LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PÚBLICA

SECCIÓN DE FISICO E INMUNOQUÍMICOS

PROTOCOLO

DE VERIFICACIÓN DEL MÉTODO (SFQ-M-010)

DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL PARA HÍGADO DE
BOVINO POR EL ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO DE ELISA
PARA EL KIT RIDASCREEN R-1711

CLAVE: SFQ-PV-010

REVISIÓN: 00

FECHA: 15/12/2022

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

IBQ. Leice QFB. Jorge Alberto QFB. Raquel Alejandra

Izquierdo Alejandro Cach Rivero Castillo Rodríguez
Sección de Fisicoquímicos Coordinación de Laboratorios Dirección

R 03/02/2020 CGI-F-001-1
 CLAVE:
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(SFQ-M-010), DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL 15/12/2022
PARA HÍGADO DE BOVINO POR EL ENSAYO
INMUNOENZIMÁTICO DE ELISA PARA EL KIT PÁGINA:
RIDASCREEN CLENBUTEROL R-1711 2 de 14

1. OBJETIVO

1.1 Objetivo General:

Verificar el método de Prueba para la Determinación de Clenbuterol en muestras de hígado de bovino
mediante el Kit de ELISA R-1711.

1.2 Objetivo específico:

Determinar los parámetros de Repetibilidad, Precisión Intermedia, Porciento de Recuperación, y Verificación
del Sistema de ELISA.

2. ALCANCE
Esta verificación aplica al método para la determinación de Clenbuterol en muestras de hígado de bovino con
el kit de Clenbuterol de R-Biofharm R-1711.

3. MÉTODO DE ENSAYO
MÉTODO SFQ-M-010 utilizando el kit RIDASCREEN Clenbuterol R-1711.

3.1 Diagrama del Proceso Analítico.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
CENTRIFUGAR CENTRIFUGAR
HOMOGENEIZAR T°. Amb. (10 (2 min. /12 000 rcf) T°.
MIN/4000rcf). Amb.
RECUPERAR AÑADIR SOL.
PESAR DECOLORANTE
SOBRENADANTE
(3 g de Muestra) (R1899) 50 μL
(250 μL)
AÑADIR SOL. Reagent 3
AGREGAR
ACETONITRILO DECOLORANTE 1:4 MEZCLAR
≥ 99% (1.5 mL) (R1899) 350 μL (Invertir el tubo)
Reagent 1
FORTIFICAR
MUESTRAS AGITAR (En Vortex) INCUBAR
(N1,N2,N3) (5 min. Temp. Amb.)
AÑADIR SOL.
AGITAR DECOLORANTE
(10 s en Vortex) CENTRIFUGAR
(R1899) 100 μL
(2 min. /12 000 rcf)
Reagent 2
Temp. Amb.
INCUBAR
(10 min. Temp. Amb.) AGITAR (En Vortex) RESERVAR 50µL DE
MUESTRA PARA EL
AGITAR INCUBAR ENSAYO
(10 s en Vortex) (5 min. Temp. Amb.) INMUNOENZIMATIC
O

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RIDASCREEN CLENBUTEROL R-1711 3 de 14

ENSAYO INMUNOENZIMATICO

ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA)

LAVAR MICROPOZOS
INSERTAR MICROPOZOS
(250μL Buffer de Lavado x 3)

AGREGAR MUESTRA AGREGAR CROMÓGENO

(50μL) (100μL)

INCUBAR EN OSCURIDAD
AGITAR SUAVEMENTE LA
(30 MIN/20-25°C)
PLACA

LAVAR MICROPOZOS INCUBAR EN OSCURIDAD

(250μL Buffer de Lavado x 3) (15 MIN/20-25°C)

AGREGAR CONJUGADO
AGREGAR SOLUCIÓN STOP
(50μL)
(100μL)

AGITAR SUAVEMENTE LA
AGITAR SUAVEMENTE LA
PLACA
PLACA
(10 s en Vortex)

INCUBAR EN OSCURIDAD
LEER ABSORBANCIAS
(15 MIN/20-21°C)
(450 nm sin filtro)

