UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

ESCUELA DE POSGRADO

UNIDAD DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y

FORMALES

“AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

POTENCIALMENTE DEGRADADORAS DE PETRÓLEO A PARTIR DE

DIFERENTES MUESTRAS AMBIENTALES”

Tesis presentada por el bachiller:

Enriquez Fernandez, Paulo Cesar
Para optar el Grado Académico de Maestro en
Ciencias, con mención en Gerencia, Auditoria y
Gestión Ambiental.

Asesor:
Dr. Bernabé Ortiz, Julio Cesar

AREQUIPA – PERÚ
2022
 ii

Dedicatoria

A mi Dios que desde lo alto me cuida y dirige mi vida.

A mis padres y novia que siempre me apoyan y me

animan a seguir.
 iii

Agradecimientos

En primer lugar, a Dios por estar a mi lado siempre y permitirme realizar este trabajo de

investigación.

De igual forma a mis padres Wilfredo y Roxana por siempre animarme y apoyarme en

mi etapa académica.

A mi hermano Giancarlo que a pesar de la distancia siempre tiene espacios para

preocuparse y velar por mi futuro.

A mi novia María del Carmen por estar a mi lado y brindarme su apoyo durante todo el

tiempo de mi tesis.

A la Universidad Nacional de San Agustín y todos los profesores de la Escuela de

Posgrado por facilitarme los conocimientos necesarios durante mi etapa de estudiante.

Al Dr. Cesar Bernabé por su confianza y generosidad para poder culminar mi

investigación.
 iv

Resumen

La contaminación ambiental ha crecido exponencialmente en los últimos años, debido a las

malas prácticas en la industrialización de diferentes productos, en este caso la industria

petrolera ofrece diversos productos y sus derivados, pero a la vez causa una gran contaminación

ya sea de forma directa o indirecta a través de derrames de petróleo que tienen como destino

final tanto ecosistemas acuáticos como terrestres. El objetivo del presente trabajo fue aislar,

caracterizar e identificar las bacterias con potencial degradativo de petróleo a partir de distintas

muestras ambientales como aguas termales, humedales, insectos, tierra contaminada. Las

bacterias se aislaron utilizando tanto el caldo palleroni como acetato mineral para luego hallar

la mejor actividad emulsificante de cada bacteria para ser probadas en caldo mínimo mineral

con concentraciones de petróleo al 4%,6% y 8%. Las dos bacterias con mayor actividad

degradativa alcanzaron un desarrollo aproximado de 1.2*108 UFC en el medio mineral al 8%

de petróleo. Se identificaron Bacillus licheniformis y Lisinibacillus sp. procedentes de aguas

termales del distrito de Pampa Cañahuas-Yanahuara y del insecto Tenebrio Molitor

respectivamente.

Palabras clave:
Contaminación, muestras ambientales, bacteria, actividad degradativa.
 v

Abstract

Environmental pollution has grown exponentially in recent years, due to bad practices in the

industrialization of different products, in this case the oil industry offers various products and

their derivatives, but at the same time causes great pollution either directly or indirectly through

oil spills that have as final destination both aquatic and terrestrial ecosystems. The objective of

the present work was to isolate, characterize and identify bacteria with oil degradative potential

from different environmental samples such as thermal waters, wetlands, insects, contaminated

soil. The bacteria were isolated using both palleroni broth and mineral acetate and then found

the best emulsifying activity of each bacterium to be tested in minimal mineral broth with oil

concentrations of 4%, 6% and 8%. The two bacteria with the highest degradative activity

reached a growth of approximately 1.2*108 CFU in the mineral medium with 8% oil. Bacillus

licheniformis and Lisinibacillus sp. were identified from thermal waters of the Pampa

Cañahuas-Yanahuara district and from the insect Tenebrio Molitor, respectively.

Key words:
Contamination, environmental samples, bacteria, degradative activity.
 vi

Lista de Contenido

Dedicatoria .................................................................................................................................ii
Agradecimientos .......................................................................................................................iii
Resumen.................................................................................................................................... iv
Abstract ...................................................................................................................................... v
Lista de Tablas ........................................................................................................................viii
Lista de Figuras ......................................................................................................................... ix
Introducción ............................................................................................................................... x
Objetivo General .....................................................................................................................xiii
Objetivos Específicos .............................................................................................................xiii
Capítulo I ................................................................................................................................... 1
Marco Teórico............................................................................................................................ 1
1.1 Antecedentes de la investigación ......................................................................................... 1
1.2 Hidrocarburos ...................................................................................................................... 8
1.2.1 Contaminación por hidrocarburos .................................................................................. 12
1.3 Biorremediación de hidrocarburos ..................................................................................... 19
1.4 Microorganismos degradadores de hidrocarburos ............................................................. 31
1.5 Microorganismos aislados de distintas muestras ambientales ........................................... 41
Capitulo II ................................................................................................................................ 47
Materiales y Metodología ........................................................................................................ 47
2.1 Materiales........................................................................................................................... 47
2.1.1 Muestra ........................................................................................................................... 47
2.1.2 Material de laboratorio.................................................................................................... 47
2.2 Métodos ............................................................................................................................. 51
2.2.1 Obtención de muestras .................................................................................................... 51
2.2.2 Aislamiento de microorganismos ................................................................................... 51
2.2.3 Determinación de la actividad emulsificante .................................................................. 52
2.2.4 Caracterización fenotípica de microorganismos degradadores de hidrocarburos .......... 53
2.2.5 Determinación de la actividad degradativa de petróleo .................................................. 53
2.2.6 Identificación molecular ................................................................................................. 53
2.2.7 Filogenia molecular ........................................................................................................ 54
Capitulo III ............................................................................................................................... 55
Resultados y Discusión ............................................................................................................ 55
3.1 Aislamiento de microorganismos ...................................................................................... 55
 vii

3.2 Determinación de la actividad emulsificante ..................................................................... 56

3.3 Caracterización fenotípica de microorganismos degradadores de hidrocarburos ............. 58
3.4 Determinación de la actividad degradativa de petróleo ..................................................... 60
3.5 Identificación molecular .................................................................................................... 62
Conclusiones ............................................................................................................................ 66
Recomendaciones .................................................................................................................... 67
Referencias............................................................................................................................... 68
Anexos ..................................................................................................................................... 81
Anexo 1 .................................................................................................................................... 81
Anexo 2 .................................................................................................................................... 89
Anexo 3 .................................................................................................................................... 91
Anexo 4 .................................................................................................................................... 94
Anexo 5 .................................................................................................................................... 95
Anexo 6 .................................................................................................................................... 96
Anexo 7 .................................................................................................................................. 100
Anexo 8 .................................................................................................................................. 105
Anexo 9 .................................................................................................................................. 106
Anexo 10 ................................................................................................................................ 108
 viii

Lista de Tablas

Tabla 1 ..................................................................................................................................... 51
Tabla 2 ..................................................................................................................................... 55
Tabla 3 ..................................................................................................................................... 57
Tabla 4 ..................................................................................................................................... 58
Tabla 5 ..................................................................................................................................... 60
Tabla 6 ..................................................................................................................................... 62
 ix

Lista de Figuras

Figura 1 .................................................................................................................................... 64
Figura 2 .................................................................................................................................... 64
Figura 3 .................................................................................................................................... 65
Figura 4 .................................................................................................................................... 65
 x

Introducción

La contaminación ambiental ha tenido un crecimiento exponencial en los últimos años,

debido a las malas prácticas en la elaboración o industrialización de distintos productos

perjudicando de forma directa o indirecta los distintos ecosistemas.

Los hidrocarburos son compuestos orgánicos que en su estructura se encuentra carbono

e hidrogeno principalmente y se forman debido a la descomposición de seres vivos o vegetales

que vivieron hace millones de años, tales hidrocarburos como el petróleo o gas se encuentran

en depósitos de rocas en cuencas como materiales solidos a varios kilómetros bajo tierra o el

mar donde son extraídos en estado líquido o gaseoso. Estos hidrocarburos son una fuente rica

en energía para todas las industrias, también para las distintas actividades cotidianas. Además,

no solo actúan como combustibles sino a través de diferentes procesos se separan en distintos

compuestos que pueden ser aprovechados a través de la industria petroquímica. (Ministerio de

Energía y Minas,2012; Echeverry et al.,2010)

Los hidrocarburos son liberados al medio ambiente a partir de accidentes desde su

extracción o como productos secundarios a raíz de su comercio. Los derrames de petróleo son

las principales fuentes de contaminación tanto de suelos como de aguas ocasionando una grave

alteración de estos ecosistemas afectando su estructura y los bioprocesos naturales que se

siguen en las cadenas tróficas, ya que el petróleo es un componente toxico que produce daños

tanto en plantas, animales y seres humanos, pero el principal perjudicado son las poblaciones

de microorganismos que son importantes para el desarrollo del ecosistema y distintos procesos

biogeoquímicos (Vasudevan y Rajaram, 2001).

La biorremediación se basa en la degradación o transformación de los contaminantes en

productos menos peligrosos para el medio ambiente y la salud humana mediante el uso de
 xi

diferentes microorganismos como bacterias, hongos, microalgas, etc. Este proceso de

biodegradación se produce de forma natural y la biorremediación intenta potenciarla mediante

el uso de enzimas, nutrientes específicos para el crecimiento y así transformar los

contaminantes ya sean de origen orgánico, inorgánico o metales pesados que se encuentren en

el suelo, agua o aire (Izquierdo,2013).

Las comunidades microbianas desempeñan un papel importante en el flujo de energía,

transformación de nutrientes y reciclaje de elementos que se encuentran en el ambiente. Los

microorganismos poseen la capacidad de descomponer todo compuesto orgánico (García y

Aguirre,2015). Por ejemplo, el petróleo que está compuesto mayoritariamente por

hidrocarburos puede ser degradado en condiciones aeróbicas con mayor eficiencia.

Las bacterias nativas tienen la capacidad para degradar hidrocarburos ya que sobreviven

o se siguen desarrollando en ambientes contaminados por la presencia del petróleo crudo y sus

derivados (Head et al.,2006). Esta capacidad de las bacterias se debe a que utilizan el petróleo

como única fuente de carbono y energía para ser aprovechada en la biorremediación de

ambientes terrestres y acuáticos, donde esta técnica utiliza diferentes métodos como la

aplicación de enzimas, nutrientes específicos que favorecen el crecimiento de estos

microorganismos y el uso de microorganismos previamente adaptados al consumo del petróleo

u otros contaminantes (Das y Chandran, 2011).

Existen diferentes especies y géneros microbianos que tienen afinidad por ciertos

hidrocarburos como Acinetobacter, Pseudomonas que son capaces de degradar alcanos

monoaromáticos y poliaromáticos (Salleh et al.,2003); también los géneros Rhodococcus,

Bacillus, Psychrobacter y Shenewanella son capaces de degradar hidrocarburos.

El presente trabajo de investigación pretende estudiar el aislamiento, caracterización e

identificación de dos cepas aisladas a partir de diferentes muestras ambientales para la

 xii

degradación de petróleo mediante la evaluación de su actividad emulsificante y su actividad

degradativa utilizando petróleo crudo a diferentes concentraciones como única fuente de

carbono. Los resultados de la investigación brindaran nuevas alternativas para el uso de

microorganismos en procesos de biorremediación de petróleo.

 xiii

Objetivo General

- Aislar, caracterizar e identificar bacterias potencialmente degradadoras de petróleo a

partir de diferentes muestras ambientales.

Objetivos Específicos

• Determinar diferentes tipos de muestras ambientales.

• Aislar, caracterizar e identificar bacterias degradadoras de petróleo.

• Determinar la actividad emulsificante de cada cepa

• Evaluar y determinar las mejores cepas bacterianas para degradar petróleo.

 Capítulo I

Marco Teórico

1.1 Antecedentes de la investigación

• Biodegradación bacteriana por bioestimulación en suelos contaminados con petróleo

crudo.

Autor: Elizabet Samanez Gibaja

Resumen: Para el proceso de biodegradación bacteriana, se seleccionaron consorcios

bacterianos de acuerdo a su capacidad degradativa y emulsificante (Pseudomonas aeruginosa

TX-5, Acinetobacter calcoaceticus T2X-1, Bacillus sp. TX-4)

• Quantitative evaluation of in-situ bioremediation of compound pollution of oil and

heavy metal in sediments from the Bohai Sea, China (2020)

Autores: Wang, Chuanyuan; He, Shijie; Zou, Yanmei; Liu, Jialin; Zhao, Ruxiang; Yin,

Xiaonan; Zhang, Haijiang; Li, Yuanwei.

 2

Resumen: En el mar de Bohai se llevó a cabo un típico proyecto de ingeniería de

biorremediación in situ para sedimentos marinos derramados de petróleo y se llevó a cabo una

evaluación cuantitativa de la restauración ecológica.

Las eficiencias de biorremediación de n-alcano y PAH en el sedimento son 32,84 ± 21,66% y

50,42 ± 17,49% después de 70 días de biorremediación, y 60,99 ± 10,14% y 68,01 ± 18,60%

después de 210 días, respectivamente. Después de 210 días de biorremediación, las tasas de

degradación de los HAP de dos a tres anillos y de los HAP de cuatro anillos son 84,44 ± 23,03%

y 26,62 ± 43,76%, respectivamente. Además, las concentraciones de los metales pesados

aumentaron primero en un 6,00% debido a la degradación y liberación del derrame de petróleo,

y luego disminuyeron en un 72.60% con la degradación del petróleo causada por la

biorremediación o la migración vertical.

Según el seguimiento continuo, la composición de la comunidad microbiana en el área

restaurada fue similar a la del área de control y el área limpia en el mar de Bohai después de

210 días de biorremediación.

• Biodegradation of polyethylene mulching films by a co-culture of Acinetobacter sp.

Strain NyZ450 and Bacillus sp. strain NyZ451 isolated from Tenebrio molitor larvae

(2020)

Autores: Yin, Chao Fan; Xu, Ying; Zhou, Ning Yi

Resumen: La degradación microbiana de las películas de acolchado de polietileno (PE) ha

atraído mucha atención, pero hasta la fecha su biodegradación relativamente rápida era

limitada. Aquí, un consorcio de dos cepas bacterianas, Acinetobacter sp. cepa NyZ450 y

Bacillus sp. Se sugirió que la cepa NyZ451 del intestino de larvas de Tenebrio molitor (gusanos

de la harina) que se alimentan de PE utiliza PE, aunque cada cepa no tiene tal capacidad por sí

sola. Este consorcio eliminó aproximadamente el 18% de la película de PE después de 30 días

a 23 ◦C. Bajo microscopio electrónico de barrido, también se observó una biopelícula formada
 3

por estas cepas en la superficie de la película. El análisis de espectroscopia infrarroja

transformada de Fourier indicó que las películas incubadas con estas dos cepas o cualquiera de

ellas estaban oxidadas en comparación con el control sin inoculación. El recuento de colonias

en placa y la observación con microscopio electrónico mostraron que la cepa NyZ450 era

predominante en el cocultivo.

• Isolation, enhanced growth, and degradation characterization of a strain marine

petroleum degrading bacteria (2020)

Autores: Yang, Yuping; Liu, Yingying; Li, Nana; Shi, Ke; Xue, Jianliang; Gao, Yu; Xiao,

Xinfeng

Resumen: Se estudió la vía de degradación del diésel por las bacterias. Los resultados

mostraron que la cepa de HDMP2 era Halomonas sp. nmyj-1. Los principales factores de

crecimiento que afectaron al HDMP2 fueron la velocidad de rotación, la concentración de

inóculo, el pH y la concentración de sal según los resultados del análisis de varianza. Cuando

la velocidad de rotación fue de 179,85 r / min, la concentración de inóculo fue de 2,20%, el

valor de pH fue de 7,86 y la concentración de sal fue de 5,99%, la biomasa de HDMP2 fue la

más alta. Además, cuando la velocidad de rotación fue de 180 r / min, la concentración de

inóculo fue de 2,73%, el valor de pH fue de 7,39 y la concentración de sal fue de 4%, la tasa

de degradación del diésel por HDMP2 fue la más alta y la tasa de degradación prevista podría

llegar al 50,31%. En el proceso de degradación, la degradación del diésel por HDMP2 fue un

proceso dinámico.

