública de alcantarillado, por lo que las aguas
residuales de origen doméstico son vertidas directamente al Dren 4000, así
como también efluentes industriales de dos plantas procesadoras de
Saccharum officinarum “caña de azúcar” (Grupo comercial Bari S.A y
destiladora Chiclayo S.A.C).
El número de muestras fue calculado de acuerdo a la formula
expuesta por Alvitres (2000):

31
Donde:
n= Tamaño de la muestra
Z= 1,96 (=0.05) valor estándar
p= Presencia de microorganismos degradadores de cianuro (0.90)
q= Ausencia de microorganismos degradadores de cianuro (1-p); (0.10)
T= Error estimado 10%

Entonces, resolviendo la ecuación se obtiene lo siguiente:

n= (1.96)2 (0.90 x 0.10)

(10)2

n= 35 muestras
Las 35 muestras se tomaron del Dren 4000 de Lambayeque (figura 2).

En la figura 3 y tabla 3, se muestran los puntos georreferencia, donde se

tomaron las muestras de aguas residuales para aislar los microorganismos
del Dren 4000 de Lambayeque.

Figura 2. Toma de muestra de agua residual del Dren 4000 de Lambayeque

32
Figura 3. Puntos de ubicación de la toma de muestras de las aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque, en
coordenadas UTM

33
Tabla 3. Puntos de ubicación de las muestras del Dren 4000 de
Lambayeque.
Puntos de ubicación de la toma de muestras del Dren 4000 de
Lambayeque
Punto de Coordenada UTM
Zona
muestreo Este Norte
P1 17 M 618441.00 m E 9239785.00 m S
P2 17 M 618631.00 m E 9239981.00 m S
P3 17 M 618865.00 m E 9240153.00 m S
P4 17 M 619102.00 m E 9240331.00 m S
P5 17 M 619310.00 m E 9240479.00 m S
P6 17 M 619527.00 m E 9240666.00 m S
P7 17 M 619574.00 m E 9240791.00 m S
P8 17 M 619701.00 m E 9240791.00 m S
P9 17 M 619815.00 m E 9241261.00 m S
P10 17 M 619989.00 m E 9241419.00 m S
P11 17 M 620154.00 m E 9241534.00 m S
P12 17 M 620321.00 m E 9241650.00 m S
P13 17 M 620514.00 m E 9241770.00 m S
P14 17 M 620788.00 m E 9241980.00 m S
P15 17 M 620921.00 m E 9242069.00 m S
P16 17 M 621071.00 m E 9242159.00 m S
P17 17 M 621281.00 m E 9242360.00 m S
P18 17 M 621450.00 m E 9242501.00 m S
P19 17 M 621605.00 m E 9242668.00 m S
P20 17 M 621805.00 m E 9242801.00 m S
P21 17 M 621991.00 m E 9242932.00 m S
P22 17 M 622106.63 m E 9243011.37 m S
P23 17 M 622243.00 m E 9243103.00 m S
P24 17 M 622351.00 m E 9243186.00 m S
P25 17 M 622478.00 m E 9243289.00 m S
P26 17 M 622597.00 m E 9243367.00 m S
P27 17 M 622716.00 m E 9243448.00 m S
P28 17 M 622820.00 m E 9243527.00 m S
P29 17 M 622911.00 m E 9243592.00 m S
P30 17 M 623063.00 m E 9243718.00 m S
P31 17 M 623173.00 m E 9243846.00 m S
P32 17 M 623284.00 m E 9243955.00 m S
P33 17 M 623364.00 m E 9244049.00 m S
P34 17 M 623450.00 m E 9244187.00 m S
P35 17 M 623518.00 m E 9244291.00 m S

34
4.1.3 Microorganismos nativos degradadores de cianuro aislados de
aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque.
A partir de las 35 muestras de aguas residuales procedentes del
Dren 4000 de la Región de Lambayeque, fueron aislados 97 cultivos puros
de microorganismos degradadores de cianuro (Tablas 4 y 5), de los cuales el
59% (57 cultivos puros) fue identificado, como hongos filamentosos y el 41%
(40 cultivos puros) fue identificado como bacterias (Tabla 6 y figura 04).

Tabla 4. Cultivos puros de hongos filamentosos degradadores de cianuro

aislados de aguas residuales, Lambayeque.

Código de cultivo puro Código de cultivo puro

CLAMH01 CLAMH30
CLAMH02 CLAMH31
CLAMH03 CLAMH32
CLAMH04 CLAMH33
CLAMH05 CLAMH34
CLAMH06 CLAMH35
CLAMH07 CLAMH36
CLAMH08 CLAMH37
CLAMH09 CLAMH38
CLAMH10 CLAMH39
CLAMH11 CLAMH40
CLAMH12 CLAMH41
CLAMH13 CLAMH42
CLAMH14 CLAMH43
CLAMH15 CLAMH44
CLAMH16 CLAMH45
CLAMH17 CLAMH46
CLAMH18 CLAMH47
CLAMH19 CLAMH48
CLAMH20 CLAMH49
CLAMH21 CLAMH50
CLAMH22 CLAMH51
CLAMH23 CLAMH52
CLAMH24 CLAMH53
CLAMH25 CLAMH54
CLAMH26 CLAMH55
CLAMH27 CLAMH56
CLAMH28 CLAMH57
CLAMH29  --------

35
Tabla 5. Cultivos puros de bacterias degradadores de cianuro aislados de
aguas residuales. Lambayeque.

Código de cultivo puro Código de cultivo puro

CLAMB01 CLAMB21
CLAMB02 CLAMB22
CLAMB03 CLAMB23
CLAMB04 CLAMB24
CLAMB05 CLAMB25
CLAMB06 CLAMB26
CLAMB07 CLAMB27
CLAMB08 CLAMB28
CLAMB09 CLAMB29
CLAMB10 CLAMB30
CLAMB11 CLAMB31
CLAMB12 CLAMB32
CLAMB13 CLAMB33
CLAMB14 CLAMB34
CLAMB15 CLAMB35
CLAMB16 CLAMB36
CLAMB17 CLAMB37
CLAMB18 CLAMB38
CLAMB19 CLAMB39
CLAMB20 CLAMB40

Tabla 6. Frecuencia de microrganismos aislados del Dren 4000 de

Lambayeque.

