DIVISIÓN DE QUÍMICO BIOLÓGICAS

“CONTEO EN PLACA DE LA BACTERIA Alcaligenes faecalis

EN LA DEGRADACIÓN DE PLUMAS DE POLLO”

TESIS

PARA OBTENER EL TÍTULO DE

TÉCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO EN

QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

KARINA GUADALUPE CUEVAS ORTIZ

ASESOR INDUSTRIAL: Dr. Porfirio Raúl Galicia García

ASESORES ACADÉMICO: Dra. Maribel Quezada Cruz

INSTITUCIÓN: Universidad Tecnológica de Tecámac

GENERACIÓN: Mayo 2018 - Abril 2020

 DIVISIÓN DE QUÍMICO BIOLÓGICAS
“CONTEO EN PLACA DE LA BACTERIA Alcaligenes faecalis
EN LA DEGRADACIÓN DE PLUMAS DE POLLO”

TESIS

PARA OBTENER EL TÍTULO DE

TÉCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO EN

QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

KARINA GUADALUPE CUEVAS ORTIZ

ASESOR INDUSTRIAL: DR. PORFIRIO RAÚL GALICIA GARCÍA

ASESORES ACADÉMICO: DRA. MARIBEL QUEZADA CRUZ

INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC

GENERACIÓN: Mayo 2018 - Abril 2020

4
 DEDICATORIAS

Mi tesis la dedico con todo mi amor y cariño a mi madre Eloina Ortiz, que ha sido
el pilar más importante para mi vida, por su sacrificio y esfuerzo, gracias por las
reglas puestas y por siempre confiar en mí; por demostrarme que nunca estoy
sola. Mi mayor ejemplo de vida eres tú. A mi abuela Epifania Chacón, que se ha
dedicado a cuidarme y me da la alegría día con día. Gracias a ambas por su amor
incondicional, por todo el esfuerzo para que esto sea posible y por toda la
paciencia.

A mi padre Daniel Cuevas que me enseño el trabajo de constancia y

perseverancia, por el respeto y el apoyo brindado.

También dedico este trabajo a mis hermanos Daniel, Ivonne, y Jésica Cuevas
que son mi apoyo incondicional, que no importa el tiempo la distancia o las
ocupaciones, siempre están ahí cuando los he necesitado. Por su tiempo
brindado, la atención, y el amor.

A mi cuñado Hugo Hernández que me dio su apoyo incondicional, brindarme

confianza e inspiración para poder concluir hasta esta etapa de mi vida.

A mis sobrinos Fernando Cuevas, Ezequiel Berrios, Samuel Berrios, Ariadna

Cuevas, Bastian Cuevas, y Regina Hernández; esperando ser un ejemplo para
ustedes para que puedan llegar hasta aquí y más lejos aún.

Con todo mi amor y cariño…

 AGRADECIMIENTOS

Agradezco primero a Dios por haberme permitido llegar a concluir esta etapa en
mi vida.

Así como también agradezco la oportunidad a la Universidad Tecnológica de

Tecámac no solo por brindarme la oportunidad de realizar mis estudios, si no por
forjarme en mis conocimientos y darme las habilidades para poder desempeñarme
en el campo laboral.

Agradezco a la Dra. Maribel Quezada Cruz que me aceptó en su investigación

para realizar mi procedimiento de estadías, por brindarme de sus conocimientos y
darme enseñanzas para poder desarrollar la habilidad de la investigación.

También agradezco a la IBT. Victoria Enciso Tenorio por toda la ayuda y

atención brindada, además de su paciencia para ayudar en esta etapa y hacerme
ver que la responsabilidad y los buenos resultados son gracias a una manera
correcta de trabajo.

Y a cada persona que contribuyó para que esto pudiese concluirse…

6
 ÍNDICE DE CONTENIDO

Contenido Páginas
DEDICATORIAS 4
AGRADECIMIENTOS 5
ÍNDICE DE FIGURAS ix
ÍNDICE DE TABLAS ix
RESUMEN - 11 -
ABSTRACT - 12 -
I. INTRODUCCIÓN - 13 -
1.1 Objetivos - 14 -
1.1.1 Objetivo general - 14 -
1.1.2 Objetivos específicos - 14 -

HIPÓTESIS - 14 -
1.2 Justificación - 15 -

II. PROGRAMA Y CRONOGRAMA - 16 -

III. MARCO TEÓRICO - 17 -
3.1 Pluma de pollo - 17 -
3.1.1 Definición - 17 -
3.1.2 Partes de la pluma de pollo - 17 -
3.2 Aminoácidos - 18 -
3.2.1 Definición - 18 -
3.3 Proteínas - 18 -
3.3.1 Definición - 18 -
3.3.2 Queratina - 18 -
3.3.3 Tipos de Queratina - 19 -
3.4 Degradación biológica de plumas - 19 -
3.4.1 Degradación microbiológica de plumas de pollo - 19 -
3.4.2 Degradación de plumas de pollo con Alcaligenes faecalis - 20 -
3.5 Cuantificación de bacterias - 20 -
3.5.1 Número Más Probable (NMP) - 20 -
3.5.2 Método de peso seco - 21 -
3.5.3 Método de cuantificación por absorbancia - 21 -
3.5.4 Método de conteo en placa - 22 -

IV. METODOLOGÍA - 24 -

vii
 4.1 Degradación de plumas de pollo por Alcaligenes faecalis - 24 -
4.1.1.2 Tratamiento de plumas de pollo - 24 -
4.1.1.3 Inoculación de plumas de pollo en el medio de cultivo - 24 -
4.1.4 Inoculación de microorganismos en medios de cultivo - 24 -
4.2 Proceso de degradación de plumas de pollo a escala reactor de 3.5 litros. - 25
-
4.2.1 Tratamiento de plumas de pollo para la inoculación en el reactor APPLIKON
ADI1012. - 25 -
4.2.2 Inoculación de plumas de pollo en el medio de cultivo del reactor APPLIKON
ADI1012. - 25 -
4.2.3 Inoculación de microorganismos en medio de cultivo en el reactor APPLIKON
ADI1012. - 25 -
4.3 Conteo en placa de A. faecalis - 26 -
4.3.1 Preparación de medio para conteo en placa. - 26 -
4.3.2 Preparación de solución salina para diluciones. - 26 -
4.3.3 Diluciones para siembra. - 26 -
4.3.4 Siembra en agar nutritivo - 27 -
4.3.5 Conteo de UFC de A. faecalis - 27 -
4.4 Medición de absorbancia para medir la cinética de degradación - 27 -
4.5 Cálculo de rendimiento - 27 -

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN - 29 -
6.1 Degradación de plumas - 29 -
6.2 Degradación de plumas de pollo (método de esterilización con agua hirviendo 10
min.). - 32 -
6.3 Degradación de pluma de pollo (método de esterilización por arrastre de vapor). - 32
-
6.4 Conteo en placa de Alcaligenes faecalis - 35 -
6.5 Rendimiento - 40 -

VI. CONCLUSIONES - 42 -
VII. REFERENCIAS - 43 -
VIII. ANEXOS - 46 -
8.1 Elaboración agar plumas en cajas Petri - 46 -
8.2 Activación de A. faecalis en agar plumas - 46 -
8.3 Proceso de degradación de plumas de pollo a escala matraz - 47 -
8.4 Proceso de degradación de plumas de pollo a escala reactor APPLIKON ADI1012. - 47
-
8.5 Ensayo con esterilización de agua hirviendo (absorbancias) - 48 -
8.6 Ensayo con esterilización de arrastre de vapor (absorbancias) - 49 -
8.7 Ensayo con esterilización de agua hirviendo (UFC) - 50 -
8.8 Ensayo con esterilización por arrastre de vapor (UFC) - 51 -
8.9 Rendimiento - 51 -
8.9.1 Matraz testigo de esterilización de agua hirviendo (M1) - 52 -
8.9.2 Rendimiento de triplicado de matraz inoculado con A. faecallis y esterilizado con agua
hirviendo. (M2, M3 y M4) - 53 -

viii
8.9.3 Rendimiento a nivel matraz con esterilización por arrastre de vapor (M5) - 54 -
8.9.4 Rendimiento a nivel reactor (3.5L) con esterilización por arrastre de vapor - 55 -

ix
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Partes de la pluma.......................................................................................................................- 17 -