• Potential for native hydrocarbon-degrading bacteria to remediate highly weathered oil

polluted soils in Qatar through self-purification and bioaugmentation in biopiles

Autores: AlKaabi, Nasser; Al-Ghouti, Mohammad A.; Jaoua, Samir; Zouari, Nabil

Resumen: Las bacterias autóctonas estarían altamente adaptadas y, cuando se reintrodujeran o

estimularan, contribuirían a la rehabilitación de estos sitios. Se realizó un muestreo sistemático

 4

del suelo y se analizaron las muestras de suelo. Los resultados mostraron claramente las duras

composiciones químicas (alta salinidad y contenidos de componentes de petróleo totales en el

rango de los orgánicos del aceite). Mediante la implementación de un procedimiento de

aislamiento de bacterias altamente adaptadas, se aislaron pocas bacterias degradantes de

hidrocarburos con el objetivo de seleccionar aquellas para aplicaciones posteriores. Su

identificación por ribotipado mostró dominancia de Bacillus y Virgibacillus en el sitio

AlZubara, y Bacillus y Pseudomonas en el sitio Dukhan. Todas las cepas bacterianas fueron

altamente tolerantes al 10% de diésel y mostraron un potencial de remoción del 20% al 85%

de los hidrocarburos C10 a C36.

• Isolation and Characterization of Hexadecane Degrading Bacteria from Oil- polluted

soil in Gio Community, Niger Delta, Nigeria (2020)

Autores: Okoye, A. U.; Chikere, C. B.; Okpokwasili, G. C.

Resumen: Este estudio investigó la presencia de degradadores de hexadecano indígenas viables

en suelos contaminados crónicamente en la comunidad de Gio, Delta del Níger. El total de

hidrocarburos cultivables que utilizan el recuento bacteriano (TCHUB) para GPS, GPSS y

GUPS fueron 6,6 × 105 ufc / g, 6,4 × 105 ufc / gy 3,96 × 104 ufc / g, respectivamente. De las

22 bacterias aisladas y caracterizadas por el método de enriquecimiento con petróleo crudo,

Pseudomonas sp. (65%), Bacillus sp. (66%), Achromobacter sp. Proteus sp. (45%) y Serratia

sp. (40%). demostró un mayor potencial de biodegradación para el hexadecano usando el

indicador redox de 2,6- diclorofenol indofenoles (DCPIP). En conclusión, las bacterias

autóctonas existentes son metabólicamente activas, pueden degradar eficazmente el

hexadecano y podrían ser buenas candidatas para la biorremediación.

• Enhanced biodegradation of crude oil by constructed bacterial consortium comprising

salt-tolerant petroleum degraders and biosurfactant producers (2020)

 5

Autores: Chen, Weiwei; Kong, Yachao; Li, Junde; Sun, Yanyu; Min, Jun; Hu, Xiaoke

Resumen: En este estudio, dos bacterias productoras de biosurfactantes y degradantes del

petróleo crudo tolerantes a la sal, Dietzia sp. CN-3 y Acinetobacter sp. HC8–3S, se combinaron

funcionalmente para construir un consorcio bacteriano. El consorcio logró una eficiencia de

degradación del petróleo crudo del 95,8% en 10 días y varios n-alcanos, cicloalcanos, alcanos

ramificados e hidrocarburos aromáticos se agotaron con mayor eficacia que las cepas simples.

Optimización funcional del petróleo crudo degradado por consorcio de manera eficiente en un

amplio rango de pH (4–10) y salinidad (0–120 g L – 1). En microcosmos de suelos

contaminados artificialmente con petróleo crudo y bioaumentados con el consorcio, el 58,3%

del total de hidrocarburos de petróleo se agotaron después de 60 días y la tasa de degradación

(485,8 mg kg −1 d − 1) fue superior a las reportadas en estudios previos. En consecuencia, el

consorcio es un candidato prometedor en la biorremediación del petróleo crudo.

• Biodegradation of MC252 polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes in two coastal

wetlands (2020)

Autores: Rodriguez, Matthew; Elango, Vijaikrishnah; Curtis, David; Collins, Autumn W.;

Pardue, John H.

Resumen: Las técnicas complementarias de evaluación microbiana y geoquímica investigaron

la biodegradación de HAP y alcanos en marismas afectadas por el petróleo crudo tras el

derrame de Macondo. Se observó contaminación en los 10 cm superiores del perfil de la

marisma con base en el análisis de PAH y la medición de la firma δ13C de los suelos de la

marisma impactados. Se observó una población microbiana diversa en ambos lugares

dominados por Gamma proteobacteria e incluyendo degradadores de hidrocarburos conocidos

como Marinobacter y Alcanivorax. Hubo una riqueza compartida entre los sitios y las

estaciones, pero los resultados sugirieron un cambio sustancial de filotipos en el espacio y el

 6

tiempo. La biodegradación de alcanos y HAP alquilados se produjo cuando se suministró

oxígeno en reactores de laboratorio, pero no en ausencia de oxígeno.

• The effect of bioaugmentation with Exiguobacterium sp. AO-11 on crude oil removal

and the bacterial community in sediment microcosms, and the development of a liquid

ready to use inoculum (2020)

Autores: Muangchinda, Chanokporn; Srisuwankarn, Phadungkwan; Boubpha, Sysouvanh;

Chavanich, Suchana; Pinyakong, Onruthai

Resumen: Este estudio demuestra la viabilidad de utilizar Exiguobacterium sp. AO-11 para

remediar entornos contaminados con aceite. La bioaumentación usando AO-11 mostró el mejor

porcentaje de remoción, 75%, de 4% (p / p) de petróleo crudo en microcosmos de sedimentos

en 100 días. En términos de la estructura de la comunidad bacteriana durante la degradación

del petróleo crudo, la adición de AO-11 no cambió la comunidad bacteriana indígena, mientras

que la adición de fertilizante de urea indujo un cambio estructural de la comunidad bacteriana

indígena. Exiguobacterium sp. AO-11 se desarrolló como un producto de biorremediación y se

desarrolló una formulación líquida de AO-11. En general, la bioaumentación con la cepa AO-

11 podría ser una solución eficaz para la biorremediación de entornos contaminados con

petróleo crudo.

• Production, characterization, evaluation and toxicity assessment of a Bacillus cereus

UCP 1615 biosurfactant for marine oil spills bioremediation (2020)

Autores: Durval, Italo José B.; Mendonça, Ana Helena R.; Rocha, Igor V.; Luna, Juliana M.;

Rufino, Raquel D.; Converti, A.; Sarubbo, L. A.

Resumen: En este estudio, se cultivó Bacillus cereus en un medio mineral compuesto por un

2% de aceite para freír y un 0,12% de peptona para producir un biosurfactante. La producción

se aumentó de matraces a biorreactores de 1.2, 3.0 y 50 L, donde la tensión superficial alcanzó

28.7, 27.5 y 32 mN / my la concentración de biosurfactante 4.3, 4.6 y 4.7 g / L, respectivamente.

 7

El biosurfactante se caracterizó como aniónico, mientras que los análisis de resonancia

magnética nuclear, cromatografía de capa fina y cromatografía de gases revelaron su naturaleza

lipopéptidica. Además, el biotensioactivo estimuló el crecimiento de microorganismos

autóctonos independientemente de la presencia de aceite de motor en bioensayos realizados en

agua de mar. Estos resultados demuestran que el biosurfactante es biocompatible y tiene

potencial para la producción a escala industrial y su aplicación a la biorremediación de entornos

marinos contaminados por derrames de petróleo.

• Biodegradation of high concentrations of petroleum compounds by using indigenous

bacteria isolated from petroleum hydrocarbons-rich sludge: Effective scale-up from

liquid medium to composting process (2019)

Autores: Koolivand, Ali; Abtahi, H.; Parhamfar, Maryam; Didehdar, Mojtaba; Saeedi, Reza;

Fahimirad, Shohreh

Resumen: Se estudió la ampliación de la biorremediación de lodos ricos en hidrocarburos de

petróleo (PHRS) de medio líquido a un método de compostaje bioaumentado con dos bacterias

autóctonas, capaces de degradar altos niveles de petróleo crudo. Después de aislar las cepas

(cepa KA1 de Sphingomonas olei y cepa KA2 de Acinetobacter radioresistens) y determinar

su producción de biomasa, índice de emulsificación (E24), adhesión bacteriana a hidrocarburos

(BATH) y degradación del crudo en medio líquido, se inocularon en los experimentos de

compostaje. En medio líquido, la tasa de remoción de petróleo crudo fue de 67.25, 70.86, 61.77,

42.13 y 27.92%, respectivamente para los niveles iniciales de petróleo de 1, 2, 3, 4 y 5%

después de 7 días. También se calculó que la degradación de concentraciones de 10, 20, 30, 40

y 50 g kg −1 de hidrocarburos totales de petróleo (TPH) fue de 91,24, 87,23, 84,69, 74,08 y

60,14%, respectivamente, después de una duración de compostaje de 12 semanas.

• Microbial diversity and bioremediation of rhizospheric soils from Trindade Island –

Brazil (2019)
 8

Autores: Camacho-Montealegre, Celia Marcela; Rodrigues, Edmo Montes; Tótola, Marcos

Rogério

Resumen: Los ambientes prístinos pueden albergar comunidades microbianas complejas con

potencial metabólico para su uso en la biorremediación de contaminantes orgánicos. Este

estudio tuvo como objetivo evaluar la biodegradación del petróleo crudo por comunidades

microbianas presentes en suelos rizosféricos de Bulbostylis nesiotis y Cyperus atlanticus en la

isla Trindade y la estructura composicional de estas comunidades. Después de 60 días en

condiciones aeróbicas, la biodegradación de los hidrocarburos totales de petróleo osciló entre

el 66 y el 75%, dependiendo de la especie de planta y el origen de las muestras de suelo. No

hubo respuesta de biodegradación del petróleo a la fertilización con N: P: K (80: 160: 80 mgdm

− 3).

1.2 Hidrocarburos

Aun con la aparición de distintas alternativas de energía renovable, los productos de los

hidrocarburos siguen siendo la mayor fuente de energía para las actividades antrópicas. La

producción de productos petrolíferos y su distribución por todo el mundo implica varias

operaciones de producción como las ascendentes (extracción), intermedias (refinado) o

descendentes (suministro). Debido al altor valor económico de los productos petrolíferos se

extreman las precauciones para evitar hasta la más mínima perdida en sus diferentes etapas. A

pesar de las distintas medidas adoptadas para evitar pérdidas del producto se producen vertidos

accidentales que causan un gran riesgo para el medio ambiente (Wu et al.,2014).

Tanto el petróleo como sus derivados son una de las amenazas medioambientales más

graves para los ecosistemas acuáticos (Scoma et al.,2017). Hace falta nuevas medidas de

mitigación como métodos físicos, químicos y biológicos para remediar las distintas zonas

marinas contaminadas (Tewari y Sirvaiya,2015).

 9

El petróleo es un recurso natural que se encuentra en grandes depósitos en la corteza

terrestre, producido por la descomposición térmica de materia orgánica que está enterrada por

millones de años. El crudo de petróleo es una de las principales fuentes de energía alcanzando

una demanda de 97,2 millones de barriles diarios. El petróleo se caracteriza por su densidad y

su contenido de azufre ya que es una mezcla compleja de hidrocarburos que contienen

pequeñas fracciones de moléculas orgánicas que tienen nitrógeno, azufre, oxígeno y pequeñas

trazas de níquel y vanadio. Sin embargo, la composición del petróleo varía según su la

profundidad del pozo, la edad del yacimiento y su ubicación. Por su estructura química, los

componentes del petróleo se clasifican en cuatro grandes fracciones: aromáticos, alifáticos,

asfáltenos y resinas.

Aromáticos: Estos poseen uno o más anillos de carbono aromáticos en sus estructuras.

Por un lado, los hidrocarburos aromáticos monocíclicos (HAM) están compuestos por solo un

anillo aromático. El benceno, el tolueno, el etilbenceno y los xilenos son contaminantes muy

conocidos por su alta volatilidad y solubilidad en agua. Por otro lado, los hidrocarburos

aromáticos policíclicos (HAP) contienen dos o más anillos de benceno. Así tenemos a los

hidrocarburos aromáticos policíclicos ligeros que contienen dos o tres anillos como el

naftaleno, el antraceno y el fenantreno; y los hidrocarburos aromáticos policíclicos pesados que

están compuestos por cuatro o más anillos de benceno como el pireno y fluoranteno.

Alifáticos: Las moléculas alifáticas son estructuras lineales o ramificadas de cadena

abierta, como los n-alcanos, cicloalcanos, esteranos, isoalcanos y terpenos. Pueden ser

hidrocarburos saturados o insaturados con dobles enlace de carbono. Los n-alcanos se

clasifican según su peso molecular en: alcanos gaseosos, alcanos de bajo peso molecular (de 8

a 16 Carbonos), alcanos de peso molecular medio (de 17 a 28 Carbonos) y alcanos de alto peso
 10

molecular (mayores a 28 Carbonos). Estos hidrocarburos alifáticos son los que más abundan

en el petróleo crudo.

Resinas y asfáltenos: Las resinas y asfáltenos contienen diversos grupos funcionales

polares que están formados por nitrógeno, azufre, oxígeno y trazas de níquel, vanadio, hierro

y compuestos aromáticos con cadena alquílica larga. Los asfáltenos son compuestos de alto

peso molecular dispersos en las fracciones saturadas y aromáticas (Macaya et al.,2019)

Los hidrocarburos del petróleo son un importante recurso energético y la materia prima

para diversas industrias. Ante la increíble demanda de productos petrolíferos que son usados

en distintas actividades humanas puede provocar su escasez y aumentar el costo, ya que aún no

se han desarrollado o apostado por nuevas alternativas (Varjani et al., 2015; Varjani y Upasani,

2016).

El petróleo crudo es una mezcla de diversos hidrocarburos tanto simples como complejos

y que son degradados por varios microorganismos autóctonos capaces de descomponer un

grupo específico de moléculas. Se ha informado de trabajos que el mismo compuesto en

diferentes muestras de petróleo fue degradado en distintos porcentajes por los mismos

organismos, llevando a creer que la razón podría ser la biodisponibilidad de un compuesto

específico en una muestra de petróleo y no tanto por su estructura química (Ghazali et al.,2004).

El petróleo se produce debido a la descomposición térmica de la materia orgánica que

lleva enterrada a lo largo de millones de años. Este a su vez es extraído del subsuelo y es

transportado a las refinerías donde se somete a la destilación para producir distintos productos

(Varjani,2014). Petróleo en latín significa “aceite de roca” que es a su vez como un líquido

oscuro, viscoso y pegajoso. Los hidrocarburos del petróleo están compuestos en su mayoría

por proporciones variables de carbono e hidrogeno, sin embargo, también contienen nitrógeno,

azufre y oxigeno (Varjani et al.,2015). Este puede clasificarse en función de las proporciones
 11

relativas de los componentes de peso molecular pesados presentes en el petróleo, cerca del 85%

de los componentes de los diferentes tipos de petróleo crudo pueden clasificarse como (1) base

asfáltica, (2) base parafínica y (3) base mixta (Varjani,2014).

El petróleo crudo puede clasificarse en cuatro grandes fracciones (a) saturados o

alifáticos, (b) aromáticos o anillados, (c) resinas y (d) asfáltenos (Chandra et al.,2013). Los

alifáticos se definen como hidrocarburos sin dobles enlaces y son los que se encuentran en

mayor porcentaje dentro del petróleo crudo; según su estructura química se clasifican en

alcanos (parafinas) y cicloalcanos (Abbasian et al.,2015). Los hidrocarburos aromáticos

contienen uno o varios anillos aromáticos que suelen estar sustituidos por distintos grupos

alquílicos (Meckenstock et al.,2016). En comparación con las fracciones saturadas como

aromáticas, las resinas y asfáltenos contienen compuestos polares no hidrocarbonados. Estas

dos fracciones tienen estructuras de carbono muy complejas y en su mayoría desconocidas ya

que llevan muchos átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre (Chandra et al.,2013).

Así, cada componente tiene un comportamiento químico distinto a los demás que afecta

a su biodegradabilidad (Costa et al.,2012). Estructuralmente los cuatro componentes

principales de los hidrocarburos del petróleo, los saturados son los que se encuentran en la capa

más externa, mientras que los asfáltenos al ser componentes de mayor masa molar constituyen

la parte más interna del petróleo (Varjani, 2014).

