Principios de cromatograf ía

para desarrollar y realizar Flash y Prep HPLC

Bart Denoulet | Birke Götz | Peter Näf | Adela Bordeanu | Chantal Ulmer | Csaba Szabados
Business Area Purification - BÜCHI Labortechnik AG - Flawil - Switzerland

Flash versus Prep HPLC Enfoque general para desarrollar Diferencias entre selectividad
un método Flash o Prep HPLC y eficienciay
Flash Prep HPLC

Intensidad de la señal
Tamaño de partícula 15-63 µm 5-15 µm • Definir el tipo de método de • Elija el método analítico basado
purificación basado en el objetivo en el método de purificación
Columna ID 12-115 mm 10-70 mm Un plato teórica
-- Alta carga: cromatografía Flash -- Cromatografía Flash: TLC
Desorción
Tasa de flujo 15-250 mL/min 5-100 mL/min -- Alta resolución: Prep HPLC (cromatografía de capa fina)
Adsorción
• Verifique la polaridad de la muestra -- Prep HPLC: HPLC analítica
Capacidad de carga < 300 g <1g y seleccione el sistema de solvente • Pantalla optima para la fase Analito
Tiempo, t
Presión máxima 50 bar 300 bar -- No polar: fase normal estacionaria y móvil (selectividad) Selectividad Eficiencia
-- Polar: fase invertida con método analítico Factores que afectan la selectividad Factores que afectan la eficiencia
• Método exclusivo de purificación (expresados por el factor de (expresados por el número de placas
• Optimizar resolución (eficiencia) selectividad) teóricas):
• Fase estacionaria • Tamaño de partícula
Desarrollo de métodos vía TLC • Fase móvil • Tasa de flujo
• Carga de muestras
1. Optimizar selectividad La selectividad tiene el mayor impacto en la resolución, la eficiencia es más fácil y más
• Utilice los solventes mas comunes Solventes más comunes rápida de implementar
• Para aplicaciones complejas, use varios solventes del triángulo
de Snyder y Kirkland (vea la figura a la derecha) Fase normal (sílica): Fase reversa (sílica ligada C18):
• Ajuste la retención a través de la polaridad del solvente utilizando diferentes hexano, acetato de etilo, agua, etanol, metanol, acetonitrilo
proporciones de solvente fuerte y débil diclorometano, metanol Desarrollo de métodos mediante
HPLC analítica
• Logre optener :
-- Rf entre 0.2 y 0.5 para el compuesto objetivo
-- Punto bien separado del compuesto objetivo
1. Optimizar selectividad
distancia de
Factor de retención Rf El triángulo de Snyder y Kirkland • Ejecutar HPLC analítica bajo condiciones estándar
fase móvil • Ajuste la retención a través de la polaridad del solvente usando gradientes
I Éter isopropílico V Diclorometano con un solvente débil y fuerte
D0 distancia de soluto
Rf = Eter dietílico 1,2-Dicloroetano • Apunte a la separación de la línea de base del compuesto objetivo en la carga
ncia de fase móvil Trietilamina más alta y el tiempo de ejecución mínimo
D1
VI Dioxano •
D2
D1 II Propanol Acetato de etilo 2. Escale a una columna Prep HPLC
Posición Rf =
D3 D0 Etanol Acetona • Elija una columna con la misma longitud que la columna analítica
de inicio
Metanol Acetonitrilo • Seleccione el diámetro de la columna de preparación a = columna analítica
Aceptador
de en función de la cantidad de muestra requerida: b = columna prep
2. Escala a un cartucho flash III Tetrahidrofurano protones VII Tolueno Carga a = Carga b x (Diámetro a / Diámetro b)2 x (Longitudes a / Longitudes b)
• Seleccione el tamaño del cartucho según la cantidad de muestra requerida Piridina Benceno
• Utilice un tamaño máximo de cartucho de 120 g para la optimización durante Dimetilforamida Seleccione la tasa de flujo usando la siguiente ecuación:
las ejecuciones iniciales VIII Cloroformo Velocidad de flujo a = Velocidad de flujo b x (Diámetro a / Diámetro b)2
• Calcule el método y el gradiente con la siguiente ecuación: CV = 1 / Rf IV Ácido acético
Formamida II • Aplique el mismo perfil de gradiente utilizado para la ejecución analítica
I
VC general (volumen de columna)
3. Optimice la eficiencia a través del tamaño de partícula,
Equilibrio 3-6
IV III carga de muestra y flujo
Volumen de inyección Separación max 0.1

Enjuague (solvente fuerte) 3-6

VIII Preparación de la columna de HPLC,
VI
Rinsing (strong solvent) 2-3 V mantenimiento y manejo óptimo
VII
• Verifique la tasa de flujo y el volumen de columna (VC) predeterminados Donante • Use guarda columna para extender la vida útil de la columna
del cartucho seleccionado de Dipolo • Guarde el cartucho de la siguiente manera:
• Verifique la solubilidad de la muestra en la condición inicial (solvente débil); protones -- NP: 100% de isopropanol o hexano
en caso de problemas de solubilidad usar carga sólida -- RP: 80/20% orgánico / agua
• Evite secarse fuera de la columna
3. Optimizar la eficiencia a través del tamaño de partícula,
carga de muestra y tasa de flujo

¿Cuál es el caudal óptimo?