Figura 2. Representación de grafico de absorbancia................................................................- 21 -
Figura 3. Crecimiento de A. faecalis en agar con plumas molidas (polvo de pluma)...........- 28 -
Figura 4. Degradación de plumas de pollo a nivel matraz........................................................- 30 -
Figura 5. Degradación de plumas de pollo (método de esterilización con agua hirviendo) - 31 -
Figura 6. Comparación de la degradación de plumas de pollo a diferentes temperaturas
esterilizadas por arrastre de vapor.......................................................................................- 32 -
Figura 8. UFC de A. faecalis en la degradación de plumas de pollo (método de esterilización
con agua hirviendo)................................................................................................................ - 34 -
Figura 9. UFC en la degradación de plumas de pollo (método por arrastre de vapor).........- 35 -
Figura 10. Crecimiento celular en día 0 y 35. A. Testigo, B. M1 (Esterilización con agua
hirviendo), C. M2 (Esterilización con agua hirviendo), D. M3 (Esterilización con agua
hirviendo), E. M4 (Esterilización con agua hirviendo), F. M5 (Arrastre de vapor), G.
Reactor..................................................................................................................................... - 38 -
Figura 11. Degradación de plumas de pollo (día 20)............................................................................- 39 -

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Cantidad de cepas a inocular por matraz................................................................................- 22 -

Tabla 2. Testigo de degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo
(M1)............................................................................................................................................ - 46 -
Tabla 3. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo (M2)............- 46 -
Tabla 4. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo (M3)............- 46 -
Tabla 5. Degradación de pluma de pollo por esterilización agua hirviendo (M4)..................- 47 -
Tabla 6. Degradación de pluma de pollo por esterilización de arrastre de vapor (M5).........- 47 -
Tabla 7. Degradación de pluma de pollo en reactor (3.5L) por esterilización de arrastre de
vapor......................................................................................................................................... - 47 -
Tabla 8. Testigo de degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo
(M1)............................................................................................................................................ - 48 -
Tabla 9. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo (M2)............- 48 -
Tabla 10. Tabla 4. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo (M3)..-
48 -
Tabla 11. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo (M4)...........- 49 -
Tabla 12. Degradación de pluma de pollo por esterilización de arrastre de vapor (M5).......- 49 -

x
Tabla 13. Degradación de pluma de pollo en reactor (3.5L) por esterilización de arrastre de vapor. -
49 -

xi
 RESUMEN

En México se generaron alrededor de 440 mil toneladas de plumas en 2019

(FIRA, 2020), lo que produce un grave problema a nivel mundial en el área
ambiental y de la salud. Actualmente se tienen procesos fisicoquímicos y
biológicos que podrían minimizar este problema, sin embargo en nuestro país se
tienen pocos estudios en cuanto a la degradación biológica de estos residuos. Por
lo anterior, este proyecto se enfocó en la degradación de plumas de pollo por
medio de la bacteria Alcaligenes faecalis a escala matraz y reactor a 35°C y 20-
24°C respectivamente. Se compararon dos métodos de esterilización de plumas
(agua hirviendo y arrastre de vapor) y en todos los casos se cuantificó el
crecimiento celular como Unidades Formadoras de Colonias (UFC), por el método
de dilución y conteo en placa. Fue posible degradar plumas de pollo en todos los
casos, es decir a escala matraz y reactor con plumas previamente esterilizadas
con agua hirviendo y con arrastre de vapor. La mejor degradación se obtuvo en
20 días a escala matraz a 35°C y con plumas previamente esterilizadas con agua
hirviendo. El máximo crecimiento celular a nivel matraz fue de 4.03x10 8UFC/5g de
plumas en 20 días y a nivel reactor de 3.35x10 9 UFC/35g de plumas en 35 días.

12
 ABSTRACT

In Mexico, around 170.0 to 340.16 million tons of feathers were generated in 2019,
which produces a serious problem worldwide in the environmental and health area.
Currently there are physicochemical and biological processes that could minimize
this problem, however, in our country there are few studies regarding the biological
degradation of these residues. Therefore, this project focused on the degradation
of chicken feathers by means of the Alcaligenes faecalis bacteria on a flask and
reactor scale at 35°C and 20-24°C respectively. Two methods of feather
sterilization (boiling water and steam stripping) were compared and in all cases cell
growth was quantified, as Colony Forming Units (CFU), by the dilution method and
plate count. It was possible to degrade chicken feathers in all cases that is to say
on a flask and reactor scale with feathers previously sterilized with boiling water
and steam entrainment. The best degradation was obtained in 20 days at a flask
scale at 35°C and with previously sterilized feathers with boiling water. Cell growth
was 4.03x108 CFU/5g of feathers in 20 days and at reactor level 3.35x10 9 CFU/35g
of feathers in 35 days.

13
 I. INTRODUCCIÓN

Las plumas, que son proteína de queratina casi pura (90% o más), son generadas
en grandes cantidades como un residuo en plantas de procesamiento de pollo y
granjas de aves de corral. Alrededor de 8.5 billones de toneladas de plumas de
pollo se producen anualmente en todo el mundo, lo que ocasiona un severo
problema ambiental, ya que, al ser desechadas, son un foco de múltiples
enfermedades que pueden afectan al público en general y además de generar
daños al medio ambiente (Agrahari et al., 2010).

Una de las opciones para disminuir o eliminar el problema de la generación de

plumas de pollo es el tratamiento biológico y fisicoquímico. Las ventajas de los
biológicos es prevenir la contaminación producida por los desechos orgánicos
(plumas de pollo) a corrientes de agua, cuando no se les realizan ningún tipo de
procedimiento.

Durante el proceso biológico se forman sedimentos (hidrolizado) con un probable

potencial para recuperación de proteínas, aminoácidos (fenilalanina, isoleucina,
valina y alanina, entre otros) y enzimas.

Uno de los primeros métodos utilizados para reducir la contaminación por

residuos avícolas, fue incorporarlos a los suplementos alimenticios para animales,
ya que, el alto contenido proteico de las plumas representa una alternativa
potencial a los ingredientes alimentarios proteicos más caros para la nutrición
animal. Sin embargo, los procesos actuales para obtener este tipo de harina de
plumas son costosos y también destruyen ciertos aminoácidos, resultando en un
subproducto con una digestibilidad pobre y una calidad de nutrientes variable
(Wang et al., 1997).

En México, hay pocos estudios sobre la degradación de los desechos de plumas

de pollo. En la universidad Tecnológica de Tecámac se han llevado a cabo
procesos experimentales donde se aislaron cepas de bacterias (Alcaligenes
faecalis) de una planta procesadora de pollos; sin embargo, aún no se ha
implementado una técnica donde se haga un conteo de la bacteria durante la
degradación de las plumas (Unidades Formadoras de Colonias, UFC) para poder
calcular el rendimiento y escalar el proceso a nivel Industrial.

14
I.1Objetivos

I.1.1 Objetivo general

Determinar la cantidad de “Alcaligenes faecalis” durante un proceso de

degradación de plumas de pollo, por el método de dilución en placa para
la evaluación del rendimiento de este proceso.

I.1.2 Objetivos específicos

Cuantificar las Unidades Formadoras de Colonias de Alcaligenes

faecalis en los días 0, 7, 13, 20 y 35 de un proceso de degradación de 5
gramos de plumas de pollo a escala matraz.

Cuantificar las Unidades Formadoras de Colonias de Alcaligenes

faecalis en un proceso de degradación de plumas de pollo a escala
reactor de 3.5 litros.

Calcular el rendimiento del proceso de degradación de plumas de pollo

a escala matraz y reactor de 3.5 litros.

HIPÓTESIS
Durante un proceso de degradación de plumas de pollo la bacteria
Alcaligenes faecalis genera enzimas queratinolíticas que degradan la
queratina de las plumas por lo que la bacteria tendrá la capacidad para
duplicarse y aumentar su cantidad (crecimiento celular); por lo que se
podrá detectar su crecimiento a través de las Unidades Formadoras de
Colonias.

15
I.2Justificación

La oportunidad de aprovechar los residuos de plumas de pollo como fuente

rica en proteína surge de la posibilidad de generar diversos subproductos
benéficos, como pueden ser suplementos alimenticios, fertilizantes para
suelos e incluso para minimizar la contaminación del aire y el agua.

El conteo en placa de “Alcaligenes faecalis” será útil para poder escalar este
proyecto de nivel laboratorio a nivel industrial y medir el rendimiento que este
llega a tener debido a que la avicultura es una de las ramas de la producción
animal de mayor importancia a nivel mundial, ya que esta satisface las
necesidades de la población en la ingesta proteica. Durante los últimos años
ha habido un incremente de consumo de carne de pollo, lo que ha
incrementado la producción de aves, así como los desechos que esto mismo
genera, en algunos casos estos subproductos o desechos son utilizados para
la realización de alimentos de algunos otros animales, sin embargo no
siempre se aprovechan estos subproductos porque estos llegan a contaminar
suelos, ríos y lagos, y esto hace que se eleve carga microbiana generando
daños al medio ambiente y diversas enfermedades a la población.