Tipo N° Microorganismos Porcentaje

Bacterias 40 41%
Hongos 57 59%
Total 97 100%

Figura 4. Frecuencia de microorganismos degradadores de cianuro aislados

de aguas residuales del Dren 4000 de Lambayeque.

36
 Frecuencia de microorganismos biodegradores de cianuro

Bac-
terias
41%
Bacterias
Hongos

Hongos
59%

4.1.4 Microorganismos adaptados a concentraciones crecientes de

cianuro
El crecimiento de los microorganismos aislados de aguas
residuales del Dren 4000 fue disminuyendo conforme se incrementó la
concentración de cianuro. Asimismo, el mayor porcentaje de
microorganismos que mantuvieron su crecimiento a concentraciones
crecientes de cianuro fueron hongos filamentosos.

El 100% de los microorganismos mostró crecimiento en las concentraciones

8 ppm y 16 ppm de cianuro (Figura 12); mientras que el 93,8% creció a la
concentración 32 ppm de cianuro (56% de hongos filamentosos y 44% de
bacterias).

A su vez, el 82,4% de los microorganismos aislados creció en la

concentración 64 ppm de cianuro correspondiendo el 58,7% a hongos
filamentosos y el 41,3% a bacterias, mientras que el 64,9% de los
microorganismos aislados creció a concentración 128 ppm de cianuro
correspondiendo el 60% a hongos filamentosos y el 40% a bacterias.

El 42,3% de los microorganismos aislados creció en la concentración 256

ppm de cianuro correspondiendo el 65,9% a hongos filamentosos y el 34,1%

37
a bacterias, mientras que el 34% de los microorganismos aislados creció en
la concentración 512 ppm de cianuro correspondiendo el 69,7% a hongos
filamentosos y el 30,3% a bacterias. Finalmente, el 24% de los
microorganismos aislados creció en la concentración 1 024 ppm
correspondiendo el 73,9% a hongos filamentosos y el 26,1% a bacterias,
mientras que sólo el 1% de los microorganismos aislados identificados como
hongos filamentosos creció en la concentración 2400 ppm de cianuro.
(Figura 5 y Anexo 5).

Figura 5. Porcentaje de hongos filamentosos y bacterias que presentaron

crecimiento en concentraciones crecientes de cianuro (8ppm a 2400 ppm).

4.1.5 Microorganismo degradador de cianuro seleccionado e

identificado

El cultivo puro CLAMH26 fue seleccionado debido a que presentó

crecimiento en 2400 ppm de cianuro y fue identificado según las

38
características macroscópicas y microscópicas como Aspergillus flavus
(Figura 6).

Figura 6. Aspergillus flavus - CLAMH26 degradador de cianuro aislado de

aguas residuales en el Dren 4000 de Lambayeque

4.1.6 Efecto de la concentración de sustrato, tiempo de incubación y

velocidad de agitación en la degradación de cianuro por Aspergillus
flavus.
El efecto de la concentración de sustrato, tiempo de incubación y
velocidad de agitación en la degradación de cianuro por Aspergillus flavus -
CLAMH26 en laboratorio fue determinado a través de la eficiencia en la
degradación de cianuro en laboratorio cuyos valores oscilaron entre 91,47%
a 68,74% (Tabla 8).

La prueba de “F” del análisis de varianza del factorial 3 x 3 x 3 evidenció alta

significación entre los tratamientos, entre la concentración de Cianuro de
sodio (Factor A), entre los tiempos de incubación (Factor B) y entre las
diferentes velocidades de agitación (Factor C), así como las interacciones A
x C, B x C y A x B x C. La significación encontrada demostró que si existe
efecto de las variables en estudio en la degradación de Cianuro por

39
Aspergillus flavus - CLAMH26. Sin embargo, no existió significación de la
interacción A x B en la degradación de cianuro por Aspergillus flavus -
CLAMH26 (Tabla 8).

En la prueba discriminatoria de Tukey ( alfa < 0,05) con respecto al factor

concentración de cianuro de sodio el valor mayor de eficiencia de
degradación por Aspergillus flavus - CLAMH26 fue alcanzada en la
concentración 800 ppm de cianuro de sodio, diferenciándose
estadísticamente de las otras concentraciones de cianuro de sodio (Tabla 9)

40
 Tabla 7. Cianuro degradado (ppm) y eficiencia (%) de la degradación por
Aspergillus flavus - CLAMH26 en laboratorio por efecto de diferentes
concentraciones de sustrato, tiempo de incubación y velocidad de agitación.

Velocidad
Concentración Tiempo de Cianuro Cianuro
de Cianuro Eficiencia
de Cianuro de incubación libre inicial libre final
agitación degradado (%)
sodio (ppm) (horas) ppm ppm
(rpm)
800 72 150 424,72 36,23 388,49 91,47
800 48 150 424,72 43,15 381,57 89,84
1 600 72 150 849,43 106,94 742,49 87,41
800 72 100 424,72 54,66 370,06 87,13
800 72 50 424,72 55,77 368,95 86,87
1600 48 150 849,43 125,72 723,71 85,20
2400 72 100 1274,15 190,10 1084,05 85,08
2400 72 150 1274,15 191,00 1083,15 85,01
1600 72 100 849,43 130,22 719,21 84,67
800 48 100 424,72 65,62 359,10 84,55
800 24 150 424,72 65,62 359,10 84,55
1600 72 50 849,43 197,75 1076,40 84,48
800 48 50 424,72 68,46 356,26 83,88
1600 48 100 849,43 146,95 702,48 82,70
2400 72 50 1274,15 224,38 1049,77 82,39
800 24 100 424,72 75,98 348,74 82,11
1600 24 100 849,43 158,50 690,93 81,34
1600 48 50 849,43 164,96 684,47 80,58
2400 48 50 1274,15 250,50 1023,65 80,34
2400 24 150 1274,15 268,59 1005,56 78,92
2400 48 150 1274,15 270,76 1003,39 78,75
2400 48 100 1274,15 271,52 1002,63 78,69
1600 24 150 849,43 192,74 656,69 77,31
2400 24 100 1274,15 295,48 978,67 76,81
800 24 50 424,72 117,99 306,73 72,22
1600 24 50 849,43 238,77 610,66 71,89
2400 24 50 1274,15 398,30 875,85 68,74

