Universidad de Guanajuato

División de Ciencias Naturales y Exactas

Licenciatura en Biología Experimental

Laboratorio de Estructura de Biomoléculas y

Cinética Enzimática

Reporte de Ácidps Nucléicos

Prof. Luis Felipe Padilla Vaca

Equipo 6:
Laura Viridiana Pérez Rubio…. 100%
Denisse Marisol Torres Franco…100%
David Enrique Pérez Ramírez…100%

28-noviembre-2022
INTRODUCCIÓN

ANTECEDENTES HISTÓRICOS

Los nucleótidos son biopolímeros de elevado peso molecular, están formados por otras subunidades
estructurales o monómeros.
El médico y biólogo Johan Meischer descubrió los ácidos nucleicos en 1869. Mientras trabajaba con leucocitos y
espermatozoides de salmón, obtuvo una sustancia abundante en carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y con
un porcentaje elevado de fósforo. En un principio le llamó a esta sustancia nucleína, ya que se encontraba en el
núcleo. Años más tarde, se fragmentó esta nucleína, se separó un componente proteico y un grupo prostético,
esta último, por ser ácido, Richard Altman, discípulo de Miescher, le llamó ácido nucleico. Albert Kossel
comprobó que tenían una estructura bastante compleja, ya que identificó las bases nitrogenadas que
constituyen los ácidos nucleicos (adenina, citosina, guanina y timina). En 1929 Phoebus Levene en sus estudios
de la estructura y función de los ácidos nucleicos, logró determinar la existencia de ADN y ARN, además de la
composición del ADN determinando que está formado por 4 bases nitrogenadas timina y citosina (pirimidinas),
guanina y adenina (purinas), un azúcar (desoxirribosa) y un grupo fosfato. Determinó que la unidad básica del
ADN estaba conformada por fosfato-azúcar-base nitrogenada, a la cual llamó nucleótido. Por su parte, Robert
Feulgen, describió un método de tinción del ADN basado en el colorante fucsina, gracias a este se descubrió que
la información hereditaria (ácido desoxirribonucleico), está localizada en los cromosomas.

Aproximadamente en los años 50s, Maurice Wilkins y su estudiante Raymond Gosling, lograron las mejores
imágenes de difracción de rayos X a partir de ADN de alta pureza. Las fotografías sugieren una forma helicoidal
pero no aclaraba si la molécula estaba formada por el entrelazamiento de uno, dos, tres o cuatro filamentos.
Inicialmente Wilkins se decidió por un modelo de filamento único, pero en el King’s College de la Universidad de
Londres no contaban con suficiente capacidad y experiencia para identificar las imágenes de difracción de rayos
X. Pero más adelante la cristalógrafa Rosalind Franklin, nacida en 1920 licenciada en fisicoquímica en Cambridge
se incorpora en 1951 al equipo del King’s College y en febrero de 1953 escribió en sus notas de trabajo que el
ADN tenía una estructura de dos cadenas, con los grupos fosfatos orientados hacia fuera. Sin embargo, muere a
la temprana edad de 38 años en abril de 1958 víctima de un cáncer de ovario, y de no ser por eso seguramente
hubiera compartido el premio Nobel con Crick, Watson y Wilkins pues su aporte fue fundamental para encontrar
la estructura del ADN. (Guevara, 2004).

CLASIFICACIÓN:
Los ácidos nucleicos son el material genético de todos los seres vivos, esta función es compartida por dos tipos
de ácidos nucleicos que difieren entre sí en pequeños detalles de su estructura, propiedades y composición
química y gran parte de su función. Enciclopedia de Biología, s.f.)
Atendiendo a su estructura y composición existen dos tipos de ácidos nucleicos que son:

• Ácido desoxirribonucleico (DNA). Se encarga del almacenamiento del material genético.

El ADN es una biomolécula de doble hélice. Se encuentra ubicada en el núcleo de las células eucariotas,
específicamente dentro del cromosoma, con excepción de las células procariotas, cuyo ADN se encuentra
disperso en el citoplasma y cuya forma es circular.

• Ácido ribonucleico (RNA). Es el responsable de la trasferencia del material hacia las células.
El ARN es una biomolécula con una sola hélice que está presente en organismos eucarióticos y procarióticos. En
ocasiones, el ARN es el único material genético que presentan los virus.