16
 II. PROGRAMA Y CRONOGRAMA

Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tarea

Planteamiento del
trabajo

Búsqueda de
información

Preparación de
medios

Cultivos en
matraces

Toma de primera
muestra

Conteo en placa

Toma de la
segunda muestra

Conteo en placa

Toma de la
tercera muestra

Conteo en placa

Toma de la
cuarta muestra

Conteo en placa

Toma de la quinta
muestra

Interpretación de
resultados

Elaboración de
reporte técnico

17
 III. MARCO TEÓRICO

3.1 Pluma de pollo

3.1.1 Definición
Las plumas son estructuras queratinosas de la piel de las aves y otros dinosaurios
terópodos. Son los apéndices integumentarios (escamas, pelos, cuernos, etc) de
estructura más compleja entre los vertebrados. El conjunto de todas las plumas de
un ave recibe el nombre de plumaje, y forma una capa densa, aislante, que la
protege frente al frío y el agua, contribuyendo a la termorregulación de estos
animales. Son fundamentales en el vuelo aviar, pues forman la superficie
sustentadora del ala. Las plumas tienen también otras funciones relacionadas con
su color y su vistosidad, como el camuflaje, el reconocimiento entre los miembros
de la misma especie y la comunicación entre ellos, la diferenciación de sexos y
como elemento de atracción sexual durante el cortejo (Endler et al., 2005).

3.1.2 Partes de la pluma de pollo

El eje de la pluma está dividido en dos partes: el cálamo y el raquis (Figura 1). El
cálamo o cañón es la parte inferior y hueca con la que se inserta al cuerpo. El
cañón tiene dos orificios denominados ombligos. El ombligo inferior está en el
extremo basal del cálamo, es por donde penetra la papila de la pluma durante su
desarrollo para alimentarla, y el ombligo superior es el orificio por donde
inicialmente surgió la parte laminar de la pluma. Ésta está dispuesta a ambos
lados del raquis y se denomina estandarte o vexilo, está formado por
ramificaciones paralelas llamadas barbas. Las barbas a su vez se ramifican
perpendicularmente en barbillas o bárbulas que también están ramificadas en
ganchillos, encargados de enganchase con los ganchillos de las barbillas
colindantes. La parte superior del estandarte que queda perfectamente unida y
ordenada mediante el entrelazado de los ganchillos se denomina parte plumácea,
mientras que la parte inferior de la pluma cuyas barbas están separadas y
desordenadas, porque sus barbillas tiene pocos o ningún ganchillo, se denomina
parte plumosa.

18
 Figura 1 Partes de la pluma.

3.2 Aminoácidos
3.2.1 Definición
Un aminoácido es una de las molécula orgánica con un grupo amino (-NH 2) y un
grupo carboxilo (-COOH). Los aminoácidos más frecuentes y de mayor interés son
aquellos que forman parte de las proteínas; juegan en casi todos los procesos
biológicos un papel clave. Los aminoácidos son la base de las proteínas (Badui et
al., 2006).

3.3 Proteínas
3.3.1 Definición
Las proteínas (<en griego: πρωτεῖος [proteios], ‘prominente, de primera calidad’?)
o prótidos2 son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.
Estas se ensamblan de diversas formas, lo que les permite participar como los
principales componentes estructurales de las células y los tejidos. Por este motivo
el crecimiento, la reparación y el mantenimiento del organismo dependen de ellas
(García, 2010).

3.3.2 Queratina
La queratina (del griego κερατίνη, córneo) es una proteína con estructura fibrosa,
muy rica en azufre, que constituye el componente principal que forman las capas
más externas de la epidermis de los vertebrados y de otros órganos derivados del
ectodermo, faneras como el pelo, uñas, plumas, cuernos, ranfotecas y pezuñas
(Lehninger et al., 1995).

19
3.3.3 Tipos de Queratina
Las subunidades básicas de estas proteínas se dividen en dos grupos: las
queratinas ácidas y las queratinas básicas (y neutras). Existen alrededor de veinte
subunidades básicas, denominadas del uno al veinte como k1, k2…, k20. Las
ocho primeras son queratinas básicas o neutras, mientras que las restantes son
queratinas ácidas. La unión de estas subunidades da lugar a distintos tipos de
queratinas. Hasta hoy, se han descrito al menos treinta tipos distintos de
queratinas.
Cada cadena polipeptídica (estructura primaria) posee un dominio helicoidal de
alrededor de 310 aminoácidos y se encuentra flanqueada por una cabeza más
corta (dominio N-terminal) y una cola (dominio C-terminal) no helicoidales que se
cree que tienen una conformación flexible (Bragulla y Homberg, 2009).

3.4 Degradación biológica de plumas

Hallazgos recientes han demostrado el potencial microbiano presente en la
naturaleza, capaz de degradar sustratos no convencionales, tales como queratina
en su mayoría de plumas (Moldes et al., 2002). La biotecnología permite la
bioconversión de residuos agroindustriales en productos de interés comercial
mediante procesos de extracción directos de transformaciones microbiológicas
(Wang et al., 1997).
El fenómeno de la degradación de queratina está asociado a la necesidad de la
célula de hidrolizar sustratos proteicos de gran tamaño en moléculas pequeñas
para su aprovechamiento como fuente de nutrientes. Se han encontrado distintas
clases de microorganismos que producen proteasas con actividad para degradar
queratina, las cuales se usan en el tratamiento de degradación de las plumas de
aves (Cui et al., 2016).

3.4.1 Degradación microbiológica de plumas de pollo

Degradación por Bacillus subtilis, este es un microorganismo Gram +, que

produce una proteasa con actividad para degradar queratina, el cual se usa en el
tratamiento de degradación de plumas de pollo (Cui et al., 2016).

Agrahari et al. el año 2010, aislaron e identificaron las bacterias B. megaterium, B.

thuringenesis y B. pumilis, estas degradaron las plumas y tuvieron su máxima
actividad proteolítica a las 120h de incubación, usando caseína como sustrato, con
una actividad específica de 54 U/mL.

Kani et al. (2012), trabajaron con la degradación de plumas de pollo, mediante el

uso de los microorganismos Leuconostoc sp. y Pseudomonas microphilus. Gracias
a las queratinasas que son producidas por estos organismos queratinolíticos ,
fueron utilizados para la degradación de desperdicios de plumas, por lo que la
actividad de queratinasa de la concentración máxima de Pseudomonas
microphilus 0.884 (20 / ml) en 30 días y concentración mínima de 0.425 (IU / mt)
en 30 días. El porcentaje de pérdida de peso de la pluma tratada durante 10 días

20
se encontró que era 20%. El porcentaje de pérdida de peso de la incubación de 20
días de plumas fue del 45%. La pérdida de peso de la pluma se encontró que el
tratamiento durante 30 días fue del 70% a partir de las fechas en Pseudomonas
microphilus en comparación con Leuconostoc. sp.

Según Fang et al. (2013), trabajaron con enzimas derivadas de Stenotrophomonas

maltophilia BBE11-1 para biodegradar residuos con queratina, por lo que se aisló y
se identificó la bacteria Stenotrophomonas maltophilia, posteriormente se purificó
con cromatografía de interacción hidrofóbica, columna de intercambio aniónico y
columna de filtración en gel, se separaron las enzimas queratinolíticas K1, K2, K3,
posteriormente se midió la actividad proteolítica usando caseína a una
absorbancia de 660nm, como resultado se obtuvo que la enzima K2 alcanzó una
actividad proteolítica de 947U/mL, mientras que K1 se tuvo una actividad de 262
U/mL.

Moldes et al. (2002) trabajaron con la bacteria Bacillus sp. CL33A y con el método
Folin- fenol se determinó la actividad proteolítica usando azocaseína como
sustrato, según los tiempos en que se tomaron; en el tiempo 0 horas la actividad
fue de 1.5 mg/mL, a las 24 horas fue de 1.27 mg/mL, finalmente la máxima
actividad proteolítica en las 72h con 4.39 mg/mL.