41
4.2 Proceso de prueba de hipótesis
Tabla 8. Análisis de varianza de los valores promedios de la eficiencia (%)
de la degradación de cianuro por Aspergillus flavus - CLAMH26 en
laboratorio por efecto de diferentes concentraciones de sustrato, tiempo de
incubación y velocidad de agitación

42
Tabla 9. Prueba discriminatoria de Tukey (=0,05) para los valores
promedios de la eficiencia (%) de la degradación de diferentes
concentraciones de cianuro por Aspergillus flavus - CLAMH26 (ppm)

Tabla 10. Prueba discriminatoria de Tukey (=0,05) para los valores

promedios de la biodegradación de cianuro por Aspergillus flavus -
CLAMH26 por efecto de diferentes tiempos de incubación (horas).

43
Tabla 11. Prueba discriminatoria de Tukey (=0,05) para los valores
promedios de la eficiencia (%) de la degradación de cianuro por Aspergillus
flavus - CLAMH26 por efecto de diferentes velocidades de agitación (rpm)

44
Tabla 12. Prueba discriminatoria de Tukey ( =0,05) para la eficiencia de la
degradación de Cianuro por Aspergillus flavus - CLAMH26 por efecto de
diferentes concentraciones de cianuro de sodio (ppm), velocidades de
agitación (rpm) y tiempos (horas)

45
4.3 Discusión de resultados

Para aislar microorganismos degradadores de cianuro se tomaron

muestras del Dren 4000, donde se vierten aguas residuales de origen
doméstico e industrial. Estas aguas constituyeron una fuente propicia para el
aislamiento, debido a los residuos orgánicos y químicos que contienen este
contaminante (Adamson, 1972).

Los alimentos como almendras, cerezas, legumbres, alfalfa,

rábanos, repollos, col, coliflor, brócoli y nabos presentan compuestos
cianurados que son liberados durante su descomposición. Los residuos
químicos provienen de sustancias que se utilizan para el revelado de
fotografías, producción de papel, textiles, plásticos, lana, seda, acrílicos y
poliuretanos (Akcil et al., 2003). Asimismo, Morales et al., (2003), enfatizó
que a pesar de no ser necesario que un ambiente esté contaminado para
encontrar microorganismos degradadores, la población microbiana se
incrementa notablemente cuando está presente el contaminante como el
cianuro que constituye una fuente de nitrógeno.

A partir de 35 muestras de aguas residuales fueron aislados 97

microorganismos catalogados como degradadores de cianuro porque
presentaron crecimiento en el medio de cultivo, en el cual gradualmente se
fue eliminando la materia orgánica quedando el cianuro como única fuente
de nitrógeno. Esta reducción se logró realizando tres subcultivos
consecutivos de tal manera que se eliminaron los microorganismos
heterótrofos que inicialmente desarrollaron en la materia orgánica remanente
del inóculo primario, utilizándola como fuente de nitrógeno pero no así el
cianuro existente en el medio de cultivo.

De esta manera, el criterio de selección utilizado en el aislamiento

de microorganismos degradadores de cianuro a partir de aguas residuales
responde al conocimiento que en proceso biotecnológico de biorremediación
ambiental se debe tener la certeza de trabajar con microorganismos que

46
utilicen el contaminante en su metabolismo y a su vez mantengan estables
sus capacidades biológicas (Carreño y Villanueva, 2005)

El proceso de adaptación de los microorganismos degradadores

de cianuro se llevó a cabo con un pH inicial de 9,5 y una concentración inicial
de cianuro de sodio (Na CN) de 4 ppm. El cianuro de sodio se disuelve en
agua originando catión sodio (Na+) y anión cianuro (CN-). El anión cianuro
se combina con el ión hidrógeno (H+) y se forma ácido cianhídrico (HCN). En
la relación cianuro iónico (CN-) que se disuelve en agua y el cianuro de
hidrógeno (HCN) que se forma en solución existe un pH de equilibrio de 9,36
(50% de CN- y 50% de HCN) (Logsdo et al., 2003). A pH inferior a 9,3 casi
todo el cianuro libre se encuentra como HCN y puede volatilizarse. En
cambio, a pH superior 10 se encuentra como CN- (Mariños y Ríos, 1996).

El cianuro es una sustancia química caracterizada por la

presencia de carbono y nitrógeno unidos por un enlace triple capaz de
reaccionar con metales pesados con mucha facilidad, e inclusive en muy
bajas concentraciones. En el ser humano su toxicidad se debe a que forma
complejos estables con el ión férrico (Fe+++) inactivando enzimas como la
citocromo-oxidasa.

Como consecuencia se produce anoxia citotóxica hiperproducción

de lactato y acidosis metabólica severa (ISAT, 2000). Sin embargo, existen
microorganismos que resisten y desarrollan en cianuro, detoxificándolo o
metabolizándolo rápidamente a niveles ambientales aceptables (Guerrero,
2003; Gil y Giraldo, 2005)

Entre los microorganismos degradadores de cianuro aislados

predominaron los hongos filamentosos frente a las bacterias y asimismo
fueron estos microorganismos los que mayormente se adaptaron a
concentraciones crecientes de cianuro de hasta 2400 ppm. De igual manera
Reyes (1 998) adaptó una cepa de Aspergillus sp. a niveles crecientes de
cianuro (50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1500 y 2000 ppm) así como
Guzmán y Obando (1996) adaptaron cepas de Trichoderma sp. y Aspergillus

47
sp. a una concentración de 2000 ppm de cianuro, por cuanto en el Perú la
mayoría de las empresas mineras que se dedican al beneficio del oro y la
plata evacúan relaves con un contenido de cianuro cuyos valores oscilan
entre 50 ppm a 2000 ppm.