Ilustración 1. Clasificación general de los ácidos nucleicos

Ilustración 2. Formación de un fragmento de ARN

En la célula se encuentran varias clases de RNA las cuales cubren una amplia variedad de funciones.

• RNA ribosómico (rRNA). Son componentes de los ribosomas, complejos que llevan a cabo la síntesis de
proteínas.
• RNA mensajeros (mRNA). Actúan de intermediarios, trasportando la información desde un gen o unos
pocos genes hasta el ribosoma, donde se sintetizan las proteínas.
• RNA de transferencia (tRNA). Son moléculas adaptadoras que traducen con fidelidad la información
contenida en el mRNA a secuencias específicas de aminoácidos.

Ilustración 3. Tipos de ARN

Además, existe una amplia variedad de RNA que desempeñan funciones
específicas. Entre ellos se pueden mencionar el RNA de interferencia, Micro RNA, RNA interferente pequeño,
RNA asociados a Piwi, RNA anti-sentido, RNA largo no codificante, Riboswitch.

Nucleótidos: los nucleótidos son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos, se liberan mediante hidrólisis
controlada y están formados de tres moléculas, una base nitrogenada, un monosacárido y un grupo fosfato.
Bases nitrogenadas: son compuestos orgánicos cíclicos, con dos a más átomos de nitrógeno, que constituyen
una parte fundamental de los nucleótidos, nucleósidos y ácidos nucleicos. Desde el punto de vista de la Biología
existen cinco bases nitrogenadas principales, que se clasifican en dos grupos, bases púricas (derivadas de la
estructura de la purina) y las bases pirimidínicas (derivadas de la
estructura de la pirimidina). La adenina (A) y la guanina (G) son púricas,
mientras que la timina (T), citosina (C) y el uracilo (U) son pirimidínicas.
Las primeras bases se encuentran en el ADN, mientras que en el ARN en
lugar de la timina existe el uracilo. Las bases nitrogenadas son
complementarias entre sí, es decir, forman parejas. La adenina y la timina
son complementarias, al igual que la guanina y la citosina. Como en el
ARN no existe la timina, la complementariedad se da entre la adenina y
el uracilo. Como se muestra en la ilustración 4.

Ilustración 4. Purinas y primidinas

Monosacáridos. Los ácidos nucleicos poseen una aldopentosa y

es la que da el nombre a los ácidos, la ribosa en el RNA y
desoxirribosa en el RNA. Como se muestra en la ilustración 5.

Ilustración 5. Estructura molecular de los

monosacáridos del RNA (ribosa) y del DNA
(desoxirribosa).

Grupo fosfato. Este componente deriva del ácido fosfórico, en los

nucleótidos es responsable de su carácter ácido y gran parte de
la solubilidad.

Ilustración 6. Comparación de la estructura

molecular del RNA y del DNA.
DISTRIBUCIÓN EN LA NATURALEZA:

Los ácidos nucleicos se encuentran en todos los organismos, específicamente dentro de sus células, estas
biomoléculas dirigen y controlan la síntesis de sus proteínas, proporcionando la información que determina su
especificidad y características biológicas, ya que contienen las instrucciones necesarias para realizar los procesos
vitales y son los responsables de todas las funciones básicas en el organismo. En los eucariotas, el DNA se
encuentra localizado en el núcleo formando largas moléculas lineales asociadas a proteínas básicas. Aunque la
mayor parte del DNA de las células eucariotas está confinada en el núcleo, en las mitocondrias y en los
cloroplastos también hay DNA. En los eucariotas el RNA se localiza tanto en el núcleo como en el citoplasma.
Todos los RNA se sintetizan en el núcleo utilizando como molde una de las dos cadenas de polinucleótidos del
DNA. (Biología Sur, 2010)
IMPORTANCIA BIOLÓGICA:

NUCLEÓTIDOS:

• Son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos.

• Pueden actuar como mensajeros
• Transportadores de energía
• Transportadores de moléculas activadas
• Forman parte de coenzimas
• Tienen funciones reguladoras
• Intermediarios metabólicos especializados en transferir energía.

