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Versión V.3.1
MICROBIOLOGÍA MEDICA Documento de R.D. N° 022-2032-FCS-
Aprobación UPSJB
Fecha de Aprobación 15.03.2023
GUÍA DE PRÁCTICA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
GUÍA PRÁCTICA
1.1. ASIGNATURA
1.1 Facultad CIENCIAS DE LA SALUD
1.2 Escuela Profesional MEDICINA HUMANA
1.3 Semestre académico 2023-I
1.4 Nombre de la asignatura MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1.5 Ciclo IV
1.6 Código 041201
1.7 Modalidad Presencial
1.8 Tipo de curso Obligatorio
1.9 Pre requisitos Bases Moleculares y Celulares de la Medicina II
1.10 Créditos 04
1.11 Horas semanales Teóricas 02 Prácticas 04 Total 06
1.12 Duración del semestre Inicio 27/03/23 Culminación 15/07/23
1.2 DOCENTE
2. SUMILLA
3. INTRODUCCIÓN
Sin duda que las repercusiones que se desprenden de la Microbiología, en cuanto a la vida
cotidiana y la cantidad de aspectos que se enmarcan en ella misma, es el factor más
importante de esta ciencia. Debido a que no hay límite alguno que se excluya en lo referente
a la ciencia de la salud.
• TOXINAS BACTERIANAS
3 10
• AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM
POSITIVOS: GÉNERO STAPHYLOCOCCUS
• AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM
4 11,12,13 POSITIVOS: GÉNERO STREPTOCOCCUS
• AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM
NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA
8 EXAMEN PARCIAL
• AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS
GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONAS
9 20,21
• ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE VIBRIO CHOLERAE
• DIAGNÓSTICO DE COVID-19
13 27
• DIAGNÓSTICO DE LA RABIA
14 28
• ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
AMBIENTALES
• ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
DERMATOFITOS
15 29,30,31,32 • ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.
OBSERVACIÓN DE CORTES HISTOPATOLÓGICOS.
• ESTUDIO DE HONGOS DIMÓRFICOS. OBSERVACIÓN
DE CORTES HISTOPATOLÓGICOS
16 EXAMEN FINAL
5. SISTEMA DE EVALUACIÓN
PF = Promedio Final
EP = Examen Parcial
EF = Examen Final
PC= Prácticas Calificadas, estas pueden darse mediante: talleres, tareas académicas,
trabajos aplicativos, etc. (considerar asistencia y puntualidad)
6. BIBLIOGRAFÍA
• Intranet UPSJB.
• Plataforma Blackboard Learn Ultra
• Grabación Asincrónica de Clase
• Plataforma Upto Date https://biblioteca.upsjb.edu.pe/#/biblioteca
• Plataforma Turnitin
• EBSCO-Host https://biblioteca.upsjb.edu.pe/#/biblioteca
• Scopus https://biblioteca.upsjb.edu.pe/#/biblioteca
a) Marco Teórico:
La seguridad en el laboratorio se puede definir como: “La situación carente de riesgo o con
un riesgo limitado, que resulta del cumplimiento de un conjunto de normas y prácticas para
lograr este fin”
Barreras primarias: Las localizadas en tomo al origen del riesgo, como son: -
Contenedores, equipo e instrumental correcto y “buena práctica” (la técnica de trabajo
ordenada v rigurosa es probablemente la mejor protección que existe) – Uso de
desinfectantes y cabinas de seguridad.
• Presuponer que todos los pacientes están potencialmente infectados por HIV u otros
patógenos transportados por la sangre.
• Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puertade entrada a la
infección. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente
al agua.
• Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente después de cualquier contaminación.
• Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
• Ningún material tóxico o infeccioso abandone el laboratorio.
• Acceso restringido a determinadas áreas de laboratorio.
• Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves eincineradores para
desechos contaminados.
• Acceso al laboratorio únicamente al personal capacitado.
DESINFECCIÓN, DESCONTAMINACIÓN Y ESTERILIZACIÓN Existen muchos agentes
químicos o físicos para eliminar los microorganismos podemos distinguirtres grupos:
• Agentes antisépticos: son germicidas químicos para la utilización en la pielcomo, por
ejemplo; alcohol, iodóforos, etc.
• Agentes esterilizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por
ejemplo: los sistemas de autoclave, calor seco, óxido de etileno.
• Eliminación de residuos peligrosos: Todos los materiales contaminados son
agentes potencialmente infecciosos que deben ser
descontaminados antes de su eliminación. Esto implica porciones
no utilizadas de las muestras de los pacientes, cultivos de las
muestras cultivos almacenados de microorganismos e
instrumentos descartables, por ejemplo, escalpelos y jeringas con
agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar
mediante autoclave, incinerador o cualquiera de los diversos
métodos alternativos de tratamiento de residuos.
b. Material Didáctico:
• Protocolo de Bioseguridad vigente.
• Contenedores de descarte de punzocortante.
• Guantes, gorros, mandilones, lentes
• Autoclave (visita al laboratorio donde está el equipo)
c. Actividades:
d. Desarrollo de la Práctica:
e. Instrumento de Evaluación:
Definición de Bioseguridad.
1. Mencione cinco ejemplos (c/u) de barreras primarias, secundarias y terciarias.
2. ¿Cuál es la diferencia entre desinfección, descontaminación y esterilización?
(ejemplo de c/u).
3. Mencione los cuatro niveles de laboratorio de bioseguridad, justifique por qué está
clasificado en estos niveles
• Video de máximo tres minutos: (algunas medidas de bioseguridad).
f. Resultados Esperados
a. Marco teórico:
El microscopio es un instrumento que permite magnificar o ampliar imágenes de un objeto
como muestras biológicas in vivo, coloreadas u otro material de estudio cuando se observa a
través de las lentes, permite aumentar el tamaño y dar una mejor resolución.
Microscopio de Fluorescencia.
Se compone de un primer filtro de corte o filtro de excitación, espejo dicroico, segundo filtro
de corte o filtro de emisión, fuente de iluminación y condensador. Se observan muestras
teñidas, inmunofluorescencia directa o indirecta.
Microscopio de Interferencia.
Es un instrumento que permite la medida de la masa de regiones pequeñas y
transparentes de células vivas, obteniéndose datos de tipo cualitativo y cuantitativo. Sus
componentes son, un analizador rotable, un cuarto de longitud de onda, objetivo de
interferencia, condensador, polarizador y filtro de interferencia.
FUNCIÓN DEL ACEITE DE INMERSIÓN: Se coloca sobre la laminilla cubre objeto. Se usa
con el objetivo de inmersión y éste debe tener el mismo índice de refracción. Al colocarse el
aceite sobre la laminilla se evita que los rayos de luz cuando pasan de éste al aceite se
dispersen antes de llegar al objetivo permitiendo que penetre de esta manera un gran cono
de luz.
Parte mecánica:
• Ocular
• Lentes de condensador
• Objetivos
• Diafragma
• Espejo
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica
e. Instrumento de evaluación:
f. Resultados esperados
El alumno identifica las partes del microscopio compuesto y realiza con destreza el manejo
de este instrumento.
GUIA PRÁCTICA Nº 03 SEMANA 01
MÉTODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de teñir e interpretar los resultados
como parte de un diagnóstico.