Los HAP contienen más de un anillo de benceno, los que están formados por dos o tres

anillos cíclicos formando varias cadenas hexagonales con dobles enlaces como el naftaleno

(dos anillos), el fenantreno y el antraceno (tres anillos), se denominan hidrocarburos aromáticos

policíclicos de bajo peso molecular o ligeros. Los HAP de cuatro anillos o más como el pireno

y los crisenos (cuatro anillos), el fluoranteno y en benzopireno (cinco anillos) se denominan

hidrocarburos aromáticos policíclicos de alto peso molecular o pesados (Costa et al.,2012).

 12

Resinas: Contienen diversos grupos funcionales polares formados con nitrógeno,

oxígeno y azufre además de metales traza (níquel, vanadio, hierro). Las resinas son sólidos

amorfos que están disueltos en el petróleo. Estos contienen compuestos aromáticos de cadena

alquílica larga siendo solubles en n-pentano y n-heptano. Estructuralmente son similares a las

moléculas tensioactivas del petróleo y actúan como agentes peptizantes.

Asfáltenos: Son moléculas de color marrón oscuro, grandes y complejas que se dispersan

coloidalmente en saturados y aromáticos ya que contienen numerosos grupos funcionales

polares. Son solubles en hidrocarburos aromáticos ligeros como el benceno y tolueno. También

son viscosos y de alto peso molecular ya que están compuestos por grupos policíclicos

sustituidos de forma variable con grupos alquilos provocando una gran resistencia a la

biodegradación. Los agentes peptizantes como las resinas mantienen los asfáltenos en

suspensión, de esta forma promueven a la estabilidad del petróleo crudo (Chandra et al.,2013).

1.2.1 Contaminación por hidrocarburos

También las refinerías de petróleo generan grandes cantidades de lodos con

hidrocarburos que no logran procesarse por completo debido a sus características desfavorables

como su contenido bajo en aceite, niveles elevados de asfáltenos y su alta densidad.

Actualmente, la sociedad se ve afectada por problemas medioambientales causados por

la industrialización que usan compuestos contaminantes que se liberan diariamente y que

pueden ocasionar daños en todos los ecosistemas del mundo (Gaur et al.,2014).

El deterioro del medio ambiente en el mundo ha sido provocado por actividades

antropogénicas como el aumento de la agricultura y de las industrias han perjudicado a los

seres humanos tanto a la flora y fauna ocasionando problemas ecológicos que solo llevan al
 13

suministro incontrolado de una diversidad de contaminantes. No obstante, diversos

microorganismos pueden utilizar el petróleo como fuente de alimento (Kumar et al.,2011).

Un grave problema internacional de los últimos tiempos son los derrames de petróleos

ya que pueden causar distintos impactos en el medio marino consiguiendo distribuirse por el

agua de mar, los sedimentos e incluso a los diferentes organismos. Es por eso la necesidad de

proporcionar una estrategia adecuada para eliminar el petróleo crudo de las zonas contaminadas

(Beyer et al.,2016).

Debido a la excesiva expansión petrolífera en alta mar, su transporte y otras actividades

industriales ha causado que los ecosistemas marinos se vean amenazados por los vertidos de

petróleo. Según los datos obtenidos entre el 2010 y 2015 se alcanzó un total de 330 000

toneladas de petróleo derramado en el océano a nivel mundial (ITOPF, 2016). Cuando el

petróleo entra en el océano se propaga muy rápido invadiendo las costas mediante las mareas

y olas (Agarwal y Liu,2015). Este contaminante es difícil de ser eliminado y puede permanecer

en las zonas intermareales por cientos de años, ya que el petróleo tiene una alta densidad, una

baja solubilidad y una fuerte estabilidad causando una descontrolada acumulación en los

organismos acuáticos (Duran y Cravo-Laureau,2016).

En años recientes, el aumento de la demanda de petróleo ha crecido exponencialmente y

con ello lleva a exploraciones constantes de yacimientos como la explotación y su posterior

transporte causando problemas ambientales por derrames de petróleo y otros accidentes. Estos

accidentes afectan a los ecosistemas marinos causando varios cambios físicos y químicos en el

agua de mar afectando la fotosíntesis de las plantas y el desarrollo de los organismos acuáticos

provocando una gran amenaza (Yan et al.,2019).

 14

Una de las cuestiones más importantes ha sido el cómo resolver los peligros causados

por la contaminación por petróleo en zonas marítimas convirtiéndose en prioridad de muchos

países para garantizar una buena gobernanza ambiental (Ahmed et al.,2019).

Los derrames de petróleo constituyen un peligro constante en todas las partes del mundo

ya que causan daños irreversibles al medio ambiente, es por eso que requieren medidas

preventivas o de remediación. Se han informado sobre distintos accidentes causados por

derrames de petróleo entre ellos lo ocurrido en agosto del 2019 en Brasil, afectando más de

3000 km de la costa noreste de Brasil provocando el peor desastre ambiental en la historia de

la cuenca del Atlántico Sur. La contaminación alcanzo a más de 980 localidades de nueve

estados y se recogió alrededor de 1000 toneladas de petróleo de las playas. También, provoco

fuertes impactos sobre 27 especies en peligro de extinción, además de afectar distintas

actividades económicas como el turismo y la pesca implicando aproximadamente a 870 000

personas involucradas (Magris y Giarrizzo, 2020).

Cabe resaltar que hay distintos problemas en la industria petrolera como fugas, vertidos

que involucran combustibles fósiles y sus subproductos (Silva et al.,2014). En los últimos años,

se ha intensificado la creación de distintos organismos de control ambiental que puedan aplicar

sanciones cuando se determinen responsabilidades de las empresas. Por ejemplo, los

hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son los productos que más preocupan cuando se

ocasiona un derrame de petróleo debido a sus propiedades que causan un peligro para la salud

humano, es por eso que necesitan procesos de remediación específicos (Lamichhane et

al.,2017). Diversos estudios se han centrado en la remediación tanto de aguas como suelos

contaminados por hidrocarburos aromáticos policíclicos utilizando extracción con disolventes,

biorremediación, fitorremediación (Nharingo y Moy, 2016), la oxidación química, la

degradación fotocatalítica, el tratamiento térmico, los procesos enzimáticos (Eibes et al., 2015)
 15

y los procesos con algas (Zeraatkar et al., 2016). También se han utilizado tipos de remediación

combinados, por ejemplo, tratamiento químico y biológico.

La contaminación de los hidrocarburos en los suelos, agua de mar, agua dulce y

sedimentos se produce durante la extracción, refinado, transporte y el almacenamiento del

petróleo, ocasionando un fuerte impacto negativo en los ecosistemas. Así pues, se han aplicado

distintos enfoques de remediación para recuperar los lugares contaminados por el petróleo.

Los distintos productos derivados del petróleo son la principal fuente de energía para

diversas industrias como también en la vida cotidiana de los seres humanos. No obstante,

durante la exploración, extracción, producción, refinado, transporte, almacenamiento y

obtención de productos petrolíferos se producen constantemente derrames y fugas accidentales

provocando una fuerte contaminación ambiental. En 2018, los derrames de petróleo en todo el

mundo alcanzaron unas 116 000 toneladas, provocando distintos impactos en ecosistemas

marinos como terrestres. Es por eso, que la remediación de los sitios contaminados es vital para

recuperar los ambientes aplicando distintas estrategias teniendo en cuenta las propiedades

fisicoquímicas del petróleo como coeficientes de difusión en el aire, de sorción del carbono

orgánico, de solubilidad en el agua; ya que son relevantes para desarrollar técnicas de

remediación o biorremediación (Macaya et al.,2019)

Por un lado, la volatilización de los hidrocarburos alifáticos en especial los de bajo peso

molecular son los dominantes en los procesos de meteorización del petróleo crudo.

Generalmente, los alcanos y alquenos son más volátiles que los compuestos aromáticos. Por

otro lado, los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son altamente hidrofóbicos y

prefieren adsorberse a los sedimentos y suelos, mostrando una baja solubilidad en las aguas

subterráneas. Cuando se ocasionan los vertidos de petróleo en el agua, los hidrocarburos de

bajo peso molecular tienden a evaporarse, mientras que los hidrocarburos de alto peso
 16

molecular descienden por el agua y se depositan en los sedimentos. Además, la contaminación

de la superficie del agua, puede inhibir los distintos sistemas biológicos, bloqueando la

transferencia de nutrientes, de oxígeno y luz (Chandra et al.,2013)

Además, la cantidad de oxigeno disminuye, ocasionando que se reduzca la

biodegradación aeróbica. En aguas subterráneas, el oxígeno disuelto es consumido rápidamente

por los microorganismos mediante un proceso aeróbico y con esto promueve condiciones

anaeróbicas. Las propiedades físicas del suelo como tamaño de partículas, porosidad, contenido

de materia orgánica, permeabilidad; afectan la distribución de los hidrocarburos en la matriz.

Hay dos fracciones de hidrocarburos que están presentes en las partículas sólidas como el suelo

y sedimentos. La primera fracción contienen a los hidrocarburos fuertemente absorbidos por la

materia orgánica del suelo como BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno, xileno) y los

hidrocarburos aromáticos policíclicos disminuyendo su biodisponibilidad y biodegradación. La

segunda fracción contiene a los hidrocarburos capaces de desorberse y difundirse desde las

partículas sólidas hacia las liquidas; aumentando su biodisponibilidad y biodegradación.

Los sedimentos son producidos gracias a la erosión de las rocas y las fracciones

inorgánicas, favoreciendo el transporte del petróleo en los distintos medios acuáticos. Así, en

los sedimentos marinos, los hidrocarburos del petróleo como por ejemplo BTEX, naftalina

pueden alcanzar capas superiores hasta 30 cm, permitiendo su sorción en materiales

sedimentarios hidrofóbicos. Los hidrocarburos pueden persistir en estos entornos debido a su

escasa biodisponibilidad y las condiciones toxicas que no permiten el proceso de degradación

biológica por parte de microorganismos. Las propiedades fisicoquímicas de las matrices

contaminadas afectan la eficacia de las distintas técnicas de remediación. Además, la

temperatura, pH, concentración de oxígeno, humedad, salinidad y presencia de metales pesados

 17

son influyentes en la estructura microbiana ocasionando que la degradación de los

hidrocarburos no sea la adecuada (Das y Chandran, 2011).

Debido a todos los daños que ocasionan los contaminantes de hidrocarburos del petróleo

se han denominado compuestos recalcitrantes siendo clasificados como contaminantes

prioritarios (Costa et al.,2012). Las actividades antropogénicas, como escorrentías municipales

e industriales, el vertido de efluentes, las actividades de la industria petrolera tanto en tierra

como en mar, así como los vertidos accidentales han contribuido con el deterioro del planeta.

Esta contaminación por hidrocarburos afecta al ambiente causando un riesgo sea de forma

directa o indirecta para la salud de todas las especies del planeta (Souza et al.,2014). El

ambiente marino es considerado como el mayor y ultimo sumidero de los contaminantes de los

hidrocarburos del petróleo, siendo imprescindible combatir este tipo de contaminación (Varjani

y Srivastava,2015). La remediación de los contaminantes de hidrocarburos sigue siendo de los

problemas pendientes que tiene la industria petrolera (Varjani et al.,2015).

Estos contaminantes son denominados también contaminantes orgánicos persistentes

debido a su biomagnificacion provocando daños extensos o permanentes en los distintos

ecosistemas del planeta (Chandra et al.,2013). La mayoría de contaminantes de hidrocarburos

se dan a través de derrames y fugas en tanques subterráneos, vaporizadores, sitios de refinería

abandonados causando la contaminación del suelo superficial, aguas subterráneas y el propio

océano (Souza et al.,2014). Diversos componentes del crudo de petróleo son recalcitrantes y

muy tóxicos debido a la presencia de sustancias hemotoxicas y carcinogénicas; entre ellos los

BTEX y los hidrocarburos aromáticos policíclicos (Costa et al.,2012, Chandra et al.,2013,

Souza et al.,2014). La asfixia, la anoxia, el retraso en el crecimiento y las alteraciones en las

distintas vías metabólicas han causado un desequilibrio hormonal en las diferentes formas de

vida causando efectos tanto directos como indirectos (Souza et al.,2014). Los impactos a largo
 18

plazo incluyen malformaciones en el desarrollo de las especies marinas como, por ejemplo:

falta de pigmentación, cráneos sin fusionar y reducción de las mandíbulas. (Varjani,2014).

Todos estos efectos provocan cambios en las poblaciones o en las comunidades de las especies

trayendo como consecuencia un desorden en todo el ecosistema. Por un lado, los compuestos

orgánicos volátiles (COV) del petróleo crudo son extremadamente dañinos para los seres

humanos (Souza et al.,2014). Por otro lado, los hidrocarburos aromáticos policíclicos tienen el

potencial para inducir tumores malignos que afectan a la piel como otros tejidos epiteliales, ya

que por su composición tienen una gran afinidad por centro nucleofílico del ADN, ARN y

proteínas (Costa et al.,2012).

Los hidrocarburos del petróleo se subdividen en rangos específicos por el número de

carbonos para así evaluar el riesgo para la salud humana y ambiental (CCME, 2008, 2010).

Dichas fracciones pueden subdividirse en subfracciones y ser descritas por sus

características tanto químicas, físicas y toxicologías. La primera fracción es equivalente al

número de carbono de 6 a 10, representando la fracción más volátil de las mezclas de

hidrocarburos. La segunda fracción se define como el rango de carbono de 10 a 16,

representando la fracción semivolatil. La tercera fracción abarca el número de carbonos entre

16 a 34 y es considerada como la fracción no volátil. La cuarta fracción indica a los números

de carbonos mayores a 35 y son considerados los de menor volatilidad y solubilidad

(CCME,2008).

Es importante conocer el destino de los hidrocarburos en el medio ambiente para de

alguna forma poder controlarlos y emplear técnicas de remediación adecuadas (CCME,2010).

El petróleo crudo es sometido a distintos procesos de intemperie como: el esparcimiento,

evaporación, dispersión, hundimiento, disolución, emulsión, foto-oxidación y la

biodegradación (Souza et al.,2014). Los procesos de meteorización dependen de factores

 19

ambientales como las corrientes oceánicas y la temperatura. La alta resistencia de estos

contaminantes a la degradación microbiana tanto en el suelo o el agua se debe al tipo, al peso

molecular y el número de anillos en el caso de los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Así,

el naftaleno se biodegrada con facilidad, pero los hidrocarburos aromáticos policíclicos con

cuatro o más anillos tienden a degradarse mucho más lento. Cabe resaltar que la biodegradación

aeróbica se produce más rápido que la biodegradación anaeróbica (Abbasian et al.,2015).

1.3 Biorremediación de hidrocarburos

Tradicionalmente los métodos fisicoquímicos como la quema en el sitio, la dispersión y

barreras de petróleo aún están disponibles como técnicas de remediación. No obstante, estas

tecnologías son caras y pueden generar subproductos que son tóxicos para los ecosistemas ya

que son liberados al ambiente (Chen et al.,2016).

La biorremediación es una técnica útil para la limpieza de sitios contaminados con

petróleo crudo ya que es rentable, puede ser aplicada a grandes áreas y sobre todo no alterar el

medio ambiente. Algunas técnicas disponibles como la atenuación natural, bioestimulación o

bioaumentación. A pesar, que los métodos biológicos llevan más tiempo que los fisicoquímicos

estos alcanzan mejores resultados al degradar a los contaminantes por completo (Varjani y

Upasani,2017).

La bioaumentación se utiliza como una técnica alternativa para mejorar la degradación

de los contaminantes. Esta técnica alcanza el éxito siempre y cuando se consiga una alta

supervivencia de los microorganismos exógenos introducidos (Liang et al.,2020). Para que esta

técnica sea lo más económica posible, los microorganismos pueden cultivarse utilizando

sustratos de bajo coste, como diversos residuos agroindustriales; de esta forma se aprovechan

los residuos y se degradan los contaminantes (Sadh et al.,2018).

 20

Las distintas estrategias de remediación son necesarias para reducir los efectos

perjudiciales que ocasionan los derrames de petróleo. Existen métodos físicos, químicos y

biológicos, incluso se pueden combinar entre todos para mejorar los resultados de degradación.

Por un lado, los métodos químicos utilizan productos o compuestos que provocan la

coagulación o solubilización de los hidrocarburos; por ejemplo, detergentes como Tween 80,

Tween 85, sulfosuccinato de sodio, además estos tensioactivos pueden añadirse a los sitios

contaminados por hidrocarburos para ayudar a la solubilidad de los aceites (Zhao et al.,2015).

