UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de Biología
Semestre 2022

GUÍA DE PRÁCTICAS DE VIROLOGÍA

CURSO: VIROLOGÍA

PROFESOR: BLGO. MIGUEL COBOS ZELADA

AÑO: 2023
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 PRACTICA Nº1

TEMA: SOLUCIONES DESINFECTANTES EN VIROLOGÍA

DESINFECTANTES QUÍMICOS

Las fórmulas de los productos desinfectantes comerciales presentan grandes diferencias, por lo
tanto, las diluciones se deben realizar siguiendo las instrucciones del fabricante.

CLORO: HIPOCLORITO SÓDICO

El cloro es un desinfectante universal activo contra todos los microorganismos. En general se
utiliza en forma de hipoclorito sódico, las presentaciones comerciales tienen distintas
concentraciones de cloro libre. Es un enérgico agente oxidante, corrosivo para los metales. Las
soluciones de hipoclorito pierden progresivamente su actividad, por lo que es necesario preparar
diariamente las soluciones.
Como solución desinfectante para toda clase de trabajos de laboratorio, se utiliza a la
concentración de 1 g/litro (1000 ppm de cloro libre). Se recomienda utilizar soluciones de
hipoclorito sódico con una concentración de 5 g/litro (5000 ppm de cloro libre) como
desinfectante de elección en situaciones de urgencia provocadas por virus ,tales como los virus
de Lassa y Ebola.
Numerosas soluciones de hipoclorito sódico vendidas para uso industrial y de laboratorio
contienen 50 g/litro (50 000 ppm de cloro libre) y por consiguiente deben diluirse a razón de 1:50
ó 1:10 para obtener concentraciones finales de 1 g/litro y 5 g/litro, respectivamente.
Las lejías domésticas suelen contener 50 g/litro (50 000 ppm de cloro libre) y en consecuencia
deben diluirse a la concentración de 1: 10 a 1: 50 para emplearlas.

Formaldehido
El formaldehído es un gas activo contra todos los microorganismos excepto a temperaturas
inferiores de 20°C. Se adquiere comercialmente en forma de un polímero sólido o de tabletas
denominado paraformaldehído , o como formol en agua a la concentración de aproximadamente
370 g/litro (37%) y que contiene metanol (100 ml) como estabilizador.
El formaldehído a la concentración de 18,5 g/litro (formol al 2 % en agua) puede utilizarse como
desinfectante líquido y se recomienda su uso contra los virus en general.
Para fines de descontaminación de ambientes se utiliza 0.3 gr/pie 3 de formol mantenido 37° por
8 horas a 24 °C o T.A. (1 m3 = 35.3147 pie3)

Nota: El formaldehído es un agente cancerígeno.

Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son activos contra todas las formas vegetativas de microorganismos,
pero no contra las esporas. Su actividad frente a los virus lipídicos es variable. Los compuestos
fenólicos son la base de cierto número de desinfectantes corrientes, pueden emplearse cuando
no se dispone de hipoclorito, diluyéndolos de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

Alcohol y mezclas alcohólicas

El etanol (alcohol etílico) y el 2-propanol (alcohol isopropílico) tienen análogas propiedades
desinfectantes. Son activos contra las bacterias vegetativas, los hongos y los virus lipídicos, pero
no contra las esporas Su acción contra los virus no lipídicos es variable. Para alcanzar su

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máxima eficacia deben utilizarse en soluciones acuosas al 70% aproximadamente, las
soluciones más concentradas o más diluidas pueden ser igualmente germicidas.
Las mezclas con otros productos son más eficaces que el alcohol solo, por ejemplo, alcohol al
70% que contiene 100 g de formaldehido por litro o alcohol que contiene 2 g/litro (2000 ppm) de
cloro libre

Yodo y yodóforos
La acción de estos desinfectantes es parecida a la del cloro. Las superficies limoias pueden
tratarse eficazmente con soluciones que contengan 0,075 g/litro (75ppm) de yodo libre.
Los yodóforos pueden diluirse en etanol para el lavado de manos como esporicida. Se considera
que una concentración de 0,45 g/litro (450 ppm) de yodo libre es eficaz contra los virus de Lasa
y Ebola.