LOGRO A
Realizar coloraciones: simples, diferenciales y especiales.
MEDIR
Diferenciar qué tipos de muestras se utilizan para cada
coloración.
Interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en
las distintas coloraciones y discernir si la coloración fue bien
realizada.
a. Marco teórico:
A. Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados
colorantes ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.
B. Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de
metileno.
C. Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico)
Eosina (ácido).
a) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, TintaChina, Azul
de lactofenol
b. Material didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica
1. Realización de la extensión:
2. Secado:
Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente con
un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.
3. Fijación:
Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo algunas coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él motivo de esta es hacer adherir el frotis
al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por coagulación rápida de las
proteínas.
Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin usar
cubreobjetos. Depositar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión.Descender primero el
objetivo de 10x, una vez enfocado pasar al lente de 100x sumergiéndolo en la gota, comprobar
el enfoque microscópico con el tornillo micrométrico.
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar lamorfología de los
microorganismos.
1.- Coloración azul de metileno:
a. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor
b. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos
c. Lavar con agua y dejar secar
d. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro
Resultado: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus neoformans
e. Instrumento de evaluación:
f. Resultados esperados:
a. Marco teórico:
Coloraciones diferenciales:
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas
la mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano. Existen varias modificaciones del
Gram, una de ellas es la de Kopeloff.
Material didáctico
• Cepa bacteriana Gram positiva
• Cepa bacteriana Gram negativa
• Solución fisiológica al 0.85%
• Láminas portaobjetos
• Asa bacteriológica de Kolle en aro
• Pipetas pauster de plástico
• Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff: Violeta de genciana o Cristal violeta
(colorante primario) Bicarbonato de sodio Lugol (mordiente) Alcohol- acetona
(decolorante) Fucsina básica (colorante de contraste)
• Mechero de Bunsen
• Varillas para coloración
• Cabina de flujo laminar
• Microscopio Binocular
• Aceite de inmersión
• Alcohol isopropílico
• Papel lente
• Algodón
Actividades
Desarrollo de la práctica:
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación
del frotis
2. Con el asa bacteriológi.ca previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis
en el centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia,
para obtener una preparación en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o conla ayuda de
la llama débil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotasde la solución
de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar
hasta que no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con
agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero deBunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
Resultados: Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram
negativas de color rosado.
Material didáctico
Actividades
Desarrollo de la práctica
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con
el mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este
procedimiento por tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
4. Lavar con agua corriente
b. Instrumento de evaluación
1. ¿Por qué Escherichia coli adquiere el color de la Fucsina, de qué está compuesta la pared
celular? Explique brevemente el fundamento.
2. ¿Por qué Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no de Fucsina, de
qué está compuesta su pared celular?
3. ¿Por qué el bacilo de Koch se tiñe con la fucsina fenicada y no con elazul de metileno,
de qué está compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. ¿Qué otros microorganismos son considerados dentro de la clasificación BAAR?
c. Resultados esperados
a. Marco teórico:
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad
con los colorantes de anilina como: las espiroquetas, con estas coloraciones podemos teñir la
cápsula Bacillus anthracis (coloración de Hiss), esporas en Bacillus (coloración de Wirtz
Conklin), los flagelos (coloración de Leifson), gránulos, metacromáticos Corynebacterium
(coloración de Albert), así como también la coloración de microorganismos presentes en la
sangre.
Material didáctico:
Actividades:
Desarrollo de la práctica:
Material didáctico:
• Lámina portaobjetos
• Lámina Cubreobjeto
• Palito mondadientes
• Solución fisiológica al 0.85%
• Set de coloración de Vago: Mercurio cromo al 2% y Violeta de genciana
• Asa de siembra en aro
• Microscopio estereoscópico
• Aceite de inmersión
• Cabina de flujo laminar
• Algodón
• Sarro dentario
Actividades
Desarrollo de la práctica:
b. Instrumento de evaluación
1. ¿Qué microorganismo puede ser teñido con la coloración de Leishman que ayude al
diagnóstico de la enfermedad conocida como?
2. ¿Qué bacteria infecciosa de forma helicoidal, puede aislar de una muestra del tubo
digestivo, que provoca diarrea con fiebre puede observarse con la coloración de vago?
3. Mencione el nombre de la espiroqueta que observa en sarro dental en una coloración de
vago
4. Realice un cuadro sinóptico de las coloraciones especiales estudiadas enclase
c. Resultados esperados
a. Marco teórico:
Líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos.
El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo,compuesto principalmente de
extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la
obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.
Según su utilización:
1. Medios Simples: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El
medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la
adición de agar al caldo nutritivo. Otrosrepresentantes de este grupo se encuentra el agar
el agar triplicase de soja, el agar Columbia, etc.
3. Medios selectivos: Son medios donde sólo crece un grupo de bacterias inhibe al mismo
tiempo a otros grupos, contiene inhibidores, indicadores de Ph y azúcares que ayuda a
identificarlo por el metabolismo que de este. Ejemplo: agar Mac Conkey, agar Salmonella
– Shigella (SS), agar Manitol salado.
b. Material didáctico
d. Desarrollo de la práctica:
e. Instrumento de evaluación
• Aplicación de rúbrica
• Cuestionario:
f. Resultados esperados
El alumno al final de la práctica debe conocer los medios de cultivos para seleccionar el
más adecuado para el aislamiento de bacterias patógenas.
GUIA PRÁCTICA Nº 07 SEMANA 02
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los
resultados como ´parte de un diagnóstico.
LOGRO A • Realizar la siembra bacteriana de manera adecuada.
MEDIR • Reconocer las características morfológicas de las colonias.
a. Marco teórico:
La siembra por estría, por dispersión agotamiento, por inoculación y por puntura.
b. Material Didáctico:
c. Actividad
d. Desarrollo de la práctica:
A. Tipos de siembra:
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra
bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra
en aro. Ejemplo agar urea, citrato, TSI, LIA
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con
ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma verticalhasta la mitad de Agar.
Ejemplo SIM, MIO, TSI, LIA
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e
introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del
tubo. Ejemplo los medios en caldo MR-VP, peptona,nutritivo.
B. Lectura:
Aplicación de rúbrica.
1. Explique por qué es más efectivo como desinfectante una solución de etanol al 75% que
el etanol absoluto.
2. ¿Cuál es la importancia de determinar para una bacteria los parámetros de CIM y CLM?
3. Describa la técnica de Kirby-Bauer.
4. ¿Qué factores intervienen o modifican los resultados de un antibiograma?
f. Resultados esperados
a. Marco teórico
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades
de ácidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es
visible por el cambio de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la
presencia de gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio
sólido.
B. Reacciones de oxidación - fermentación de azúcares:en medio TSI (Triple Sugar
Iron)
EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en
la capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de
hidrógeno (H2S).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos
presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres:
Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que
se detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o pordesplazamiento del mismo
hacia arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y
sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitadonegro insoluble de sulfuro
ferroso (FeS).
b. Material didáctico
• Tubo con medio TSI en plano inclinado con cepas control: E. coli, Salmonella, P.
aeruginosa
• Incubador Agitador
• Papel Lente
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica:
1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centrodel tubo y
estríe la superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37°C por 18 - 24 horas.