Según Reyes (1998) los microorganismos tolerantes al cianuro adaptan su

metabolismo a la presencia del contaminante formando oxidasas alternativas
que no son citocromos o bien otras enzimas constitutivas o inducibles para la
degradación y detoxificación del cianuro. Sin embargo, Tremolada y
Guerrero (1992) sostuvieron que concentraciones de cianuro en exceso
pueden ser inhibitorias para el proceso de biodegradación.

Una alta concentración del contaminante puede resultar tóxica

para la microbiota autóctona del medio, generando una disminución o
supresión en la actividad de degradación y/o muerte de la comunidad. Por el
contrario, concentraciones menores a la concentración límite, es decir
aquella suficiente para soportar el crecimiento o mantenimiento de la
población microbiana degradadora, pueden detener el proceso y el
contaminante podría persistir en el ambiente. Una explicación a este
fenómeno es que, a muy bajas concentraciones, los compuestos no generan
suficiente energía para el crecimiento de los microorganismos, o no inducen
el sistema enzimático necesario para su metabolismo, si se encuentran
presentes otros sustratos más fácilmente biodegradables.

Entre los microorganismos degradadores de cianuro sólo

Aspergillus flavus - CLAMH26 desarrolló en la concentración de 2 400 ppm
de cianuro. De igual manera Castro y Gonzales (2003) adaptaron 71
aislamientos microbianos a concentraciones crecientes de cianuro
encontrando que el 15,54% de cepas bacterianas y el 21,32% de hongos
filamentosos mostraron crecimiento hasta la concentración 2500 ppm de
cianuro de sodio. Después de inocular en medio cianurado todos los
microorganismos como un consorcio reaislaron diez microorganismos de los
cuales el 90% fueron hongos filamentosos identificando siete cepas de

48
Aspergillus sp. (A. flavus, A. terreus), una cepa de Cladosporium
cladosporioides y una cepa de Penicillium sp. Investigadores como
Tremolada y Guerrero (1992), Guzmán y Obando (1996), Mariño y Ríos
(1996) y Reyes (1998) también demostraron la capacidad degradativa de
cianuro de hongos filamentosos como Aspergillus spp, Aspergillus niger,
Penicillium spp, Trichoderma spp, Rhizopus spp, Fusarium moniliforme.

Se han postulado diferentes mecanismos a través de los que el

cianuro es degradado por ser utilizado como fuente de nitrógeno por
microorganismos como: Fusarium, Aspergillus, Hansenula, E.coli,
Pseudomonas fluorescens, Citrobacter, Bacillus subtilis (Gárces et al., 2006).
Uno de los mecanismos involucra la enzima cianuro hidratasa, que resulta
en la conversión irreversible del cianuro en formamida, que finalmente es
transformada en anhídrido carbónico y amoníaco. A través de un segundo
mecanismo en una reacción catalizada por la B-cianoalanina sintetasa, el
cianuro es convertido en B-cianoalanina o en un A-aminonitrilo,
intermediarios que luego son hidrolizados liberando un ácido y amoníaco. Un
tercer mecanismo utiliza una cianuro monoxigenasa para catalizar la
conversión al ácido cianhídrico (HCN) en cianato de hidrógeno (HOCN), el
cual es hidrolizado en reacción mediada por la enzima cianasa, produciendo
anhídrido carbónico y amoníaco (Guerrero, 2003).

El proceso degradativo de cianuro por A. flavus - CLAMH26 fue

influenciado por la concentración de cianuro, el tiempo de incubación y la
velocidad de agitación debido a que éstos parámetros afectan directamente
la actividad microbiana (Guzmán y Obando, 1996; Mariños y Ríos, 1996).

Cuando las concentraciones de cianuro oscilaron entre 800 a 2

400 ppm la eficiencia degradativa osciló entre 84,73 a 79,41%. Al respecto,
diversos investigadores han determinado valores inferiores y superiores en la
eficiencia de degradación de cianuro. Sin embargo, en todos los casos la
concentración de cianuro fue inferior a la del presente estudio. Freyre et al.,
(1994) obtuvieron 88% de eficiencia para 664 ppm de cianuro, Mariños y

49
Ríos (1996) obtuvieron 85,66% de eficiencia en la degradación de 155 ppm
de cianuro libre por Fusarium moniliforme. Por su parte Terrence y
Trepanowski (1987) trabajaron con Fusarium laterium y obtuvieron 98,07%
de eficiencia para 200 ppm de cianuro; Guzmán y Obando (1996) trabajando
con Trichoderma sp. y Aspergillus sp. Obtuvieron 99% de eficiencia para
1000 ppm de cianuro y Reyes (1998) determinó para Aspergillus sp. 98,87%
en la eficiencia de degradación de cianuro a una concentración de 160 ppm.
Asimismo, Castro y Gonzales (2003) determinaron valores de eficiencia de
87,66%; 83,15% y 79,97% para concentraciones de cianuro de 1000, 1500 y
2000 ppm.

Respecto al tiempo de incubación y velocidad de agitación

estuvieron relacionados directamente con la eficiencia de degradación,
alcanzándose los valores mayores con 72 horas y 150 rpm (86,04% y
84,27% respectivamente). Los resultados son superiores a los obtenidos por
Castro y Gonzales (20003), quienes determinaron 80,37% de eficiencia en la
degradación de cianuro con una concentración inicial de 2000 ppm después
de 72 horas de incubación de un consorcio microbiano constituido en un
90% por hongos filamentosos como Aspergillus flavus, A. terreus, Penicillium
sp y Cladosporium cladosporioides.