DNA: Es la base química de la herencia, y está organizada en genes, las unidades fundamentales de la información
genética. Funciona como almacén de la información genética que se localiza en los cromosomas del núcleo, las
mitocondrias y los cloroplastos en las células eucariotas. En las células procariotas el DNA se encuentra un
cromosoma único, y de manera extra cromosómica, en forma de plásmidos. (Micocci, 2018)

ARN: interviene en la transferencia de la información requerida por el DNA hacia los compartimientos celulares.
Se encuentra en el núcleo, el citoplasma, la matriz mitocondrial y el estroma de los cloroplastos en células
eucariotas; en células procariotas se encuentra en el citosol

• ARN ribosómico: (ARNr) forma parte de la estructura de los ribosomas, sitio donde se da la síntesis de
las proteínas.
• ARN mensajero: (ARNm) indica las secuencias de aminoácidos que integrarán la proteína a sintetizar.
• ARN de transferencia: (ARNt) presenta una estructura muy particular denominada “en hoja de trébol”,
su función es el de transportar específicamente los aminoácidos para su acople en la secuencia que
conformará la futura proteína.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA:

Los nucleótidos poseen una gran capacidad de absorber luz ultravioleta, de allí la posibilidad de sufrir
alteraciones que pueden derivar en asociaciones carcinogénicas por ello, son importantes en tratamientos como
la quimioterapia se utilizan un conjunto de análogos de purina y pirimidina sintetizados químicamente; que
reflejan dos procesos, la inhibición por el medicamento de actividades enzimáticas que son específicas y
esenciales para la síntesis de ácidos nucleicos, y la incorporación de metabolitos que alteran el apareamiento de
las bases nitrogenadas, lo que es esencial para la transmisión exacta de información.

Las enfermedades derivadas de los ácidos nucleicos pueden clasificarse como de base genética y se caracterizan
por comprometer la calidad de vida de los afectados, causando una grave discapacidad intelectual o física. Así
mismo, es frecuente que estas enfermedades tengan un carácter progresivo y condicionen una mortalidad
precoz (Carbajal & Navarrete, 2015).

Un elevado porcentaje de las denominadas enfermedades raras tienen un origen genético. Hablar de genética
en las enfermedades raras es referirse al conjunto amplio de tres tipos de enfermedades genéticas:
 1. Defectos monogénicos: la afección es de un solo gen, se transmiten según las leyes de la herencia de
Mendel (de ahí que también se conozcan como enfermedades mendelianas), o en el pequeño genoma
ubicado en la matriz de las mitocondrias con un patrón de transmisión específico conocido como
herencia mitocondrial.
2. Trastornos cromosómicos donde hay alteraciones numéricas de los cromosomas, deleciones parciales,
o a alteraciones estructurales de los cromosomas.
3. Multifactoriales, en los cuales hay mutación en dos o más. Muchas de estas enfermedades afectan al
sistema nervioso con lo que adquieren una importancia singular, porque atañen a aquello que
caracteriza de modo más específico

Existen variaciones genéticas denominadas polimorfismos que son diferencias, cambios de pares de bases, que
se establecen entre individuos una vez cada ciento de pares de bases, por ejemplo:

• Fibrosis quística: Es producida por una mutación en el gen que codifica la proteína CFTR. LA alteración
de esta proteína provoca secreciones producidas por el cuerpo humano sean más espesas de lo habitual,
lo que origina varios problemas como congestión nasal que puede llegar a destruir el tejido pulmonar,
categorizándola como una enfermedad potencialmente mortal, por lo que requiere cuidados continuos.
• Anemia Falciforme: se debe a una mutación en el gen de la globina Beta, de la hemoglobina, en la cual
los glóbulos rojos se deforman como consecuencia y no son capaces de transportar bien el oxígeno.
• Enfermedad de Huntington: se inicia en el gen de huntingtina, una proteína que se cree que tendría un
papel importante en el almacenamiento de la memoria a corto plazo. La mutación que hace dicha
proteína se acumula en las células nerviosas, produciendo una degeneración progresiva. Los síntomas
incluyen movimientos incontrolables, dificultad para tragar alimentos, cambios abruptos de conducta,
dificultades para mantener el equilibrio y caminar, fallos de memoria, habla y perdida cognitiva.
• Síndrome de Down: es una anomalía cromosómica que afecta a 1 de cada 1000 recién nacidos,
aproximadamente, Consiste en la aparición de una copia extra del cromosoma 21. Las personas con este
síndrome sufren retrasos del desarrollo, malformaciones cardiacas y digestivas.