Interpretación:
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que laglucosa
(que se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido
utilizada y la cantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos
alcalinos generados por la utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser
utilizados. Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio,
mientras que, en el fondo, por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay
fermentación y el medio permanece ácido.
3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo). La fermentación de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos,
por lo que el tubo permanece amarillo.
4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamenteutilización
oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo sealcaliniza.
5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del
medio.
Material didáctico:
Actividades:
Desarrollo de la práctica:
Interpretación:
1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo delmismo nombre,
cuyo rango de viraje está entre pH 4.4 (rojo) y 6.0(amarillo).
2. La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo-
naranja.
3. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml (12 gotas) de Alfa naftol y
0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15
minutos. Es importante añadir los reactivos en el orden específico.
4. Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora
los cultivos pueden presentar un colorcobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco (NH3). El indol puede
detectarse en un medio rico en triptófano, observando la aparición de un color rojo (en forma de
anillo impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que contiene p-
dimetilaminobenzaldehido.
Material didáctico
Actividades
Desarrollo de la práctica:
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos
segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y
constituye una prueba positiva. Las bacterias que, a pesar de desarrollar en el medio, pero
que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta
una prueba negativa.
Principio:
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato
con formación de subproductos alcalinos. El medio (citrato de Simmons) incluye citrato de
sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de
nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la
sal de amonio, con producción de amonio (NH3), alcalinizando el medio por conversión del
NH3 en hidróxido de amonio (NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el
azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9 (verde) y pH 7.8 (azul).
Material didáctico:
Actividades:
Desarrollo de la práctica:
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estría encada tubo
la cepa citrato positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18 - 24 horas.
Interpretación:
Material didáctico:
Actividades:
Desarrollo de la práctica:
Interpretación:
TSI
(fermentación, H2
S)
MR
Rojo de Metilo
VP
Voges-Proskauer
INDOL
LIA
CITRATO
UREASA
e. Instrumento de evaluación
Cuestionario
f. Resultados esperados
Que el alumno conozca y adquiera destreza en interpretar los resultados de los medios de
cultivos diferenciales como ´parte de un diagnóstico.
GUIA PRÁCTICA Nº 09 SEMANA 02
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS
(ANTIBIOGRAMA)
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados
como ´parte de un diagnóstico.
LOGRO A • Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar
MEDIR lasusceptibilidad a los antibióticos.
• Interpretar los resultados del método utilizado.
• Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada
a. Marco teórico:
Si bien es cierto muchos microorganismos son importantes para proceso vitales en el planeta,
pero muchos de estos agentes se encuentran en superficies inertes como contaminantes o
pueden producir enfermedades al hombre o a otros organismos como animales o plantas. Por
lo mencionado el hombre ha tratado de encontrar maneras para controlarlos, ya sea
matándolos o simplemente deteniendo su desarrollo. Muchas de estos microrganismos buscan
estrategias como para sobrevivir en condiciones adversas.
Entre los mecanismos existentes para controlar el crecimiento microbiano se encuentran los
agentes físicos antimicrobiano como el calor, bajas temperaturas, la filtración, desecación,
presión osmótica y radiaciones; En cuanto a los agentes químicos antimicrobianos
generalmente se tiene que tomar en cuenta la concentración, lugar de aplicación en el control
de desarrollo del microorganismo, tenemos a los bactericidas, bacteriostáticos, antisépticos y
desinfectantes.
Antibióticos: Son las sustancias químicas producidas por microorganismos y que poseen
acción antibacteriana (actúan contra las bacterias).
Quimioterapéutico. Compuestos obtenidos por síntesis química y con características
antibacterianas.
• Método de dilución
• Método de Difusión en Agar
Dilución en tubo:
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendola concentración
inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el crecimiento “in vitro”
bacteriano.
Estas pruebas pueden realizarse en una microplaca y forman la base de los sistemas de
pruebas de sensibilidad automatizados.
Difusión en agar (Según Kirby- Bauer y col.):
Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o
quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en
sembrar el microorganismo aislado y puro de la muestra en estudio luego se siembra sobre
toda la superficie de una placa de Agar Mueller-Hinton ,( la concentración de bacterias debe
ser medida con la ayuda de la escala de Mac Farland o por espectro ) y colocar luego discos
de papel filtro que contienen concentraciones diversas de los antibióticos; después de una
incubación de 24 horas, se observan y se miden las zonas de inhibición alrededor de cada disco
de antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el disco difiere para los distintos fármacos.
b. Material didáctico
d. Desarrollo de la práctica:
2. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo ysembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
4. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de
20mm. 4. Incubar a 37°C durante 24 horas.
Lectura:
• Aplicación de rúbrica
Que el alumno conozca y adquiera destreza en interpretar los resultados de los medios de
cultivos diferenciales como ´parte de un diagnóstico.
GUIA PRÁCTICA Nº 10 SEMANA 03
TOXINAS
BACTERIANAS
OBJETIVO Conocer e interpretar la acción de las toxinas y enzimas como
parte de pruebas de diagnóstico.
LOGRO A MEDIR Evidenciar la acción de diversas toxinas y enzimas bacterianas.
a. Marco teórico:
Las toxinas son componentes bacterianos que dañan directamente los tejidos o ponen en
marcha actividades biológicas destructivas. Las toxinasy las actividades de otras sustancias
similares se deben a la acción de diversas enzimas degradativas que ocasionan la lisis celular
y de proteínas que se unen a receptores específicos que inician reacciones tóxicas en un tejido
diana específico.
Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias. El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa
convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo con la siguiente reacción:
Materiales:
Actividades
Desarrollo de la práctica:
Procedimiento:
• Colocar sobre una lámina portaobjeto una solución de peróxido dehidrógeno al 3%.
• Colocar sobre el peróxido un asa del cultivo de S. aureus.
• Observar la presencia de burbujas (liberación de oxígeno) queindican positividad
• Realizar el mismo procedimiento con una cepa control catalasanegativa.
• Observar, esquematizar e interpretar.
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como elúltimo eslabón de la
cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones H al oxígeno con formación de agua. El
sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos,
permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos. En
el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil-
p- fenilendiamina (el cual se presentaen solución, discos o tiras llamados comúnmente oxidasa).
Materiales:
• Cepa control sembrada en agar nutritivo: Pseudomonas, Neisseria
• Reactivo de oxidasa
• Papel filtro
Procedimiento:
• Colocar sobre una lámina portaobjeto o dentro de una placa de Petri un pedazo de
papel filtro.
• Colocar varias gotas del reactivo oxidasa sobre el papel filtro.
• Colocar una asada del cultivo Pseudomonas o Neisseria sobre el papel con el
reactivo.
• La aparición de un color negro o púrpura indica una prueba positiva.
• Realizar el procedimiento con una prueba control negativa.
• Observar, esquematizar e interpretar.
Prueba de coagulasa
Los estafilococos patógenos producen una enzima capaz de coagular el plasma sanguíneo del
conejo y del humano, el cual es considerado comofactor de virulencia.
Materiales:
Procedimiento:
Demostración de hemolisinas
Material didáctico:
Procedimiento:
• Sembrar en una placa de agar sangre de carnero una asada de cultivo joven de S.
pyogenes, S. pneumoniae. (o muestra positiva) por el método de agotamiento por
estría.