La velocidad de agitación está relacionada con la homogenización

del sustrato y la transferencia de oxígeno al medio proporcionando las
condiciones requeridas para la actividad metabólica de los hongos
filamentosos que son aerobios en su mayoría (Scrag, 1 999). Corroborando
los resultados, Mariño y Ríos (1996) concluyeron que el pH, la aireación y el
tiempo así como la interacción aireación – tiempo son altamente
significativos en la degradación de cianuro por Fusarium moniliforme.

Por su parte, Gil y Giraldo (2005) trabajaron con Pseudomonas

fluorescens y determinaron que 140 rpm durante 150 horas y 200 rpm en un
tiempo de 90 horas son los valores óptimos para alcanzar las
concentraciones finales de cianuro menores a 1 mg/L, concluyendo que el

50
porcentaje de degradación del efluente es proporcional al tiempo de
incubación en el proceso de biodegradación.

Con la interacción 800 ppm de cianuro – 72 horas de incubación –

150 rpm se alcanzó el valor máximo en la degradación de cianuro,
correspondiente a 91,47% lo que significa 36,23% de cianuro libre residual,
valor que está muy por encima del límite establecido para fines de protección
del medio ambiente y que es de 1 mg/L de CN para vertimientos al
alcantarillado público (Gil y Giraldo., 2005).

Con el fin de incrementar la eficiencia de la biodegradación

cuando los efluentes tienen una elevada concentración de cianuro se justifica
un tratamiento previo que disminuya al máximo el contaminante para
optimizar la actividad microbiana por cuanto se ha demostrado que niveles
cada vez mayores de cianuro afectan negativamenete la actividad
microbiana. De acuerdo a lo determinado por Monod, incrementos del
sustrato tóxico limitan la velocidad máxima de crecimiento y por lo tanto la
biodegradación (Crueger y Crueger, 1989).

51
 CONCLUSIONES

1.- A partir de muestras de aguas residuales del Dren 4000, Lambayeque se

obtuvieron 97 aislamientos de microorganismos degradadores de cianuro, de
los que el 59% fue identificado como hongos filamentosos y el 41% como
bacterias.

2.- Aspergillus flavus - CLAMH26 mostró crecimiento en concentraciones

crecientes de cianuro de hasta 2 400 ppm.

3.- En la determinación del efecto de la concentración de sustrato, agitación

y tiempo en la Biodegradación de cianuro en laboratorio: La concentración
800 ppm de cianuro, 150 rpm durante 72 horas permitieron alcanzar el valor
mayor (91,47%) de eficiencia en la degradación de cianuro por Aspergillus
flavus - CLAMH26.

52
 RECOMENDACIONES

1. Determinar la eficiencia de la degradación de cianuro utilizando otro tipo

de biorreactor.

2. Probar la técnica de biodegradación en consorcio con otros

microorganismos degradadores de cianuro.

53
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Adamson, R., (1972) The chemestry of the extraction of gold from

its ores. Capetown, South Africa.

 Akcil, A.; Karahan, H. y O. Sagdic, (2003) “Biological treatment of

cyanide by natural i s o l a t e d b a c t e r i a (Pseudomonas sp)” in
Mineral Engineering. Vol 16, Nº 7. Julio 2 003, pp. 643-649

 Alvitres, V., (2000) Método Científico Planificación de la

Investigación. Segunda Edición. Editorial Ciencia. Perú.

 Barnett, H. y B. Hunter, (1972) Illustrated genera of imperfecti

fungi. Cuarta edición. Macmillan Publishing Company. New York.

 Blanco, J. y Malato, S., (2001) “Purificación de Aguas por

Fotocatálisis Heterogénea: Estado del Arte” in Applied Catalysis.
Num 28.

 Blas, J., (1998) Aislamiento y selección de bacterias

degradadotas de cianuro y agitación en la biodegradación de
cianuro de sodio presente en los efluentes de la Compañía Minera.
Tesis de licenciatura. Perú, Facultad de Ingeniería Metalúrgica.
Universidad Nacional de Trujillo.

 Blesa, M. (2001). “Eliminación de contaminantes por fotocatálisis

heterogénea: Introducción” en Ciencia y Tecnología para el
Desarrollo (CYTED). (En Línea). Argentina, disponible en:
http://www.cnea.gov.ar/xxi/ambiental/CYTED/default.htm
(Accesado 14 de setiembre de 2004)

 Bosecker, K., et al (1 998) Desarrollo de un Proceso Biológico

para la Detoxificación de Aguas Superficiales Mineras. Instituto
Federal para Geociencias y Recursos Naturales (BGR). Alemania.

54
 Carreño, C y Villanueva, C. (2005) Manual de Práctica de
Microbiología Industrial, Perú, 2. Determinar la eficiencia de la
degradación de cianuro utilizando otro tipo de biorreactor. Región
Lambayeque.Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo de
Microbiología y Parasitología.

 Castro, M y F. Gonzáles, (2003) Eficiencia d e la biodegradación de

cianuro por un consorcio microbiano aislado de aguas superficiales
de quebradas que alimentan el Río Llaucano. Cajamarca. Tesis de
licenciatura, Perú, Región de Lambayeque. Universidad Nacional
Pedro Ruiz Gallo - Microbiología y Parasitología.

 Commonwealth Mycological Institute (CMI) (2003) Descriptions

of Pathogenic Fungi and Bacteria. Second Edition. Commonwealth
Agricultural Bureaux.

 Córdoba, D. (2000) Toxicología. 4th E d i c i ó n . Manual moderno.

 Crueger, W. y A. Crueger, (1989) Biotecnologia manual de

microbiologia industrial. Segunda edición. Editorial Acribia.

 Domènech, X., Jardim, W. y M. Litter, (2001) “Eliminación de

contaminantes por fotocatálisis heterogénea: Procesos avanzados
de oxidación para la eliminación de contaminantes” en Ciencia y
Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (En Línea). Argentina,
disponible en:
http://www.cnea.gov.ar/xxi/ambiental/CYTED/default.htm.
(Accesado 24 de agosto de 2004).