Este tipo de enfermedades afecta una gran cantidad de aspectos en los seres humanos, como el comportamiento
cognitivo, la memoria, la conducta emocional, etc., estas enfermedades son capaces de producir una disfunción
del sistema nervioso, cuya repercusión sobre el desarrollo del individuo es poco predecible, ya que puede ser
modificada por cambios en el flujo sanguíneo cerebral, respuestas inmunitarias, infecciones, agresiones por
factores ambientales, entre otros muchos factores (Baynes & Dominiczak, 2010).

IMPORTANCIA INDUSTRIAL:

La importancia industrial o la rentabilidad económica de los ácidos nucleico se basa en las diferentes aplicaciones
que se le pueden dar al conocimiento de su estructura y función. Dichas aplicaciones son determinantes para el
desarrollo de la biotecnología moderna y la nanotecnología.

Cuando se comprendió la estructura e información contenida en los genes, se comenzó a buscar la forma de
aislarlos, analizarlos, modificarlos y transferirlos de un organismo a otro para proveerle una nueva característica.
La ingeniería genética permite replicar fragmentos de ADN y expresar genes en diferentes organismos. Al
manipular y transferir ADN, se logra la producción de organismos genéticamente modificados, enzimas,
proteínas recombinantes y analizar genes específicos para procesos industriales o investigaciones. Dentro de la
biotecnología, las moléculas de ARN ayudan a monitorear patrones de expresión genética y a su vez, el
desarrollar nuevas técnicas científicas, útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Tal es la
importancia de los ácidos nucleicos que muchas empresas ofrecen sus servicios o productos para el análisis de
estas biomoléculas, uno de los servicios más comunes es la secuenciación, la cual puede ser utilizando diferentes
técnicas.

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS:

POLARIDAD Y SOLUBILIDAD. Los ácidos nucleicos (tanto del ARN como del ADN) son de carácter polar, esto
quiere decir que son solubles en agua (o en medios acuosos) y son de carácter hidrofílico. Así mismo, son
insolubles en solventes inorgánicos (como el cloroformo, metanol o etanol)
CARGA. Los ácidos nucleicos se encuentran fuertemente cargados de manera negativa, esto debido a los grupos
fosfato involucrados en su estructura, los cuales en un pH fisiológico (próximo a 7) adquieren una carga negativa.
Esta carga le da un carácter ácido a este tipo de biomoléculas.
REACTIVIDAD QUÍMICA. La reactividad de los ácidos nucleicos es variable, dependiendo en gran medida de las
condiciones del medio en el que se encuentra y su estructura. El ADN es mucho más estable que el ARN debido
a su conformación estructural de doble cadena, ya que no posee grupos hidroxilo disponibles en su cadena, a
comparación del ARN, que puedan reaccionar con especies químicas.
DESNATURALIZACIÓN, RENATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN. Los ácidos nucleicos, al igual que las proteínas,
pueden sufrir cambios en su conformación estructural debido a cambios en el pH o la temperatura del medio.
Tanto los ADN´s de doble cadena como los ARN´s que posean una estructura de horquilla pueden ser afectados
por este proceso. La desnaturalización se da en condiciones de alta temperatura (en promedio por encima de los
60°C), pero la temperatura varía de acuerdo con la composición de bases del ácido nucleico, y con un pH alcalino
(condiciones que favorecen la ruptura de los enlaces puente hidrogeno). Al romperse estos enlaces se pierde el
vínculo que une a las dos cadenas de ADN y por ende su estructura. El proceso de renaturalización puede
revertirse al restablecer la temperatura y pH, logrando que la cadena se vuelva a estructurar mediante la
renaturalización y la hibridación. La renaturalización se da cuando los nucleótidos de la cadena se vuelven a
aparear, pero de manera aleatoria y no siguiendo su secuencia original. Mientras que la hibridación es un proceso
más lento que si sigue la secuencia de nucleótidos. (Timberlake & Olguín, 2013; Voet, et al., 2016; Karp, 2009;
Nelson & Cox, 2009).
HIDRÓLISIS. Involucra la ruptura del esqueleto de azúcar y fosfato de los ácidos nucleicos. Esta reacción se da
gracias a la protonación del ácido hacia la pentosa que participa en el enlace fosfodiéster, generando el
rompimiento de este enlace. Pese a que esta reacción se da tanto en el ADN como en el ARN, se lleva a cabo con
mayor facilidad en las moléculas de DNA. Esto debido a que la pentosa del DNA es más fácil de protonar que la
pentosa del RNA.
ABSORBANCIA DE LA LUZ. Tanto el ADN como el ARN son moléculas capaces de absorber la radiación ultravioleta
(a una longitud de onda de 260 nm) gracias a la presencia de los compuestos cíclicos (purinas y pirimidinas)
dentro de su estructura. Si la doble hélice permanece unida o hibridada se observa un efecto hipocrómico (una
reducción de la absorbancia de la muestra), mientras que si esta desnaturalizada se observa un efecto
hipercrómico (un aumento de la absorbancia presentada por la muestra).