Fakhfakh et al. (2011) trabajaron con la bacteria queratinolítica Bacillus pumilus A1

en la producción de hidrolizado de proteína con una alta actividad antioxidante,
donde se logró la degradación completa de las plumas en un medio que contenía
hasta 50 g / l de materia prima de plumas. El cultivo de 50 g / l de plumas durante
dos días, a 45 ° C y al pH inicial de 10.0, resultó en un máximo de producción de
aminoácidos y péptidos (42.4 g / l). Además, el hidrolizado de proteína de plumas
(FPH) se presenta una digestibilidad in vitro muy alta (98%) en comparación con la
de las plumas no tratadas (2%)

3.4.2 Degradación de plumas de pollo con Alcaligenes faecalis

Alcaligenes faecalis, es una bacteria que se encuentra en el entorno fácilmente, se
han encontrado en el suelo y el agua, en productos lácteos, huevos podridos y en
el tracto intestinal de los vertebrados (Rodríguez, 1998).

La masa típica de una bacteria sería de aproximadamente 10 −12g ó un pico-gramo

(Elert, 2003; Cervantes, 2019).

3.5 Cuantificación de bacterias

3.5.1 Número Más Probable (NMP)
El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de
atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones
consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el
principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo

21
turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la
muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho
organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de
esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que
recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán
turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán
transparentes.

Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos

contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Al
calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se
puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la
muestra original, a partir de una tabla estadística (Oblinger et al., 1975).

3.5.2 Método de peso seco

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran
en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C
hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra,
debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un
gran número de bacterias.

La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden

perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra
seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente
tiene una humedad relativa alta (Arnáiz et al., 2000).

3.5.3 Método de cuantificación por absorbancia

La absorbancia mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de
una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de

diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi
la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere
decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al
peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin
embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC
(Unidades Formadoras de Colonias) cuando los tamaños de las células
bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de
microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una
suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de

22
microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad
Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC (Neidhart et al.,
1990).

Figura 2. Representación de grafico de absorbancia

Donde:

K = constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa

del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el
valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco = Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso

seco (µg/ml-mg/ml).
La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para
suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una
absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley
de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede
involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de
absorción.

3.5.4 Método de conteo en placa

Consiste en realizar diluciones seriadas 1:10 y extender 0.1 mL de cada dilución
en una placa; las placas se incuban hasta que las colonias son apreciables para
su recuento. Esta metodología tiene la ventaja de tener un buen límite de
detección, sin embargo consume mucho tiempo durante los plaqueos; en el caso
de realizar el recuento de bacterias a partir de muestras cuya población se

23
desconoce se requiere realizar el extendido de cinco diluciones para cada conteo,
sin tomar en consideración repeticiones (Ortega, 2014).

La norma oficial mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para

la cuenta de bacterias aerobias en placa (Diario Oficial de la Federación, 1995)
sugiere utilizar las siguientes herramientas para el conteo de colonias de
bacterias:

Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadriculada y lente amplificador: Está diseñado para el conteo rápido y preciso de
las colonias de bacterias y moho en placas de cultivo. Permite el conteo de las
colonias por cada pulsación del contador quedando grabado en la pantalla digital.
Registrador mecánico o electrónico: Combina la función de contador electrónico
por presión, con el marcaje mediante el marcador indeleble, impidiendo un doble
conteo.

24
 IV. METODOLOGÍA
IV.1 Degradación de plumas de pollo por Alcaligenes faecalis
IV.1.1 Proceso de degradación de plumas de pollo a nivel matraz
4.1.1.1 Preparación de agares
1. Se elaboró un agar plumas (Ver anexo 8.1)
2. Se realizó la activación de A. faecalis en agar plumas (Ver anexo 8.2)
3. Se prepararon los medios de cultivo para el proceso de degradación (Ver anexo
8.3).

4.1.1.2 Tratamiento de plumas de pollo

1. Se pesaron 5g de plumas de pollo por quinduplicado en una balanza analítica
OHAUS AR2140.
2. Se empacaron respectivamente en bolsas de polipapel y se colocó cada
paquete de plumas en el escurridero con ayuda de las pinzas.
4. Se realizaron duplicados de lavados de agua hirviendo en condiciones de
esterilidad durante 5 minutos a cada uno de los paquetes que contenían las
plumas, con la finalidad de eliminar todo agente externo (contaminación y
microorganismos) a las mismas.
5. Se dejaron escurrir las plumas en cada lavado en la coladera, para reducir el
exceso de agua y recolectar en un papel de aluminio previamente esterilizado.

4.1.1.3 Inoculación de plumas de pollo en el medio de cultivo

1. Recolectadas las plumas con su previo tratamiento, se procedió a inocularlas.
2. En condiciones estériles, se colocaron los paquetes de 5g de plumas en cada
uno de los matraces Erlenmeyer de 1 L.

4.1.4 Inoculación de microorganismos en medios de cultivo

1. En condiciones estériles, se realizó un raspado de cajas Petri (con ayuda de las
espátulas estériles) que contienen a la bacteria previamente activada en cada
matraz Erlenmeyer con su medio de cultivo y plumas. La cantidad de bacteria a
inocular en cada matraz fue en base a la Tabla 1.

Tabla 1. Cantidad de cepas a inocular por matraz.

Matraz Condiciones de esterilización de Cantidad de cajas con cepa

plumas a raspar
M1 Lavadas 2 veces con agua hirviendo por 0 (Testigo)
10min.

25
 M2 Lavadas 2 veces con agua hirviendo por 7 cajas
10 min.
M3 Lavadas 2 veces con agua hirviendo 10 7 cajas
min.
M4 Lavadas 2 veces con agua hirviendo 10 7cajas
minutos
M5 plumas esterilizadas con arrastre de 0 cajas
vapor a 121°C, durante 1 hora

2. Posteriormente los matraces con plumas y medio de cultivo se incubaron en un

baño con agitación POLYSCIENCE 2DLB/S/C a 121 rpm a 35°C durante 35 días.

IV.2 Proceso de degradación de plumas de pollo a escala reactor de 3.5 litros.

1. Se preparó el medio para la degradación de plumas de pollo (Ver anexo 8.4)

4.2.1 Tratamiento de plumas de pollo para la inoculación en el reactor APPLIKON

ADI1012.

1. Se pesaron 25g de plumas de pollo en una balanza analítica OHAUS AR2140

2. Se empacó respectivamente en bolsas de polipapel.
3. Se colocó el paquete de plumas en el escurridero con ayuda de las pinzas.
4. Se realizaron duplicados de lavados de agua hirviendo en condiciones de
esterilidad durante 5 minutos al paquete que contenía las plumas, con la finalidad
de eliminar todo agente externo (contaminación) a las mismas.
5. Se dejaron escurrir las plumas en cada lavado en la coladera, para reducir el
exceso de agua.

4.2.2 Inoculación de plumas de pollo en el medio de cultivo del reactor APPLIKON

ADI1012.
1. Recolectadas las plumas con su previo tratamiento, se procedió a inocularlas.
2. En condiciones estériles, se colocó el paquete de 25g en el reactor APPLIKON
ADI1012.

4.2.3 Inoculación de microorganismos en medio de cultivo en el reactor

APPLIKON ADI1012.
1. En condiciones estériles, se realizó un raspado de 35 cajas Petri (con ayuda de
las espátulas estériles) que contienen a la bacteria previamente activada.
2. Realizada la inoculación de las bacterias en el reactor APPLIKON ADI1012 con
su respectivo medio de cultivo.
3. Se dejó a temperatura ambiente a 121 rpm por 35 días a temperatura ambiente.

26
4.3 Conteo en placa de A. faecalis
4.3.1 Preparación de medio para conteo en placa.
1. Se realizaron 220 mL de agar nutritivo en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.
2. Se mezcló y calentó con ayuda del mechero, procurando eliminar todos los
grumos.
3. Se colocó una muñeca y su respectivo gorro de aluminio en la boca del matraz,
de tal manera que lo cubriera perfectamente para evitar la entrada de un agente
externo al medio de cultivo.
4. Se colocó cinta testigo en la parte inferior del gorro de aluminio, de manera que
quedara sujetada al matraz.
5. Se situó el matraz en 2 bolsas de poli papel y se colocaron dentro de la
autoclave vertical CVAR EV-30 y se esterilizaron a 15 lb/pulg 2 durante 15 minutos
a 121 °C.
6. Se enfrió el medio de cultivo, para obtener una temperatura aproximada de
40°C.
7. En condiciones estériles y de asepsia se vacío el medio en 42 cajas Petri.
8. Se empaquetaron de 10 en 10 en bolsas estériles de polipapel y se rotularon.
9. Se incubaron en el horno RÍOS ROCHA HS4885 a una temperatura de 35°C
durante 24 h como prueba de esterilidad.
10. En las mismas condiciones de esterilidad se revisaron las cajas pasadas la
prueba para comprobar la esterilidad del proceso en la ausencia de
contaminación.