 Escobar, J. y A. Echeverri, (1990) Notas sobre minería de veta y

cianuración. Fundación Escobar. Medellín. Colombia.

 Fernández, P. (2003) Propiedades Coloidales de Partículas de

TiO2: Aplicación al Tratamiento Fotocatalítico Solar de Aguas. Tesis
de doctorado, España, Departamento de Ciencias Físicas,
Universidad de Granada.

55
 Freyre, A., et al (1994) Biodegradación de Efluentes de Cianuración.
Investigación del Laboratorio de Investigación y Desarrollo en Ciencia
y Tecnología (LID), Perú. Universidad Peruana Cayetano Heredia.

 Fuentes, J. y U. Gómez, (2001) Guías toxicológicas – Urgencias

Manual 1. Gobernación de Antioquia, Dirección Seccional de Salud.

 Garcés, A., et al (2006) “Aislamiento de consorcio de

microorganismos degradadores de cianuro” en Revista Lasallista de
investigación. Vol. 3 No. 1. pp. 7-12

 Gil, E y C. Giraldo, (2005) Proceso “Acoplado” Físico- químico y

Biotecnológico para el tratamiento de Aguas Residuales
contaminadas con cianuro. Universidad EAFIT, Colombia. Documento
38-112 005.

 Guerrero, G.(2006) Capacidad Degradativa de Policlorobifenilo

(PCB) por Bacterias Aisladas de Aguas Residuales del Dren 4 000 de
Lambayeque. Tesis de licenciatura, Perú, Departamento de
Microbiología y Parasitología, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo -
Lambayeque.

 Guerrero, J. (2003). “Cianuro: destrucción, recuperación y lixiviantes

alternativos” en Revista El Ingeniero de Minas. Año X - Nº 35. Perú

 Guzmán, G y E. Obando, (1996) Efecto del pH, tiempo y

concentración de hongos de los géneros Trichoderma y Aspergillus en
la biodegradación de cianuro y la bioacumulación de oro desde
soluciones pregmat. Tesis de licenciatura, Perú. Departamento de
Ingeniería Metalúrgica, Universidad Nacional de Trujillo.

 Instituto Salud y Trabajo (ISAT) (2000) Contaminación por Cianuro.

Bogotá – Colombia.

 Logsdo, M., Hagelstei, K. y T. Mudder, (2003) “The Management of

Cyanide in Gold Extraction” in International council on Metals and
the environment. (En Línea). Argentina, disponible en:
http://www.cyantists.com (Accesado 10 de octubre de 2006)

56
 Madigan, M.; Martinko, J. y J. Parker, (2001) Brock biologia de los
microorganismos. Quinta edición. Editorial Pearson Prentice Hall,
Argentina.

 Mariños, S. y R. Ríos, (1996) Influencia del pH, Oxígeno y Tiempo en

la Destrucción de Cianuros por Acción de Fusarium moliniforme,
en los relaves Provenientes de la Compañía. Minera Poderosa S.A.
Tesis de licenciatura, Perú, Departamento de Ingeniería Metalúrgica,
Universidad Nacional de Trujillo.

 Meyers, P. y G. Pravin, (1991) “An Efficent Cyanide Degrading

Bacillus Pumillus strain” in Journal of General Microbiology, University
of Cape Town, South Africa.

 Misari, F. (1993). Metalurgia del Oro I, Edit. Talleres de Publiasesores

SRL, Lima Perú 2:236-241.

 Morales, J., et al (2003) Manual de Medicina. Primera edición,

Editorial Mediterráneo.

 Reyes, I. (1998) Destrucción del Enlace Triple del Cianuro, en un

Efluente de la Minería Aurífera, en función del pH y Concentración de
Aspergillus. Tesis de maestría, Perú, Departamento de Gestión
Ambiental, Universidad Nacional de Trujillo.

 Serpone, N. y A. Emeline, (2002) Suggested terms and definitions in

photocatalysis and radiocatalysis. International journal of photoenergy.
4, 91-131

 Smith, A. y T. Mudder, (1991) “The chemistry and treatment of

cyanidation waste” in Mini journal book limited.

 Staton, M. y T. Colbert, (1986) Environmental handbook for

cyanide leaching projects. Energy, Mining and Minerals Division,
Department of the Interior, Denver – Colorado. EE.UU. pp 6-25.

 Terrence, D. y Trepanowski, J. (1987) “Utilization of Soils to Mitigate

Cyanide Releases” Third Western Regional Conference on
Precious Metals, Coal and Environment, Rapid City – South Dakota.
EE.UU. pp 23-26.

57
 Thompson, L. (1997) Biotratamiento de Cianuro y Biomineralización
de Minerales Gastados y Soluciones Procesadas. U.S.E.P. Capítulo 6.
pp 74-96.

 Tremolada, J. y Guerrero, J. (1 992) Destrucción del cianuro de sodio

a través de microorganismos biológicos en efluentes y/o residuos
tóxicos de las plantas auríferas industriales por cianuración.
Compañía Minera San Nicolás S.A. Cajamarca.

 Villanueva, C. (2 008) El pH, tiempo y concentración en la eficiencia

de biodegradación de cianuro por Pseudomonas fluorescens cepa
CPCT – UNT en un biorreactor de columna de burbujeo. Tesis
de doctorado, Perú, Departamento de Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional de Trujillo.

 Yurramendi, L., Ipiñazar, E. y J. Pavón, (1994) “Eliminación de

cianuros presentes en efluentes industriales” en Ingeniería Química.
306, 129-134.