Por otro lado, los métodos físicos se encargan de contener los derrames o la eliminación de los

contaminantes mediante el uso de materiales adsorbentes (Wu et al.,2014).

Sin embargo, los métodos físicos para eliminar los hidrocarburos de lugares

contaminados son muy laboriosos e ineficientes. Así pues, los métodos químicos también

presentan desventajas como el uso de productos químicos que son caros y perjudiciales para

los distintos ecosistemas ya que pueden acumularse en el tiempo y persistir en el medio

ambiente. Alternativamente a los métodos físicos y químicos, la biorremediación o los métodos

biológicos que usan microorganismos específicos para los distintos contaminantes del petróleo

suelen ser eficaces y sin causar alteraciones en los ecosistemas, es por eso que se emplea

diferentes técnicas como bioaumentación, compostaje, bioventilación, etc. (Azubuike et

al.,2016). Las combinaciones de los productos químicos con el empleo de microorganismos

son eficaces para la degradación de hidrocarburos (Iraji y Ayatollahi, 2019).

A pesar de las distintas ventajas de la biorremediación requiere de tiempos prolongados

para degradar los distintos contaminantes debido a que los microorganismos pierden eficiencia

al estar en el entorno natural y también por las características recalcitrantes de los

hidrocarburos. Esta presencia recalcitrante en los hidrocarburos se debe principalmente a los

 21

distintos compuestos de alto peso molecular como asfáltenos, resinas y principalmente por los

hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), etc. (Hernandez-Lopez et al.,2015).

La biorremediación es una tecnología prometedora, amigable con los ecosistemas y muy

rentable debido a sus bajos costos de implementación capaz de restaurar o minimizar los

contaminantes de petróleo (Das y Chandran,2011; Varjani,2017). Esta es capaz de aprovechar

la capacidad de los distintos microorganismos para degradar y metabolizar los diferentes

contaminantes asimilando las moléculas orgánicas siendo aprovechadas como alimento y por

consecuencia se da un aumento de la biomasa y la conversión de los contaminantes en dióxido

de carbono y agua (Varjani,2017).

Dos de las tecnologías más aplicadas en el mundo son la bioestimulación y la

bioaumentación. Por un lado, la bioestimulación utiliza nutrientes que promueven el

crecimiento de los diferentes microorganismos degradadores de hidrocarburos propios de las

zonas contaminadas. Por otro lado, la bioaumentación incorpora microorganismos autóctonos

o no que son más eficaces para biorremediar los lugares contaminados. Distintas bacterias

degradadoras de Hidrocarburos se han aislado de distintos ecosistemas como, sedimentos,

suelos o ambientes acuáticos (Catania et al.,2018).

La biorremediación es el proceso en que se hace uso de diferentes microorganismos para

eliminar los contaminantes en una zona determinada. Esta técnica es capaz de erradicar los

contaminantes de una zona específica para así restaurar este ecosistema a su forma original

(Ayangbenro y Babalola,2017).

La biorremediación puede ser clasificada en función de sus ventajas, sus limitaciones, o

el lugar de aplicación en los siguientes tipos:

 22

Biorremediación “ex situ”: Esta técnica consiste en retirar las muestras para ser tratadas

lejos de los lugares contaminados siendo así una técnica costosa y de alterar los sitios naturales

(Guang-Guo,2018). Uno de los ejemplos más comunes dentro de esta técnica es el compostaje

que implica la degradación de la materia orgánica en presencia de un sinfín de

microorganismos que metabolizan los contaminantes generalmente a temperaturas elevadas

que van entre los 50º C a los 65º C.

Biorremediación “in situ”: Son las técnicas que tienen como fin degradar los distintos

contaminantes en el mismo lugar de la contaminación. Las principales técnicas de

biorremediación “in situ” son:

- Bioventilación: Esta técnica promueve la degradación de cualquier compuesto

contaminante mediante el suministro de oxígeno a los microorganismos que existen en

el suelo a una baja tasa de flujo para mantener el suficiente oxígeno para que los

microorganismos puedan metabolizar los contaminantes. Este suministro de oxígeno se

inyecta mediante pozos.

- Bioaumentación: Esta técnica implica un grupo diverso de cepas microbianas naturales

o algún microorganismo modificado genéticamente capaz de degradar contaminantes

de suelos o aguas. Generalmente, estos microorganismos son inoculados en plantas de

tratamientos de aguas residuales para activar estos biorreactores. Algunos estudios

indican que suelos o aguas subterráneas contaminadas con tricloroetileno o cloroetileno

utilizan esta técnica para degradar estos contaminantes en etileno y cloruro que no son

tóxicos para el medio ambiente.

- Biopiling: Es una tecnología que es usada a gran escala en la que se hacen grandes

agujeros para apilar la tierra contaminada y se suministra una gran cantidad de oxígeno.

Estos contaminantes se degradan en dióxido de carbono y agua. Estas biopilas se

 23

componen de un sistema de aireación, un sistema de riego para controlar la humedad y

temperatura y un sistema que recogerá los lixiviados. Es necesario controlar la

humedad, nutrientes, oxigeno, pH, temperatura ya que pueden afectar el proceso de

degradación (Das y Dash,2014).

Actualmente, las distintas tecnologías de remediación de contaminantes de hidrocarburos

se basan en métodos físicos, químicos y biológicos. Los métodos biológicos son procesos

semiespontaneos si incluyen algún tipo de intervención del hombre o pueden ser

completamente espontáneos. Al sitio contaminado se puede incluir microorganismos

mejorados artificialmente o utilizar los originales del mismo sitio para degradar los

hidrocarburos del petróleo en distintos medios sea el ambiente acuático o terrestre. A

comparación de los métodos químicos y físicos, la biorremediación tiene muchas ventajas

porque se da naturalmente, tiene buena eficacia para reducir los contaminantes, no altera los

ecosistemas en donde están los contaminantes a tratar, la implementación no es muy cara y

puede degradar contaminantes específicos. Últimamente, la biorremediación ha tomado

protagonismo para remediar diversos contaminantes en especial los causados por derrames de

petróleo (Li et al., 2016).

Hay distintas tecnologías de remediación física y química para remediar el crudo de

petróleo, por ejemplo, existen barreras, tratamientos térmicos, materiales sorbentes (Mapelli et

al.,2017). La biorremediación es considerada la más completa ya que es capaz de mineralizar

el petróleo crudo (Cui et al.,2020).

Los métodos físicos como químicos son caros ya que su implementación es difícil al

igual que los productos químicos son de alto costo, además de ser peligrosos para el ambiente

(Gaur et al.,2014). Paralelamente, la biorremediación ofrece distintas ventajas ya que es un

 24

tratamiento natural que utiliza organismos o sus productos para remediar los contaminantes de

los hidrocarburos (Muñiz-Hernández y Velázquez-Fernández, 2013).

Los organismos que son utilizados en la biorremediación pueden ser tanto

microorganismos como sus productos ya sean enzimas o metabolitos y hasta incluso las plantas

ofrecen una variedad de soluciones para remediar distintos contaminantes (Gaur et al.,2014).

Las diferentes técnicas de biorremediación se aplican a ecosistemas terrestres o lodos y también

a ecosistemas acuáticos o varios tipos de aguas residuales (Zhang et al.,2017). La atenuación

“in situ” incluye diferentes estrategias como la bioaumentación que implica la inoculación

directa de microrganismos a los sitios contaminados y la bioestimulación que adiciona los

nutrientes específicos para promover el crecimiento de los microorganismos de interés que son

capaces de remediar los contaminantes (Andreolli et al.,2015). La biorremediación de

contaminantes orgánicos es la menos costosa para los microorganismos y estos son capaces de

convertir los contaminantes en materia inorgánica y biomasa. Diferentes investigaciones han

estudiado el uso de diferentes microorganismos ya sean bacterias, algas u hongos para degradar

los contaminantes que estén presentes tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos

(Alegbeleye et al.,2017).

La biorremediación de derrames de petróleo ha tomado relevancia en países como Brasil,

Australia e Indonesia debido a sus extensas áreas de manglares ya que remediar hidrocarburos

aromáticos policíclicos es una labor compleja y que aun así los microorganismos por si solos

no son capaces de degradar completamente el petróleo, sino que es más eficiente la

biorremediación cuando se trabaja con consorcios microbianos (Santos et al.,2011).

La bioaumentación y la bioestimulación son dos estrategias relevantes dentro de la

biorremediación. Las bacterias que degradan hidrocarburos han sido ampliamente estudiadas

y usadas en diferentes ensayos para remediar distintos contaminantes. Sin embargo, hay
 25

factores ambientales que limitan la capacidad de las bacterias para remediar los hidrocarburos,

por ejemplo, baja temperatura, pH, metales pesados, humedad; también hay factores

nutricionales como algunos micro elementos que son necesarios para el desarrollo de ciertas

bacterias y por último la presencia heterogénea de los microorganismos en los lugares

contaminados. La combinación de la bioaumentación con la bioestimulación ha conseguido

buenos resultados para remediar lugares contaminados por hidrocarburos de petróleo.

Los microorganismos tienen una gran capacidad catabólica para reducir, mineralizar los

contaminantes del petróleo que estén presentes en diferentes ecosistemas como suelos, agua y

aire. Principalmente se utilizan dos técnicas para remediar los derrames de petróleo que son la

bioaumentación y la bioestimulación; ambas estrategias se basan en el uso de microorganismos

para degradar los contaminantes de los hidrocarburos. La bioaumentación añade

microorganismos autóctonos o exógenos para mejorar la eficacia ya que la microbiota nativa

es ineficiente para degradar los contaminantes. La bioestimulación se encarga de estimular a

los microorganismos que son capaces de degradar hidrocarburos mediante el suministro de

diversos nutrientes o algunos biosurfactantes.

La biorremediación ex situ es más costosa que los tratamientos in situ debido a los costos

que implica la excavación y el transporte de las muestras contaminadas. Tecnologías como los

biorreactores y biofiltros son utilizadas para remediar hexano, tolueno, benceno, xileno en

muestras tanto de agua como aire contaminadas (Macaya et al.,2019).

El éxito de la biorremediación en cualquiera de sus tecnologías se basa en conocer las

propiedades fisicoquímicas de las muestras contaminadas, la composición, la concentración y

tipos de hidrocarburos, factores ambientales y la capacidad de las comunidades microbianas

nativas o exógenas para degradar contaminantes específicos (Macaya et al.,2019; Das y

Chandran, 2011)
 26

Bioestimulación: La contaminación por hidrocarburos produce una alteración entre el

contenido natural de los suelos en cuanto a elementos como carbono, nitrógeno y fosforo. Esta

técnica acelera la degradación, ya que son suministrados los nutrientes necesarios para el

crecimiento de los microorganismos. Esta metodología puede ser aplicada a sistemas abiertos

como ecosistemas acuáticos, océanos, lagos, ríos y sistemas cerrados como tanques de

almacenamiento. En cuerpos de agua grandes es importante que la adición de nutrientes sea de

liberación lenta, debido a la dilución veloz en fuentes de agua. Además, los biosurfactantes son

moléculas que esparcen los hidrocarburos en pequeñas gotas, consiguiendo reducir la tensión

superficial e incrementar su disponibilidad para los microorganismos. Estos compuestos se

caracterizan por tener un dominio hidrofílico que puede estar constituido por azucares o

péptidos y un dominio hidrofóbico principalmente de ácidos grasos. Existen diversos

biosurfactantes como los ramnolipidos, trehalolipidos, celobiolipidos, soforolipidos, lípidos

polioles, diglicosil glicéridos, lipopolisacáridos, arthrofactin, lychesin A y B, surfactina,

viscosin, ornitina lisina, fosfolípidos, sulfonolipidos, alasan, etc. producidos por distintos

microorganismos como por ejemplo Candida bombicola, Pseudomonas fluorescens, Bacillus

subtilis, Acinetobacter radioresistens, Bacillus licheniformis, Rhodotorula graminus,

Arthrobacter, etc.

Bioaumentación: Esta técnica tiene distintas variantes entre las principales tenemos la

adición de (1) un solo microorganismo, (2) un microorganismo modificado genéticamente, (3)

genes específicos que degraden un tipo de contaminante incluidos en un vector para ser

recombinados con los organismos autóctonos, (4) un consorcio de microorganismos. Una de

las técnicas que se han utilizado para aislar diferentes organismos capaces de degradar

compuestos recalcitrantes ha sido el enriquecimiento selectivo que añade al medio de

crecimiento compuestos o fuentes únicas de carbono o nitrógeno como contaminantes

específicos, tolueno, benceno, xileno, etc. Por lo general, los consorcios de microorganismos
 27

han demostrado una mejor capacidad para degradar diferentes contaminantes ya que al trabajar

en armonía logran mejores resultados que microorganismos individuales. Uno de los éxitos de

la biorremediación es lograr que los microorganismos se adapten al lugar contaminado

(Macaya et al.,2019).

Ventajas de las estrategias de biorremediación:

La combinación tanto de metodologías biológicas con las fisicoquímicas ha logrado

resultados maravillosos. Sin embargo, la biorremediación sigue siendo más rentable y amigable

que los tratamientos fisicoquímicos. Durante el proceso de biorremediación, los hidrocarburos

pueden ser mineralizados en productos inorgánicos que son inocuos para el medio ambiente.

El uso de los residuos industriales orgánicos contribuye a la reducción de los precios

implicados en la biorremediación (Kumar et al.,2011).

Desafíos de las estrategias de biorremediación

Diferentes factores influyen en un proceso de biorremediación, uno de ellos es la

recalcitrancia de los contaminantes, las transformaciones incompletas y la lentitud que lleva el

proceso de biorremediación. Por ejemplo, en la bioaumentación se ha encontrado una

disminución de los microorganismos vivos debido al estrés que es producto de cambios en las

condiciones ambientales como pH, temperatura, salinidad; agotamiento rápido de los

nutrientes, la toxicidad de los contaminantes y los metabolitos propios de los microorganismos

al degradar estos contaminantes. También se ha encontrado una competencia por los nutrientes

entre los microorganismos exógenos y los autóctonos. Para hacerle frente a la baja

supervivencia de los microorganismos se ha dado vital relevancia a la reinoculacion. Una de

las alternativas para proteger a los microorganismos tanto del estrés, la competencia por los

nutrientes y la depredación propia ha sido la encapsulación de las células en materiales como

agarosa, agar, gelatina, alginato (Chandra et al.,2013).

 28

Nuevos enfoques de biorremediación:

No basta con solo inocular bacterias degradadoras de hidrocarburos a sitios

contaminados, por ello es vital seleccionar a los mejores microorganismos que puedan degradar

contaminantes específicos. Recientemente, se ha empezado a utilizar microorganismos

extremófilos debido a su resistencia a condiciones ambientales extremas ya sea temperaturas

elevadas o bajas, salinidad, pH acido o básico, etc. Estos microorganismos extremófilos tienen

la capacidad de sobrevivir y desarrollarse en ambientes extremos que son letales para otros

microorganismos comunes. Por ejemplo, se informó de trabajos que usan bacterias

hidrocarbonoclasticas halófilas en ambientes salinos. El avance de las tecnologías en temas de

identificación de especies ha permitido conocer el tipo de microorganismo como sus vías

metabólicas para degradar hidrocarburos. La genómica y la bioinformática son herramientas

útiles para identificar microorganismos y así conocer la función de sus genes y tratar de explicar

las rutas metabólicas que utilizan para degradar contaminantes de hidrocarburos. Además, las

herramientas proteómicas y transcriptómicas permiten obtener nuevos conocimientos sobre el

metabolismo de los microorganismos y también el papel de las principales enzimas que

intervienen en la degradación del petróleo.