4.3.2 Preparación de solución salina para diluciones.

1. Se realizaron 320 mL de solución salina en un matraz Erlenmeyer de 500 mL
2. Con ayuda de una pipeta de 10 mL se colocaron 9 mL de solución salina en 35
tubos de ensaye con capacidad de 15 mL con rosca Y se les colocó cinta testigo
para la verificación de su esterilización
7. Se metió el paquete a esterilizar en la autoclave vertical CVAR EV-30 a 15
lb/pulg2 de presión por 15 min a una temperatura de 121 °C.
8. Transcurrida la esterilización se colocaron 24 h en una temperatura de 35 a 37
°C para prueba de esterilidad en un horno RÍOS ROCHA HS4885.
9. Pasadas las 24 h se revisan en condiciones de esterilidad que no presenten
turbiedad para su uso posterior.

4.3.3 Diluciones para siembra.

1. En condiciones de esterilidad se tomaron 14 ml de muestra de cada uno de los
matraces y del reactor APPLIKON ADI1012 y se colocaron en tubos con capacidad
de 15 ml previamente esterilizados.

27
2. Se rotuló cada tubo para su identificación y se tomó 1mL de cada tubo.
4. Se realizaron series de diluciones de 10 1 hasta 10 5 (Camacho, 2009)

4.3.4 Siembra en agar nutritivo

1. En condiciones de esterilidad se tomaron 100 µL de la dilución 10 4 y 10 5 de
cada muestra y se procede a la siembra por estría continua con ayuda de un
hisopo previamente esterilizado.
2. Se dejaron las cajas en reposo durante 5 minutos para que se pudiera absorber
la muestra en el agar.
3. Se rotularon las cajas Petri con fecha de siembra, dilución y número de
muestra.
4. Se empaquetaron en paquetes de 10 en 10, en 2 bolsas de poli papel.
5. Se dejaron incubar en el horno RIOS ROCHA HS4885 a 35°C por 24 h.

4.3.5 Conteo de UFC de A. faecalis

1. Se revisaron las cajas Petri despues de las 24 h de incubación en condiciones
de esterilidad.
2. Se contaron las UFC de cada caja.
3. Se inactivaron las cajas que ya fueron usadas en autoclave vertical CVAR EV-
30 a 12 lb/pulg2 de presión por 30 min a 121 ° C.

4.4 Medición de absorbancia para medir la cinética de degradación

1. Se tomaron 3 ml de muestra del día 0, 7, 13, 20, 35 ya reservada para este
procedimiento y se colocaron en vasos de pp de 50 mL
2. Se rotularon los vasos de pp de 50 mL.
3. Se midió la turbiedad del medio por espectrofotometría en un espectrofotómetro
THERMO GENESYS10 VIS a una λ de 620 nm.
4. Se graficaron los resultados obtenidos.

4.5 Cálculo de rendimiento

1. Se tomó el peso de la cantidad de pluma al inicio y al final para obtener los

pesos reales del sustrato, excepto a nivel reactor por pandemia.
2. Se tomó en cuenta el valor de la masa de la bacteria y se realizo la
conversión de UFC a g para poder tener el peso de la biomasa.
3. Se calculó el rendimiento de cada ensayo con ayuda de la siguiente
fórmula:

28
Donde:

Yx/S = Rendimiento célular

ΔX = Biomasa producida
ΔS = Sustrato consumido
X = Biomasa inicial
X0 = Biomasa final
S0 = Sustrato inicial
S = sustrato final

29
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Degradación de plumas

Los resultados muestran que la bacteria Alcaligenes faecalis puede crecer y estar
activa en cajas con agar bacteriológico y también en agar nutritivo, es decir utilizan
la pluma como única fuente de carbono y nitrógeno (Figura 3). Lo anterior es muy
importante ya que se comprobó que además de crecer en agar bacteriológico
también puede estar en agar nutritivo ya que es aislada debido a que ya no se
tuvieron complicaciones para cualquier estudio que se deba realizar
posteriormente dejando nuevas opciones para futuras investigaciones.

Figura 3. Crecimiento de A. faecalis en agar con plumas molidas (polvo de

pluma).
La especie Alcaligenes faecalis presenta un potencial de actividad queratinolítica,
es decir, estos microorganismos producen enzimas (queratinolíticas, también
conocidas como queratinasas) capaces de degradar la queratina (proteasas)
(Chaturvedi et al., 2014). Ya que para su desarrollo utilizaron el sustrato (plumas
de ave) como fuente de carbono y nitrógeno. Esta cepa, fue sometidas a otras
pruebas más específicas para la degradación de queratina, en función de la
liberación de grupos amino libres a fin de analizar su potencial de actividad
queratinolítica.

Algunos autores como Yusuf et al. (2016) Llevaron a cabo la optimización de

fuentes carbono y nitrógeno adicionales (carbono y nitrógeno) durante la

30
degradación de plumas, sin embargo, en algunos casos las fuentes
complementarias de carbono como el manitol o el almidón no presentaron algún
incremento en comparación con el control. La temperatura es un factor clave ya
que el reactor al no tener una temperatura adecuada el proceso de degradación
de plumas de pollo es más lento. Sin embargo, Liu (2014) obtuvo resultados
positivos con la adición de una fuente de carbono extra, lo que redujo el tiempo de
degradación de las plumas. En el presente trabajo no se utilizaron fuentes de
carbono extras a las plumas de pollo, lo que podría significar una reducción de
costos frente a un escalamiento industrial puesto que algunas fuentes de nitrógeno
y carbono extra pueden afectar el objetivo de la producción de enzimas, aunque
también significa el aumento de la eficiencia del proceso de degradación de la
forma realizada se obtienen resultados satisfactorios. Además de las plumas de
pollo solo se adicionó una solución con algunas sales (sales de potasio, sodio,
magnesio y calcio), notamos que un factor realmente importante no son las
fuentes de carbono, si no la temperatura ya que en los 5 matraces presentaron
una degradación total de plumas pero en el reactor la degradación es más lenta ya
que no cuenta con un temperatura establecida y se dejó los 35 días a temperatura
ambiente.

En la figura 4 se ve la apariencia de los matraces, en un inicio era transparente

(día 0), posteriormente cambiaron a un aspecto turbio (día 20). Después de eso se
pudo observar la aparición de un precipitado color crema al fondo de los matraces
(día 35), lo que fue un indicativo de que A. faecalis presenta potencial de actividad
queratinolítica y las plumas aparecen totalmente degradadas.

Testigo A. faecalis + plumas (día 0)

31
 A. faecalis + plumas
(día 20)

A. faecalis + plumas
(día 35)

Figura 4. Degradación de plumas de pollo a nivel matraz.

En Día “20” (Figura 11) del procedimiento de degradación de plumas de pollo,
donde ya no se distinguen las partes de pluma debido a que ya solo queda el
raquis y se aglomeraron las barbas.

32
6.2 Degradación de plumas de pollo (método de esterilización con agua hirviendo
10 min.).

En el ensayo se observó la degradación de las plumas por Alcaligenes faecalis

(Figura 5) con solución salina y 5 g de plumas (fuente de carbono) lavadas con
agua hirviendo. En el testigo se obtuvo un valor máximo de absorbancia de 0.025
y no se observa aumento durante los 20 días del estudio, lo que indica que no
hubo duplicación (crecimiento) de la bacteria y por lo tanto no hubo degradación
de las plumas. La absorbancia que tuvo fue debido al desgaste mecánico que
presentaron las plumas. Lo anterior se puede confirmar con lo observado a simple
vista en la figura 4. En el caso del triplicado con plumas (esterilizadas con agua
hirviendo), se observa una etapa logarítmica a partir del día 0 al 13 con una
absorbancia máxima de 1.767. Posteriormente, se tuvo una etapa estacionaria del
día 14 al 20.

Figura 5. Degradación de plumas de pollo (método de esterilización con agua

hirviendo)

6.3 Degradación de pluma de pollo (método de esterilización por arrastre de

vapor).
Comparando los ensayos de degradación de plumas de pollo con el método de
esterilización por arrastre de vapor (Figura 6), se puede observar que se realiza
una buena degradación de pluma de pollo. Sin embargo, en el método de arrastre
de vapor (M5) no se inoculó con bacteria. Es decir, que el método por arrastre de
vapor permitió el crecimiento de alguna bacteria que soportó la temperatura de

33
121 °C y al estar en contacto con solución salina se dedicó a la biodegradación de
las plumas de pollo. Esto es importante debido a que puede ayudar a escalar a un
nivel industrial o planta piloto, y se podrían reducir gastos ya que no sería
necesario la inoculación de A. faecalis. Sin embargo, se recomienda la
identificación de la bacteria que soportó la temperatura por arrastre de vapor pues
podría ser diferente a la bacteria A. faecalis. También, es necesario investigar más
sobre la posibilidad de una contaminación cruzada.