• Realizar el mismo procedimiento con otras cepas bacterianas y otros medios de
cultivo
• Incubar por 18 – 24 horas a 37° C.
• Observar, esquematizar e interpretar.
b. Instrumento de evaluación:
Aplicación de rúbrica.
GUIA PRÁCTICA Nº 11 SEMANA 04
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS:
STAPHYLOCOCCUS
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los
resultados como ´parte de un diagnóstico.
LOGRO A MEDIR Reconocer a los microorganismos cocos Gram Positivos
Diferenciar a los miembros del género Staphylococcus
patógenos de los saprófitos
Identificar a los microorganismos mediante pruebas bioquímicas
yconfirmativas
a. Marco teórico:
b. Material didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con agar hipertónico de Chapman y agar
sangre, por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a
37°C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylococcus, estudiando
las características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de
Chapman (tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una
colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldoplasma e incubar a 37ºC (Prueba
de la coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertónico de Chapman o manitol salado contiene: NaCl al 6.5%y como indicador
de pH el rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novobiocina y furazolidona.
Resultados:
e. Instrumento de evaluación
f. Resultados esperados
Alumnos preparan un organizador gráfico de estafilococos.
GUIA PRÁCTICA Nº 12 SEMANA 04
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GÉNERO STREPTOCOCCUS
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados
como ´parte de un diagnóstico.
LOGRO A MEDIR • Reconocer a los microorganismos cocos Gram Positivos
• Diferenciar a los miembros del Género Streptococcus
• Identificar a los microorganismos mediante pruebas
bioquímicas yconfirmativas
a. Marco teórico:
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite
diferenciar algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta,
los glóbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados, pero no lisados como
sucede en la hemolisis tipo. Existe un reverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito
de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la
biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría
de Streptococcus pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas
bioquímicas permiten la diferenciación de las especies de Streptococcus.
b. Material didáctico:
• Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo BHI
• Placas con Agar sangre de carnero
• Torunda estéril y bajalengua
• Tubos con Tioglicolato
• Tubos con caldo Inulina
• Discos de Bacitracina
• Discos de Optoquina
• Solución de Desoxicolato al 2%
• Tubo con NaCl al 6.5%
• Láminas portaobjetos
• Set de colorantes de Gram- Kopeloff
• Reactivo de oxidasa
• Asas de Kolle, pinzas
• Microscopio Binocular
• aceite de inmersión
• papel lente
• Cabina de flujo laminar.
• Incubador agitador
• Placas con Agar sangre de carnero sembrado S. pyogenes, S. pneumoniae / S.
agalactiae
• Placas de agar sangre de carnero 5% más disco de bacitracina sembrada con cepa
de S. pyogenes
• Placas de agar sangre de carnero 5% más discos de optoquina sembrada con cepa
de S. pneumoniae / S. agalactiae
• Prueba de CAMP en agar sangre, sembrada con cepas de S. aureus (una raya recta)
y S. pyogenes (en ángulo recto)
• Tubos con caldo BHI NaCl 6.5% sembrada con cepa de Enterococcus
• Tubos con caldo BHI NaCl 6.5% sembrada con cepa de Streptococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 10oC sembrada con cepa de Streptococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 45oC sembrada con cepa de Streptococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 10oC sembrada con cepa de Enterococcus
• Tubos con caldo BHI incubado a 45oC sembrada con cepa de Enterococcus
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica:
Procedimiento:
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento
produce turbidez o sedimento.
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de
dispersión y agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la
lámina portaobjetos y colorear por Gram.
3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente ala bacitracina y el
disco de optoquina.
4. Sembrar una cepa de S. aureus (línea) y de Streptococcus (ángulorecto sin tocarse) en
agar sangre.
5. Sembrar las cepas bacterianas en caldo BHI o TSB
6. Sembrar la cepa en el tubo con NaCl al 6.5%.
7. Realizar la prueba de la catalasa.
8. Realizar la prueba de desoxicolato de sodio, permite observar lacapacidad de ciertas
bacterias de lisarse en presencia de sales biliares.
Lectura:
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son β-hemolíticos; S. viridans y S.
pneumoniae son α-hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la bacitracina y optoquina: S. pyogenes essensible a la
bacitracina y S. pneumoniae es sensible a la optoquina.
3. Observe la hemólisis sinérgica en el área de intersección donde el factorCAMP y la B-
hemolisina se han difundido en el medio.
4. Observar el crecimiento de microorganismos en caldo BHI o TSB a 10°Cy 45°C.
5. En la solución de NaCl al 6.5%, observar que sólo desarrolla Enterococo(Grupo D)
6. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa. 7.Agregar una gota
de desoxicolato de sodio al 10% sobre una o variascolonias en la placa de Agar sangre
e incubar a 35°C durante 30 minutos.En una reacción positiva las colonias se desintegran
o solubilizan.
Protocolo
Desoxicolato de
Desarrollo en
Organismo
Metabolismo
de la inulina
NaCl 0,5%
Baitracina
Optochin
Hipurato
Esculina
CAMP
sodio
β Hemolítico
Grupo A S R N N N N N N
S.pyogenes
Grupo B
S.agalactiae R* R P P N N P* N
Grupo C,F,G R R N N N N N N
α hemolitico
Grupo Viridans R* R N N N* N N N
S. pneumoniae R S N N N P N P*
e. instrumento de evaluación:
Aplicación de rúbrica.
2. Explique la importancia que tienen los cultivos en agar sangre en la clasificación del
género Streptococcus.
3. ¿Cuáles son y qué efecto que tienen las estreptolisinas en los tejidos del hombre?
a. Marco teórico:
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares,
con los lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies,
entre éstas N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa
en el hombre. En muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con
el colorante azul de metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de
otros microorganismos morfológicamente similares.
b. Material didáctico:
• Placa de medio MTM (Thayer Martin Modificado) sembrada con Neisseria gonorrhoeae /
N. meningitidis
• Placa con Agar sangre sembrada con Neisseria gonorrhoeae / N. meningitidis
• Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
• Reactivo de Citocromo - oxidasa
• Reactivo de catalasa
• Agar base semisólido tripticasa-cistina (CTA) con : Glucosa, Maltosa, Sacarosa y
Lactosa. al 1% sembrado con Neisseria gonorrhoeae / N. meningitidis
• Solución fisiológica al 0.85%
• Láminas portaobjetos
• Set de coloración de Gram
• Colorante de Azul de metileno
• Microscopio Binocular
• Asas de siembra en aro y punta
• Solución de alcohol yodado
• Algodón
• Papel lente
• Alcohol isopropilico
• Cabina de flujo laminar
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica
Medios de Azul de
Colonias Tamaño
cultivo/muestras Gram metileno
Agar MTM
Agar sangre
Secreción
endocervical
Oxidasa Catalasa
Pruebas
bioquímicas
Utilización de
carbohidratos
GUIA PRÁCTICA Nº 14 SEMANA 05
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM
POSITIVOS:GÉNERO BACILLUS
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los
resultados como parte de un diagnóstico.