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN:
Es necesario obtener los ácidos nucleicos en su forma más pura posible, ya que de otra manera los análisis que
se le realicen se verán afectados debido a la intervención de otras biomoléculas (como proteínas o carbohidratos)
las cuales alteraran directamente la información obtenida de la muestra.

Existen dos tipos de ADN que pueden ser extraídos: DNA cromosómico y DNA plasmídico. El método más común
para efectuar la purificación de DNA plasmídico es mediante el protocolo de lisis alcalina. Para esto es necesario
llevar a cabo la alcalinización del medio (al añadir NaOH) junto con la presencia de un detergente de carácter
aniónico (típicamente SDS) para provocar la lisis celular y la desnaturalización del ADN cromosómico (junto con
la de las proteínas) sin afectar la estructura del ADN. Finalmente, para separar adecuadamente el ADN genómico
y las proteínas del medio del ADN plasmático es necesario se añade al medio una alta concentración de sal
(generalmente acetato potásico) y por centrifugación diferencial. Para realizar la extracción de ADN plasmídico
se utiliza el método de Mini prep por cTAB. El cTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) es un detergente iónico se
emplea para llevar a cabo la lisis de la pared celular de la bacteria, de tal manera que el ADN plasmídico no reciba
ningún daño. Su alta carga iónica, aunada a la adición del buffer STET (conformado por EDTA, sacarosa, Buffer
de Tris y Tritón x-100) provoca la desnaturalización y precipitación de las proteínas, así como del ADN genómico,
ARN total y los diversos componentes celulares. Por otro lado, la precipitación de los plásmidos bacterianos se
consigue al añadir metanol. Por otro lado, la purificación del ADN genómico se puede dar mediante la extracción
con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PIC), es una extracción orgánica liquido-liquido, la cual se logra al
realizar la desnaturalización de las proteínas (gracias al fenol y al cloroformo) y evitar su emulsión (mediante la
adición de alcohol isoamílico). Las proteínas desnaturalizadas precipitan y se depositan en la fase orgánica,
mientras que las moléculas de ADN permanecen en la fase acuosa. También está la extracción basada en el uso
de la proteinasa k, bajo un rango de temperatura alto (50°C-70°C) y pH ligeramente básico (7-9), para después
efectuar una extracción orgánica del ADN.

Las purificaciones del ARN necesitan llevarse con sumas precauciones, ya que este ácido nucleico es muy
propenso a la degradación tanto física como química. Para llevar a cabo la extracción de ARN total se puede
utilizar la extracción con TRIzol. El TRIzol es una solución conformada por fenol e isotiocianato de guanidino, la
cual tiene la capacidad de desnaturalizar proteínas sin afectar la integridad del ARN. Al homogenado celular se
le añade el TRIzol para provocar la solubilización y precipitación de proteínas y la inactivación de las RNasas,
posteriormente se lleva a cabo una extracción orgánica al añadir cloroformo y provocar la separación de fases
(en la fase orgánica se concentran las proteínas, en la interfase el ADN y en la fase acosa el ARN). También se
puede llevar a cabo mediante el método RNeasy. Este se basa en el uso de una serie de columnas de sílice, las
cuales son capaces de retener las moléculas de ARN, al homogenado extraído se le trata con un buffer de
tiocianato de guanidina y se le añade etanol (para promover la unión del ARN con la columna). La muestra se
hace pasar por la primer columna spin, a la cual se unen fuertemente las moléculas de ARN por interacciones
electrostáticas mientras los componentes eluyen. Posteriormente la columna es tratada con diferentes buffers
para finalmente lavar la columna con agua y obtener el RNA total.

ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN:

La caracterización de los ácidos nucleicos va encaminada en determinar la secuencia de bases que conforman a
dichas biomoléculas, así como también en determinar la presencia de una secuencia en particular dentro de una
muestra. Existen diferentes métodos a partir de los cuales puede llevarse a cabo la secuenciación de las bases
que componen a un ácido nucleico como:
 • Método de Snager: Utiliza el mecanismo de síntesis de DNA por DNA polimerasas para generar cuatro
grupos de fragmentos marcados. Dichos fragmentos se generan a partir del uso de ddNTP´s
(didesoxinucleótidos trifosfato) los cuales son nucleótidos que carecen de un grupo 3´-hidroxilo en la
desoxirribosa. La molécula de DNA fragmentada se mezcla con un cebador (una cadena corta de
nucleótidos), dNTP´s (nucleósidos trifosfato), un tipo determinado de ddNTP´s en baja concentración y
DNA polimerasa. La síntesis de ADN a partir de la cadena complementaria se lleva a cabo de manera
normal, hasta que la ADN polimerasa inserta un ddNTP el cual detiene por completo el proceso y causa
la liberación de la cadena. Este proceso se repite varias veces con cada uno de los tipos de ddNTP´s
generando fragmentos de distinta longitud, los cuales serán corridos en un gel de electroforesis para
separarlos por tamaños y localizar cada uno de los residuos en la secuencia. El gen se leerá de abajo hacia
arriba (Voet, et al., 2016; Karp, 2009; Nelson & Cox, 2009).
• Pirosecuenciación: Primero el ADN desnaturalizado se fija a una placa que posee pozos, en los cuales se
encuentra una molécula de ADN. Posteriormente, el ADN de cada pozo es replicado y transferido a un
pozo de fibra óptica. Se añade un primer, DNA polimerasa y dNTPS. Los nucleótidos son unidos por medio
de la ADN polimerasa generando pirofosfato, el cual irradia luz. Finalmente, un detector registra la
longitud de onda emitida, la cual varía de acuerdo con el nucleótido que se une a la cadena sintetizada.
Este proceso se repite múltiples veces para obtener la secuencia de nucleótidos (Voet, et al., 2016).
• Southern blot: Se utilizan enzimas de restricción para romper la molécula de DNA, los fragmentos se
separan por electroforesis de acuerdo con sus tamaños y son desnaturalizados. Dichos fragmentos
desnaturalizados se transfieren a una membrana de blotting (de nitrocelulosa). La membrana se trata
con una sonda marcada radioactiva o químicamente, la cual reconoce y se hibrida con la secuencia de
interés. Se lava la membrana y se expone a radiación electromagnética para identificar la presencia de
la sonda en el gel (Sagar, 2018; Brown, 2001).
• Northern blot: Técnica aplicada para RNA que permite identificar una secuencia de ARN determinada en
una muestra problema. Primero la muestra de ARN previamente extraída se carga en un gel de agarosa/
poliacrilamida para efectuar la separación de los fragmentos por bandas. Las bandas transferidas a una
membrana de nailon cargada positivamente y se fijan a ella mediante calor. La membrana se lava para
eliminar de la superficie de la placa el exceso de sonda no hibridada. La membrana se irradia con energía
electromagnética. Si se observa la irradiación de luz de la membrana se considera como un resultado
positivo (Biosource, 2016; Medical life Science, 2018).

ENSAYOS DE CUANTIFICACIÓN:

La cuantificación de los ácidos nucleicos tiene la finalidad de determinar la concentración de dichas biomoléculas
en una solución determinada. Se puede llevar a cabo mediante diversos, pero el más común es mediante la
absorbancia. Los ácidos nucleicos son capaces de absorber luz ultravioleta en una longitud de onda de 260 nm.
Su comportamiento se apega a la ley de Lambert-Beer, la cual establece que la absorbancia de una muestra es
directamente proporcional a su concentración de solutos. Para determinar la concentración especifica se recurre
a curvas de calibración.