58
 ANEXOS
ANEXO 1

Composición del medio Caldo Ms9b para el aislamiento de

microorganismos degradadores de Cianuro (Mariños Y Ríos, 1996
modificado por Chambergo y Herrera, 2007)

Carbono (glucosa) 1 g/L

Nitrógeno [(NH4)2SO4] 0,25 g/L
MgSO4.7H2O 0,1 g/L
K2HPO4.3H2O 0,04 g/L
pH 11

Composición del Medio Agar Ms9b para el aislamiento de

microorganismos degradadores de Cianuro (Mariños y Ríos, 1996
modificado por Chambergo y Herrera, 2007)

Carbono (glucosa) 1 g/L

Nitrógeno [(NH4)2SO4] 0,25 g/L
MgSO4.7H2O 0,1 g/L
K2HPO4.3H2O 0,04 g/L
Agar-agar 18 g/L
pH 11

Después de esterilizar el medio de cultivo Ms9b agregar cianuro de

sodio en cantidad suficiente para alcanzar las concentraciones requeridas (8
ppm, 16 ppm, 32 ppm, 64 ppm, 128 ppm, 256 ppm, 512 ppm, 800 ppm,
1024 ppm, 1600 ppm, 2048 ppm, 2400 ppm).

59
 ANEXO 2

Cálculo para determinar la Concentración de Cianuro Libre en una

solución de cianuro de sodio (2400 ppm)

 Concentración de 2400 ppm de Cianuro de Sodio:

A 1 L de caldo Ms9b adicionar 2400 mg. de cianuro de sodio.

 Concentración de Cianuro Libre (CN-) en 2400 ppm de Cianuro de

Sodio:

Por lo tanto:

1 274,145 mg = 1 274,145 ppm de CN-

Es decir:

2400 ppm de NaCN equivalen a 1 274,145 ppm de CN-

60
 ANEXO 3
Preparación del caldo Ms9b con diferentes concentraciones
de cianuro de sodio

Concentración Cianuro Caldo Concentración

de Cianuro de de Sodio Ms9b de Cianuro Libre
Sodio (ppm) (mg) (mL) (ppm)

1 1 1 000 0,531
8 8 1 000 4,247
16 16 1 000 8,494
32 32 1 000 16,989
64 64 1 000 33,977
128 128 1 000 67,954
256 256 1 000 135,909
512 512 1 000 271,818
800 800 1 000 424,715
1 024 1 024 1 000 543,635
1 600 1 600 1 000 849,430
2 048 2 048 1 000 1 087,270
2 400 2 400 1 000 1 274,145

61
 ANEXO 4
Determinación Volumétrica de cianuro libre con solución de
Nitrato de Plata en Yoduro de Potasio como indicador (Castro y
Gonzáles, 2003)

1. SOLUCIÓN DE NITRATO DE PLATA

1.1. Calibración de la botella

Pesar una botella de vidrio oscuro (color café) de 1 litro de
capacidad, completamente vacía. Luego llenar la botella con tanta agua,
hasta que su peso sea el peso de la botella vacía más un kilo (esto
corresponde a un litro). Marcar el nivel del agua y secar la botella.
Si se consigue una botella de vidrio oscuro (color café), forrar la botella
con cinta aislante negra, porque la luz daña la solución.

1.2. Preparación de la solución de nitrato de plata

Pesar 17,33 gramos de nitrato de plata, depositar en la botella.
Después llenar la botella con agua destilada exactamente hasta la marca
que corresponde a 1 litro.

2. SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO

2.1. Calibración de la botella

Pesar una botella vacía de 100 cm3 de capacidad. Luego,

llenar la botella con tanta agua, hasta que su peso sea el peso de la

botella vacía más 100 gramos (esto corresponde a 100 cm 3). Marcar el
nivel de agua y secar la botella.

62
2.2 Preparación de la solución
Pesar 3 gramos de yoduro de potasio, verter en la botella.
Llenar la botella con agua destilada exactamente hasta la marca que

corresponde a 100 cm3.

3. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CIANURO EN

SOLUCIÓN

1. Con la pipeta succionar 10 cm3 de solución de cianuro y

depositar en el vaso de vidrio.
2. Añadir tres gotas de solución de yoduro de potasio.
3. Llenar la bureta con solución de nitrato de plata. Anotar la lectura
inicial.
4. Dejar gotear (lentamente y siempre moviendo el vaso) la solución
de nitrato de plata al vaso con la solución hasta que se torne
permanentemente turbia (amarillenta).
5. Tomar la lectura final y calcular la diferencia entre la lectura
inicial y la lectura final.

6. La cantidad de cm3 de solución de nitrato de plata gastada para

lograr el color amarillento en el vaso, corresponde a la

concentración de cianuro libre en 0,1 g/L ó 0,1 Kg/m3. Por ejemplo

14 3, corresponden a 1,4 Kg/m3 de cianuro libre en la solución.

cm

7. Si no se va a realizar inmediatamente otro análisis, devolver

la solución de nitrato de plata de la bureta a la botella, porque la
solución se daña con la luz.
8. Lavar la pipeta y la bureta con agua destilada y el vaso con agua del
grifo.

Después de cierto tiempo de uso, la superficie interior de la bureta se

mancha de negro con plata precipitada. Basta lavar el tubo con solución
de cianuro o ácido nítrico y luego con bastante agua destilada para
volver la bureta a su estado normal.
63
4. CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE CIANURO LIBRE EN LA
SOLUCIÓN
La cantidad de centímetros cúbicos de solución de nitrato de plata gastados,
para lograr el color amarillento en el vaso, corresponde a la concentración

de cianuro libre en 0,1 g/L ó 0,1 Kg/m3. Por ejemplo 14 cm3,

corresponden a 1,4 Kg/m3 de cianuro libre en la solución.

Ejemplo:

En una muestra cianurada cuya concentración inicial es 800 ppm de

NaCN. ¿Cuánto de cianuro libre se encuentra en la muestra? Si el gasto

inicial fue 1,7 kg/m3 y el gasto final fue 1,5 kg/m3

En una solución de 800 ppm de NaCN existen 424,715 ppm de CN-

Entonces:

424,715ppm de CN- ------------ 1,7 kg/cm3

X ------------ 1,5 kg/cm3

X= 424,715 x 1,5/ 1,7

X= 374,769 ppm de CN-

Por lo tanto, un gasto de 1,5 kg/cm3 representa 374,769 ppm de CN-

(cianuro libre).