LOGRO A • Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos
MEDIR • Diferenciar a los miembros del género Bacillus
• Identificar a los microorganismos mediante pruebas
bioquímicas yconfirmativas
a. Marco teórico:
b. Materiales:
• Placas Petri con Agar nutritivo sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus
cereus
• Placas Petri con Agar sangre sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus
cereus
• Tubos con Caldo nutritivo
• Tubos con Agar semisólido SIM sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis,
Bacillus cereus
• Tubos con gelatina sembrado con Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus
• Láminas para frotis
• Reactivo de la catalasa
• Reactivo de oxidasa
• Set de coloración de Gram modificado
• Set de coloración de Hiss para cápsula
• Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas
• Asa de Kolle o de siembra
c. Actividades
1. Preparar un frotis
2. Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30
segundos
3. Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4. Lavar con agua corriente y secar
5. Observar al microscopio con lente de inmersión
1. Preparar un frotis
2. Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de
vapores por 5 minutos (adicionar colorante cada vez que falte)
3. Lavar con agua corriente
4. Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5. Lavar y secar
6. Observar al microscopio con lente de inmersión
Lectura:
En los cultivos:
• En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, nohemolítica en las
especies patógenas y ß- hemolíticas en las especies saprofitas. En Agar nutritivo: Se
observan bacilos endoesporulados
• En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
• En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido En Gelatina:
sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.
e. Instrumento de evaluación:
Aplicación de rúbrica.
Género: Bacillus
a. Marco teórico:
b. Material didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica:
1. Hacer frotis a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo ycolorearla con Gram.
2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivosembrado, entre
lámina y laminilla.
3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre,Agar nutritivo, y en
los diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
Lectura:
• Frotis con Gram: se observarán como bacilos: Gram positivos.
• Láminas en fresco: Se observará la movilidad peritríca, utilizando los objetivos de 40
aumentos.
• En caldo nutritivo: Se observará una turbidez tenue y homogénea.
• En agar sangre: se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.
• En medios diferenciales: Observar
Protocolo:
+
Hemolisina + Sacarosa - VP
Catalasa + -
Lactosa
Oxidasa - Manita -
- +
Urea Salicina
Citrato - Esculina +
e. Instrumento de evaluación:
Aplicación de rúbrica.
GUIA PRÁCTICA Nº 16 SEMANA 05
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM
POSITIVOS:GÉNERO CORYNEBACTERIUM
OBJETIVO Conocer, adquirir la destreza de colorear e interpretar los resultados
como ´parte de un diagnóstico.
LOGRO A Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos
MEDIR Diferenciar a los miembros del género Corynebacterium
Identificar a los microorganismos mediante pruebas bioquímicas y
confirmativas.
a. Marco Teórico:
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier
lesión inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe,
y enviar inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer
o Agar telurito.
b. Material didáctico:
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica:
Procedimiento
Coloración de Albert
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva
de polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se
tiñen de color azul intensoy el soma bacteriano se observa muy débilmente.
Procedimiento
Lectura
Aplicación de rúbrica.
SEMANA 06
GUIA PRÁCTICA N.º 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CLOSTRIDIUM
OBJETIVO Realizar la identificación de bacterias del género Clostridium.
LOGRO A Reconocer a los microorganismos bacilos Gram positivos formadores
MEDIR de esporas.
Diferenciar a los miembros del género Clostridium.
Identificar a los microorganismos mediante pruebas bioquímicas y
confirmativas.
a. Marco Teórico:
Los clostridios son bacilos grampositivos grandes que forman esporas, tienen esporas
resistentes al calor, desecación y desinfectantes. Pueden sobrevivir durante años en el
ambiente y regresar a la forma vegetativa cuando se les coloca en un medio favorable.
b. Material Didáctico:
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
Procedimento:
e. Resultados Esperados:
f. Instrumento de Evaluación
a. Marco Teórico:
Este género está conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología
bacilar, poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se
desarrollan lentamente en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los
componentes nutritivos.
Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en
el aire, en el agua y en la tierra.
Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad
hominis, que puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar,
renal y digestiva los más frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para
establecer el diagnóstico específico a través de la baciloscopia. Mycobacterium leprae
produce la lepra o enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium,
Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia, también, son
patógenos.
PRUEBAS DIAGNÓSTICAS:
Examen directo: baciloscopía
Cultivo convencional: Ogawa o Lownstein
Pruebas de sensibilidad convencionales: Método de proporciones de 1ralínea. Método de
Proporciones en placa de 2da Línea (APP)
Pruebas de sensibilidad rápidas
GENOTÍPICAS:
Sondas de ADN (Genexpert MDRplus): Se evalúa las drogas Isoniacida y Rifampicina
GeneXpert: Se evalúa la droga Rifampicina
FENOTÍPICAS
MODS: Se evalúa las drogas Isoniacida y Rifampicina
b. Material Didáctico
• Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
• Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. hominis
• Láminas con extensión de otras especies de Micobacterias
• Reactivos para la coloración Ziehl Neelsen (B.A.A.R.)
• Cepas patrones sembradas en medio Lowenstein Jensen o Ogawa.
• Muestra: esputo positivo, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural.
• Gabinete de Bioseguridad Nivel III (Cabina Horizontal), si hay replique de cepas.
c. Actividades
d. Desarrollo de la Practica
e. Resultados Esperados
LECTURA:
Observar cómo los gérmenes visibles por el Gram no aparecen en la coloración de Ziehl-
Neelsen porque no son ácidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares
rojos en un fondo azul.
BACILOSCOPÍA:
La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que está en tratamiento y
permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS:
f. Instrumento De Evaluación
a. Marco teórico:
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias
(Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y
aerobios, algunos de los cuales son patógenos para el hombre y causantes de enfermedades.
El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza
mediante el COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la
enfermedad, para el aislamiento del agente patógeno bacteriano.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio
y urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e
infección y son productoras de endotoxinas. Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con
flagelos peritricos son exclusivas del hombre y causan la fiebre tifoidea; otras, causan
infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan
la Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres
abdominales y fiebre. La especie S. dysenteriae es la más virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con
flagelos peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes
de infecciones urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.
b. Material didáctico
• Placas Petri con Agar Mac Conkey, Agar SS, agar manitol, Sabouraud
• Placas Petri con Agar Mac Conkey, Agar SS, sembrado con Escherichia coli / Klebsiella
pneumoniae, Salmonella typhimurium / Shigella flexneri, Proteus
• Tubos con medio TSI, LIA
• Placas Petri con agar manitol S.aureus
• Placas con agar Sabouraud sembrado con Candida albicans
• Tubos con caldo peptonado
• Tubos con Citrato de Simmons
• Tubos con caldo MR-VP
• Frasco con Lugol
• Reactivo para Citocromo-oxidasa
• Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
• Reactivo para Rojo de metilo
• Láminas portaobjeto y cubreobjeto
• Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)
• Juego de colorantes para Gram
• Material básico para laboratorio
• Muestras: heces patogénicas, resultado de colostomia, ileostomia o contenido duodenal
• Ph metro
• Incubador agitador
• Balanza de plato
• Horno Calor seco
• Autoclave
• Gabinete de Bioseguridad (Cabina Horizontal)
c. Actividades
d. Desarrollo de la practica
• Agar Mac Conkey, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la
Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
• Agar SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color
negro en las colonias que son SH2.
• En Agar manitol y Agar Sabouraud, observar el desarrollo de colonias y anotar las
características.