La estimación de la carga bacteriana de las plumas es un desafío porque las

células pueden estar firmemente unidas a las estructuras de las plumas o dentro
de ellas, lo que puede conducir a subestimar la abundancia microbiana.

Los resultados mostraron que el método de esterilización por arrastre de vapor

permitió que sobrevivieran algunas bacterias con alto potencial de degradación de
plumas de pollo, comparado con el método de esterilización con agua hirviendo.

Figura 6. Comparación de la degradación de plumas de pollo a diferentes

temperaturas esterilizadas por arrastre de vapor

En la figura 6 se compara la degradación de plumas de pollo a diferentes

temperaturas (35°C) y (20-23°C) con las plumas previamente esterilizadas con
arrastre de vapor, en ambos casos se llevó a cabo la degradación de las plumas y
hay crecimiento de la bacteria, sin embargo la degradación de plumas de pollo a
temperatura ambiente (20-23°C) es más lenta debido a que como lo menciona

34
Martínez (2014), las enzimas trabajan a una temperatura óptima y si esta se eleva
o es menor, la actividad de la enzima se verá afectada; en este caso al no tener
una temperatura óptima la velocidad de la degradación es menor que en los
matraces que estuvieron a 35°C. En el reactor se observa una etapa logarítmica
del día 0 al 35, ya que aún no termina el proceso de la degradación, al día 35
presenta un valor máximo de absorbancia de 1.529.

El estudio a nivel reactor indicó que es posible escalar el proceso de degradación

de plumas de pollo y que la temperatura juega un papel muy importante. Se
recomienda realizar un nuevo proceso de degradación a nivel reactor con la
temperatura controlada a 35°C.

Figura 7. Degradación de plumas diferentes métodos de esterilización

El ensayo permitió la comparación entre los dos métodos de esterilización; en la
figura 7 se observa que ambos métodos comienzan con una absorbancia de
0.010. El matraz esterilizado con agua hirviendo tiene una fase logarítmica del día
0 al 13 teniendo una absorbancia máxima de 1.643, y del día 14 al 35 una fase
estacionaria teniendo una absorbancia final de 1.842. El matraz esterilizado por
arrastre de vapor presenta una fase logarítmica del día 0 al 15, teniendo una
absorbancia máxima 2.340, este matraz no fue inoculado con la bacteria de A.
faecallis por lo que se cree que su degradación fue gracias a que una bacteria de
pluma resistió la esterilización y comenzó su proceso natural de degradación
gracias a las condiciones óptimas, El método por arrastre de vapor a nivel reactor

35
tiene una fase logarítmica del día 0 al 35 teniendo una absorbancia máxima 1.529
ya que este aún no termina su proceso de degradación ya que no tenía una
temperatura óptima.

6.4 Conteo en placa de Alcaligenes faecalis

En la figura 8 se observa el crecimiento de las colonias de A. faecalis de los

ensayos a nivel matraz con plumas previamente esterilizadas con agua hirviendo,
se nota una fase logarítmica del día 7 al día 20 y una fase estacionaria del día 21
al día 35, en la muestra con el método con agua hirviendo se tuvo un crecimiento
celular máximo de 7.00 X108 UFC/mL de plumas de pollo.

Jin-Ha et al. (2010) trabajaron con la degradación de plumas de pollo por medio de
una nueva especie de Xanthomonas sp. P5. La degradación de plumas se realizó
a nivel laboratorio en 50 ml de medio basal con diferentes fuentes de carbono y
nitrógeno durante 9 días a 30 ° C y 200 rpm. En el caso de las diferentes fuentes
de carbono, se tuvo un aumento en el crecimiento celular de 1.3x10 8 a 20x108
UFC/mL y con respecto a las diferentes fuentes de nitrógeno el crecimiento celular
aumentó de 1.9x108 a 20x108 UFC/mL; esta cantidad de bacterias fue mayor a la
del presente trabajo ya que se obtuvo un incremento de 1.23 X10 6 a 4 x108 UFC /
mL. La diferencia se debe probablemente a que los autores adicionaron fuente de
carbono y nitrógeno adicionales a la pluma y la agitación fue mayor.

Figura 7. UFC de A. faecalis en la degradación de plumas de pollo (método

de esterilización con agua hirviendo)

36
En la figura 9 y 10 se observa la comparación del crecimiento celular entre el
ensayo a nivel matraz y reactor por el método de esterilización de arrastre de
vapor. A nivel matraz se observa una etapa logarítmica del día 0 al 7 y una etapa
estacionaria del día 8 al día 20, teniendo un valor máximo de crecimiento celular
de 4.10 x108 UFC/mL a 35 °C, en el reactor se nota un crecimiento más alto
teniendo la fase logarítmica del día 7 al 35, con un valor máximo de crecimiento
celular de 3.35 x109 UFC / mL a temperatura ambiente (20 a 24 °C). Pareciera
que la temperatura ambiente no afectara la velocidad de degradación de las
plumas, porque se tiene una alto crecimiento celular, sin embargo, esto se debe a
la cantidad de bacterias inoculadas más que a la velocidad de crecimiento de la
bacteria.

Chaturvedi et al (2013) realizaron un estudio de decoloración y degradación de

plumas con verde de malaquita por medio de Pseudomonas mendocina,
encontraron que el verde de malaquita no fue tóxico para la bacteria y pudo
degradar las plumas. El estudio de degradación se realizó a nivel matraz con 50
mL de medio LB y con un inóculo fijo de 1.2x10 8 UFC/mL y para la determinación
de actividad queratinolítica en 100ml de caldo de harina de pluma con un inóculo
de 1x107 UFC/mL, es decir una cantidad mayor de UFC que las utilizadas en el
presente estudio, que fue de 1.23x106 UFC / mL. Esto es muy importante porque
al escalar el proceso de degradación la cantidad de microorganismo a inocular
implica gastos en la producción. Es decir, el presente trabajo obtuvo buena
degradación con menor cantidad de bacteria comparada con el autor anterior.

Figura 8. UFC en la degradación de plumas de pollo (método por arrastre de

vapor).

37
Dille et al. (2016) trabajaron con una ave llamada junco pizarroso (Junco
hyemalis), del cual obtuvieron bacterias que presentaron capacidad para crecer en
queratina de plumas, lo cual sugiere la capacidad para degradarlas. Ellos midieron
la abundancia de las bacterias a diferentes temperaturas, la mayor carga de
bacterias fue a 25 °C con una cantidad de 1x10 5-1x106 UFC/ gramo de plumas
comparada con el crecimiento a 4 y 37 °C. En el caso del presente estudio se
obtuvo mayor crecimiento a 35°C con 4.04x1010 UFC/ g de pluma.

38
Día “0” Día “35”

A A

B B

C C

D D

39
 E E

F F

G G
Figura 9. Crecimiento celular en día 0 y 35. A. Testigo, B. M1 (Esterilización
con agua hirviendo), C. M2 (Esterilización con agua hirviendo), D. M3
(Esterilización con agua hirviendo), E. M4 (Esterilización con agua
hirviendo), F. M5 (Arrastre de vapor), G. Reactor.

40
 Figura 10. Degradación de plumas de pollo (día 20)

6.5 Rendimiento

Rendimientos:

1.22 x10-4>1.19x10-4>7.86x10-5<1.31x10-5

Ensayo de esterilización por agua hirviendo e inoculado con A. faecallis (M2, M3

yM4); Reactor 3.5L esterilizado con arrastre de vapor e inoculado con A. faecallis;
Matraz de esterilización con arrastre vapor sin inoculación; Matraz testigo de
esterilización de agua hirviendo sin inoculación respectivamente.

Gurav et al. (2016) utilizan la cepa de Klebsiella sp a 140 rpm a 37 °C por 72 h y

obtiene una degradación de 78.65% con un rendimiento del 1.32X10 -7 las
condiciones que utilizan son parecidas a las empleadas en nuestro trabajo a nivel

41
matraz, ya que el rendimiento también es parecido, lo que cambia es la velocidad
en la que esta se efectúa.
Zheng et al. (2019) En su estudio utilizan un cocultivo de B. licheniformis y S.
maltophilia y dice que se tuvo una degradación del 81.8 % y un rendimiento de
1.15x10-6 en 48 horas, utiliza un fermentador de 3L con 50g/L de plumas de pollo
y menciona que el rendimiento es más efectivo gracias a que implementa el
control de la temperatura y el oxígeno disuelto por lo que esto hace más eficaz el
proceso. A diferencia de nuestro estudio en el que se obtuvo 1.19x10 -4, ya que los
días son más debido a que no se tiene un control de temperatura ni se le agrega el
oxígeno disuelto.

