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Cromatografía Uplchplc y Gases

Química General (Escuela Politécnica Nacional)

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Cromatografía líquida HPLC/UPLC y cromatografía de gases

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Cromatografía líquida HPLC/UPLC y

cromatografía de gases

1,2,3,4
Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria, Quito, Ecuador

Resumen:
La cromatografía es un método físico que se enfoca en la separación de mezclas complejas, en la presente práctica se
estudio el funcionamiento de los equipos de Cromatografía Líquida HPLC/UPLC y Cromatografía de Gases (CG) además
del estudio de los diversos componentes que acompañan a los equipos como son los detectores. Los detectores utilizados
para CG fueron ionización de llama y espectrómetro de masas. Una de las aplicaciones más relevantes que tiene el CG es
el de determinación de pesticidas como lo son los organoclorados (OCLs), para lo cual se emplea dos detectores, un
espectrómetro de masa y un detector de captura de electrones. Para Cromatografía Líquida se utilizo el equipo de UPLC
en donde se analizó cafeína y se obtuvo el cromatograma respectivo.

Palabras clave: Cromatografía Líquida, UPLC, HPLC, Cromatografía de Gases, Detectores

1 1. INTRODUCCIÓN

1.1. Cromatografía líquida

La cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) es una

técnica empleada en la separación de los constituyentes de una
mezcla distribuidos entre dos fases: la fase móvil y la fase
estacionaria o columna que generalmente es sílica. La muestra
siempre en solución se inyecta a la fase móvil que es
inmiscible con la fase estacionaria, fluye por esta para eluir a
los analitos de la muestra. (Fernández, 2016)

Por otro lado, la cromatografía líquida de ultra alta resolución Figura 1. Esquema de un equipo HPLC (Gasca, 2011)
( UPLC), es una técnica que busca mayor rendimiento basado
Para la instrumentación del equipo de UPLC se tiene un
en un menor tamaño de las partículas en la columna es decir
carrusel donde se coloca la muestra, la columna UPLC,
de 2 µm, lo que implica mayor sensibilidad y rapidez al detectores, bomba que mantiene en movimiento los fluidos, y
momento de realizar el análisis. (Morales, 2016) una botella de desechos y el registrador de datos, como se
muestra en la Figura 2. (Swartz, 2005)
A pesar de que el método de operación de HPLC y UPLC es
el mismo, la principal diferencia radica en que para el primero
se necesita bombear una presión de 40 MPa para partículas de
un tamaño aproximado de 5 µm mientras que el otro bombea
una presión de 100 MPa debido a las partículas mas finas y que
a su vez disminuye el consumo de solvente. (Taleuzzaman M,
2015)

El equipo de HPLC esta constituido por un dispositivo para

suministro del eluyente que incluye una bomba, dispositivo de
inyección, detectores y registradores, además de la columna, y
botellas para desechos, debido a que no pueden ser eliminadas
directamente por la alcantarilla; el esquema se indica en la
Figura 1. (Gasca, 2011)
Figura 2. Equipo de UPLC (Waters, 2008)