• Agar triple azúcar hierro (TSI), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos
toma el medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro
• Lisina descarboxilasa (LIA), observar si hay descarboxilación y desaminación de la
Lisina y producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se
eleva el pH del medio debido a la producción de aminas, pH=5.2 (color amarillo), pH
6.8 (color púrpura) [indicador púrpura de bromocresol]
• Caldo peptona, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el
reactivo de Kovacs tornándose rojo grosella.
• Citrato de Simmons, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como
fuente de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo
(color azul), negativo (color verde).
• Caldo rojo de metilo, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de
metilo. Cuando hay producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo);
pH > 4.4 (negativo color amarillo).
• Caldo Voges Proskauer, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15
minutos cuando se le añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-
carbinol. Positivo (color rojo), negativo (color amarillo).
• Prueba citocromo oxidasa agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia
y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en
caso contrario no habrá ningún cambio de color
• Coloración de Gram observar los bacilos Gram negativos.
• Suero fisiológico y lugol observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad
utilizando objetivos de 40 aumentos.
e. Instrumento de evaluación
a. Marco teórico
La especie Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles
con flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son
exigentes para su desarrollo “In Vitro”.
b. Material didáctico
c. Actividades
e. Instrumento de evaluación:
TSI
Agar nutritivo – pigmento
Prueba de Citocromo –
oxidasa
Solubilidad cloroformo -
piocianina
Agar semisólido
GUIA PRÁCTICA N.º 21 SEMANA 09
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE VIBRIO CHOLERAE
OBJETIVO Identificar bacterias del género Vibrio
LOGRO A Reconocer a los microorganismos bacilos Gram negativos.
MEDIR Diferenciar a los miembros del género Vibrio.
Identificar a los microorganismos mediante pruebas bioquímicas y
confirmativas
a. Marco teórico:
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos,
en parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no
forman esporas, sin cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios
alcalinos.
b. Material didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la práctica
Procedimiento y lectura:
1. En Agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de
V. cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente,
circulares, de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos
a partir de la utilización de la sacarosa)
2. En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de
aspecto verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa
positiva)
3. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de
la sacarosa, no produce H2S.
4. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol.
5. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.
6. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol
7. Oxidación y fermentación de la glucosa presenta metabolismo fermentativo, acidificando
el medio Hugh Leifson sin producción de gas
8. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio
9. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
10. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de
Desoxicolato sobre una lámina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro
transferir una colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión
viscosa al retirar el asa “como una cuerda larga” que se torna más pegajosa después
de 60 segundos más.
11. Para el caso de Vibrio cholerae es necesario la utilización de un sueropolivalente para
la identificación del serogrupo O1 y sueros monovalentes para los serotipos Ogawa e
Iwaba.
Medios Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus
Acidez en superficie y Acidez en superficie y
TSI profundidad profundidad
LIA Positiva Positiva
VP 10-50% Positiva Negativo
MR Negativo Negativo
Indol Positiva Positiva
Citrato Negativo Negativo
Urea Negativo Negativo
Oxidasa Positiva Positiva
Catalasa Positiva Positiva
Prueba de la cuerda Positiva Negativo
e. Instrumentos de evaluación
a. Marco teórico:
Haemophilus es un coco bacilo gramnegativo pequeño que mide 0,2-0,3 por 0,5-0,8 µm,
inmóvil, no formador de esporas, En la tinción de Gram pueden verse pleomórficos y Gram
variables. Se describe satelitismo, ya que crece alrededor de colonias de S. aureus hemolítico
(fuente de factor V).
b. Material didáctico:
c. Actividades
e. Instrumentos de evaluación:
¿Por qué se utiliza el agar chocolate para el aislamiento de Haemophilus?
GUIA PRÁCTICA Nº 23 SEMANA 11
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
OBJETIVO Aplicar la técnica del urocultivo para identificar microorganismos.
causantes de infecciones del tracto urinario (ITU).
LOGRO A MEDIR Reconoce a los microorganismos causantes de infecciones del tracto
urinario (ITU).
Realiza la técnica de urocultivo.
Interpreta los resultados obtenidos.
a. Marco Teórico
Como se indicó, la orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas
siguientes a la recolección para lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá
identificarlas y realizar el antibiograma correspondiente.
b. Material Didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos,
cristales anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células
epiteliales, cilindros.
2. En los frotis coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y
Gram negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol
resistentes (en caso de infección por Mycobacterium).
SEGUNDO DÍA:
e. Instrumento de Evaluación
Se espera que el estudiante conozca la utilidad de la técnica del urocultivo para identificar
microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario (ITU), incluyendo el
antibiograma.
GUIA PRÁCTICA Nº 24 SEMANA 11
a. Marco Teórico
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 2 de ancho
y 5 a 15 de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes
de anilina y es difícil su cultivo en medios artificiales.
b. Material Didáctico
• Suero problema
• Laminas excavadas
• Antígeno VDRL o RPR
• Pipetas graduadas
• Baño maría
• Microscopio binocular
• Alcohol 70°
• Algodón
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
PROCEDIMIENTO (VDRL)
• Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero inactivado (baño María a 56°C x 30 minutos)
sobre la lámina excavada.
• Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos.
• Observar al microscopio con objetivo de menor aumento l a formación de flóculos
cuando la reacción es positiva.
PROCEDIMIENTO (RPR)
I. PRUEBA CUALITATIVA
Con el gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo:
reactivo A 1 gota (17 l)
Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica
y proceder de la misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado
por la inversa de la última dilución que se observe reactiva.
RESULTADOS
e. Instrumento de Evaluación
Cuestionario:
f. Resultados Esperados
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los principios de las pruebas de VDRL y RPR
empleadas para el diagnóstico de laboratorio de la sífilis.
GUIA PRÁCTICA Nº 25 SEMANA 11
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DEL GÉNERO LEPTOSPIRA
OBJETIVO Conocer las características del género Leptospira y los métodos
diagnósticos de la leptospirosis.
LOGRO A MEDIR
Reconocer a los microorganismos espirilares
Diferenciar a los miembros del género Leptospira
Identificar a los microorganismos mediante pruebas
serológicas generales y moleculares
a. Marco Teórico
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente
unidas, muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µmy 0.1 µm de diámetro, sus extremos
semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los
roedores y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la
orina el agente etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de
transmisión puede ser directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través
del agua o material contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través
de lesiones de la piel y mucosas incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
b. Material Didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
e. Instrumento de Evaluación
Cuestionario:
1. Indique el tipo de muestra que se utiliza para el aislamiento de las leptospiras,
considerando el momento ideal para su toma, según la fecha de inicio de los síntomas.
2. ¿Por qué se utiliza el microscopio de campo oscuro para observar la presencia de las
leptospiras?
3. Cuáles son las coloraciones empleadas para la observación microscópica de las
leptospiras y por qué se emplean cada una de ellas.
4. Cuáles son los principios de la prueba confirmatoria de referencia MAT (Técnica de
aglutinación microscópica).
f. Resultados Esperados
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los métodos diagnósticos de la leptospirosis.
GUIA PRÁCTICA Nº 26 SEMANA 12
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS
OBSERVACIÓN DE LÁMINAS COLOREADAS
OBJETIVO Conocer los diversos métodos de aislamiento de los virus.