Para realizar el cálculo de concentración de los ácidos nucleicos es necesario multiplicar la absorbancia
presentada por la muestra a 260 nm por un factor determinado (50 para el ADN y 40 para el ARN) según indica
las siguientes formulas (Turner BioSystems, 2009; Gallagher, & Desjardins, 2011):
Una técnica alternativa al análisis ultravioleta es el bromuro de etidio. Esta es utilizada cuando las
concentraciones del ácido son tan pequeñas que puede existir gran margen de error o la muestra contiene
contaminantes que absorben luz a la misma longitud de onda. El bromuro de etidio es un colorante fluorescente
que se une específicamente a los ácidos nucleicos y genera un complejo fluorescente, el cual al ser irradiado con
luz UV emite un espectro característico. Sin embargo, es pertinente recalcar que no es comúnmente utilizada
para análisis de cuantificación, sino más ampliamente utilizada para realizar el revelado de las manchas o bandas
generadas en un gel electroforético (Zhao, et al., 2018).

CLONACIÓN DE GENES Y PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Se conoció que la información genética en todas las células se traduce a proteínas, componentes fundamentales
que desempeñan una gran diversidad de funciones. Entre ellas las enzimas, que son proteínas que catalizan
reacciones químicas en los seres vivos. En ingeniería genética, se utilizan estas enzimas para cortar y aislar un
gen determinado -que tiene información para fabricar una proteína particular- e introducirlo en las células de un
organismo distinto del inicial. En consecuencia, este organismo tendrá ADN recombinante a partir del cual
fabricará una nueva proteína. A la proteína producida a partir de ADN recombinante se la denomina proteína
recombinante.

La recombinación de genes humanos en el ADN de bacterias es una de las posibilidades que ofrece la
biotecnología, y que posibilita obtener proteínas humanas con fines terapéuticos. Por ejemplo, insulina humana
obtenida a partir de la bacteria Escherichia coli. Esta técnica es de gran valor porque las bacterias se reproducen
rápidamente y pueden duplicar su número cada 20 minutos. De esta forma se pueden obtener en poco tiempo
muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano, y producir grandes cantidades de proteínas
recombinantes. La insulina es el primer caso de proteína producida por ingeniería genética aprobada para uso
en humanos, desde 1982. En la actualidad, varios laboratorios farmacéuticos producen insulina humana, tanto a
partir de bacterias como de levaduras, y sin ningún riesgo para la salud. Para evitar dificultades en la obtención
de la insulina recombinante se sintetizan químicamente la secuencia de ADN correspondiente a las cadenas
polipeptídicas A y B que se insertan separadamente en un gen bacteriano. Los plásmidos recombinantes se
introducen en bacterias E. coli, donde se multiplican. Una vez purificadas las dos cadenas, se unen mediante una
reacción que forma puentes disulfuro (de azufre) y se obtiene insulina humana pura. El producto final, la insulina
humana biosintética, es idéntica en todos los aspectos a la insulina purificada del páncreas humano.

RESULTADOS

Primeramente, se realizó un aislamiento correspondiente a RNA de E. Coli, pues esta bacteria primeramente fue
inoculada en un medio de ampicilina, posterior a unas 14 horas es cuando fue sometida a centrifugación de
13000 g por un minuto, en base a la preparación marcada en el manual correspondiente a lisis alcalina es como
se pretende que se obtuvo la pastilla con el contenido de RNA plasmídico de la E. Coli, esta pastilla de RNA fue
almacenada alrededor de 1 semana para posteriormente ser analizada bajo una electroforesis en gel de agarosa.

El plásmido aislado fue sometido a lecturas de 260 nm y 280 nm con el fin de conocer que tan puro se encontraba
este RNA o si había sido contaminado a lo largo del proceso, se obtuvo que la concentración del plásmido era de
1.58 µg/µL, pues correspondía a una disolución del 100% por lo que este valor corresponde al RNA total, para
asegurarse de que la contaminación fuera mínima se realizó una división entre los valores obtenidos de cada
lectura, donde la lectura de 280 nm tiene una absorbancia de 0.316 A y una absorbancia de 0.182 A en el caso
de 260 nm. Se procede a realizar la división:
0.316
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = 1.736
0.182
Este valor es cercano al de 1.8 que corresponde al de pureza óptima, por lo que se deduce que se encuentra en
una pureza aceptable.