El estudio de una comunidad de microorganismos en un lugar o nicho especifico se llama

microbioma. Las tecnologías relacionadas con el estudio de las comunidades microbianas son

la metagenómica, metaproteómica entre otras. La primera implica la extracción del ADN de

una población para obtener información sobre todo ese nicho y conocer sus funciones. Tanto

la metaproteómica como la metatranscriptómica estudian la expresión de genes y proteínas de

la comunidad microbiana para conocer la función que esta desarrolla en su entorno (Macaya et

al.,2019).
 29

La biorremediación de los lugares contaminados por hidrocarburos se vuelve limitada

por la escasa biodiversidad de los microorganismos nativos específicos para los contaminantes

presentes en su hábitat (Ron y Rosenberg,2014). Por eso, es que últimamente se ha apostado

por los cultivos mixtos o consorcios de microorganismos ya que ofrecen versatilidad

metabólica para utilizar los contaminantes del petróleo como fuente de carbono y energía (Das

y Chandra,2011). También, los cultivos de bacterias y hongos han demostrado incrementar los

porcentajes de degradación de muchos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en

condiciones de laboratorio (Wang et al.,2012). Es así que es importante la cooperación entre

distintos microorganismos para reducir los contaminantes del petróleo (Varjani et al.,2015).

Eliminación de contaminantes de hidrocarburos de petróleo

-Métodos fisicoquímicos frente a los métodos biológicos

Los distintos métodos tanto físicos como químicos implican una gran inversión debido a

la excavación, el transporte de grandes cantidades de contaminantes para su tratamiento ex situ,

el uso de productos químicos o incluso la incineración (Varjani y Srivastava,2015). También

existen las técnicas como la dispersión, dilución, la sorción, volatilización entre otras. Por el

contrario, la biorremediación utiliza tecnologías verdes que son amigables con el medio

ambiente, no producen contaminantes secundarios, no producen alteraciones en los

ecosistemas implicados, pueden desarrollarse en el mismo sitio de la contaminación siendo

más eficiente, mostrando una gran versatilidad para diferentes contaminantes y más económica

(Chandra et al., 2013).

La biorremediación se ha convertido en una técnica innovadora ya que los

microorganismos pueden reducir o degradar los contaminantes a compuestos inocuos como

dióxido de carbono, agua, metano y biomasa sin alterar el medio ambiente (Ron y Rosenberg,

2014). Debido a que los hidrocarburos son compuestos ricos en energía, existen diversos
 30

organismos capaces de metabolizar estos contaminantes. Es importante aislar los

microorganismos autóctonos de las zonas ya que probablemente se desarrollan ahí hace miles

de millones de años y combinados con microorganismos exógenos o modificados

genéticamente mejorara mucho los procesos de biorremediación (Zhao et al., 2016).

Biorremediación de hidrocarburos de petróleo.

La biorremediación microbiana es empleada para el tratamiento de diversos

contaminantes del petróleo tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos (Abbasian et

al.,2015). En los últimos años, se han reportado muchos estudios sobre la biorremediación de

contaminantes de hidrocarburos (Varjani et al.,2015). Así también, se han descrito muchos

estudios que describen los mecanismos generales como específicos que siguen los

microorganismos para degradar hidrocarburos (Abbasian et al.,2015). Se sabe que los

microorganismos tienen un papel determinante para el mantenimiento, recomposición de los

ecosistemas para conducir a un entorno amigable y de armonía (Varjani y Srivastava,2015).

Estos microorganismos también pueden ser utilizados como reporteros de los ecosistemas ya

que si se este se ve afectado por algún contaminante los microorganismos autóctonos irán

desapareciendo o se reducirán (Chandra et al.,2013). Los microorganismos están distribuidos

por todo el mundo ya sea en ambientes acuáticos, terrestres, extremos o en el aire (Varjani et

al.,2013). No sorprende que se aíslen distintos microorganismos tanto de suelos, sedimentos,

aguas contaminadas por hidrocarburos ya que también estos compuestos han estado en la

naturaleza (Ron y Rosenberg, 2014, Varjani y Upasani 2016). Los microorganismos consiguen

adaptarse y desarrollarse en ambientes contaminados por hidrocarburos gracias a que estos

contaminantes tienen una composición de carbono que es crucial para los componentes

celulares de los microorganismos, se puede decir que los microorganismos utilizan estos

contaminantes como comida (Abbasian et al.,2015). Una de las fortalezas de los

microorganismos es que se pueden adaptar a ambientes inhóspitos y de esta forma se producen

 31

mutaciones genéticas en las futuras generaciones que están preparadas para degradar

hidrocarburos, por eso es importante el estudio de los microorganismos autóctonos para

biorremediar distintos contaminantes (Varjani et al.,2015). Tantos las bacterias, hongos,

levaduras, microalgas y algas son reconocidas por su gran capacidad para degradar

contaminantes del petróleo. Principalmente las que mayor ventaja tienen sobre los demás

microorganismos son las bacterias que son capaces de degradar distintos contaminantes de

hidrocarburos (Abbasian et al.,2015).

1.4 Microorganismos degradadores de hidrocarburos

Hay diferentes reportes sobre bacterias que tienen la capacidad de degradar hidrocarburos

del petróleo. Algunas de estas bacterias pertenecen a los géneros Alcaligenes, Acinetobacter,

Alcalinovorax, Pseudomonas y Bacillus (Mansur et al.,2016) son algunos ejemplos más

representativos. Muchos de estos estudios se llevaron a cabo utilizando sustratos puros como

benceno, xileno, tolueno, naftaleno, n-hexano, etc. Por lo tanto, es difícil determinar si estas

bacterias tendrán un buen desempeño en los vertidos de petróleo, ya que estos contaminantes

son una mezcla de varios hidrocarburos diferentes. También existen pocos estudios sobre la

degradación de asfáltenos que es uno de los compuestos más recalcitrantes en los lodos de

petróleo (Bezza et al.,2015; Zhang et al.,2016). De todas formas, los microorganismos

presentan una gran versatilidad metabólica que les permite adaptarse a diferentes entornos y

pueden producir diferentes enzimas que les permite utilizar los diferentes contaminantes como

fuente de energía.

Por un lado, se ha encontrado en ecosistemas terrestres ciertas actinobacterias que tienen

la capacidad de degradar moléculas recalcitrantes (De Pasquale et al.,2012) ya que son

resistentes a condiciones de sequía y tienen la capacidad de colonizar tanto superficies que

tengan compuestos orgánicos como inorgánicos (Randazzo et al.,2015). Por otro lado, en
 32

ecosistemas acuáticos, los microorganismos que tienen mejor capacidad para degradar el

petróleo son las bacterias hidrocarbonoclasticas que se encuentran en ambientes con

hidrocarburos (Yakimov et al.,2007). Los diferentes microorganismos que se encuentran en la

naturaleza pueden ser utilizados como herramientas biotecnológicas para remediar la

contaminación causada por hidrocarburos del petróleo, estudios recientes han apostado por la

inmovilización de bacterias degradadoras de hidrocarburos sobre distintos soportes para

biorremediar diferentes contaminantes ambientales (Partovinia y Rasekh,2018).

Las poblaciones de microorganismos nativas que fueron afectadas por contaminantes de

hidrocarburos se convirtieron en habituales para ser posteriormente modificadas

genéticamente. Es por eso, que las comunidades microbianas que logran adaptarse en zonas

contaminadas por hidrocarburos de petróleo, tardan menos en degradar estos contaminantes

que aquellos microorganismos que no están en contacto con los contaminantes (Kannepalli y

Farrish, 2016). Se ha demostrado que para mejorar la degradación de los diferentes

contaminantes es necesario que haya más de una especie de microorganismo, ya que una sola

tiene muchas limitaciones para degradar los contaminantes. Por ello, es necesario el uso de

poblaciones mixtas que tengan diferentes capacidades enzimáticas para mejorar los porcentajes

de degradación de los contaminantes del petróleo. Hoy en día, se ha demostrado en diferentes

estudios que los consorcios microbianos son los mejores para eliminar los contaminantes del

petróleo en diferentes ambientes, además estos son respetuosos con el medio ambiente y no

afectan a la salud humana (Abatenh et al.,2017).

Los microorganismos juegan un rol importante en la naturaleza ya que son capaces de

remediar ambientes contaminados y pueden ser biosorbentes, bioacumuladores y

biocatalizadores. Dentro de los microorganismos tenemos diferentes categorías como:

 33

- Bacterias: Son las más empleadas para las técnicas de biorremediación, ya que tienen

propiedades sorbentes para tratar diferentes ecosistemas contaminados, estas poseen la

capacidad de desarrollarse en condiciones controladas y también de soportar

condiciones extremas como altas o bajas temperaturas, pH extremos, salinidad, etc.,

además poseen la capacidad de soportar algunos metales pesados (Srivastava y

Dwivedi,2015). Las capas de la pared celular como el peptidoglicano contienen alanina,

acido glutámico y ácido teicoico que están presentes en las bacterias Gram Positivas

denominadas así después de pasar por la Tinción de Gram, mientras que las

glicoproteínas, lipopolisacáridos, lipoproteínas y fosfolípidos se encuentran en la pared

celular de las bacterias Gram Negativas (Ayangbenro y Babalola,2017).Estos

compuestos sirven como sitios de unión de los metales pesados y por consiguiente,

resulta en la biorremediación de estos metales pesados del medio ambiente (Gupta et

al.,2015). Cabe resaltar que los consorcios de cepas bacterianas consiguen mejores

porcentajes de degradación que la aplicación de una sola cepa para remediar diferentes

contaminantes.

- Hongos: Debido al gran micelio y cantidad de esporas de estos microorganismos tienen

la capacidad de absorber metales pesados. Su remediación de estos microorganismos

se lleva a cabo por la acumulación, precipitación tanto intracelular y extracelular o la

transformación de los iones metálicos. Sin duda, lo hongos son los únicos

microorganismos del planeta con la capacidad de descomponer la madera. El micelio

de los hongos produce potentes enzimas extracelulares y algunos ácidos que son

capaces de descomponer la lignina y celulosa (Gupta et al.,2017). Por ejemplo,

Rhizopus oryzae posee la capacidad de biosorcion del contaminante pentaclorofenol

mediante un proceso de metilación y decloracion (Leo'n- Santiesteban et al., 2016). La

gran mayoría de los hongos de la familia Zygomycetes y Aspergillus han sido utilizados
 34

para decolorar y desintoxicar aguas residuales procedentes de la industria textil.

Diversos hongos como Penicillum chrysogenum, Scedosporium apiospermun,

Fusarium solani también poseen la capacidad para degradar bifenilos policlorados

(Tigini et al.,2009). El uso de hongos para la biorremediación suele llevar el nombre de

micorremediacion.

- Algas: Ultimamente, se ha demostrado que estos microorganismos tienen una alta

eficacia para la bioacumulación de metales pesados y degradar otros contaminantes.

Estos microorganismos desempeñan un rol importante en la fijación del dióxido de

carbono y además de que a partir de la biomasa se puede producir biocombustibles

(Huang et al.,2010). Diferentes especies como Selenastrum capricornutum y

Monoraphidium braunii tienen el potencial de eliminar distintos contaminantes como

el benceno, tolueno y naftaleno de ambientes contaminados (Gattullo et al.,2012) El

uso tanto de algas como de microalgas para remediar ambientes contaminados adopta

el nombre de cianorremediacion. La adsorción tanto de contaminantes orgánicos como

farmacéuticos por medio de las microalgas han sido reportadas en los últimos años

(Xiong et al.,2018) Por ejemplo, especies como Chlorella sorokiniana, Nannochloris y

Chlamydomonas son aplicadas para la remediación de compuestos como diclofenaco,

ibuprofeno, paracetamol, carbamazepina, trimetoprima, ciprofloxacino, triclosán, etc.

(Bai y Archarya, 2017)

- Levaduras: Estos microorganismos pueden ser alternativas para remediar metales

pesados del ambiente, ya que por sus características pueden asimilar una gran cantidad

de compuestos (Abbas y Badr,2015). La composición de la pared celular de las

levaduras muestra una carga negativa capaz de unirse a metales pesados por

interacciones electrostáticas. Por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae es la especie más

común utilizada para la biosorcion de algunos metales pesados como cromo, plomo,
 35

zinc, mercurio, níquel. También Candida tropicalis, Candida utilis y Cyberlindnera

fabianii fueron reportadas como microorganismos capaces de remediar cromo en

ecosistemas contaminados (Bahafid et al.,2013).

A lo largo de los años se han reportado distintas bacterias que tienen la capacidad de

degradar los hidrocarburos del petróleo. Especies como Pseudomonas, Aeromonas, Moraxella,

Beijerinckia, Flavobacteria, Chrobacteria, Nocardia, Corynebacteria, Modococci,

Streptomyces, Arthrobacter (Thapa et al.,2012). En un estudio se utilizó una cepa recombinante

de Acinetobacter baumannii que mostraba porcentajes altos de degradación de contaminantes

del petróleo. En otros estudios para remediar los derrames de combustible y aceite lubricante

se encontraron a bacterias del género Yokenella, Alcaligenes, Roseomonas, Stenotrophomonas,

Acinetobacter, Flavobacter, Corynebacterium, Streptococcus, Providencia, Shingobacterium,

Bacillus, Enterobacter (Jain et al.,2010). Además, se han encontrado también hongos capaces

de degradar hidrocarburos, pero con la desventaja que estos microorganismos son de

crecimiento más lento que las bacterias. Entre los hongos que se encontraron tenemos a

Neosartorya, Graphium, Talaromyces, Aspergillus y Amorphoteca.

Las bacterias hidrocarbonoclasticas generan una mayor importancia ya que han sido

aisladas de sitios contaminados por hidrocarburos de petróleo. Algunos géneros como

Alcalinovorax, Marinobacter, Thallassolituus, Cycloclasticus y Oleispira participan en la

degradación de hidrocarburos de sitios marinos contaminados (Genovese et al.,2014). En

particular, los géneros Pseudomonas, Marinomonas, Halomonas y Micrococcus son capaces

de degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos; Acinetobacter y Sphingomonas permiten

degradar compuestos alifáticos. Bacillus thuringensis ha sido utilizado para degradar el gasóleo

(Mnif et al.,2017).
 36

Las bacterias que se encuentran en el suelo tienen una gran adaptación y desarrollan

mecanismos para degradar de forma total o parcial los contaminantes del petróleo, así mismo

otras bacterias pueden utilizar las moléculas de los contaminantes que ya han sido

transformadas parcialmente (Safdel et al.,2017). Estos microorganismos son capaces de

desarrollar quimiotaxis que es un sistema de señalización para permitir la entrada de los

hidrocarburos a las células (Cheng et al.,2018). Es importante que los compuestos de los

contaminantes interactúen con las células bacterianas para empezar la biorremediación

(Varjani,2017). Otro mecanismo que les permite a las bacterias movilizar a los contaminantes

son sus superficies hidrofóbicas (Das y Chandran,2011). A su vez, las bacterias también pueden

producir algunos surfactantes que mejoran la solubilidad y el acceso a los hidrocarburos

(Balseiro-Romero et al.,2017). El éxito de los microorganismos para atacar a los hidrocarburos

dependerá de sus características como su estructura, los alcanos que presenten en las cadenas

ramificadas, los alcanos cíclicos y lineales, compuestos aromáticos (Castro-Jimenez et

al.,2012). El fracaso en la biorremediación se debe principalmente a que las bacterias no se

adaptan a las condiciones climáticas y al entorno donde se encuentran los contaminantes. La

inoculación de bacterias exógenas no necesariamente garantiza el éxito de la biorremediación.

Es importante que haya una adecuada simbiosis entre las bacterias exógenas y las nativas, sin

embargo, es impredecible las rutas que seguirán para remediar los contaminantes (Ghaly et

al.,2013).

En un estudio realizado el 2019 se aisló Vibrio alginolyticus del agua de mar contaminada

con hidrocarburos del petróleo y se vio que tenía un gran potencial para biorremediación

(Imron et al.,2019). En el 2015 se utilizó Bacillus subtilis aislado de los vertidos de polímeros

en India para la degradación del crudo de petróleo mostrando porcentajes de degradación del

80% en 10 días (Sakthipriva et al.,2015). Un estudio más a fondo analizo las vías de

degradación de los hidrocarburos del petróleo que incluyeron la adsorción en la superficie

 37

celular y la biodegradación, incluyendo tanto el interior como exterior de las bacterias. No

obstante, hay pocos estudios que hayan optado por mejorar las condiciones de crecimiento, de

biodegradación, mecanismos de degradación. Es necesario estudiar los mecanismos de

degradación como el crecimiento de las bacterias para mejorar la biorremediación (Shi et

al.,2019).

