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El Microscopio
El Microscopio
HISTORIA: EL INVENTO
Se inventó,
hacia 1610, por
Galileo, según
los italianos, o
por Jansen, en
opinión de los
holandeses
EL NOMBRE
La palabra
microscopio fue
utilizada por
primera vez por los
componentes de la
"Accademia dei
Lincei“
Micro=pequeño
Scopein=ver
GALILEO GALILEI
La “Accademia dei
Linceii” era una
sociedad científica a
la que pertenecía
Galileo y publicaron
un trabajo sobre la
observación
microscópica del
aspecto de una abeja
MALPIGHI
Las primeras
publicaciones
importantes aparecen
en 1660 y 1665
cuando Malpighi
observa los capilares
sanguíneos y Hooke
publica su obra
Micrographia
ANTONY VAN
LEENWENHOEK
En el siglo XVII un
comerciante
holandés, utilizando
microscopios simples
de fabricación propia
describió por primera
vez protozoos,
bacterias,
espermatozoides y
glóbulos rojos
MICROSCOPIO DE
LEEUWENHOEK
CARACTERÍSTICAS DEL
MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK
El primitivo
microscopio de
Leeuwenhoek tenía
dos lupas
combinadas con las
que llegó a alcanzar
260 aumentos, lo cual
le permitió visualizar
algunos protozoos e
infusorios
MICROSCOPIOS DEL SIGLO
XVIII
ERNST ABBE
Mejora la
microscopía de
inmersión
sustituyendo el
agua por aceite de
cedro lo que
permite obtener
2000 aumentos
FUNDAMENTO DE LA
MICROSCOPÍA
Cuando el observador
se acerca el objeto se
agranda
Pero a menos de 25
cm no se ve con
claridad
Si se aumenta el
ángulo visual se ve
con claridad
EVOLUCIÓN DEL
MICROSCOPIO
ESQUEMA DEL
MICROSCOPIO
Un tubo cilíndrico aloja el
sistema óptico
ocular/objetivo. Una
platina de original
diseño permite observar
las preparaciones, que
son iluminadas por un
espejo cóncavo que
concentra la luz sobre el
objeto a estudiar.
PARÁMETROS ÓPTICOS
Aumento
Poder de
resolución
Nº de campo
Profundidad de
foco
Contraste
AUMENTO
Se calcula
multiplicando
el aumento del
objetivo por el
aumento del
ocular
PODER DE RESOLUCIÓN
Distancia si dos
puntos se distinguen
Mayor, cuando menor
es la longitud de onda
Mayor, cuanto mas
grande es la apertura
numérica
Mayor, con aceite de
cedro
Número de campo
Es el diámetro
de la imagen
observada a
través del
ocular,
expresado en
milímetros
PROFUNDIDAD DE CAMPO
CONTRASTE
Diferencia de
absorción de luz
entre el objeto y
el medio
Puede
aumentarse con
las tinciones
BUENOS PARÁMETROS
MICROSCOPIO ÓPTICO
COMPUESTO
PARTE MECÁNICA QUE SE
PUEDE DESMONTAR
Estativo
Tornillos
Cabezal de la
platina
Oculares
Condensador
Objetivos
SISTEMA DE SOPORTE O
ESTATIVO
Tubo
Platina Brazo
Píe
SISTEMA DE AJUSTE (1)
Anillo de
ajuste de los
oculares
Tornillo que
permite
mover el
cabezal
Tornillos del
condensador
Tornillos
Palanca de reguladores
cierre del de la platina
diafragma
SISTEMA DE ENFOQUE
Freno
Tornillo
macrométrico
Tornillo
micrométrico
PLATINA
Pinza
Escala
PARTE ÓPTICA
Sistema de
iluminación:
fuente de luz,
condensador y
diafragma
Lentes: objetivos
y oculares
SISTEMA DE ILUMINACIÓN:
FUENTE DE LUZ
Interruptor y
graduación de la luz