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En cromatografía liquida las muestras a inyectar tienen que
pasar previamente por un proceso de preparación para que
puedan estar en solución, para eso se puede diluir, disolver o
añadir un estándar. Los tipos de muestras a usar son
carbohidratos, aminoácidos, pesticidas, fármacos, vitaminas
azucares, alimentos, así como muestras de agua y suelo.
(Snyder, 2012)
Los detectores utilizados dependen de la muestra que va a ser
inyectada y la propiedad de esta que será aprovechada,
entonces pueden ser aquellos que responden a una propiedad
de la disolución, es decir de la fase móvil, como son: índice de
refracción, electroquímico. También se tienen aquellas que
aprovechan una propiedad del soluto tal como: absorbancia
UV-Visible, fluorescencia, absorbancia, radioactividad,
infrarrojo entre otros. (Gomis Yagües, 2008)
Entre las aplicaciones de la cromatografía líquida en la
industria se puede destacar: detección de drogas ilícitas,
tecnología alimenticia, ciencia clínica, manufacturas
productos para que tenga mayor pureza. (Wong, 2016)
En la cromatografía tiene una gran importancia la temperatura,
dado que permite trabajar con flujos mayores, diluye la
viscosidad de la fase móvil lo que incrementa la rapidez de
circulación del flujo. Para el UPLC como antes fue
mencionado la presión es importante dado que agiliza el
análisis, sin embargo, a largo plazo reduce la vida útil de las
columnas y requiere mayor mantenimiento. (Guillarme, 2012)
Una vez finalizado el análisis cromatográfico, se obtienen
cromatogramas que son una representación gráfica como
respuesta del detector utilizado, la concentración de los
analitos. En el cromatograma podemos encontrar picos que
registran la respuesta del detector emitida cuando un
constituyente es eluido de la columna, el tiempo muerto (to)
indicador del tiempo necesario para renovar la fase móvil de
la columna, además del tiempo de retención (tr), siendo este el
tiempo que ha pasado para que se produzca la mayor
concentración del soluto. (Swartz M. E., 2004)
Un ejemplo de cromatograma se indica en la Figura 3.
Figura 3. Ejemplo de cromatograma (Fekete, 2013)
1.2. Cromatografía de gases
Cuando hablamos de cromatografía de gases, hablamos de un
método físico de separación de mezclas; en el cual los
componentes a separar son distribuidos entre dos fases, la
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primera la fase estacionaria y la segunda la fase móvil.
(McNair, Miller, & Snow, 2019)
Este método provee la información del tiempo de retención o
tiempo de elución de los componentes o analitos de la mezcla.
(Kitson, Larsen, & McEwen, 1996)
Mediante la cromatografía de gases es posible determinar
varios compuestos, aunque dicha técnica cuenta con una serie
de limitaciones tales como: la muestra debe ser volátil y
termoestables, es decir, estables a temperaturas a las que se
trabajan, por lo general de 50 a 300ºC. Si la muestra no es
volátil, se suelen preparar derivados adecuados para un
análisis por GC. (Gary, 2009)
Para análisis de muestras volátiles, por este método, se hace
uso de cromatógrafos de gases, en el cual, la muestra es
inyectada en la fase móvil (fluido inerte que arrastra a la
muestra a través de la fase estacionaria), generalmente un gas
inerte como el helio. En esta fase, cada uno de los compuestos
de la muestra tiene distinta afinidad con la fase estacionaria
(contenida dentro de la columna), lo que permite la separación
de estos. (Gutiérrez & Droguet, 2002)
Como en el anterior párrafo, se hace alusión al equipo utilizado
en esta técnica, cabe mencionar los aspectos importantes del
mismo, tales como: métodos de inyección, tipos de columnas
y detectores que se utilizan.
Entre los principales métodos de inyección (los cuales suelen
ser automatizados) encontramos tres, los cuales son Split, en
el cual solamente una parte de la muestra inyectada al equipo
se deriva a la columna, mientras que la otra se desvía hacia
fuera del equipo; Split-less, toda la muestra inyectada es
dirigida a la columna y on-column que consiste en una
inyección manual de la muestra, la cual es directamente sobre
la columna de separación. (Gutiérrez & Droguet, 2002)
La fase estacionaria en la cromatografía de gases está
contenida en una columna cromatográfica, la cual puede ser de
dos tipos: columnas empacadas o columnas capilares, siendo