Los microorganismos son células pequeñas que existen individualmente o agrupadas en

colonias a lo largo de todo el mundo y se pueden encontrar tanto en respiraderos, cuevas,

montañas, lagos, aguas termales, salineras, etc. Entre las bacterias y las arqueas son los

organismos unicelulares con más antigüedad y presencia en el mundo. Debido a la alteración

del medio ambiente, las bacterias también se vieron afectadas en sus procesos metabólicos y

lograron desarrollarse en ambientes extremos (Davies et al.,2007) Estos microorganismos

extremófilos logran desarrollarse en ambientes calientes, helados, condiciones acidas o

alcalinas, en ambientes radioactivos, etc. Estos son clasificados según el entorno en el cual se

desarrollan, por ejemplo, los psicrófilos que logran desarrollarse en temperaturas frías,

termófilos que logran sobrevivir en ambientes calientes, los halófilos que se pueden encontrar

en salineras tolerando concentraciones elevadas de sal, los acidófilos que se desarrollan en

ambientes de pH bajos, los alcalofilos que sobreviven a ambientes de pH altos, los barofilos

que pueden sobrevivir a presiones elevadas (Rampelotto,2013). Todas estas comunidades

microbianas se encuentran a lo largo del mundo en ambientes inhóspitos para la vida humana

tales como regiones geotérmicas, lugares volcánicos, fuentes termales, lugares subterráneos,

depósitos de petróleo, etc. (Canganella y Wiegel,2014). Los termófilos han llamado la atención

de los últimos tiempos debido a la producción de enzimas industrialmente atrayentes como las

lipasas, proteasas, chitinasas, celulasas y amilasas (Gupta, Gupta, Capalash y Sharma,2017).

 38

Hablando de fisiología, ecología y biotecnología, las bacterias juegan un rol importante

como los microorganismos más importantes debido a su omnipresencia y prevalencia (Xia et

al.,2019). A medida que se han ido adoptando técnicas de biorremediación se han descubierto

una gran diversidad de bacterias que tienen la capacidad de remediar hidrocarburos del

petróleo, por ejemplo, Alcalinovorax y Acinetobacter capaces de degradar alcanos (Lin et

al.,2014), Cycloclasticus es capaz de degradar hidrocarburos aromáticos, Dietzia tiene la

capacidad de degradar n-alcanos, alcanos ramificados e hidrocarburos aromáticos como

fenantreno, pireno (Chen et al.,2017).

Se puede mejorar la eficacia de la biorremediación de contaminantes mediante la

bioaumentación de cepas especificas con alta eficiencia de remoción de contaminantes (Cui et

al.,2020). Los consorcios bacterianos son atrayentes debido a su capacidad de aceptar diversos

sustratos, su mayor versatilidad, sus capacidades metabólicas para degradar contaminantes más

complejos y su gran adaptación a ambientes contaminados (Varjani y Upasani,2019). Los

estudios de campo como de laboratorio han demostrado que la bioaumentación mejora la

degradación del petróleo, de este modo un estudio que combino cinco cepas bacterianas para

remediar diferentes contaminantes alcanzo porcentajes entre el 25% y el 48% de remoción de

hidrocarburos en un tiempo de 40 días.

Habitualmente, las bacterias producen dos tipos de biosurfactantes con diferentes

composiciones y características, así tenemos los de bajo peso molecular que reducen la tensión

superficial y los emulsionantes de mayor peso molecular que contribuyen a la unión de

sustratos (Xia et al.,2019). Concretamente, los biosurfactantes son importantes en la

biorremediación de contaminantes de petróleo debido a su baja toxicidad, alta eficiencia y

compatibilidad (Wang et al.,2014).

 39

La biotecnología ha cobrado relevancia en los últimos años a través del uso de

biosurfactantes para mejor la remediación de diferentes contaminantes (Almeida et al.,2016).

Estas son moléculas con diversos potenciales según la industria ya que poseen características

emulsificantes, formación de espuma, humectación, separación de fases, actividad superficial

y la reducción de la viscosidad del petróleo. Estas características permiten gestionar

adecuadamente la producción de derivados de petróleo para evitar sus derrames accidentales

(Varjani y Upasani,2017). La composición general de los biosurfactantes tiene una cola

hidrofílica y una cola hidrofóbica, proporcionándole una naturaleza anfipática. La cola

hidrofóbica está compuesta generalmente de ácidos grasos con longitudes que van entre los

ocho y dieciocho átomos de carbonos, en tanto la cola hidrofílica puede estar compuesta de

esteres, de grupos hidroxilo, de fosfatos o incluso estar unido a azucares o proteínas (Sing et

al.,2019). Dentro de sus propiedades benéficas, los biosurfactantes también causan menos

impacto en el ambiente porque pueden ser producidos a partir de sustratos renovables y menos

tóxicos a diferencia de los surfactantes convencionales (Karlapudi et al.,2018). Diferentes

microorganismos como bacterias y levaduras son capaces de producir biosurfactantes entre

ellos las bacterias pertenecientes al género Bacillus en especial las especies licheniformis y

subtilis (Bezerra et al.,2018).

Las bacterias hidrocarbonoclasticas tienen la capacidad de utilizar hidrocarburos tanto

alifáticos como aromáticos para usarlos como carbono y energía. Estos microorganismos están

distribuidos en el ambiente. Los n-alcanos de bajo peso molecular son degradados con mayor

facilidad, en cambio los alcanos de alto peso molecular son difíciles de degradarse. Por un lado,

algunos géneros como Pseudomonas, Rhodococcus y Bacillus que están presentes en

superficies terrestres y acuáticas muestran afinidad por los hidrocarburos alifáticos como el

octano, hexadecano y por los hidrocarburos aromáticos como naftaleno y fenantreno. En

ecosistemas acuáticos, tanto los hidrocarburos alifáticos por ejemplo el pristano, n-alcanos
 40

como los hidrocarburos aromáticos por ejemplo benceno, antraceno pueden ser degradados por

bacterias pertenecientes a los géneros Marinobacter, Alcaligenes y Alcanivorax. En

ecosistemas terrestres, los géneros Acinetobacter, Paraburkholderia, Micrococcus y

Achromobacter son capaces de utilizar como fuente de energía hidrocarburos alifáticos y

aromáticos. Por otro lado, también existen diversos géneros de levaduras que se utilizan en

biorremediación, por ejemplo, Pichia, Hansenula, Saccharomyces y Yarrowia. Estas levaduras

tienen afinidad principalmente por alcanos con carbonos que van desde los diez a los dieciocho,

mientras que los alcanos insaturados y ramificados se degradan a una velocidad muy lenta.

Además, podemos incluir a distintos géneros de hongos como Aspergillus, Fusarium,

Penicillium, Cladosporium y Varicospora que presentan una buena capacidad para degradar

hidrocarburos del petróleo. Cladosporium sphaerospermun tiene la capacidad de asimilar

hidrocarburos aromáticos policíclicos de cinco a seis anillos mediante la secreción de enzimas

degradadoras de lignina y así remediar suelos contaminados con estos hidrocarburos (Macaya

et al.,2019; Fathepure, 2014).

Metabolismo microbiano de los hidrocarburos

El uso de distintos microorganismos depende del actuar de cada contaminante en el

ambiente, por ejemplo, los componentes del petróleo presentan una gran recalcitrancia debido

a la gran estabilidad que presentan los enlaces carbono-hidrogeno, en tanto que los

hidrocarburos aromáticos son más estables debido a la presencia de un anillo aromático que les

confiere una baja reactividad y por lo tanto una difícil degradación. De cualquier modo, para

comenzar con el proceso de degradación de cualquier contaminante es importante saber la

funcionalización de la estructura del hidrocarburo para saber que ruta metabólica seguirán.

Tanto en ambientes aeróbicos como anaeróbicos se han estudiado la degradación por bacterias

y hongos clasificando en dos ramas según el proceso metabólico que toman, sea mecanismos

mediados por el oxígeno o independientes de oxigeno (Macaya et al.,2019).

 41

Diferentes microorganismos muestran afinidad para degradar hidrocarburos alifáticos,

monoaromáticos o poliaromáticos hasta incluso resinas. Especies bacterianas pertenecientes a

los géneros Achromobacter, Acinetobacter, Arthrobacter, Azoarcus, Brevibacterium,

Cellulomonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Marinobacter, Micrococcus, Nocardia,

Ochrobactrum, Pseudomonas, Stenotrophomaonas y Vibrio han sido reportadas como

degradadoras de hidrocarburos (Chandra et al.,2013; Varjani et al,2015). Especies de hongos

pertenecientes a los géneros Aspergillus, Amorphoteca, Fusarium, Graphium, Neosartoria,

Paecilymces, Penicillium, Sporobolomyces, Talaromyces y algunas levaduras como Candida,

Pichia, Pseudozyma, Rhodotorula y Yarrowia han sido utilizadas para degradar contaminantes

del petróleo (Wilkes et al.,2016).

Entre las principales bacterias reportadas con gran capacidad de remediar contaminantes

del petróleo han sido Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Rhodococcus

sp, Bacillus sp, Acinetobacter sp, Ochrobactrum sp y Exiguobacterium, y además de producir

biosurfactantes (Varjani et al.,2015; Varjani y Upasani, 2016).

1.5 Microorganismos aislados de distintas muestras ambientales

Fuentes termales: Son llamadas también fuentes geotérmicas y se forman mediante

diversos mecanismos. En las profundidades del planeta el magma calienta la roca y cuando la

lluvia o el agua subterránea se filtra por la superficie de la tierra y arriba a las rocas calentadas

se producen las fuentes termales. Mayormente las regiones con actividad volcánica tienen este

tipo de aguas termales, dado al proceso de calentamiento el agua se vuelve viscosa y flotante,

por lo tanto, busca fisuras para salir de la superficie del planeta. Y si el agua caliente no

consigue salir por alguna grieta o fisura forma vapores que se acumulan y que lleva a la

formación de geiseres (Van Middlesworth y Wood, 1998).

 42

Distribución

Las fuentes termales se encuentran a lo largo de todo el planeta, en distintos países van

desde las regiones montañosas hasta los trópicos. Los principales países que son atrayentes por

sus manantiales geotérmicos son Hungría, Canadá, Honduras, Islandia, Chile, Japón, Turquía,

Israel, Costa Rica, Estados Unidos. Existen diferentes aguas termales como:

Gran manantial prismático: Ubicado en el parque nacional de Yellowstone, ubicado en

Wyoming, Montana e Idaho. Este parque fue creado el primero de marzo de 1872 siendo el

mayor manantial de la tierra con una profundidad de unos 160 pies y un ancho de 300 pies.

Este manantial es famoso debido a su belleza que se obtiene por sus efectos prismáticos que en

el centro es de color azul y que cambia a verde, amarillo, naranja y rojo simulando un arco iris.

Estos cambios de colores se deben a la presencia de distintos microorganismos como algas y

bacterias termófilas. Además, de los microorganismos presentes que dan los colores

característicos también existen especies exóticas de flora y fauna. Uno de los descubrimientos

más revolucionarios para ciencia fue el aislamiento de la bacteria Thermus aquaticus que

produce una enzima denominada Taq ADN polimerasa, que es vital para el desarrollo de la

técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa.

Estanque de sangre: Recibe el nombre de Chinoike Jigoku que es traducido como “estanque

del infierno sangriento” y está ubicado en Beppu, Japón. Este es famoso por su coloración

sanguinolenta que se debe a la arcilla acida que contiene hierro y magnesio que salen del suelo.

Sin embargo, esta coloración se ve afectada con los cambios de estación, en verano adopta un

color rojo anaranjado, mientras que en invierno se torna de un color rojo intenso. Dado a su

elevada temperatura de 78 º C, se prohíbe a la población bañarse, pero, aun así, los turistas

visitan esta laguna para tratar sus enfermedades de la piel.

 43

Laguna Azul: Este lugar es uno de los preferidos por los turistas y está situado en el suroeste

de Islandia. Alcanza temperaturas hasta los 40ºC resultando un buen ambiente para bañarse

durante todo el año. Este manantial contiene sílice por eso el agua adopta un color azul lechoso

y de igual forma los turistas creen que con esta agua pueden curarse enfermedades de la piel

(Olafson, 1996).

Hamman Maskhoutine: Recibe el nombre de “baño de los condenados” que se refiere a un

grupo de aguas termales que están situadas en Hamman Debagh, Argelia. Son un total de diez

manantiales diferentes que se encuentran en este valle, alcanzan temperaturas muy calientes

cerca a los 98ºC. Están presentes el hierro y el carbonato de calcio en estas aguas. Los turistas

consideran que tanto el calor con los minerales presentes tiene un valor curativo para tratar a

personas con reumatismo y artritis (Scheffel y Wernert, 1980).

Diversidad microbiana en aguas termales

Para tratar de abarcar la gran diversidad de microorganismos en aguas termales se han

desarrollado varias técnicas y enfoques que se clasifican en dos grupos como enfoques que

dependen de los cultivos y enfoques que son independientes de los cultivos. El primer enfoque

se basa en la capacidad del investigador en aislar cepas de primera calidad y conocer a fondo

sus características (Jia, Liu, Daroch, Geng y Cheng, 2014). La mayoría de microorganismos

termófilos han sido aislados mediante el uso de esta técnica demostrando las diversas ventajas

que tienen dentro del campo de la biotecnología con énfasis en la producción de enzimas

termorresistentes (Li, Liu, Cheng, Mos y Daroch, 2015).

Se comprobó que los principales grupos bacterianos tenían forma de bastón y algunos

otros mostraban forma de coco o cocobacilos, además de que estos grupos bacterianos

mostraban un buen desarrollo a temperaturas mayores a los 50ºC. También se encontró que

algunas cepas se teñían de color rojo con la tinción de Gram y pasando por distintas reacciones
 44

químicas se descubrió que varias bacterias podían producir enzimas de interés como xilinasas,

celulasas y amilasas.

Se utilizaron diferentes medios de cultivo como el agar dextrosa papa, el agar tiosulfato,

el medio pikovskaya, agar tripticasa de soya, el medio reductor de sulfato y un agar selectivo

para actinomicetos. Principalmente se encontró grupos bacterianos como Bacillus con

endosporas dándoles la capacidad de resistir altas temperaturas. La composición mineral de las

aguas termales varía mucho según los lugares y sus características.

Básicamente, se encontraron familias como Enterobacteriacea, Planococcacea,

Bacillaceae, Pseudomonadacea y Paenibacillaceae. La temperatura adecuada para el

desarrollo de estos microorganismos va desde los 37ºC a los 50ºC, siendo el género Bacillus el

más abundante en distintos manantiales (Sen y Maiti, 2014). Estos grupos bacterianos fueron

capaces de producir diferentes tipos de enzimas como ureasa, oxidasa, lipasa, gelatinasa y

amilasa (Pathak y Rathod, 2015).

La bacteria Bacillus licheniformis que fue encontrado en las aguas termales de Tuva-

Timba, Gujarat presento características de anaerobio facultativo y con gran resistencia a la sal.

En un trabajo de remediación con este microorganismo se logró la reducción de contaminantes

del petróleo debido a la capacidad de esta bacteria por producir sustancias exopolimericas

permitiendo el flujo de agua a través de zonas poco permeables. El exopolisacarido fue

utilizado como biosurfactante y además de tener la capacidad de formar biopelículas (Suthar,

Hingurao, Desai y Nerurkar, 2009).

En diversos estudios, se vio que algunos insectos como las larvas de gusanos de la harina

(Tenebrio molitor) (Brandon et al.,2018, Yang et al.,2020), los supergusanos (Zophobas

atratus), polillas indias de la harina (Plodia interpunctella) (Yang et al.,2014) y polillas de cera

(Galleria mellonella) (Bombelli et al.,2017), y algunos animales de tierra como los caracoles
 45

(Achatina fulica) (Song et al.,2020) fueron descritos por su capacidad de alimentarse de

plásticos, incluyendo compuestos recalcitrantes como poliestireno y polietileno, lo que sugirió

que su flora intestinal tiene la capacidad de digerir plásticos. Hoy en día, se han informado de

diversas bacterias que se han encontrado en el suelo de lugares contaminados y también del

intestino de diferentes insectos para degradar estos plásticos recalcitrantes y hasta derivados

del petróleo (Yang et al.,2014).

Factores que afectan a la biodegradación de los contaminantes de hidrocarburos del petróleo

Si bien los microorganismos muestran una gran capacidad de adaptación y de desarrollo

hasta incluso en ambientes inhóspitos para el ser humano, eso no quita que son sensibles al

entorno de crecimiento. Entonces, las tasas de degradación se ven afectadas por diversos

factores como:

- Características del contaminante: Esto responde a la disponibilidad, las propiedades y

la longitud que presentan los hidrocarburos, su solubilidad y volatilización (Chandra et

al.,2013).