CUESTIONARIO

1. SEÑALE 5 EJEMPLOS DE AGENTES ETIOLÓGICOS VIRALES PARA CADA UNO DE

LOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1, 5 EJEMPLOS PARA NIVEL DE BIOSEGURIDAD
2, 3, 4.
2. SEÑALE LAS DIFERENTES CLASES Y TIPOS DE CABINA DE FLUJO LAMINAR
(CABINAS DE BIOSEGURIDAD) CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES.
3. LOS LABORATORIOS DE UNA UNIVERSIDAD QUE NIVEL DE BIOSEGURIDAD DEBE
CONTAR.

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 PRÁCTICA Nº2

TEMA: PREPARACIÓN DE REACTIVOS: SOLUC. STOCK 10 X HANKS O EARLE Y

P.B.S., SOLUCIONES E. INDICADORES DE PH, SOLUC. DE BICARBONATO Y
MEDIO DE CULTIVO MEM EAGLE CON SALES HANKS O EARLE

PREPARACION DE SOLUCIONES BUFFERADAS

INTRODUCCIÓN
Muchas de las reacciones químicas que se producen en solución acuosa necesitan que el pH
del sistema se mantenga constante, para evitar que ocurran otras reacciones no deseadas. Las
soluciones ""reguladoras"" o Buffer son capaces de mantener de acidez o basicidad de un
sistema dentro de un intervalo reducido de pH, por lo cual tienen múltiples aplicaciones, tanto en
la industria como en los laboratorios.
Esta práctica de laboratorio tiene como propósito reforzar en el estudiante el concepto de lo que
son soluciones buffer, además de ayudar a los estudiantes a familiarizarse con la resistencia que
estas soluciones poseen en cuanto al ph.
Así mismo, se puede obtener una solución reguladora haciendo reaccionar parcialmente por
(neutralización) un ácido débil con una base fuerte. o un ácido fuerte con una base débil. Una
vez formada la solución reguladora, el pH varia poco por el agregado de pequeñas cantidades
de ácido fuerte ó de una base fuerte, y pierde su capacidad reguladora por el agregado de agua
(disolución).La disolución no cambia el pH de la solución Buffer pero disminuye
considerablemente su capacidad reguladora.
En general puede decirse que esta práctica tiene como propósito la comprensión de las
adiciones de ácidos y sales a estas soluciones.

MARCO TEÓRICO
Las soluciones buffers, son soluciones que resisten cambios de su pH. Estas soluciones
mantienen constante el pH cuando se adicionan pequeñas cantidades de ácidos o bases. El
control del pH es importante en numerosas reacciones químicas, en los sistemas biológicos y en
muchas otras aplicaciones. El cambio del pH de la sangre en 0,5 unidades puede resultar fatal,
pero la sangre es una solución buffer. El agua no es un buffer y la simple adición de una gota de
HCl 1M a un litro de agua cambia el pH de 7,0 a 4,3. Así pues, un buen control del pH es esencial.
Una solución buffer debe contener un ácido débil y una sal de éste ácido; por ejemplo ácido
acético/acetato de sodio, donde el CH3COOH es el ácido y el Ion CH3COO- es la base o una
base débil y una sal de ésta base; por ejemplo amoníaco/cloruro de amonio, donde el NH3 es la
base y el Ion NH4+ es el ácido. Las soluciones buffers trabajan removiendo los iones H+ o los
iones OH- de la solución.
El intervalo de pH para el cual un sistema buffer regula adecuadamente es: pKa – 1 < pH < pKa
+1
El sistema buffer más adecuado es aquel cuyo valor de pKa esta lo más cerca posible del pH
que se desea regular.

Preparación de Phosphate Buffered Saline (PBS)

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La Solución Salina Amortiguada por Fosfatos (PBS) constituye una solución amortiguadora de
pH comúnmente empleada para procedimientos bioquímicos. Su osmolaridad y concentración
de iones (Cl-, Na+ y K+) es muy semejante a la del líquido extracelular de los mamíferos. Esta
solución se prepara a partir de Cloruro de Sodio, Fosfato de Sodio y, en algunas formulaciones,
con Fosfato de Potasio. Esta solución es isotónica y no-tóxica para las células de los mamíferos.
El PBS se emplea como vehículo neutro para células, ya que no modifica el perfil de expresión
y funcionamiento celular normal. Esta solución es empleada comúnmente para lavar células a
través de centrifugación. El PBS puede ser empleado como diluyente para métodos de
desecación de biomoléculas, ya que las moléculas de agua presentes en el PBS se adhieren
alrededor de la biomolécula permitiendo inmovilizarla a una superficie sólida. Esta monocapa de
agua evita que la biomolécula sea desnaturalizada (o sufra modificaciones conformacionales) en
el proceso de desecación. Los amortiguadores a base de carbonatos también son empleados para
este procedimiento, aunque con menor éxito. El PBS también es empleado como referencia
espectral para procedimientos de elipsometría por absorción proteica El PBS puede ser
complementado con aditivos para procedimientos específicos. La adición de EDTA, por ejemplo,
permite disgregar células cuando estas forman agregados. La incorporación de Zinc, no
obstante, no es recomendada ya que provoca la precipitación de otras sales constituyentes.