las más comunes las columnas capilares. Estas últimas
proporcionan mejores separaciones que las empaquetadas,
tanto en velocidad como eficiencia; dentro de estas columnas,
la fase estacionaria es una película de líquido, que recubre el
interior del capilar. (Skoog, M.West, Holler, & Crouch, 2015)
Cabe recalcar que la columna es introducida dentro de un
horno de temperatura controlada (dependiendo del punto de
ebullición de la muestra y grado de separación requerido),
puesto que la temperatura de esta garantiza una mayor
eficiencia. (Abelló Linde, 2019)
Como se sabe una de las desventajas de la cromatografía de
gases es que entrega una información no suficiente para la
identificación correcta de compuestos de una muestra, por lo
cual, se hacen usos de detectores, entre los más usuales se
encuentran el espectrómetro de masas, el cual satisface la
necesidad de identificar “inequívocamente” los compuestos de
una mezcla compuesta. (Stashenko & Martínez, 2010)
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Cromatografía líquida HPLC/UPLC y cromatografía de gases
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El espectrómetro de masas es un instrumento que mide la
relación masa/carga de los iones formados, especialmente por
el impacto electrónico que consiste en bombardear electrones
con energía con la capacidad de generar la disociación de las
moléculas, de tal manera que presenta una información
estructural de la molécula analizada, además de que presenta
una gran sensibilidad. (Villa, 2003)
En otras palabras, la mezcla compleja es inyectada al
cromatógrafo, de tal manera que se separa en la columna, y
mediante una serie de eluciones, los componentes pasan al
espectrómetro, registrándose así en forma de picos en un
cromatograma (indica el tiempo de retención del analito) y se
identifica por su correspondiente espectro de masas. (Gutiérrez
& Droguet, 2002)
Otro tipo de detector muy usado es el de ionización de flama o
de llama el cual da respuesta al número de átomos de carbono
que entran a dicho detector por unidad de tiempo, la desventaja
de este detector es que el mismo es un detector destructivo de
la muestra. (Parrales, Reyes, & Pine, 2012)
Figura 1. Sistema de escritorio para cromatografía de gases-
espectrometría de masas. (Gary, 2009)
La cromatografía de gases puede ser empleada en la
determinación de ácidos grasos, al igual que para establecer la
pureza de compuestos orgánicos, identificación de
componentes en la sangre, análisis de constituyentes de las
gasolinas, mezclas de gases de refinería, pesticidas y
contaminantes del agua. (Stashenko & Martínez, 2010)
Como antes fue mencionado, una de las aplicaciones más
relevantes de la cromatografía de gases es el estudio de
pesticidas como lo son los organoclorados (OCLs) , para lo
cual se emplea un cromatógrafo de gases Agilent 6890N
acoplado a dos detectores, un espectrómetro de masa
AGILENT 5973 y un detector de captura de electrones, y un
inyector automático AGILENT 7683. (Mendieta, 2017)
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Figura 4. Cromatógrafo de gases Agilent 6890N. (Institut
Universitari de Restauració del Patrimoni (IRP), 2018)
2. METODOLOGÍA
2.1 Cromatografía líquida HPLC
El equipo HPLC que se empleó en el laboratorio presentaba en
la parte superior dos recipientes con disolventes los cuales
deben estar libres de impurezas lo cual se logró con filtración
al vacío, a esta parte se le denomina fase móvil; posteriormente
la fase móvil llega a una cámara donde se mezclan y llegan
hacia la columna gracias a una bomba cuya presión fue de 450
bars.
El sistema de inyección automático que poseía el equipo hacía
que la muestra colocada en un vial cuya capacidad fue de 2 mL
se insertara dentro de un automuestreador logrando que la
misma se dirija hacia la columna C-18 rellena de sílica gel que
posee un poro de filtración de 0,45 μm donde los compuestos
se separan y pasan a un detector para que, finalmente con la
ayuda de una computadora y software adecuados se
examinaran los analitos deseados. Cabe recalcar que el equipo
posee un sistema de desechos los cuales son depositados
dentro de un contenedor.
2.2 Cromatografía líquida UPLC
Para la Cromatografía UPLC se utilizó el equipo ACQUITY
H-CLASS PLUS que era el que se tenía en el departamento de
ciencias nucleares (DCN) en la Escuela Politécnica Nacional,
se diferencia de la HPLC ya que posee mejores resultados en