Lámpara
CONDENSADOR Y
DIAFRAGMA
Condensador:
concentra la luz de la
lámpara en un punto
de la preparación
Diafragma o iris (está
dentro del
condensador):si se
cierra mejora el
contraste, pero
empeora la resolución
LENTES: OBJETIVOS
Están colocados en el
revolver
Tienen un sistema de
amortiguación
Un anillo coloreado
indica los aumentos
Son de 4, 10, 40 y
100 (inmersión)
aumentos
OBJETIVOS
Rojo
4x
Amarillo
10x
Blanco
100x Azul
40x
Amortiguación
LENTES: OCULARES
Oculares
Ajuste de la distancia
interpupilar
OCULARES: 10x; 15x; 20x
TETRAOCULARES
MATERIAL NECESARIO:
PORTAS Y CUBRES
ACEITE DE INMERSIÓN
Hoy no son de
madera de cedro,
sino sintéticos
Los hay de baja,
media y alta
viscosidad
Su empleo es
imprescindible con el
objetivo de inmersión
(100x)
MANEJO DEL MICROSCOPIO
Mirando
No ponerporla preparación
fuera subir laal platina
revés
Regular ylaajustar
Enfocar luz a intensidad media
Ajustaralcondensador
Pasar siguiente aumento
y diafragma
y enfocar
al medio
Empezar
Al acabar por
retirar
pocola aumento
preparación
Apagar la luz
CONSERVACIÓN DEL
MICROSCOPIO
Ponerle su funda al
guardarlo
Limpieza de lentes
con papel de gafas
El exceso de xilol al
limpiar las lentes
desgasta el cemento
Usar pincel y pera de
aire
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Microscopio
Óptico Simple Lupa
óptico Microscopio
M.O. Normal
Campo oscuro
Óptico
Contraste de fases
Compuesto
Fluorescencia
Transmisión
Barrido
electrónico Digital
Efecto túnel o cuántico
PODER DE OBSERVACIÓN
DEL MICROSCOPIO
MICROSCOPÍA DE CAMPO
OSCURO
Treponema pallidum
MICROSCOPÍA DE
CONTRASTE DE FASES
Células epiteliales 20 x
MICROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
El microscopio
electrónico de
transmisión (T.E.M.)
consiguió aumentos
de 100.000 X. Fue
desarrollado por
Max Knoll y Ernst
Ruska en Alemania
en 1931
PRIMER MICROSCOPIO
ELECTRONICO
Utilizó un haz de
electrones en lugar
de luz para enfocar
la muestra.
Posteriormente, en
1942 se desarrolla el
microscopio
electrónico de
barrido (SEM).
PRIMER M.E. EN ESPAÑA
(1949)
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE BARRIDO
M.E. DE TRASMISIÓN
Bacilos en división
M.E DE BARRIDO
Glóbulo rojo
M.E. DE BARRIDO
Glóbulo blanco
Formación imagen microscópica
Formación de la imagen
Formación de la imagen en el
microscopio
OBSERVADOR
Objeto
1 Imag Imagen
Lente en real
virtua (Objeto Lente
Objetivo
l 2) Ocular
(converge
(diverge
nte)
nte)
Poder de resolución
Cubreobjeto
Portaobjeto
Tipos de Microscopios de luz
De campo claro
(brillante): el
contraste lo provee
la tinción de las
muestras
Imágenes con
microscopio de
campo claro
Tipos de Microscopios de luz
Contraste de fases:
permite observar
muestras vivas, o
carentes de color
Imagen con
microscopio de
contraste de fases
Tipos de Microscopios de luz
Fluorescente: utiliza
luz de longitud de
onda corta para
excitar los
electrones de la Fibroblastos
muestra teñidos con el
fluorocromo
Bacillus subtilis
FITC
esporulando teñidos
con FITC, DAPI y
βgalactosidasa.