Procedimiento:

1. Prepare 100 mL de Acido Clorhídrico 1M (1M HCl) agregando 8.62 mL de HCl concentrado a
91 mL de dH20 previamente colocados en un vaso de precipitados de 250 mL. ¡No agregar el
agua al ácido! Mezcle en una plancha agitadora magnética durante 5 minutos. Afore a 100 mL
con dH20.
2. Prepare 100 mL de Hidróxido de Sodio 10M (10M NaOH) agregando 40 g de NaOH a 40 mL
de dH20 previamente colocados en un vaso de precipitados de 250 mL. Mezcle con una barra
magnética en una plancha agitadora hasta que el NaOH se haya disuelto por completo. Afore a
100 mL con dH20. ¡Precaución, esta reacción es exotérmica!
3. Añada las sales (ver nota #1) a un vaso de precipitados adecuado para el volumen de la
solución por preparar. De acuerdo a la Tabla de Preparación mostrada a continuación.
4. Añada el 80% del volumen de dH20 requerido y mezcle encima del agitador magnético hasta
diluir las sales.
5. Ajuste el pH a 7.4 con 1M HCl o 10M NaOH (según sea necesario) empleando para ello una
pipeta de transferencia de plástico (ver nota #2) mientras se monitorea el pH. Añada las
soluciones de HCl o NaOH gota a gota.
6. Afore la solución con dH20 al volumen final requerido.

Standard Operating Procedures (SOPs) Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de

Medicina UASLP
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to copy, distribute, display and make derivative works based on this document, including
commercial use, as long as they credit the author as “Laboratorio de Genomica Viral y Humana,
Facultad de Medicina UASLP”.
7. Filtre la solución a través de unidades de filtración o discos de 0.45 µm para eliminar partículas
suspendidas.
8. Esterilice en autoclave.
9. Dentro del Gabinete de Seguridad Biológica (GSB) y bajo técnica aséptica, distribuya
alícuotas de 50 mL en tubos cónicos esterilizados.
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10. Almacene a temperatura ambiente (uso rutinario) o bajo refrigeración entre 4 y 8 °C.

Tabla de preparación
1x Cf 250 ml 500 ml 1000 ml 10 x Cf 250 ml 500 ml 1000 ml
138 1.380
Na Cl mM 2.015 g 4.03 g 8.06 g Na Cl mM 20.15 g 40.3 g 80.6 g
K Cl 3 mM 0.015 g 0.11 g 0.22 g K Cl 30 mM 0.15 g 1.1 g 2.2 g
Na2HPO4 8.1 mM 0.2815 g 0.575 g 1.15 g Na2HPO4 81 mM 2.815 g 5.75 g 11.5 g
1.5
KH2PO4 mM 0.015 g 0.10 g 0.20 g KH2PO4 15 mM 0.15 g 1.0 g 2.0 g
cbp 250 cbp 500 cbp cbp 250
d H 2O ,,,,,,,,,,,, ml ml 1000 ml d H 2O ,,,,,,,,,,,, ml cbp 500 ml cbp 1000 ml

Notas
1. Limpie perfectamente bien la balanza con la brocha para evitar el acarreo de contaminantes
y la corrosión de la balanza o de las superficies de acero inoxidable.
2. Las soluciones 10X de PBS poseen un pH ~6.8 que se corrige automáticamente a pH 7.4 una
vez llevadas a 1X. Por ello en el caso de las soluciones 10X, no es necesario ajustar el pH sino
hasta que son llevadas a 1X. Las soluciones 1X no presentan variaciones de pH dependientes
de temperatura.

Referencias

1. Dulbecco R, Vogt M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis
viruses. J Exp Med. 1954 Feb;99(2):167-82.

Standard Operating Procedures (SOPs) Laboratorio de Genómica Viral y Humana

Facultad de Medicina UASLP.