LOGRO A MEDIR Diagnosticar la infección por virus.
Conocer los diversos métodos de aislamiento directo o indirecto
Demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus
formas como se deben evaluar en los diferentes procesos
infecciosos que generan en el ser humano
a. Marco Teórico
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de
los animales, de las plantas y también delas bacterias (bacteriófagos).
En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano;
debido a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo
intracelular obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien
algunas de las enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad
(viruela, rabia, hepatitis, etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes
fundamentales para el crecimiento y multiplicación deben necesariamente utilizar los
sistemas de las células que parasitan y por ello se denominan parásitos intracelulares
obligados.
En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de
las infecciones virales, así como drogas antivirales específicas para muchos virus.
Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se
replican en el interior de las células vivas, para su cultivo in vitro es necesario el empleo de
métodos especiales en el laboratorio de virología, tales como:
Métodos indirectos:
a) Cultivos víricos en tejidos humanos o animales: Los virus necesitan células vivas
para replicarse. Muchos virus se replican de forma activa en cultivos celulares. Los
sistemas de cultivo celular son monocapas de células vivas que sostienen el
crecimiento de los virus. La replicación del virus se detecta mediante el efecto
citopático en la monocapa celular. Se denomina efecto citopático a las alteraciones
morfológicas características visibles en una línea susceptible debido a la replicación
del virus. Existen varios sistemas celuares, siendo las líneas celulares continuas más
utilizadas las la HeLa y la HEp-2
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7151762/)
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amniótica, cavidad
alantoidea y saco vitelino).
d) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones:
Inmunohistoquímica.
Métodos indirectos:
b. Material Didáctico
• Huevos embrionados de 7-9 días.
• Huevos embrionados de 10-12 días.
• Lamina de células normales, rabia, Enterovirus –Virus polio, Herpes simple,
Citomegalovirus, adenovirus en células HEP-2
• Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.
• Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
• Colorante azul de metileno al 1% con agua destilada
• Frascos con alcohol yodado
• Algodón
• Ovoscopio
• Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
• Equipo de disección (pinzas, tijeras curvas, guantes)
• Destilador de agua
• Incubador agitador
• Líneas celulares LLC-MK2, Vero-76 o Vero-6
• Medio Eagle modificado Dulbecco´s (DMEM).
• Suero bovino fetal (SBF) al 10%
• Penicilina-estreptomicina al 1%.
c. Actividades
La práctica se desarrolla de forma grupal y de acuerdo con la metodología de la asignatura.
d. Desarrollo de la Práctica
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-
35°C por 2-4 días, luego cosechar y observar.
b) Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima
del embrión y hacer una perforación rectangular de 0.5cm, con el punzón.
c) Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona
no vascularizada de la membrana corioalantoideasubyacente.
d) Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arribala membrana
amniótica, formando una pequeña “tienda” en la base del cualse inyecta 0.2 ml, de la
solución de Azul de metileno o del inoculo problema.
f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a
3335°C por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)
a) Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del
huevo embrionado de 6-7 días.
e. Instrumento de Evaluación
Cuestionario:
1. Indica las ventajas y las desventajas de la técnica de aislamiento viral con la técnica
de huevos embrionados.
2. Indica las ventajas y las desventajas de la técnica de aislamiento viral con la técnica
de cultivo celular.
3. Dibuja los efectos citopáticos producido por los siguientes virus:
a. Virus de la rabia
b. Virus Polio
c. Citomegalovirus
d. Adenovirus
f. Resultados Esperados
a. Marco Teórico
Los coronavirus pertenecen a la familia Coronaviridae, que tiene dos subfamilias, una de las
cuales son los Orthocoronavirinae, que son virus ARN de una sola cadena de sentido positivo.
El tamaño de los genomas varía entre 26 a 32 kilonucleótidos, siendo uno de los virus de tipo
ARN positivos de mayor tamaño (Zheng, 2020). Tienen una nucleocápside de simetría
helicoidal con una envoltura que tiene unas estructuras glicoproteícas que parecen una
corona de puntas (por ello llamado coronavirus) y es el más insidioso entre su clase. El virus
puede medir de 120 a 160 nm de diámetro (Cortellis, 2020, p.15).
b. Material Didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
PROCEDIMIENTO:
a. Muestra
• Aspirado nasofaríngeo.
• Sangre
Toma de muestra:
- Desinfectar el dedo.
- Pinchazo en el dedo
con lalanceta.
b. Aislamiento viral
• Extraer RNA viral a partir del aspirado nasofaríngeo y del sobrenadante del cultivo
celular mediante el QIAamp Viral RNA Mini Kit™
• La transcripción inversa y posterior amplificación del genoma viral se hizo en un solo
paso empleando el qScript XLT 1-Step RT-qPCR Tough Mix™ con los oligonucleótidos
y sondas específicos para el gen N1.
d. Prueba inmunocromatográfica
Cuestionario:
f. Resultados Esperados
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los principios de los métodos de diagnóstico
del COVID-19.
GUIA PRÁCTICA Nº 28 SEMANA 14
DIAGNÓSTICO DE LA RABIA - OBSERVACIÓN DE LÁMINAS
OBJETIVO Detectar el virus de la rabia mediante la técnica de
inmunofluorescencia directa e inoculación en animales de
laboratorio.
LOGRO A MEDIR Conoce la técnica de inmunofluorescencia directa para detectar el
virus de la rabia.
Conoce la técnica de inoculación en animales de laboratorio para
aislar el virus de la rabia.
a. Marco Teórico
La rabia es una enfermedad neurológica mortal que afecta una amplia variedad de
hospederos mamíferos incluyendo al hombre, y su transmisión está asociada a especies
hospederos, comúnmente carnívoros y quirópteros. Aunque la vacunación y la terapia con
anticuerpos es efectivaen el tratamiento post-exposición, se estima al menos 59 000 muertes
humanas anuales causada por rabia canina, siendo las áreas más afectadas África y Asia.
El virus se encuentra en el sistema nervioso, saliva, orina, linfa, leche y sangre. Puede
cultivarse en embriones de pollo, ratones recién nacidos, así como en cultivo de células de
riñón de hámster o de células diploides de origen humano.
El diagnóstico de rabia debe realizarse por medio de estudios de laboratorio, ante todo,
mediante inmunofluorescencia directa, que se ha considerado la prueba ideal. Además, la
lesión histopatológica de la rabia es patognomónica, es decir, la presencia de cuerpos de
Negri en el citoplasma de las neuronas confirma el diagnóstico. No obstante, en muchos
casos el diagnóstico se hace clínicamente debido a que durante elinicio del cuadro clínico se
presentan los signos característicos que le confieren el nombre de “derriengue” a la
enfermedad.
En el Perú, los principales reservorios del VR son los canes (rabia urbana) y murciélagos
hematófagos, Desmodus rotundus (rabia silvestre), los cuales mantienen ciclos
independientes de transmisión. Según los reportes del Laboratorio de Zoonosis Virales del
Instituto Nacional de Salud (INS), 80 casos de rabia urbana fueron notificados en los
departamentos de Madre de Dios, Piura, y Puno, durante el periodo 2010-2014; cinco casos
en humanos, nueve en diversas especies (bovino, llama, y gato) y 66 casos en canes, este
último con un promedio de 14 casos al año.
b. Material Didáctico
• Tijera de disección.