Tipos de Microscopios de luz
Luz polarizada:
utiliza filtros
polarizantes para
observar
estructuras con
birrefringencia
(emite brillantez)
Cristales de ácido urico
observados con
microscopio de luz
polarizada
Tipos de Microscopios de luz
De campo oscuro:
para muestras no
teñidas, objeto se
observa brillante
sobre un fondo
oscuro
Requiere tinciones
CONTRASTE DE FASES
FLUORESCENCIA
DE LUZ POLARIZADA
Produce birrefringencia
CAMPO OSCURO
CONFOCAL
Forma imágenes 3D
Videomicroscopia digital
Permite el
registro y
almacenamiento
electrónico de
imágenes
microscópicas
poniendo una
cámara de vídeo
en el plano de la
imagen
producida por la
Microscopio electrónico
Utiliza electrones en lugar
de fotones para formar
imágenes de objetos muy
pequeños
Funciona con un haz de
electrones de alto voltaje
Utiliza lentes magnéticas
para formar la imagen
sobre una pantalla
Microscopía Electrónica
Aumenta la imagen desde 1000 hasta 250000
veces
Óvulo de hamster
sin zona pelucida
con
espermatozoides
DE TRANSMISION
Permite ver el interior de las estructuras
DE BARRIDO
Permite ver la superficie de las estructuras
Límite de resolución y magnificación
Resolución
Magnificación
Ojo humano 0.1 mm no produce
Microscopio
Óptico 200 nm 1000 – 2000 veces
Microscopio
Electrónico 3 – 5 Aº 250,000 veces
Microscopía
El Microscopio es un
instrumento de
óptica que permite
ver de cerca, y
aumentados, objetos
pequeños o detalles
estructurales
imperceptibles a
simple vista.
Microscopía óptica(2)
Procesado de la muestra biológica
para su adecuada observación
Procesamiento de la muestra:
Permitir que la luz la atraviese y podamos observarla
Mantener condiciones cercanas a las naturales
Pasos a seguir
1. Obtención de la muestra
2. Fijación
3. Inclusión
4. Corte
5. Tinción
6. Montaje
OBTENCIÓN Ó RECOGIDA DE LA MUESTRA
Evitar:
Autolisis por liberación de enzimas lisosomales (más rápida)
Putrefacción provocada por enzimas bacterianos (más tardía)
FIJACIÓN
Evitan la aparición de alteraciones tras la muerte (autolisis y
putrefacción)
Agentes fijadores
Capacidad fijadora (evitan autolisis)
Físicos
Congelación:
N2 líquido (-121ºC)
Isopentano (-50ºC)
Criodesecación o liofilización (desecación por sublimación)
Criosustitución (alcohol etílico, acetona o polietilenglicol)
Químicos: desnaturalización
Bloqueo de la autolisis.o precipitación de proteínas
Efecto microbicida.
Evitar los efectos osmóticos.
Evitar los cambios de textura y composición tisular.
Efecto mordiente.
TIPOS DE FIJADORES QUÍMICOS
Mezclas fijadoras
INCLUSIÓN
PARAFINA
Deshidratación previa
mediante fijación en alcohol
en gradación ascendente y
su
Aclarado posterior
CORTE
CORTE
TINCIÓN
Tinción Hematoxilina-Eosina
TINCIÓN GENERAL Y TINCIÓN ESPECÍFICA
TINCION DE FLAGELOS
Los flagelos son estructuras de locomoción en forma de
hilo, tan delgados que sólo se pueden observar
directamente con el microscopio electrónico.
Para observarlos con el M. optico, se aumenta su grosor
cubriéndolos con mordientes, como ácido tànico y
alumbre de potasio, y tiñéndolos con pararosanilina o
fucsina básica.
Los métodos de tinción de flagelos ofrecen una información
taxonómica importante acerca de su presencia y el
modelo de su distribución.