42
 VI. CONCLUSIONES

El proceso de degradación de 5 gramos de plumas de pollo fue posible con ambos

métodos de esterilización de las plumas (agua hirviendo y arrastre de vapor).

En el crecimiento celular fue posible cuantificar las UFC de tal manera que a nivel
matraz por el método de esterilización de agua hirviendo se obtuvo un máximo de
crecimiento de 4.77 x108 UFC/mL, y por el método de esterilización por arrastre de
vapor se obtuvo un máximo de crecimiento de 3.05 x10 8 UFC/mL.

El crecimiento celular a nivel reactor se pudo cuantificar aplicando el método de

esterilización por arrastre de vapor dando un crecimiento máximo de 3.35 x10 9
UFC/mL.

Se obtuvo satisfactoriamente el rendimiento de la biomasa, a nivel matraz por el

método de esterilización de agua hirviendo sin inocular se obtuvo un rendimiento
de 1.31x10-5, a nivel matraz de esterilización de agua hirviendo inoculado con A.
faecallis se obtuvo un rendimiento de 1.22 x10 -4, a nivel matraz con el método de
esterilización por arrastre de vapor sin inocular se obtuvo un rendimiento de
7.86x10-5 y a nivel reactor de 3.5L esterilizado por el método de arrastre de vapor
se obtuvo un rendimiento de 1.19 x10 -4, teniendo mayor rendimiento en el ensayo
a nivel matraz por esterilización de agua hirviendo inoculado con A. faecallis,
debido a que el reactor no obtuvo su mayor degradación por pandemia.

43
 VII. REFERENCIAS

 Agrahari S., Neeraj W., (2010). Degradation of chicken feather a poultry

waste product by keratinolytic bacteria isolated from dumping site a
Ghazipur poultry processing plant. International journal of poultry science.
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procesos biológicos. Pp 34, 56-62.
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Quintanar Duarte, ed. Química de los Alimentos. Biblioteca Escuela Técnica
Josefa Capdevila 4-005 96 San Martin Mendoza: Pearson Educación. p.
121.
 Bragulla H., Homberg D., (2009). Structure and functions of keratin proteins
in simple, stratified, keratinized and cornified epithelia. Department of
Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University. pp 267:270.
 Camacho, A. (2009). Técnica para el análisis microbiológico. 2ª ed.
Facultad de química, UNAM. México pp 4-5.
 Chaturvedi, V., Khushboo, B., Renu, B., y Pradeep, V. (2014).
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 Cui H., Li W., Li C., Lin L., (2016). Intelligent release of cinnamon oil from
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 Diario Oficial de la Federación.
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46
 VIII. ANEXOS

8.1 Elaboración agar plumas en cajas Petri

1. Se realizaron 450 mL de agar plumas en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Con
las siguientes cantidades:
• 0.25 g de cloruro de amonio
• 0.25 g de cloruro de sodio
• 0.05 g de cloruro de magnesio hexahidratado
• 0.15 g de fosfato monobásico de potasio
• 0.2 g de fosfato dibásico de potasio
• 0.05 g de extracto de levadura
• 500 mL de agua de garrafón.
• 10 g agar bacteriológico
• 1 g plumas molidas
2. Se mezclaron todos los reactivos en un matraz Erlenmeyer y calentaron con
ayuda del mechero, procurando eliminar todos los grumos.
3. Se colocó una muñeca y su respectivo gorro de aluminio en la boca del matraz,
de tal manera que lo cubriera perfectamente para evitar la entrada de un agente
externo al medio de cultivo.
4. Se colocó cinta testigo en la parte inferior del gorro de aluminio, de manera que
quedara sujetada al matraz.
5. Se situó el matraz en 2 bolsas de poli papel y se colocó dentro de la autoclave
vertical CVAR EV-30 y se esterilizó a 15 lb/pulg 2 durante 15 minutos a 121 °C.
6. Se enfrió el matraz con el medio de cultivo, para obtener una temperatura
aproximada de 40°C.
7. En condiciones estériles y de asepsia, se vaciaron en 30 cajas Petri
aproximadamente 15 mL de medio de cultivo agar pluma.
8. Se empaquetaron de 10 en 10 en bolsas estériles de poli papel y se rotularon.
9. Se incubaron en el horno RIOS ROCHA HS4885 a una temperatura de 35°C
durante 24 hrs como prueba de esterilidad.
10. En las mismas condiciones de esterilidad se revisaron las cajas pasadas la
prueba para comprobar la esterilidad del proceso en la ausencia de
contaminación.

8.2 Activación de A. faecalis en agar plumas

1. En condiciones estériles, se inoculó A. faecalis por estriado continuo con ayuda
de un asa bacteriológica previamente esterilizada a 121°C por 15 min a 15 lb/pulg 2
de presión, en 14 cajas Petri con agar plumas
2. Se dejó libre de bacterias 1 caja Petri con medio de cultivo para ser utilizadas
como testigo.

47
4. Se empaquetaron nuevamente las cajas Petri correspondientes de cada
bacteria y se rotularon.
5. Se incubaron en horno RIOS ROCHA HS4885 a una temperatura de 35°C
durante 72 hrs.

8.3 Proceso de degradación de plumas de pollo a escala matraz

1. Se preparó el medio de cultivo de plumas para la bacteria a inocular (A.
faecalis) a modo de caldo en 5 matraces Erlenmeyer de 1 L. con las siguientes
cantidades:
• 0.25 g de cloruro de amonio
• 0.25 g de cloruro de sodio
• 0.05 g de cloruro de magnesio hexahidratado,
• 0.15 g de fosfato monobásico de potasio
• 0.2 g de fosfato dibásico de potasio
• 500 mL de agua de garrafón.
2. Paralelamente se realizó una solución salina para fungir como blanco con las
mismas proporciones de reactivo para 150 mL de solución preparado en un
matraz Erlenmeyer de 250 mL.
3. Una vez que se prepararon los 5 matraces Erlenmeyer de caldo de cultivo y el
blanco, se homogenizó perfectamente y se colocaron las muñecas y sus
respectivos gorros de aluminio en las bocas de los matraces, de tal manera que
los cubrieran perfectamente para evitar la entrada de un agente externo al medio
de cultivo.
4. Se colocó cinta testigo en la parte inferior de los gorros de aluminio de cada
matraz, de manera que quedara sujetada a los matraces.
5. Se situó cada matraz en 2 bolsas de polipapel.
6. Se colocaron 4 matraces de 1 L con el medio de cultivo de plumas y el testigo
que contenía la solución salina, dentro de la autoclave vertical CVAR EV-30 y se
dejaron esterilizar a 15 lb/pulg2 durante 15 minutos a 121 °C.
7. Se colocó el otro 2 matraz restante, dentro de la autoclave vertical CVAR EV-30
y se dejó esterilizar por arrastre de vapor durante 1 hora a 121 °C.
8. Pasado el tiempo de esterilización de los medios de cultivo, se refrigeraron los
matraces a una temperatura entre 4 y 8°C durante 24 horas, para su uso posterior.

8.4 Proceso de degradación de plumas de pollo a escala reactor APPLIKON

ADI1012.
1. Se preparó el medio de cultivo de plumas para la bacteria a inocular (A.
faecalis) a modo de caldo en un reactor APPLIKON ADI1012 de 3 L con las
siguientes cantidades:
• 1.5 g de cloruro de amonio

48
• 1.5 g de cloruro de sodio
• 0.3 g de cloruro de magnesio hexahidratado,
• 0.9 g de fosfato monobásico de potasio
• 1.2 g de fosfato dibásico de potasio
• 3000 mL de agua de garrafón.
2. Una vez preparado el medio se colocó en la autoclave vertical CVAR EV-30
para su esterilización por arrastre de vapor durante 1 hora a 121°C.