64
 ANEXO 5
Crecimiento de 40 cultivos bacterianos en Medio Ms9b con concentraciones
crecientes de Cianuro de Sodio: 8 ppm, 16 ppm, 32 ppm, 64 ppm, 128 ppm,
256 ppm, 512 ppm, 1024 ppm, 2048 ppm y 2400 ppm.

(+) = Crecimiento y (-) =No crecimiento.

Concentración de Cianuro de Sodio

Cultivos
(ppm)
bacterianos

8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 2400

CLAMB01 + + + - - - - - - -
CLAMB02 + + + + + + + + + -
CLAMB03 + + + + + + + + - -
CLAMB04 + + + + + + + - - -
CLAMB05 + + + + + + + - - -
CLAMB06 + + + - - - - - - -
CLAMB07 + + + + + - - - - -
CLAMB08 + + + + + + + - - -
CLAMB09 + + + + + + - - - -
CLAMB10 + + + + + + + - - -
CLAMB11 + + + + + - - - - -
CLAMB12 + + + + + - - - - -
CLAMB13 + + + + + - - - - -
CLAMB14 + + + - - - - - - -
CLAMB15 + + + + + - - - - -
CLAMB16 + + + + + - - - - -
CLAMB17 + + + + + + + + + -
CLAMB18 + + + + - - - - - -
CLAMB19 + + + + + + - - - -
CLAMB20 + + + + + + - - - -
CLAMB21 + + + + + + - - - -
CLAMB22 + + + - - - - - - -
CLAMB23 + + + + - - - - - -
CLAMB24 + + + + - - - - - -
CLAMB25 + + + + - - - - - -
CLAMB26 + + + - - - - - - -
CLAMB27 + + + + + - - - - -
CLAMB28 + + + + + - - - - -
CLAMB29 + + + + + - - - - -
CLAMB30 + + + - - - - - - -

65
 Concentración de Cianuro de Sodio
Cultivos
(ppm)
bacterianos

8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 2400

CLAMB31 + + + - - - - - - -
CLAMB32 + + + + + + + + - -
CLAMB33 + + + + + + + + - -
CLAMB34 + + + + + + + + - -
CLAMB35 + + + - - - - - - -
CLAMB36 + + + - - - - - - -
CLAMB37 + + + + + - - - - -
CLAMB38 + + + + + - - - - -
CLAMB39 + + + + + - - - - -
CLAMB40 + + + - - - - - - -

Crecimiento de 57 cultivos de hongos filamentosos en Medio Ms9b con

concentraciones crecientes de Cianuro de Sodio: 8 ppm, 16 ppm, 32 ppm,
64 ppm, 128 ppm, 256 ppm, 512 ppm, 1024 ppm, 2048 ppm y 2400 ppm.

(+) = Crecimiento y (-) =No crecimiento.

Cultivos de Concentración de Cianuro de Sodio

hongos ppm
filamentosos
8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 2400
CLAMH01 + + + - - - - - - -
CLAMH02 + + + + + + + + + -
CLAMH03 + + + + + + + + + -
CLAMH04 + + + + + + + - - -
CLAMH05 + + + + + + + - - -
CLAMH06 + + + - - - - - - -
CLAMH07 + + + + + - - - - -
CLAMH08 + + + + + + + - - -
CLAMH09 + + + + + + - - - -
CLAMH10 + + + + + + + - - -
CLAMH11 + + + + + - - - - -
CLAMH12 + + + + + - - - - -
CLAMH13 + + + + + - - - - -
CLAMH14 + + + - - - - - - -
CLAMH15 + + + + + - - - - -

66
 Cultivos de Concentración de Cianuro de Sodio
hongos ppm
filamentosos
8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 2400
CLAMH16 + + + + + - - - - -
CLAMH17 + + + + + + + + - -
CLAMH18 + + + + - - - - - -
CLAMH19 + + + + + + + - - -
CLAMH20 + + + + + + - - - -
CLAMH21 + + + + + + + + - -
CLAMH22 + + + - - - - - - -
CLAMH23 + + + + + + + - - -
CLAMH24 + + + + - - - - - -
CLAMH25 + + + + + + + + - -
CLAMH26 + + + + + + + + + +
CLAMH27 + + + + + - - - - -
CLAMH28 + + + + + + - - - -
CLAMH29 + + + + + - - - - -
CLAMH30 + + + - - - - - - -
CLAMH31 + + + + + + + + - -
CLAMH32 + + + + + + + + - -
CLAMH33 + + + + + + + + - -
CLAMH34 + + + + + + + + - -
CLAMH35 + + + - - - - - - -
CLAMH36 + + + + + + - - - -
CLAMH37 + + + + + - - - - -
CLAMH38 + + + + + + + + - -
CLAMH39 + + + + + - - - - -
CLAMH40 + + + + + + + + - -
CLAMH41 + + + + + + + + - -
CLAMH42 + + + + + + + + - -
CLAMH43 + + + + + + + + - -
CLAMH44 + + + + - - - - - -
CLAMH45 + + + + - - - - - -
CLAMH46 + + + + - - - - - -
CLAMH47 + + + + - - - - - -
CLAMH48 + + + + - - - - - -
CLAMH49 + + + + - - - - - -
CLAMH50 + + + + + + + + - -
CLAMH51 + + + + + + + + - -
CLAMH52 + + - - - - - - - -
CLAMH53 + + - - - - - - - -
CLAMH54 + + - - - - - - - -

67
 Cultivos de Concentración de Cianuro de Sodio
hongos ppm
filamentosos
8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 2400
CLAMH55 + + - - - - - - - -
CLAMH56 + + - - - - - - - -
CLAMH57 + + - - - - - - - -

68