OBTENER RESULTADOS

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4. EQUIPO E INSTRUMENTOS
Calificación,
Características ID Calibración,
Equipo
M.
Preventivo
Marca: Bio Lion. Modelo XC50S3. 8 camisas.
Centrífuga SFQ-EQ-020
Velocidad 5000 rpm.
Marca: THERMO FISHER SCIENTIFIC MOD.
Refrigerador SFQ-EQ-001
REL 1204ª21
Marca: Torrey, Modelo CHTC-255 Temperatura
Congelador ARM-EQ-003
promedio -20°C
Analítica Digital MARCA DENVER
Balanza SFQ-EQ-013 20/10/2022
INSTRUMENTS, Modelo: TP-214
Homogeneiza Marca: Ika, Modelo: Turrax 25, Velocidad: 3
SFQ-EQ-018
dor 400 a 24 000 rpm.
De escritorio Marca HP Pavilion Slimline con
Equipo de
Software RIDASOFTWIN, data reduction for Sin clave ID
Cómputo
inmunoassays R-Biopharm
Marca Davis Instruments, modelo Vantage Vue
06/10/2022
6351
Meteorómetro SFQ.MT-001 10/10/2022
Alcance: T°C= 0.1 a 60°C, HR=1 a 100%,
11/10/2022
P.Atm.=540 a 1100 mbar.
Lector de
Marca Biorad Modelo IMARK, Serie 12525 SIBM-EQ-012 10/02/2022
ELISA
Marca: Brannan, de vidrio, alcance -20 a
Termómetro 110°C, Div. Min. 1.0°C Medición De SFQ-TLV-001 25/02/2022
Temperatura de las muestras
Marca: Brannan, de Líquido orgánico,
Termómetro inmersión total, alcance: -5 a 20°C Equipo SFQ-TL-001 23/02/2022
SFQ-EQ-001 Refrigerador
Marca: Apollo, modelo Apollo Vortex mixer,
Vortex SIBM-EQ-007
alcance: 3 400 rpm
Micropipeta
Unicanal de
De 100 a 1000μL, marca BOECO SFQ-EQ-003
Volumen
Variable
Micropipetas De 8 canales, alcance de 30 a 300μL Marca SFQ-PM-003
Multicanal de
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RIDASCREEN CLENBUTEROL R-1711 5 de 14

Volumen
Brand, modelo Transferpette
Variable

5. MATERIALES.

Tubos cónicos de para centrifuga de 50 mL.

Puntas para pipetas de 2 A 20μL.
Puntas para pipetas de 30 a 300μL.
Reservorios
Guantes de Nitrilo
Cuchillos
Tablas de Picar
Matraces volumétrico de 50, 100 y 500Ml.
Vasos de Precipitado de 50, 100, 250 y 600mL.
Pipetas serológicas de 1, 5 y 10mL.
Auxiliar de Pipeteado.

6. REACTIVOS

6.1 Generales
6.1.1 Biológicos
Grado Fecha
Nombre Fórmula o de
Marca Lote
Purez Caducid
a ad
Kit Ridascreen Clenbuterol ensayo
R-
inmunoenzimático 21401 06/2023
Biopharm
(R1711) Clenbuterol con placa de 96
micro pozos, 6 estándares
Std 1[0 ppt], std 2 [75 ppt], std 3 [150 R-
23371 08/2023
ptt], std 4 [300 ppt], std 5[900ppt], std Biopharm
6 [2700 ppt]
R-
1 Sol. Conjugado 25371 08/2023
Biopharm

6.1.2 Químicos
Fecha
Nombre Fórmula Grado o de
Marca Lote
Pureza Caducid
ad
Agua tipo 1 H2O Agua Tipo No Aplica No Aplica

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1
Wash Buffer Salt Tween Incluido en el kit R-Biopharm 11349 08/2024
No Aplica
(Buffer de Lavado) de Detección
1 Sol. Sustrato/cromógeno R-Biopharm 22090 08/2023
1 Solución Stop R-Biopharm 25331 07/2026
RIDA Simple Decolorant
24311 09/2023
(R1699) Reagent 1
RIDA Simple Decolorant R-Biopharm
24311 09/2023
(R1699) Reagent 2
RIDA Simple Decolorant
24311 09/2023
(R1699) Reagent 3
SIGMA- SHBP73 No Indica
Acetonitrilo CH3CN ≥99%
ALDRICH 867386