Posterior a la preparación del gel de agarosa, se utilizó un marcador a inicio de la muestra, un plásmido aislado
otorgado por el docente, el plásmido aislado por los integrantes del equipo y una muestra PCR

Analizar el gel completo

Imagen 1. Resultado del recorrido de las muestras a través de electroforesis en gel de agarosa

El carril corresponde a lo que son los marcadores, en el 3,5 y 8 al RNA plasmídico aislado por los integrantes del
equipo, puede tratarse de ello o de únicamente nucleoticos rotos, es por eso que se aprecia como una mancha
brillante barrida sin la presencia de carriles, con la excepción del carril 8, donde presenta bandas definidas en
alrededor de 2000 y 2500 pb, la muestra del carril 3 se ve degradada y corrida.

En el caso del carril 1, se trata de otro plásmido aislado, el cual no se aprecian bandas definidas, en la caso del
carril 6 se trata también de otro plásmido aislado que no presenta ningún tipo de interacción y por último en el
carril 9 se observa 2 bandas definidas que podría tratarse de DNA. Por ultimo, en el casi del carril 4, 7 y 10 se
aplicó una PCR, la cual no corre hacía ningún extremo y permanece en la zona colocada, pues no presenta
ninguna interacción con el gel.
DISCUSIÓN

Para determinar si las muestras corresponden a DNA genómico o RNA total, se realizó una electroforesis en gel
de agarosa con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es, como la mayoría de los compuestos fluorescentes,
una sustancia aromática, este es utilizado en la electroforesis en gel de agarosa debido a que se intercala entre
las bases de los ácidos nucleicos, incrementándose de forma muy importante su emisión fluorescente lo que
permite observar bandas más nítidas en el gel de agarosa. El DNA genómico representa todo el material genético
de un organismo, por lo que se encuentra formado por larguísimas cadenas de nucleótidos

Por otro lado, otro dato importante que proporciona esta electroforesis es la calidad que presentan las muestras.
Si en los carriles en los que se corrieron las muestras se puede observar un barrido, esto indica su degradación.
Así mismo, una banda en la parte inferior de la placa puede corresponder a fragmentos de los ácidos nucleicos.
Esta degradación puede deberse a que durante el proceso de extracción no se tomaron las medidas adecuadas
por lo que pudo existir una contaminación de enzimas que generaron fragmentos más pequeños. La extracción
de ADN genómico puro e íntegro es esencial para tener éxito en la obtención de datos genéticos.

DNA plasmídico, es frecuente que tengan lugar algunos cortes, dando lugar a una forma circular relajada, Por
otra parte, si se produce el corte en las dos hebras de algunas moléculas de plásmido, se convertirán en moléculas
lineales de longitud completa. Las tres formas, superenrollada, relajada y lineal, tienen la misma “longitud” y la
misma masa molecular, pero distinta conformación y, así, distinto tamaño tridimensional. Por ello, avanzan a
distinta velocidad por el gel. Siendo así que las que más avanzan son las formas superenrolladas, posteriormente
las circulares relajadas y por ultimo las de longitud completa, si bien se observan varias bandas es porque el DNA
plasmídico busca la conformación termodinámica más estable, por lo que presentan diferentes grados de
enrollamiento, es por esto por lo que se observan diversas bandas.

CONCLUSIÓN

En estas prácticas se llevaron a cabo la extracción, purificación y cuantificación de ácidosen E. coli, se

electroforesis para establecer a que correspondía cada lectura del espectrofotómetro. Al realizar la electroforesis
en gel de agarosa, se llevó a cabo la cuantificación de ADN genómico y ARN total de las muestras, obteniendo
los resultados que se presentaron. Es importante considerar que en estas prácticas se llevaron a cabo dos
diferentes absorbancias, lo cual se realizó para determinar la contaminación que se pudiera tener al momento
de purificar, en nuestro caso se hizo a una absorbancia de 280 nm exclusivamente para determinar la presencia
de proteínas contaminantes. Por otro lado, en caso de querer llevar a cabo la cuantificación de DNA plasmídico,
es importante tener en cuenta la manera en que se encuentra empacado, y no solo es necesario tomarlo en
cuenta para la cuantificación, si no para la interpretación de las bandas en la electroforesis.

Finalmente es importante mencionar que los ácidos nucleicos son fundamentales para industrias alimenticias
especialmente a las que se dedican al mejoramiento y avance de los alimentos transgénicos, así como para
algunas otras que se dedican a mejorar algunos cultivos, hortalizas y plantas. Además de las industrias y centros
de investigación que se encargan de la fabricación de fármacos y antibióticos.

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