Mantenimiento de cartucho flash
y manejo óptimo
• El caudal óptimo da la mayor eficiencia 1000
50µm 30 µm
H*= altura de la placa

• Cuanto menor sea el tamaño de partícula, mayor será el caudal óptimo 900

• El flujo práctico es generalmente mucho más alto que el índice de flujo óptimo 800

• No exceda el límite de presión máxima y la pérdida de eficiencia en este punto todavía es aceptable 700

• En caso de reutilización (consulte la tabla • Operar por encima o por debajo del caudal óptimo tiene diferentes efectos: 600
25 µm
500
a continuación), almacene el cartucho de
400
la siguiente manera: Baja eficiencia Alta presión 15 µm
300
-- NP: 100% de isopropanol o hexano Largo tiempo de análisis Baja eficiencia
200
-- RP: 80/20% orgánico / agua
100
• Evite que el cartucho se seque Caudal óptimo 10 µm
0
• No use agua al 100% con material 95/5% 100% agua 0 20 40 60
C18 (colapso de fase) agua / disolvente • Cuanto más pequeñas son las partículas, menor es el efecto del caudal en la Tasa de flujo(mL/min)
orgánico eficiencia * Cuanto menor sea la altura de la placa, mayor será la eficiencia

Tamaño de partícula y control de presión FlashPure Scout

• Cuanto menor sea el tamaño de partícula Solvent% ELSD UV1 UV2 UV3 Solvent% ELSD UV1 UV2 UV3 La contrapresión generada durante Encuentra tu cartucho
en un cartucho o columna, mayor será 663 0.50 359 0.50 una corrida está influenciada por varios
el área de superficie total y el número 530 0.40 287 0.40 parámetros • Elija el cartucho FlashPure que mejor
nFL
∆P =
ELSD (mV)

215 0.30
ELSD (mV)

de platos teóricas (eficiencia) 398 0.30 se adapte a sus necesidades

AB 143
AB
0.20
K0 ∏r2 dD2
• Disminuir el tamaño de partícula es un 265 0.20 • Aprende más sobre los parámetros
enfoque fácil y rápido para aumentar 133 AB 0.10 71 AB 0.10 ∆P: cambio en la presión (bar) dp: tamaño de partícula (μm) para mejorar la resolución
F: caudal (ml / min) r: radio de la columna (mm)
la resolución, pero debe aplicarse con 0 0.00 -1 0.00 L: longitud de columna (mm) n: viscosidad del disolvente • Obtenga todos los detalles técnicos
cuidado, ya que la contrapresión 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 K: permeabilidad específica (cP) (1 para agua, 2 para
de su cartucho FlashPure para la
de la columna agua / MeOH 50/50)
también aumenta Time (min) Time (min) optimización del método
El tamaño de las partículas y el radio son los • Obtenga fácilmente un presupuesto
ica, tamaño de partícula 50µm Sílica, tamaño de partícula 15µm principales factores que influyen en la presión para los cartuchos seleccionados flashpurescout.buchi.com

Todo sobre la carga de muestras

Carga liquida Carga sólida Procedimiento para la preparación de una muestra sólida Capacidades de carga
Es un método rápido pero con se utiliza para muestras que solo son • Disolver la muestra cruda en un disolvente adecuado • La sobrecarga disminuye la eficiencia • La sílice (fase normal) tiene una capacidad de carga
resolución reducida solubles en solventes fuertes (fase móvil • Incubar durante unos minutos en un baño sonicador para mejorar • Las aplicaciones Flash permiten cargar más alta que la C18 (fase invertida):
inicial) o para mejorar la resolución; la solubilidad más muestras que Prep HPLC
método bastante lento • Si es necesario, filtre la mezcla para eliminar el material no resuelto -- Objetivo Flash: carga alta Aplicación Común máx. cargando
• Agregue sílica a la mezcla (3-5 veces el peso de la muestra cruda) -- Objetivo Prep HPLC: alta resolución Flash Fase Normal 10-30%
Solvente Sílice
MUESTRA MUESTRA • Eliminar el disolvente completamente por evaporación; asegúrate
LÍQUIDA SÓLIDA de que el polvo fluya libremente Flash Fase Reversa 2.5-5%
• Cargue la muestra sólida (mezcla de muestra cruda y sílice) en Prep HPLC Fase Normal 15%
un cartucho vacío y colóquela frente al cartucho de purificación
Muestra Prep HPLC Fase reversa  1%
Muestra

Fases móviles y estacionarias típicas en Flash y Prep HPLC

Nombre Sistema solvente Propiedades Ideal para separar Reusabilidad Sistema solvente típico
- Superficie altamente polar - Hexano / acetato de etilo
Sílice Fase Normal - Compuestos polares o polares medianos De un solo uso
- Fase polar más popular - Diclorometano / metanol
- Agua / metanol
- Superficie no polar - Compuestos no polares
C18 Fase Reversa Cartucho reutilizable - Agua / acetonitrilo
- Fase no polar más popular - Proteínas / Péptidos <2000 Da
- Agua / etanol
- Agua / metanol
- Compuestos no polares
C4 Fase Reversa - Superficie no polar Cartucho reutilizable - Agua / etanol
- Proteínas / Péptidos <2000 Da
- Agua / acetonitrilo
- Compuestos polares medianos
Aminado Fase Normal y Reversa - Superficie polar media Cartucho reutilizable - Ver C18 y sílice
- Hidratos de carbono, heterociclos que contienen nitrógeno, aminas
- Compuestos polares medianos
Diol Fase Normal y Reversa - Superficie polar baja - Moléculas polares Cartucho reutilizable - Ver C18 y sílice
- Lípidos
- Compuestos polares o compuestos polares medios
- Superficie altamente polar - Hexano / acetato de etilo
Alúmina Fase Normal - Compuestos sensibles a los ácidos De un solo uso
- Disponible en tipos neutro, ácido y básico - Diclorometano / metanol
- Para casos en los que se debe evitar el uso de modificadores de solventes

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