cuanto a eficiencia, por ende, el equipo poseía cuatro envases
para disolventes; al igual que el equipo HPLC estas se dirigían
hacia una cámara cuya bomba soporta hasta 15000PSI de
presión haciendo que la retención del analito sea menor.
La muestra colocada en el vial ingresó al equipo en un
automuestreador con capacidad de 48 muestras las cuales con
inyección automática fueron hacia la columna que poseía un
poro de filtración de 0,22 μm, es necesario mencionar que en
una columna UPLC puede emplearse una columna HPLC sin
embargo no se puede emplear en una columna HPLC una
UPLC, debido al tamaño de poro.
Finalmente, los datos del equipo fueron tratados por un
software que es capaz de mostrar datos mucho más acertados
y detallados debido a la sensibilidad que poseía el equipo.
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En el equipo se analizó cafeína, para lo cual se empleó como
disolvente o fase móvil acetonitrilo y agua los cuales debían
estar en un estado altamente puro; el flujo de inyección
empleado fue de 0.25 mL/min, con una presión de 8300 PSI
cuyo tiempo de retención dentro de la columna fue de 3,82
minutos. Como se puede observar en la Figura 1.
Figura 5. Detalles sobre la cafeína detectada en el equipo
UPLC.
2.3 Cromatografía de Gases
La presente práctica se realizó en el laboratorio de ciencias
nucleares de la facultad de Ingeniería Química y Agroindustria
de la Escuela Politécnica Nacional en donde se tiene un
cromatógrafo de gases marca CLUNS 500-PRZ, como es ya
conocido el corazón de la cromatografía, en este caso de gases,
es la columna en donde se utilizó una de la marca ZEBRON
de 60 m con un diámetro interno de 2,5 mm y un relleno de
0,25 µm , las condiciones del equipo como la temperatura se
las pone de acuerdo a las especificaciones de la columna, en la
que se usó la temperatura máxima era de 280 ℃ , también se
tiene una diferente columna con 30 m de largo, diámetro
interno de 0,25 mm, esta columna se utiliza para programas
isotérmicos (misma temperatura) y la temperatura máxima que
se puede alcanzar esta entre 325℃ y 350℃
Una parte de la columna se coloca en el inyector y la otra va al
detector el cual puede ser un espectrómetro de masas o el de
ionización de llama (FID) que son los que posee el laboratorio
en donde se trabajó. Para el de ionización de llama se tiene un
generador de hidrógeno
Para realizar cromatografía de gases se requirió también el
tanque del gas portador, el cual posee un manómetro para
poder controlar el flujo y la presión del gas que fue helio al
99,999% de pureza para que no existan interferencias en el
equipo, pero si existiesen filtraciones se utilizan también
trampas de oxígeno, de humedad y de hidrocarburos.
Las muestras se colocan en viales para cromatografía de gases
(sellados herméticamente) y posteriormente en un carrusel de
donde se inyecta la muestra a la columna y el detector que se
utilice envía el tiempo de retención de los analitos y el
cromatograma. De acuerdo con el detector se utiliza el
software, para ionización de llama está el total Chrome y para
Espectro de masas es el turbomass.
REFERENCIAS
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https://www.abellolinde.es/es/index.html
Fekete, S. S. (2013). Ultra-high performance liquid
chromatography and its applications. New York: Wiley: Q. A.
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Fernández, J. (2016). Fundamentos del análisis
cromatográfico. México: Grupo de Investigación
QUIMYTEC.
Gary, C. (2009). Química Analítica . México: McGrawHill.
Gasca, F. (2011). Introducción a laCromatografía de Líquidos
HPLC. Madrid: CSIC.
Gomis Yagües, V. (2008). Tema 4. Cromatografía de líquidos
de alta resolución. Técnicas Instrumentales en el Análisis
Industrial, 28-57.
Guillarme, D. &. (2012). UHPLC in life sciences (No. 16).
Brusels: Royal Society of Chemistry.
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Febrero de 2018). Cromatógrafo Agilent 6890N. Obtenido de
https://irp.webs.upv.es/es/cromatografo-agilent/
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McNair, H., Miller, J., & Snow, N. (2019). Basic Gas
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Mendieta, C. J.-C. (2017). Metodología para la determinación
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Parrales, A., Reyes, M., & Pine, W. (2012). Cromatografía del
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