6.2 PATRONES DE REFERENCIA

Nombre Fórmula Grado o Lote Fecha de
Marca
Pureza Caducidad
RIDA Clenbuterol
C12H18Cl2N2O
Spiking Solution
Clenbuterol en R-Biopharm 100ng/mL 25431 09/2023
R1799
buffer de lavado

7. MUESTRA

7.1 Hígado de res

Se adquirirá 500 g de hígado de res en presentación comercial con sello TIF en un supermercado
y se dará ingreso mediante el área de Recepción de Muestras.
Se realizarán 10 réplicas independientes para caracterizar la muestra y usarla como control
negativo o como blanco de muestra para la fortificación.
Tabla 1. Resultados de la Caracterización de la Muestra (Control Negativo)
No. Lectura Resultado
Réplicas (Absorbancia (ppt)
a 450 nm)
1
2

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3
4
5
6
7
8
9
10
Promedio

7.2 Muestra control Negativa de Hígado caracterizada

Se utilizará la muestra caracterizada cuya concentración sea menor o igual a 75 ppt.

7.3 Muestra control Positiva de Hígado caracterizada

Se utilizará la muestra caracterizada como blanco de muestra para fortificarla a una concentración
de 1 000 ppt.
Se calculará la concentración con la que se va a fortificar el blanco de muestra que no rebase los
150 µL (10 por ciento del Volumen de Acetonitrilo añadido (1.5 mL.) para cada uno de los niveles
Partiendo de la concentración de la Solución patrón RIDA Clenbuterol Spiking R1799, que es de
100 ng/mL, tenemos que para preparar la solución fortificadora de 10ng/mL:

100 ng−−−−−1 mL
10ng----------------X
X= 0.1mL= 100µL
Debemos diluir 100µL de la Solución RIDA Clenbuterol Spiking R1799 en 900µL del buffer de
lavado.
Verificamos que esta concentración teórica cumpla con el criterio de no adicionar más de 150µL de
la solución fortificante:
(C . fortificación ) (m)
v=
C . Fortificante
Donde:
V= volumen de la solución fortificante a utilizar (mL)
C. Fortificación= Concentración a la cual se desea fortificar la muestra (ppb).
C. Fortificante= Concentración de la solución fortificante (ppb o ng/mL)
m=Cantidad de muestra a fortificar (g o mL).
Como se va a fortificar a 1 000ppt (1 ppb) tenemos que:
(1 ppb ) (3 g) 3
v= = =0.3 mL=300 µL
10 ng /mL 10

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Como no se cumple el criterio se procede a calcular otra concentración fortificante ahora de 20

ng/mL.:

(1 ppb ) (3 g) 3
v= = =0.15 mL=150 µL
20 ng /mL 20

Aquí si se cumple el criterio, y entonces se Fortificará a 1000 ppt con 150µL de la solución
fortificante de 20 ng/mL, la cual se prepara con 200µL de RIDA Clenbuterol Spiking + 800µL del
Buffer de lavado.

7.4 Fortificación de Muestras

Se fortificará la muestra a 3 niveles de concentración para las características de desempeño de
porciento de recobro, repetibilidad y precisión intermedia.

7.4.1 Se utilizarán tres soluciones fortificantes con concentraciones de 20ng/mL, de 30 ng/mL y de

50 ng/mL las cuales de prepararán conforme a la siguiente tabla:
Tabla 2. Preparación de las soluciones Fortificantes
Concentración Vol. Sol. RIDA Clenbuterol Vol. Buffer Vol. Total
ng/mL Spiking 1799 (µL) de Lavado (µL)
20 200 800
30 300 700 1 000µL
50 500 500 (1mL)

7.4.2 Cálculos para la Fortificación

Para la fortificación las muestras en los diferentes niveles se utilizarán 3 soluciones fortificantes: de
20 ng/mL, 30 ng/mL y 50ng/mL.

a) Para fortificar una muestra de hígado a 1000 ppb(1ppt) con una solución fortificante de 20
ng/mL:

(1 ppb ) (3 g) 3
v= = =0.15 mL=150 µL
20 ng /mL 20
V= 150µL de Solución Fortificante de 20ng/mL (ppb).

b) Para fortificar una muestra de hígado a 1500 ppb (1.5 ppt) con una solución fortificante de
20 ng/mL:
(1.5 ppb ) (3 g) 4.5
v= = =0.15 mL=150 µL
30 ng /mL 30
V= 150µL de Solución Fortificante de 20ng/mL (ppb).