- Los microorganismos: La adaptación que tengan estos para seguir la ruta metabólica

correcta para conseguir asimilar el contaminante y adaptarse a los cambios estructurales

que puedan sufrir como algunas inclusiones hasta secreción de exopolisacaridos

(Meckenstock et al.,2016).

- Condiciones del ambiente: Factores como el potencial de hidrogeno, el contenido de

agua, salinidad, temperatura, oxígeno y factores nutricionales (Chandra et al.,2013,

Varjani et al.,2015).

- Propiedades del suelo: Se refiere principalmente a las características fisicoquímicas

como retención de agua, densidad, humedad, textura (Beskoski et al.,2011).

 46

Las propiedades fisicoquímicas y la biodisponibilidad de los contaminantes del petróleo

tienen un rol importante para lograr una buena biorremediación (Varjani et al.,2015). La

segunda se define como la cantidad de contaminante que es accesible para las bacterias (Varjani

y Upasani 2016). Estudios anteriores han demostrado que el mismo compuesto en distintos

contaminantes puede conseguir diferentes porcentajes de degradación por los mismos

microorganismos o consorcios, debido a la disponibilidad de un compuesto en particular

(Varjani et al.,2015).
 47

Capitulo II

Materiales y Metodología

2.1 Materiales

2.1.1 Muestra

• Tierra

• Agua

• Tenebrio Molitor

2.1.2 Material de laboratorio

Equipos:

• Autoclave, CVQ-280D

• Balanza analítica, Ohaus Adventurer AR31

• Balanza, Scout TM Pro

• Horno de secado, PSelecta

• Incubadora de CO2, Comfort

• Incubadora, PSelecta
 48

• Microscopio, Zeiss Primostar

• Agitador orbital, Selecta

• Fotocolorimetro DR 900 Hach

• Centrifuga de tubos Eppendorf, Gemmy

• Cuenta colonias, Quebec

Material de Laboratorio

• Asa de Kolle

• Asa de Digralsky

• Camara de neubauer

• Cinta indicadora de pH, Merck

• Espatula

• Micropipeta de 10 μL - 100 μL.

• Micropipeta de 100 μL - 1000 μL

• Puntas amarillas para micropipeta de 10 μL - 100 μL.

• Puntas azules para micropipeta de 100 μL - 1000 μL

• Tubos eppendorf de 1.5 mL

• Pinzas de metal

• Mecheros bunsen

• Bisturí

Material de Vidrio

• Laminas portaobjetos

• Laminas cubreobjetos

• Matraz erlenmeyer de 100 mL, 250 mL, 500 mL

• Placas petri de 20 mL
 49

• Probeta de 50 mL, 100 mL, 250 mL

• Tubos de ensayo de 5 mL, 10 mL

Reactivos:

• Acetato de sodio

• Carbonato de sodio al 0.05%

• Citrato de amonio férrico

• Cloruro de amonio

• Cloruro de calcio

• Cloruro de potasio

• Cloruro de sodio

• Diésel comercial

• Etanol

• Extracto de levadura

• Fosfato acido di sódico

• Fosfato ácido dipotásico

• Fosfato ácido disódico

• Fosfato diácido de potasio

• Glicerol

• Kit para Tinción de Gram

• Nitrato de amonio

• Peptona de carne

• Sulfato de magnesio

Medios de Cultivo:

• Agar agar, Merck

 50

• Agar nutritivo, Merck

• Caldo nutritivo, Merck

• Caldo BHI, Merck

• Agar King B

Otros:

• Agua destilada

• Alcohol

• Algodón

• Gasa

• Bolsas Ziploc

• Guantes de nitrilo

• Barbijo

• Bata de laboratorio

• Celdas de fotocolorímetro

• Recipientes para muestras estériles

• Escala de Mac Farland

 51

2.2 Métodos

2.2.1 Obtención de muestras

Se tomaron muestras de diferentes lugares como lo indica la Tabla 1; para el caso de la

muestra biológica con la ayuda de guantes y pinzas se recolectaron los gusanos de la harina,

para las muestras de tierra se recolectaron con la ayuda de espátulas ambas muestras fueron

recogidas en bolsas ziploc, en tanto las muestras liquidas fueron recolectadas en recipientes

estériles (Anexo 1). Para el caso de las muestras de tierra se recogió aproximadamente 200

gramos, para las muestras liquidas se llenó hasta la tercera parte del recipiente y para la muestra

biológica se recogieron al menos diez gusanos (Anexo 1).

Tabla 1

Lugares de Muestreo
Numero de muestra Lugar de recolección Tipo de muestra
1 Tierra contaminada con petróleo Tierra
2 Humedal Huasao-Cusco Liquida
3 Humedal Huasao-Cusco Tierra
4 Calera Yura-Arequipa Liquida
5 Aguas Termales Pampa Cañahuas-Yanahuara Liquida
6 Automóvil- Volkswagen-Arequipa Tierra
7 Combi-Tanque de gasolina Tierra
8 Gusano de la harina Biológica

2.2.2 Aislamiento de microorganismos

Primero, se empezó a procesar las muestras de tierra para esto se pesaron 5 g de tierra

con la ayuda de una balanza en agua destilada estéril; para el caso de las muestras liquidas se

midió 50 ml con la ayuda de una probeta y se suspendió en agua destilada estéril. Luego, ambos

tipos de muestras se sembraron en medios de pre enriquecimiento tales como caldo palleroni
 52

(Anexo 1) y caldo acetato mineral (Anexo 1) ambos en un volumen de 25 ml en frascos de

vidrio pequeños. Todas las muestras se llevaron al orbital agitador a una temperatura de 30 ºC

por 72 horas. Posteriormente, las muestras procedentes del caldo palleroni fueron sembradas

por estría en placas que contenían Agar King B (Anexo 2) y las muestras procedentes del caldo

acetato mineral fueron sembradas por estría en placas que contenían Agar Cerebro Corazón

(Anexo 2). Todas las placas se incubaron a 30 ºC por 48 horas. Después, se aislaron colonias

de las diferentes placas según su morfología y procedencia de la muestra con la ayuda del

contador de colonias. En seguida, las colonias seleccionadas fueron sembradas para su

purificación en tubos que contenían 5 ml de caldo nutritivo (Anexo 2) y fueron llevadas a la

incubadora a 30 ºC por 48 horas y fueron sembradas en placas con agar nutritivo. Para el caso

de la muestra biológica el gusano de la harina con la ayuda de las pinzas y bisturí estériles se

cortó al gusano transversalmente para extraer el intestino y luego este se inoculo en caldo

acetato mineral y caldo Palleroni para seguir el mismo procedimiento de las muestras tanto de

tierra como liquidas.

2.2.3 Determinación de la actividad emulsificante

Primero, se preparó el medio mínimo de Goldman (Anexo 3) con extracto de levadura al

3% y luego de ser autoclavado el medio se le agrego el etanol. Luego, se repartió 8 ml del

medio con 2 ml de cada cultivo puro en tubos de 10 ml. Se llevaron al agitador orbital a una

temperatura de 30 ºC durante 72 horas con una agitación de 150 r.p.m. (Anexo 3). Transcurrido

el tiempo, todos los tubos fueron llevados a la centrifuga a 5000 r.p.m por 30 minutos (Anexo

3). Más tarde, se recolecto 5 ml del sobrenadante en tubos y se les agrego 0.1 ml de petróleo

crudo con la ayuda de una micropipeta y se agito manualmente durante 5 minutos para facilitar

la emulsión. Inmediatamente, se transvaso 2 ml del tubo anterior a celdas de cuarzo para medir

la absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 540 nm con un blanco que
 53

correspondió al medio de cultivo sin inoculación (Anexo 3). Por último, se convirtió la lectura

de las absorbancias en unidades de actividad emulsificante por ml (UAE/ml), teniendo como

equivalente que 0.816 de absorbancia equivale a una unidad de actividad emulsificante por ml.

Se escogieron las 10 cepas con mayor actividad emulsificante para seguir con la tinción de

Gram y la actividad degradativa de petróleo.

2.2.4 Caracterización fenotípica de microorganismos degradadores de hidrocarburos

Se realizó la tinción de Gram (Anexo 4) a las 10 cepas que se escogieron y luego se

visualizó en el microscopio a 100X para reportar su morfología como cocos, bacilos o

cocobacilos, y la tinción de su pared celular como Gram positivo o Gram negativo; además se

reportó sus características macroscópicas como forma, borde, apariencia con la ayuda del

contador de colonias.

2.2.5 Determinación de la actividad degradativa de petróleo

Primero, se preparó el medio mineral (Anexo 5) y se le adiciono petróleo crudo como

única fuente de carbono a diferentes concentraciones como 4 %, 6% y 8%. Luego, se repartió

4 ml del medio con 1 ml del cultivo con mayor actividad emulsificante en tubos de 5 ml y se

incubo a temperatura ambiente por 30 días. Posteriormente, se midió el crecimiento

cualitativamente mediante la turbidez de los tubos con la ayuda de la escala de Mc Farland

(Anexo 5). Finalmente, se tomaron lecturas de acuerdo a la turbidez y se eligieron las cepas

que tuvieron mayor crecimiento en los tubos con concentraciones al 6% y 8%.

2.2.6 Identificación molecular

Se seleccionó a las mejores bacterias que mostraron capacidad degradativa y se procedió

a realizar la identificación molecular. Esta consiste en la extracción de ADN de la muestra y se

usó el Kit “The MasterPureTM DNA Purification Kit”. Luego, el ADN fue utilizado como
 54

molde para amplificar la región 16S RNAr mediante la tecnología de la reacción en cadena de

la polimerasa (PCR) con la ayuda de los primers universales 27 F y 1492 R y con las siguientes

condiciones dentro del termociclador 95ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos, 72ºC por

45 segundos. Posteriormente, los productos de la PCR fueron purificados usando el kit Qiagen

PCR purification para luego ser secuenciados. Finalmente, las secuencias de cada cepa fueron

alineadas con la base de datos del NCBI, usando como herramienta BLAST para ser

comparadas con sus homólogos a partir de la información del GenBank. Por último, con los

datos del NCBI, se procedió al análisis bioinformática con los programas Mega y DNAStar, el

que a partir del alineamiento de las secuencias construye los arboles filogenéticos mediante el

método de Neighbour-Joining para identificar el género y especie bacteriana de cada cepa.

2.2.7 Filogenia molecular

Las secuencias del gen RNAr 16S de las cepas nativas que fueron obtenidas por

secuenciación, fueron analizadas individualmente y comparadas con las secuencias depositadas

en la base de datos GenBank utilizando el programa bioinformático de alineamiento de

secuencias de tipo local BLAST, en el cual se comparó la secuencia problema con otras

secuencias depositadas en la base de datos; luego se construyeron árboles filogenéticos para

determinar las distancias genéticas y porcentaje de similitud con otras especies.

 55

Capitulo III

Resultados y Discusión

3.1 Aislamiento de microorganismos

Luego del aislamiento en agar nutritivo a partir del caldo palleroni y acetato mineral se

encontró un total de 41 cepas bacterianas (Anexo 6) y se les denomino como lo muestra la

Tabla 2.

Tabla 2

Total, de cepas bacterianas

Lugar de Muestra Bacterias del Caldo Bacterias del
Palleroni Caldo Acetato
Mineral
1 Tierra contaminada con petróleo P-1-1 A-1-1
P-1-2 A-1-2
A-1-3
2 Muestra Liquida-Humedal Huasao P-2-1 A-2-1
P-2-2 A-2-2
P-2-3
3 Muestra Tierra- Humedal Huasao P-3-1 A-3-1
P-3-2 A-3-2
P-3-3 A-3-3
4 Muestra Liquida- Calera Yura P-4-1 A-4-1
P-4-2 A-4-2
 56

5 Muestra Liquida- Aguas Termales Pampa P-5-1 A-5-1

Cañahuas-Yanahuara P-5-2 A-5-2
P-5-3 A-5-3
6 Muestra del tanque de gasolina- Volkswagen P-6-1 A-6-1
P-6-2
P-6-3
7 Muestra del tanque de petróleo-Combi P-7-1 A-7-1
P-7-2
P-7-3
8 Muestra intestino- Tenebrio Molitor P-8-1 A-8-1
P-8-2 A-8-2
P-8-3 A-8-3
P-8-4

Tanto el caldo palleroni como el acetato mineral contienen diferentes elementos como

fosfatos que permiten a las bacterias la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos; también

contienen el ion potasio que interviene en la activación de varias enzimas que participan en la

síntesis de proteínas; el ion calcio también interviene en la activación de diferentes enzimas

como proteínas; el ion magnesio ayuda en la estabilización de ribosomas, ácidos nucleicos y

membranas, además de ser cofactor de muchas reacciones; y algunas formas de amonio que

pueden las bacterias usar como fuente de nitrógeno. Estos dos medios tienen los elementos

mínimos y necesarios para el desarrollo de bacterias poco exigentes a nivel nutricional que es

lo que importa al momento de desarrollar ensayos de actividad degradativa, ya que si se quiere

usar bacterias con alto requerimiento nutricional no sería viable escalar ensayos con estos tipos

de bacterias.

3.2 Determinación de la actividad emulsificante

La actividad emulsificante se haya por medio de la absorbancia, teniendo que 0,816

equivale a una unidad de actividad emulsificante/ml. La cepa denominada P-8-1 procedente

del intestino del tenebrio Molitor obtuvo un 3,68 UAE/ml al igual que la cepa denominada P-

5-2 procedente de la muestra liquida de las aguas Termales Pampa Cañahuas-Yanahuara que
 57

obtuvo un 3,68 UAE/ml. Se escogieron a las 10 mejores cepas que obtuvieron la mayor

actividad emulsificante, los valores se muestran en la Tabla 3 y las fotos en el Anexo 7.

Tabla 3

Determinación de la actividad emulsificante

Lugar de Bacterias Absorbancia Actividad Bacterias Absorbancia Actividad

Muestra del Emulsificante del Caldo Emulsificante
Caldo (UAE/ml) Acetato (UAE/ml)
Palleroni Mineral
1 Tierra P-1-1 2,93 3,59 A-1-1 2,64 3,23
contaminada
P-1-2 2,81 3,44 A-1-2 2,55 3,13
con petróleo
A-1-3 2,79 3,42
2 Muestra P-2-1 2,83 3,47 A-2-1 2,77 3,39
Liquida-
P-2-2 2,78 3,41 A-2-2 2,89 3,54
Humedal
P-2-3 2,71 3,32
Huasao
3 Muestra P-3-1 2,33 2,85 A-3-1 2,74 3,35
Tierra-
P-3-2 2,76 3,39 A-3-2 2,8 3,43
Humedal
P-3-3 2,25 2,75 A-3-3 2,76 3,38
Huasao
4 Muestra P-4-1 2,61 3,2 A-4-1 2,92 3,58
Liquida- Calera
P-4-2 2,76 3,38 A-4-2 2,85 3,49
Yura
5 Muestra P-5-1 1,85 2,26 A-5-1 2,8 3,43
Liquida- Aguas
Termales
Pampa
Cañahuas- P-5-2 3 3,68 A-5-2 2,93 3,59
Yanahuara P-5-3 2,95 3,62 A-5-3 2,87 3,51
6 Muestra del P-6-1 2,9 3,55 A-6-1 2,9 3,55
tanque de
gasolina- P-6-2 2,93 3,59
Volkswagen P-6-3 2,88 3,53
7 Muestra del P-7-1 2,98 3,65 A-7-1 2,99 3,66
tanque de
petróleo- P-7-2 2,84 3,49
Combi P-7-3 2,84 3,48
8 Muestra P-8-1 3 3,68 A-8-1 0,45 0,55
intestino- P-8-2 2,79 3,42 A-8-2 2,97 3,64
Tenebrio P-8-3 2,78 3,4 A-8-3 2,92 3,58
Molitor P-8-4 2,23 2,73
 58

Production y Overview (2018), reporto que la producción de biosurfactantes por parte de

las bacterias incrementa su actividad emulsificante y esta se ve mejorada con la adición de una

fuente de nitrógeno al medio; al igual que en este trabajo de investigación que se agregó 3% de

extracto de levadura.