8.5 Ensayo con esterilización de agua hirviendo (absorbancias)

Tabla 2. Testigo de degradación de pluma de pollo por esterilización de

agua hirviendo (M1).
Muestra Días Fecha Absorbancias (620 nm) Promedio Desviación

Testigo 0 28/01/2020 0.018 0.018 0.018 0.018 0.000

(M1) 7 04/02/2020 0.022 0.021 0.021 0.021 0.001
13 10/02/2020 0.024 0.025 0.026 0.025 0.001
20 17/02/2020 0.026 0.025 0.024 0.025 0.001
35 03/03/2020 0.025 0.022 0.028 0.025 0.003

Tabla 3. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo

(M2).
Muestra Días Fecha Absorbancias (620 nm) Promedio Desviación

A. faecalis + 0 28/01/2020 0.021 0.023 0.025 0.023 0.002

pluma 7 04/02/2020 0.836 0.836 0.835 0.836 0.001
lavada en 13 10/02/2020 1.528 1.524 1.527 1.526 0.002
agua
20 17/02/2020 1.63 1.63 1.634 1.631 0.002
hirviendo.
(M2) 35 03/03/2020 1.851 1.855 1.857 1.854 0.003

Tabla 4. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo

(M3).
Muestra Días Fecha Absorbancias (620 nm) Promedio Desviación

A. faecalis + 0 28/01/2020 0.055 0.058 0.06 0.058 0.003

pluma 7 04/02/2020 1.183 1.184 1.182 1.183 0.001
lavada en 13 10/02/2020 1.767 1.766 1.768 1.767 0.001

49
 agua 20 17/02/2020 1.443 1.42 1.44 1.434 0.013
hirviendo. 35 03/03/2020 2.098 2.056 2.093 2.082 0.023
(M3)

Tabla 5. Degradación de pluma de pollo por esterilización agua hirviendo

(M4).
Muestra Días Fecha Absorbancias (620 nm) Promedio Desviación

A. faecalis + 0 28/01/2020 0.035 0.034 0.034 0.034 0.001

+ pluma 7 04/02/2020 0.729 0.736 0.728 0.731 0.004
lavada en 13 10/02/2020 1.632 1.637 1.638 1.636 0.003
agua
20 17/02/2020 1.541 1.545 1.545 1.544 0.002
hirviendo.
(M4) 35 03/03/2020 1.585 1.592 1.587 1.588 0.004

8.6 Ensayo con esterilización de arrastre de vapor (absorbancias)

Tabla 6. Degradación de pluma de pollo por esterilización de arrastre de

vapor (M5).
Muestra Días Fecha Absorbancias (620 nm) Promedio Desviación

plumas 0 28/01/2020 0.102 0.111 0.11 0.108 0.005

esterilizadas 7 04/02/2020 1.485 1.484 1.483 1.484 0.001
por arrastré 13 10/02/2020 2.332 2.346 2.342 2.340 0.007
de vapor
20 17/02/2020 1.89 2.65 2.314 2.285 0.381
(M5)

Tabla 7. Degradación de pluma de pollo en reactor (3.5L) por esterilización

de arrastre de vapor.
Muestra Días Fecha Absorbancias (620 nm) Promedio Desviación

A. faecalis + 0 28/01/2020 0.11 0.111 0.111 0.111 0.001

plumas 7 04/02/2020 0.597 0.597 0.571 0.588 0.015
esterilizadas 13 10/02/2020 0.886 0.886 0.888 0.887 0.001
por arrastre
20 17/02/2020 1.125 1.123 1.128 1.125 0.003
de vapor.
(Reactor 3.5 35 03/03/2020 1.528 1.529 1.529 1.529 0.001
L)

50
8.7 Ensayo con esterilización de agua hirviendo (UFC)

Tabla 8. Testigo de degradación de pluma de pollo por esterilización de

agua hirviendo (M1).
Muestra Días Fecha UFC (mL) Promedio Desviación

Testigo 0 28/01/2020 0 0 0 0
(M1) 7 04/02/2020 6.00x106 6.00x106 6.00x106 0
20 17/02/2020 3.90x107 4.00x107 3.95x107 7.07x105
35 03/03/2020 5.20x107 5.00x107 5.10x107 1.41x106

Tabla 9. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo

(M2).
Muestra Días Fecha UFC (mL) Promedio Desviación

A. faecalis 0 28/01/2020 1.23x106 1.23x106 1.23x106 0

+ pluma
lavada en 7 04/02/2020 1.19 x106 1.15 x106 1.17 x106 2.83 x104
agua 20 17/02/2020 7.00 x108 6.00 x108 6.50 x108 7.07 x107
hirviendo. 35 03/03/2020 7.20 x108 6.80 x108 7.00 x108 2.83 x107
(M2)

Tabla 10. Tabla 11. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua
hirviendo (M3).
Muestra Días Fecha UFC (mL) Promedio Desviación

A. faecalis 0 28/01/2020 1.23x106 1.23x106 1.23x106 0.00

+ pluma
lavada en 7 04/02/2020 1.23 x107 1.21 x107 1.22 x107 1.41 x105
agua 20 17/02/2020 3.40 x108 3.50 x108 3.45 x108 7.07 x106
hirviendo. 35 03/03/2020 4.20 x108 3.90 x108 4.05 x108 2.12 x107
(M3)

Tabla 12. Degradación de pluma de pollo por esterilización de agua hirviendo

(M4).

51
 Muestra Días Fecha UFC (mL) Promedio Desviación
6 6 6
A. faecalis + 0 28/01/2020 1.23x10 1.23x10 1.23x10 0.00
+ pluma
lavada en 7 04/02/2020 3.00 x107 3.10 x107 3.05 x107 7.07 x105
agua 20 17/02/2020 1.20 x108 1.30 x108 1.25 x108 7.07 x106
hirviendo. 35 03/03/2020 3.20 x108 3.30 x108 3.25 x108 7.07 x106
(M4)

8.8 Ensayo con esterilización por arrastre de vapor (UFC)

Tabla 13. Degradación de pluma de pollo por esterilización de arrastre de

vapor (M5).
Muestra Días Fecha UFC (mL) Promedio Desviación

plumas 0 28/01/2020 0.00 0.00 0.00 0.00

esterilizadas 7 04/02/2020 4.20 x108 4.00 x108 4.10 x108 1.41 x107
por arrastré 20 17/02/2020 3.00 x108 3.10 x108 3.05 x108 7.07 x106
de vapor
(M5)

Tabla 14. Degradación de pluma de pollo en reactor (3.5L) por esterilización

de arrastre de vapor.
Muestra Días Fecha UFC (mL) Promedio Desviación

A. faecalis + 0 28/01/2020 6.15 x106 6.15 x106 6.15 x106 0.00

plumas 7 04/02/2020 5.80 x107 6.20 x107 6.00 x107 2.83 x106
esterilizadas 20 17/02/2020 9.30 x108 9.25 x108 9.28 x108 3.54 x106
por arrastre
35 03/03/2020 3.20 x109 3.50 x109 3.35 x109 2.12 x108
de vapor.
(Reactor 3.5
L)

8.9 Rendimiento

Donde:

Yx/S = Rendimiento célular

52
ΔX = Biomasa producida
ΔS = Sustrato consumido
X = Biomasa inicial
X0 = Biomasa final
S0 = Sustrato inicial
S = sustrato final

8.9.1 Matraz testigo de esterilización de agua hirviendo (M1)

Datos:

X0 = 0 UFC
X = 5.10 x107 UFC
S0 = 4.8g de pluma de pollo
S = 0.92g de pluma

Para conversión: 1 UFC = 1x10-12 g

Formula:

Para conversión de UFC a g:

Para rendimiento:

Sustitución:

53
Rendimiento:

8.9.2 Rendimiento de triplicado de matraz inoculado con A. faecallis y esterilizado

con agua hirviendo. (M2, M3 y M4)

Datos:

X0 = 1.23 x106 UFC

X = 4.77 x108 UFC
S0 = 4.8g de pluma de pollo
S = 0.92g de pluma

Datos para conversión de UFC a g:

1 UFC = 1x10-12g

Fórmula para conversión de UFC a g:

Fórmula para rendimiento:

Sustitución:

54
Rendimiento:

8.9.3 Rendimiento a nivel matraz con esterilización por arrastre de vapor (M5)

Datos:

X0 = 0 UFC
X = 3.05 x108 UFC
S0 = 4.8 g de pluma de pollo (100%)
S = 0.92 g de pluma (20 %)

Dato para la conversión de UFC a g:

1 UFC = 1x10-12 g

Fórmula para conversión de UFC a g:

Fórmula para calcular rendimiento:

Sustitución:

55
Rendimiento:

8.9.4 Rendimiento a nivel reactor (3.5L) con esterilización por arrastre de vapor

Datos:

X0 = 6.15 x106 UFC

X = 3.35 x109 UFC
S0 = 35g de pluma de pollo (100%)
S = 7g de pluma (20 %)

Dato para conversión de UFC a g:

1 UFC = 1 x10-12g

Fórmula para la conversión de UFC a g:

56
Fórmula para calcular el rendimiento:

Sustitución:

Rendimiento:

57