2. Wikipedia contributors. Phosphate Buffered Saline. Wikipedia, The Free

Encyclopedia. May 23, 2008, at 03:30 UTC. Available at:
http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline .

3. The Lab Rat.com 1X/10X Phosphate Buffered Saline (PBS) Recipe .

http://www.thelabrat.com/protocols/3.shtml and 4.shtml.

PRÁCTICA Nº 3
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7
8
FIG. 13

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 PRACTICA Nº 4

B) TEMA: PREPARACIÓN DE MEDIO DE TRANSPORTE PARA OBTENCIÓN

DE MUESTRAS. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE
MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL: HECES, ORINA, LCR, HISOPADO
DE GARGANTA

1. El diagnóstico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se realice
la toma, manejo y envío de muestras siguiendo al detalle las instrucciones al respecto.
2. La interpretación del resultado del laboratorio debe estar apoyado por un buen
diagnóstico clínico y los antecedentes epidemiológicos del caso.
3. La muestra para aislamiento de agentes infecciosos debe ser tomada ANTES de
instaurar la terapia con antimicrobianos.

4. La muestra debe identificarse utilizando una cinta de tela adhesiva, escrita con LAPIZ,
donde se incluya todos los datos relevantes del caso: nombre completo o clave,
diagnóstico presuntivo, fecha de toma y tipo de muestra indicando si es 1a, 2a o 3a.
5. La muestra debe acompañarse siempre de un resumen clínico del caso y sus
antecedentes, así como de cualquier dato epidemiológico relevante.

ENVIO DE MUESTRAS
1. Hay que verificar que todas las muestras estén identificadas con los datos relevantes del
caso, tal como ya se indicó en las consideraciones generales al inicio de esta sección.
2. Los frascos, viales, tubos, etc, deben estar tapados lo más herméticamente posible,
colocando bien las tapas y tapones los cuales se asegurarán con tela adhesiva.
3. Cuando se manden varios tubos se aseguran con ligas y se colocan en bolsas cerradas.
4. Los frascos se colocan en bolsas de plástico resistentes y herméticamente cerradas.
5. Las laminillas se deben enviar secas, envueltas individualmente en papel de China y
cada una estar bien identificada con un número o el nombre del paciente.
6. Para el envío, las muestras se colocan en cajas térmicas resistentes empaquetandolas
con relleno de papel, plástico o madera (viruta), para amortiguar los golpes.
7. Si se envían por avión asegurarse que el paquete viaje en el área presurizada para evitar
la pérdida (evaporación) de los especímenes.
8. No olvidar que las muestras deben estar acompañadas de una carta u oficio en el que se
especifique claramente que tipo de prueba se solicita y un resumen clínico enfatizandola
fecha de inicio del padecimiento y la fecha de la toma de la muestra, edad y sexo, estos
documentos (original y copia), se colocan dentro del paquete en una bolsa de plástico
sellada para evitar la pérdida de esta información. Debe verificarse que el nombre de la
muestra sea el mismo en oficio y resumen clínico. Escribir con letra de molde, de
preferencia a máquina y enviar en original. Que la cantidad de muestra enviada sea de
acuerdo a los estudios solicitados. Indicar en el paquete en un lugar visible si éstecontiene
muestras de cólera, rabia, poliomielitis, aguas residuales, citología, paludismo, VIH etc.
9. Las muestras se remiten lo más pronto posible después de obtenidas para organizar su
adecuada preservación.10. Es conveniente que se informe del envío al departamento de

10
 recepción de muestras del INS al teléfono 4719920, indicando la forma, el número de
guía y si es a domicilio u ocurre.

LAS MUESTRAS SE ENVIAN A:

LABORATORIO DE REFERENCIAL DE SALUD

AREA DE RECEPCION DE MUESTRAS
DIRECCION:
……………………….
………………………

Tel: …………………
Fax: ………………..

A continuación se describen, en ORDEN ALFABETICO, los procedimientos adecuados de toma

y envío de muestras clínicas (M) para diagnóstico y referencia.