Chittepu (2019), reporto la alta actividad emulsificante por parte del género Bacillus,

incluso utilizando distintos aceites como kerosene, diésel, aceite de coco, aceite de girasol,

aceite de motor y gasolina.

3.3 Caracterización fenotípica de microorganismos degradadores de hidrocarburos

Las características microscópicas después de realizar la tinción de Gram y las

características macroscópicas con la ayuda del contador de colonias se muestran en la Tabla 4

y las fotografías se encuentran en el Anexo 8.

La cepa denominada P-8-1 procedente del intestino del tenebrio Molitor mostro ser Gram

positiva con colonias grandes, arrugadas con bordes irregulares y de aspecto seco; y la cepa

denominada P-5-2 procedente de la muestra liquida de las aguas Termales Pampa Cañahuas-

Yanahuara mostro ser Gram positiva con colonias regulares pálidas con bordes irregulares.

Tabla 4

Caracterización fenotípica de las cepas

Lugar de Muestra Código Características Gram
Muestra intestino- Tenebrio A-8-2 Colonias circulares, Bacilos en forma
Molitor color naranja, lisas de de varilla
aspecto húmedo. Positivos

Muestra intestino- Tenebrio P-8-1 Colonias grandes, Bacilos

Molitor color beige, arrugadas Positivo
con bordes
irregulares, de
aspecto seco.
 59

Muestra Liquida- Aguas P-5-2 Colonias regulares Bacilos

Termales Pampa Cañahuas- pálidas con bordes Positivo
Yanahuara irregulares de
elevación convexa
Muestra Liquida- Aguas P-5-3 Colonias pequeñas, Bacilo
Termales Pampa Cañahuas- color blanquecinas, Positivo
Yanahuara levemente arrugadas
con bordes irregulares
Muestra Liquida-Humedal A-2-2 Colonias grandes Bacilo
Huasao anaranjadas, lisas con Positivo
bordes irregulares y
planas.
Muestra del tanque de Colonias pequeñas
gasolina- Volkswagen P-6-2 translucidas con Bacilo
bordes irregulares. Positivo

Muestra Liquida- Calera A-4-1 Colonias grandes Bacilo

Yura blanquecinas, Positivo
arrugadas con bordes
irregulares.
Muestra del tanque de P-7-1 Colonias grandes con Bacilo
petróleo-Combi aspecto rugoso e Negativo
irregular con
pigmentación verde.
Muestra del tanque de A-7-1 Colonias grandes con Bacilo
petróleo-Combi aspecto rugoso e Negativo
irregular con
pigmentación verde
Tierra contaminada con P-1-1 Colonias grandes con Bacilos
petróleo aspecto rugoso, lisas e Positivos
irregular.

Aboelkhair et al. (2022), reporto en su trabajo de investigación el género Bacillus

licheniformis con las siguientes características con un tamaño de colonia grande, de forma

circular y blanca, con una elevación plana y de superficie arrugada, con un margen irregular.
 60

Kumar y Sharma (2020), reporto en su trabajo el género Lysinibacillus con las siguientes

características con colonias redondas de tamaño y margen regular, con colonias elevadas de

color blanco pálido.

3.4 Determinación de la actividad degradativa de petróleo

A las 10 cepas con mayor actividad emulsificante se les realizo la prueba de la actividad

degradativa que se determinó de forma cualitativa mediante turbidez con la ayuda de la escala

de Mc Farland que se muestran en la Tabla 5 y las fotos en el Anexo 9. La cepa denominada

P-8-1 procedente del intestino del tenebrio Molitor logro un crecimiento más alto al 6% de

petróleo y un crecimiento considerable al 8% de petróleo y la cepa denominada P-5-2

procedente de la muestra liquida de las aguas Termales Pampa Cañahuas-Yanahuara logro un

buen crecimiento al 4% de petróleo y un crecimiento considerable tanto al 6 y 8%.

El N.º de Turbidez de la escala de Mc Farland corresponde a un N.º Bacterias por ml,

para cada número de turbidez corresponde un numero de bacterias:

• N.º 2 = 6*108

• N.º 3 = 9*108

• N.º 4 = 1.2*108

• N.º 5 = 1.5* 108

Tabla 5

Determinación de la Actividad Degradativa

N.º de Turbidez Mc 2 3 4 5
Farland
Muestra % Petróleo
 61

A-8-2 4% X
6% X
8% X
P-8-1 4% X
6% X
8% X
P-5-2 4% X
6% X
8% X
P-5-3 4% X
6% X
8% X
A-2-2 4% X
6% X
8% X
P-6-2 4% X
6% X
8% X
A-4-1 4% X
6% X
8% X
P-7-1 4% X
6% X
8% X
A-7-1 4% X
6% X
8% X
P-1-1 4% X
6% X
8% X

Marzan et al. (2017) reporto que el género Bacillus tiene un importante potencial de

biorremediación ya que en su trabajo con agua de estanque estéril suplementada con aceite de

horno al 2% después de 20 días de incubación logro un 34% de las manchas de aceite; concluyo

en sus estudios que Bacillus es un buen agente de biorremediación para combatir futuros

derrames de petróleo.

Alkaabi et al. (2020), informo en su trabajo el predominio de Bacillus tanto en la

localidad de Alzubara y Dukhan siendo altamente tolerante a una concentración del 10% de

gasóleo con un potencial de eliminación del 20 al 85% de hidrocarburos; en su trabajo logro

 62

aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos mediante el enriquecimiento del MSM con 10%

de petróleo. Identifico tres especies distintas de Bacillus como subtilis, licheniformis y

circulans, por ejemplo, Bacillus subtilis tuvo la mayor actividad de emulsificacion (9,9 EU/ml)

en la localidad de Alzubara y Bacillus licheniformis (303 EU/ml) en la localidad de Dukhan.

3.5 Identificación molecular

Las placas que se mandaron a secuenciar se muestran en el Anexo 10.

Tabla 6

Identificación Molecular de las cepas

Nombre Género y especie con mayor homología % homología

P-8-1 Bacillus licheniformis 100

P-5-2 Lysinibacillus sp. 99

Zhao et al. (2021) muchas tecnologías para la remediación de petróleo son poco rentables

ya que la mayoría de microorganismos productores de surfactantes son aerobios y esto

incrementa el costo del tratamiento al insuflar aire en el sitio contaminado debido a que en su

mayoría los yacimientos carecen de oxígeno, sin embargo Zhao et al.(2021) remarca la

importancia del género Bacillus subtilis en la producción de surfactantes de forma anaeróbica

en distintos rangos de temperatura, pH y salinidad.

Kumar et al., (2014), informo la relevancia que tienen las bacterias termófilas o mesófilas

aisladas de fuentes termales debido a sus diferentes aplicaciones tanto en la industria

farmacéutica, alimentaria, textil, agrícola, detergentes y para biorremediación de sitios

contaminados con diferentes compuestos. El trabajo resalta la importancia de las fuentes

termales debido a su diversidad tanto en rangos de temperatura como en composición del agua.
 63

Aboelkheir et al. (2019), resaltó la importancia de probar diferentes materiales como

alimento para el Tenebrio Molitor, en este caso se trabajó con residuos de caucho y se observó

resultados en las modificaciones químicas de las muestras.

Jardine et al. (2018), destaco el gran potencial que tienen las aguas termales de la

provincial de Limpopo en Sudáfrica por contener diversidad de bacterias que pueden ser

candidatas para producción de diferentes enzimas o para ser usadas para biorremediar sitios

contaminados, informo que la mayoría de bacterias aisladas pertenecen al género Bacillus con

gran capacidad de producir amilasa y proteasa.

Kshirsagar et al. (2020), identifico diferentes tipos de bacterias a partir de tierra

contaminada en la India, utilizo medios minerales suplementados con distintos sustratos como

aceite desasfaltado, aceite lubricante y asfáltenos observando variaciones entre el 9 y 30% de

degradación de los hidrocarburos. Observo el mayor porcentaje de degradación de

hidrocarburos con el género Bacillus (30%) y Lisinibacillus (15%), además ambos

consiguieron porcentajes de degradación de asfáltenos del 15%, sin embargo, el consorcio

bacteriano alcanzo porcentajes del 60 % para hidrocarburos y 35 % para asfáltenos.

Kumar y Sharma (2020), informo la diversidad de bacterias en fuentes termales

ligeramente alcalinas de Yamunotri Tapt Kund con temperaturas que oscilaban entre 40 y 48ºC

aislando diez especies bacterianas dentro de ellas Bacillus licheniformis y Lisinibacillus.

Montalbán et al. (2020), concluyo en su trabajo que los gusanos de la harina criados con

una dieta baja en almidón y una cantidad alta de proteína bruta, se aisló de la microbiota del

intestino y se encontró en todas las muestras analizadas al género Bacillus.

 64

Figura 1

Porcentaje de homología

Figura 2

Árbol filogenético
 65

Figura 3

Porcentaje de homología

Figura 4

Árbol filogenético
 66

Conclusiones

• Se aisló y se caracterizó a las dos mejores bacterias, procedentes de aguas termales del

distrito de Pampa Cañahuas-Yanahuara y del Tenebrio Molitor, las cuales fueron

identificadas como Lisinibacillus y Bacillus licheniformis respectivamente.

• Se verifico la importancia de aislar microorganismos a partir de diferentes muestras

ambientales, en este caso de fuentes termales, de humedales, de tierras y lugares muy

cercanos con hidrocarburos y de gusanos con implicancia directa en el consumo de

productos derivados del petróleo.

• Se identificó a las dos cepas bacterianas con mayor actividad degradativa del petróleo

que lograron desarrollarse en el medio mineral en concentraciones al 8% de petróleo

siendo identificadas como Lisinibacillus y Bacillus licheniformis.

• Se observó que la actividad emulsificante de los microorganismos tiene una relación

directamente proporcional con la absorbancia y la degradación de petróleo, en este caso

los diez mejores microorganismos alcanzaron valores alrededor de 3,45 a 3,65

(UAE/ml)

• Se determinó que las dos mejores cepas bacterianas identificadas como Lisinibacillus y

Bacillus licheniformis lograron un desarrollo en el medio mineral al 4% de 1.5*108

UFC, para el medio mineral al 6% Bacillus licheniformis consiguió un desarrollo de

1.5*108 UFC y Lisinibacillus un desarrollo de 1.2*108 UFC, finalmente para el medio

mineral al 8% ambos microorganismos lograron un desarrollo del 1.2*108 UFC al cabo

de 30 días de incubación.
 67

Recomendaciones

• Se sugiere identificar el mayor número de microorganismos tanto bacterias, hongos,

levaduras y microalgas de todas las fuentes termales, de diferentes humedales, de

distintos ecosistemas que existen en nuestro país, para tener una diversidad de

microorganismos para diversos usos.

• Se recomienda utilizar consorcios bacterianos para mejorar la actividad degradativa por

parte de los microorganismos.

• Se sugiere usar sustratos específicos como asfáltenos, distintos tipos de aceites; para

saber la tolerancia y el potencial de crecimiento de las distintas bacterias para conocer

mejor las características de los microorganismos.

 68

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 81

Anexos

Anexo 1

Humedal-Huasao-Cusco-Muestra Tierra

Humedal-Huasao-Cusco-Muestra Tierra
 82

Humedal-Huasao-Cusco-Muestra Liquida

Humedal-Huasao-Cusco-Muestra Liquida
 83

Muestra-Distrito de Pampa Cañahuas-Agua termal

Muestra-Distrito de Pampa Cañahuas-Agua termal, muestra liquida

 84

Muestra-Distrito de Pampa Cañahuas-Agua termal, muestra liquida

Muestra-Calera Yura, muestra liquida

 85

Muestra-Calera Yura, muestra liquida

Tenebrio Molitor
 86

Caldo Palleroni
Caldo Palleroni g/l
Na2HPO4 9,37
KH2PO4 8,97
NaCl 1,7
MgSO4 0,1
CaCl 0,001
Agua destilada 200 ml

Caldo Acetato Mineral

Caldo Acetato Mineral g/l
Na2HPO4 2,25
KH2PO4 0,345
MgSO4 0,05
NH4Cl 0,25
NaC2H3O2 0,000125
CaCl2 0,00025
Na₂CO₃ al 0.05% 0,11
Agua destilada 250 ml

Preparación del Caldo Acetato Mineral y Palleroni

 87

Caldo Palleroni

Caldo Acetato Mineral

Orbital agitador a 150 r.p.m a 30°C

 88

Frascos con medio Palleroni y Acetato Mineral

 89

Anexo 2

Agar Cerebro Corazón

Disolver 52 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Calentar hasta disolver en un matraz.
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Distribuir en placas de Petri estériles
Componentes g/l
Infusión Cerebro de Ternera 200
Infusión de Corazón 250
Peptona 10
Cloruro de sodio 5
Glucosa 2
Fosfato di sódico 2,5

Agar King B
Suspender 38 gramos del medio en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerol.
Mezclar bien y disolver por calentamiento agitando con frecuencia. Hervir durante un minuto
hasta su completa disolución. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a
45-50 ºC, mezclar bien y dispensar en placas.

Componentes g/l
Peptona 20
Agar purificado 12
K2HPO4 1,5
MgSO4 1,5

Caldo Nutritivo
Suspender 8 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos y calentar con
agitación frecuente, llevando a ebullición para disolución total. Distribuir en tubos u otros
recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Componentes g/l
Pluripeptona 5
Extracto de carne 3
 90

Placa con Agar Cerebro Corazón

Placa con Agar King B

Placa con Agar Nutritivo

 91

Anexo 3

Medio Mínimo de Goldman

Medio Mínimo de Goldman g/l
K2HPO4 18
KH2PO4 6
MgSO4 0,2
(NH4)2 SO4 4
Etanol 20 ml

Tubos con 8ml de Medio Mínimo de Goldman con 2 ml de cultivo puro.

Tubos en el agitador orbital a 150 r.p.m a 30°C por 72 horas.

 92

Centrifuga a 5000 r.p.m por 30 minutos.

Tubos con Medio Mínimo de Goldman después de ser centrifugados.

 93

Espectrofotómetro 540 nm
 94

Anexo 4

Tinción de Gram
• Hacer un frotis de la cepa bacteriana con una gota de agua destilada.
• Cubrir el portaobjetos con cristal violeta y dejar actuar por un minuto y enjuagar con
agua del caño.
• Cubrir con lugol durante un minuto y enjuagar con agua del caño.
• Agregar el decolorante alcohol-acetona hasta que desaparezca el cristal violeta por 30
segundos y enjuagar con agua del caño.
• Cubrir con safranina durante un minuto y lavar con agua del caño.
• Dejar que el portaobjetos seque en el ambiente.
• Visualizar la muestra en el microscopio usando el objetivo de 100X aplicando aceite
de inmersión al portaobjeto.

Preparación de la Tinción de Gram

 95

Anexo 5

Medio Mineral:
Medio Mineral g/l
NaCl 24
KCl 0,7
KH2 PO4 2
MgSO4 1
Na2 HPO4 1
NH4NO3 1
Petróleo crudo 10 ml

Escala de Mc Farland
 96

Anexo 6

Placa de agar King B

Placa de Agar King B

Placa de agar King B

 97

Placa de agar King B

Placa de agar King B

Placa de agar Brain Heart

 98

Placa de agar Brain Heart

Placa de Agar Brain Heart

Placas en Agar King B y Brain Heart

 99

Cepas Puras en Placas de Agar Nutritivo

 100

Anexo 7

Cepa: A-8-2, Abs= 2.978

Cepa: P-8-1, Abs= 3.00

 101

Cepa: P-5-2, Abs= 3.0

Cepa: P-5-3, Abs= 2.959

 102

Cepa: A-2-2, Abs= 2.898

Cepa: P-6-2, Abs= 2.930

 103

Cepa: A-4-1, Abs= 2.927

Cepa: P-7-1, Abs= 2.983

Cepa: A-7-1, Abs= 2.994

 104

Cepa: P-1-1, Abs= 2.932

 105

Anexo 8

Tinción de Gram
Cepa P-5-2:

Cepa P-8-1
 106

Anexo 9

Fotos de tubos degradativos con la escala de Mc Farland

Tubos al 4%

Tubos al 6%
 107

Tubos al 8%

Tubos de la Cepa P-8-1

Tubos de la Cepa P-5-2

 108

Anexo 10

Placas para secuenciar

Bacillus licheniformis

Lysinibacillus sp.