• Bisturí.
• Pinzas diente de ratón.
• Placa Petri.
• Guantes de cirugía.
• Mandil.
• Recipiente con desinfectante (solución jabonosa).
• Cinco a ocho ratones albinos suizos cepa Balb-C (21 días y 11-14 g de peso).
• Mortero y pilón (fríos).
• Diluyente (agua destilada, 2% suero equino, 1000 UI penicilina y 2 mg de estreptomicina
/ ml).
• Tubo de ensayo 12 x 75.
• Jeringa (tuberculina) de 1 ml (una jeringa por muestra).
• Aguja 27 x 1/2’’.
• Recipiente para descartar agujas.
• Pinza y tijera.
• Jaulas de ratones de metal o polipropileno con sus respectivas rejillas.
• Refrigeradora
• Destilador de agua
• Centrifuga
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
1. Sujetar con una pinza diente de ratón la piel de la parte posterior de la cabeza y realizar
un corte con la tijera aperturando la piel, para luego extender el corte longitudinalmente
hasta la altura de las órbitas de los ojos.
2. Sujetar con la pinza diente de ratón la cabeza del animal tomándolo porlas órbitas y
penetrar por la parte posterior del cráneo con la punta de latijera, cortando alrededor del
cráneo.
3. Retirar la tapa del cráneo, dejando de esta manera expuesto el cerebro.
4. Con la tijera a medio abrir, levantar el cerebro cortando la base, teniendo la seguridad de
incluir el cerebelo al momento de retirar la masa encefálica.
5. Rotular la muestra con el código correspondiente.
PROCEDIMIENTO
1. Codificar las fichas con el código del laboratorio y el respectivo día de procesamiento,
así como su ingreso en el registro de muestras para diagnóstico de rabia.
2. Si la muestra fue remitida conteniendo glicerina 50%, se procederá a realizar un lavado
utilizando suero fisiológico (solución salinaestéril 0,09%).
3. Colocar el cerebro y cerebelo en una placa petri y llevar a una mesa de trabajo.
4. Realizar con la tijera un corte longitudinal al nivel de la primera circunvolución caudal
cortando paralelamente a la línea que divide ambos hemisferios. El corte se extenderá
de 3 a 5 cm hacia delante,profundizándose hasta ubicar el ventrículo lateral a nivel
de una estructura de color blanco nacarado en forma de cuerno, que sobresale
lateralmente del suelo del ventrículo. Esta estructura es el hipocampo o asta de Ammon,
que al corte transversal muestra una estructura típica de contorno espiralado
(“pionono”).
5. Se realizarán dos cortes más, uno a nivel de la corteza cerebral y otro en el cerebelo,
siempre procurando coger la sustancia gris con un espesor de 3 a 4 mm.
6. Realizar dos láminas de la corteza, asta de Ammon y cerebelo.
7. Los cortes de cada una de las estructuras se colocan sobre una tira de papel secante o
filtro y éste sobre un bajalengua.
8. Tomar un portaobjeto limpio y colocarlo con el bajalengua, formando una cruz. Realizar
dos impresiones en cada lámina procurando que la impronta no sea muy gruesa. Si la
impronta fuera muy gruesa, se podrá adelgazar presionando la impronta sobre el papel
filtro.
9. Colocar las láminas secas en un coplin con acetona fría (-20ºC) por un mínimo de 30
minutos.
10. Una vez seca la impronta, se procederá a delinear los bordes de ambas improntas con
un corrector líquido (liquid paper).
11. Diluir el conjugado antirrábico previamente titulado 1/5 con la suspensión de CRN o
agua destilada.
12. Diluir el conjugado antirrábico con la suspensión de CVS 1/5.
13. Agregar una gota de la mezcla del CRN + conjugado a la improntamás cercana del
extremo pavonado o que contenga el código.
14. Agregar una gota de la mezcla del CVS + conjugado a la improntamás alejada del
extremo pavonado.
15. Llevar a la estufa a 37°C por 30 minutos.
16. Lavar con solución salina tamponada pH 7,2-7,4 y dejar reposar por10 minutos.
17. Lavar con agua destilada.
18. Dejar secar y observar a 100X con aceite de inmersión o glicerina pura, sin colocar
laminilla a la impronta.
19. La observación de las láminas se iniciará en el extremo superior izquierdo y proseguirá
hacia la derecha y luego hacia abajo, asegurando la observación ordenada de toda la
impronta.
PROCEDIMIENTO
e. Instrumento de Evaluación
Cuestionario:
1. ¿Qué grado de bioseguridad debe tener el laboratorio que realice la toma de muestra
para el diagnóstico de la rabia? Justifique su respuesta.
2. ¿Por qué se utiliza como muestra para el aislamiento del virus de la rabia el hipocampo,
corteza cerebral y cerebelo?
3. ¿Cuáles son las ventajas de desventajas de la técnica de inmunofluorescencia directa
para la detección delantígeno rábico?
4. ¿Cuáles son las ventajas de desventajas de la prueba biológica de inoculación de
ratones para el diagnóstico de la rabia?
f. Resultados Esperados
Al culminar la práctica, los estudiantes conocen los principios de los métodos de diagnóstico
de rábia.
GUIA PRÁCTICA Nº 29 SEMANA 15
ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS AMBIENTALES
OBJETIVO Reconocer a los hongos ambientales causantes de infecciones
respiratorias yalérgicas.
LOGRO A MEDIR Reconocer las características macroscópicas de los cultivos de los
principales hongos ambientales.
Reconocer las características microscópicas de los principales hongos
ambientales.
a. Marco Teórico
b. Material Didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo con la especie en: amarillo, verde
azufrado, marrón o negro.
Penicillium
Rhizopus
Cephalosporium
Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias
hialinas agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia
elevada de color gris.
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.
g. INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN
h. RESULTADOS ESPERADOS
a. Marco Teórico
Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas
del cuerpo como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos,
germinan y los invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las
infecciones más comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum
y Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor
o Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo
piloso de los cabellos, barba y bigote.
b. Material Didáctico
c. Actividades
Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes
Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de
la colonia. Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques
transversales y con pequeñas excrecencias en la superficie, pueden también observarse
microconidias y clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Piedraia hortai
Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a
negro que envuelven completamente el tallo piloso.
e. Instrumento de Evaluación
f. Resultados Esperados
a. Marco Teórico
b. Material Didáctico
d. Desarrollo De La Práctica
Candida albicans
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de
aspecto mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de
cultivo.
En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la
levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las
lesiones, las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.
e. Instrumento de Evaluación
f. Resultados Esperados
a. Marco Teórico
Paracoccidioides brasiliensis
Histoplasma capsulatum
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la esporotricosis en el hombre y algunos
animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales
contaminados con el hongo. La infección esta localizada preferentemente en los ganglios
linfáticos.
b. Material Didáctico
c. Actividades
d. Desarrollo de la Práctica
Paracoccidioides brasiliensis
En los frotis coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células
esféricas u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos,
tabicados con microconidias esféricas o piriformes.
En agar infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige
claro. Microscópicamente se observan células esféricas, agrupadas en forma de rosetas.
Histoplasma capsulatum
En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón
claro. Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo
se encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan células en
gemación ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
e. Instrumento de Evaluación
f. Resultados Esperados