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c) Para fortificar una muestra de hígado a 2000 ppb (2 ppt) con una solución fortificante de 30
ng/mL:
(2 ppb ) (3 g) 6
v= = =0.12mL=120 µL
50 ng /mL 50
V=90µL de Solución Fortificante de 50ng/mL (ppb).

Tabla .3 Fortificación de la muestra en 3 niveles

Concentración de la
Concentración de Volumen de Solución
Niveles Solución Fortificante Gramos de Muestra
Fortificación (ppt) Fortificante a añadir (µL)
(ng/mL)
N1 1 000 20 150
N2 1 500 30 3 150
N3 2 000 50 120

8. DESARROLLO EXPERIMENTAL
8.1 Determinar la verificación del sistema de ELISA (Repetibilidad del sistema)
8.1.1 Realizar la curva de calibración del kit 3 veces por analista, en la misma corrida y con el
mismo kit.
8.1.2 Leer en el lector de placas de ELISA la densidad óptica (DO) a 450 nm sin filtro.
8.1.3 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin versión 1.2.1
8.1.4 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 1.
8.1.5 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de
variación de los resultados (X, DS y DSR respectivamente).
Tabla 4
Laboratorio:
Puntos de la Respuesta Analítica (DO) nm Resultados Estadísticos
Curva (ng/Kg) Curva A Curva B Curva C X DS %CV
0
75
150
300
900
2700

8.1.6 Criterios de Aceptación

Criterio o Característica Especificación Resultado
Absorbancia del estándar 1 Mayor que 0.8 U.A
[Clenbuterol]=0 ng/L

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Repetibilidad % DSR =≤10%

% Relativo de Desviación <5% para estándar 2, 3, 4 y 5
Estándar <50% para estándar 6

8.2 Repetibilidad del ensayo

8.2.1 Realizar al menos, 6 repeticiones independientes de cada uno de los niveles por el analista 1.
Preparados como se indica en la Tabla 3.
8.2.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA.
8.2.3 Leer en Lector de placas ELISA a 450 nm sin filtro.
8.2.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin versión
8.2.5 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 5.
8.2.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y la Desviación Estándar
Relativa

Tabla 5. Lectura de Muestra Fortificada (Repetibilidad)

Replicas Concentración Clenbuterol (ppt)
Muestra N1 (500) N2(1 000) N3(1 500)
Analista 1 Analista 1 Analista 1
1
2
3
4
5
6
Xr
DSr
%DSRr

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8.2.7 Criterios de Aceptación

Herramienta Estadística Nomenclatura Criterio
Desviación Estándar Relativa %DSR ≤20%

8.3 Reproducibilidad (Precisión Intermedia utilizando muestras fortificadas en 3

niveles).

8.3.1 Se Realizarán al menos, 6 réplicas independientes de cada uno de los niveles utilizados en la
prueba de repetibilidad, por el analista 2.
8.3.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA.
8.3.3 Leer en lector de placas de ELISA a 450 nm sin filtro.
8.3.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin versión
8.3.5 Registrar las lecturas obtenida en la tabla 6.
8.3.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y la desviación estándar
relativa.
8.3.7 Combinar los resultados con los obtenidos por el analista 1 y calcular el promedio de las
concentraciones (XR), Desviación estándar de reproducibilidad (DS R), la Desviación estándar
relativa (%DSRR) y el ANOVA.

Tabla 6. Reproducibilidad
Replicas Concentración Clenbuterol (ppt)
Muestra N1 (500) N2(1 000) N3(1 500)
Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2
1
2
3
4
5
6
Xr
DSr
%DSRr

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XR
DSRR
%DSRR
ANOVA

8.3.7 Criterios de Aceptación

Herramienta Estadística Nomenclatura Criterio
Desviación Estándar Relativa %DSR ≤20%

8.4 Por ciento Recobro

8.4.1 Se realizarán al menos 6 réplicas independientes de cada uno de los niveles utilizados en la
prueba de repetibilidad (N1= 500 ppt, N2=1 000 ppt y N3= 1 500 ppt), preparadas como se indica
en la tabla 3.
8.4.2 Se utilizará el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711 para ELISA.
8.4.3 Se Leerán las réplicas en Lector de placas de ELISA.
8.4.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin versión 1.2.1
8.4.5 Registrar los resultados obtenidos en la Tabla 7.
8.4.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y la Desviación estándar relativa.
8.4.7 Realizar los cálculos para obtener el Por ciento de recuperación, tomando en cuenta el valor promedio
de la concentración del blanco de muestra (Muestra caracterizada como negativa)

Tabla 7
N1 ( 500 ppt) N2 (1 000 ppt) N3 (1 500ppt)
Réplica
[Blanco Muestra] = Blanco Muestra] = [Blanco Muestra] =
s
Lectura Lectura
Muestra %Recobro %Recobro Lectura ppt %Recobro
(ppt) (ppt)
1
2
3
4
5
6
X
DS
%DSR
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8.4.8 Cálculo del porciento de Recobro

Nota: Se debe restar el valor de la concentración del blanco de muestra a la concentración de Clenbuterol
obtenido.
[ Clenbuterol ] obtenido
% Recobro= x 100
[ Clenbuterol ] Teórico
8.49 Criterios de Aceptación

Herramienta Estadística Nomenclatura Criterio

Desviación Estándar Relativa %DSR ≤20%
% de Recuperación %R 70-130%

9. RESULTADOS
9.1 Tabla 8
Resultado de
Parámetro Criterio de Aceptación Fuente Bibliográfica la Verificación Conclusión
Revista Ámbito
Regulador. Centro para
Coeficiente de
Verificación el control estatal de la
Correlación o
del Sistema calidad de los
linealidad R2>90 y
de ELISA Medicamentos
DSR≤20%
CECMED. La Habana
No. 00-53, 2007.
Guidelines on
Desviación Estándar bioanalytical Method
Repetibilida
Relativa validation. European
d
DSR≤20% Medicines Agency
2011.
Guidelines on
Desviación Estándar bioanalytical Method
Precisión
Relativa validation. European
Intermedia
DSR≤20% Medicines Agency
2011.
Inserto del Kit
RIDASCREEN
70-130%
% de Clenbuterol de la Cía.
(Aprox. 87% en
Recobro R-Biofharm AG.
promedio)
Darmstadt, Germany
R- 1711

9.2 Criterios de Validez proporcionado por el fabricante del Kit RIDASCREEN Clenbuterol R1711
Tabla 9

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(SFQ-M-010), DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL 15/12/2022
PARA HÍGADO DE BOVINO POR EL ENSAYO
INMUNOENZIMÁTICO DE ELISA PARA EL KIT PÁGINA:
RIDASCREEN CLENBUTEROL R-1711 14 de 14

Criterio de Resultado de la
Parámetro Aceptación Verificación Conclusión
Temperatura
ambiente de
20-25°C
realización del
ensayo
Absorbancia del
estándar 1 (st con
>0.8
cero de
concentración)
%DSR entre
repeticiones de las
10%
inoculaciones en el
pozo de la ELISA

Recuperación 70-130%

10. BIBLIOGRAFÍA
10.1 Inserto del Kit RIDASCREEN Clenbuterol R1711 de la Cía. R-Biopharm AG. Inmunoensayo enzimático
para la Determinación cuantitativa de Clenbuterol. 16-12-19.

10.2 Criterios para la Verificación, control de calidad interno y expresión de resultados para la determinación
de Clenbuterol por ensayo inmunoenzimático. CCAYAC-CR-007/0

10.3 Revista Ámbito Regulador. Centro para el control estatal de la calidad de los Medicamentos CECMED.
La Habana No. 00-53, 2007.

10.4 Guidelines on bioanalytical Method validation. European Medicines Agency 2011.

10.5 CCAYAC-M-265/2-Método de Prueba para la Determinación de Clenbuterol por Ensayo

inmunoenzimático (ELISA). 19/10/2020.

10.6 SFQ-M-010 Método de Prueba Determinación de Clenbuterol por Ensayo Enzimático (ELISA).
17/11/2022

R 03/02/2020 CGI-F-001-1