PROCEDIMIENTOS
M1. EXPECTORACION (ESPUTO)
M2. EXUDADO CUTANEO
M3. EXUDADO FARINGEO
M4. EXUDADO NASOFARINGEO
M5. EXUDADO URETRAL
M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL
M7. FROTIS SANGUINEO
M8. GARGARISMO
M9. GOTA GRUESA
M10. HEMOCULTIVO
M11. HISOPO RECTAL
M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS
M13. LAVADO FARINGEO
M14. LAVADO GASTRICO
M15. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)
M16. LIQUIDO PLEURAL
M17. MATERIA FECAL
M18. MEDULA OSEA
M19. ORINA
M20. RASPADO DE LESIONES Y/O COSTRAS
M21. SANGRE TOTAL
M22. SUERO
M23. OTRAS MUESTRAS

M1. EXPECTORACION (ESPUTO)

Toma: En un frasco de plástico combustible, con capacidad de 30 a 50 mL, de boca ancha y
estéril, se recogen unos 5 mL de expectoración del paciente. Para el aislamiento de agentes
microbianos de infección respiratoria aguda, la muestra debe satisfacer un control de calidad
consistente en el recuento celular a seco débil de 25 campos, en busca de la presencia promedio
de no más de 10 células epiteliales y más de 25 polimorfonucleares por campo; en caso de no
cumplir con estos valores se solicita otra muestra.
En los casos de sospecha de tuberculosis sólo hay que cuidar que la muestra sea mucopurulenta
y esté libre de saliva; se toman 3 muestras: una es cuando se produce tos, otra se toma en la

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mañana cuando despierta el paciente y una más al hacer la entrega de las muestras en el
laboratorio.
Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con refrigerante.

M2. EXUDADO CUTANEO

Toma: Con un hisopo de algodón se toma una porción del exudado, evitando que sea muy
superficial. Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre, agar
chocolate, PAI, etc) o se inocula en el medio de transporte de Stuart.
Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con un refrigerante.

M3. EXUDADO FARINGEO

Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se ilumina bien la
cavidad orofaríngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el
acceso a la parte posterior de la faringe. Con un hisopo de algodón se hace un raspado de las
áreas hiperémicas, purulentas o necróticas, así como de las membranas o manchas de Koplic,
si es que las presenta.
Envío:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con
1 a 2 ml de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón
y se tapa herméticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con
medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa
herméticamente.

M4. EXUDADO NASOFARINGEO

Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se introduce un hisopo
de alginato de calcio, dacrón o nylon (nunca de algodón en caso de sospechar Bordetella) por
las fosas nasales hasta la nasofaringe, sin tocar los cornetes y tratando de producir un acceso
de tos. El hisopo se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso de tos, después de lo
cual se retira rápidamente.
Envío: Si la muestra no se va a procesar de inmediato, el hisopo se mantiene en un medio de
transporte y se envía de inmediato con refrigerante:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 0.5 mL
de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa
herméticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con
medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa
herméticamente.

M5. EXUDADO URETRAL

Toma: Se recomienda al paciente que no orine por lo menos una hora antes de tomar la muestra.
En casos de gonorrea, cuando se produce un exudado abundante, se presiona ligeramente la
uretra con el fin de que lo expulse y éste se recoge con un hisopo de alginato estéril el cual se
deposita en el medio de transporte de Stuart. Cuando se sospecha de una infección por clamidia,
se emplea un hisopo de alginato de calcio adecuado para toma de muestras en varones, el cual
se introduce unos 2 a 4 cm en la uretra y se frotan las paredes haciendo girar el hisopo durante
5 a 10 segundos; con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios
que se fijan con acetona.
Envío: El tubo y las preparaciones se envía lo antes posible de modo que no lleguen al laboratorio
después de 24 horas.

M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL

Toma: Se utiliza un espejo vaginal para revisar el cérvix.

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En caso de gonorrea no se hace ningún tipo de limpieza y se recoge una muestra de exudado
con ayuda de un hisopo; la muestra se debe sembrar de inmediato en la placa de agar de Thayer
Martin y sólo que ésto no sea posible, se puede transportar en medio de Stuart.
Cuando se sospecha de infección por clamidias, se limpia el exocérvix con un hisopo de algodón
para eliminar el moco y el exudado, se introduce el hisopo (de alginato de calcio o de dacrón,
nunca de algodón) o el cepillo unos 2 a 4 cm dentro del canal endocervical y se rota
cuidadosamente presionando contra la pared, evitando el contacto con las superficies vaginales.
Con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan de
inmediato con acetona.
Envío: El tubo con el medio de transporte se envía lo antes posible de modo que no llegue al
laboratorio después de 24 horas. No es necesario refrigerar la muestra. Las preparaciones se
envuelven individualmente y se envían protegidas de la luz y el calor excesivo.

M7. FROTIS SANGUINEO

Toma: Se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón empapada
en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Con una lanceta estéril se hace una punción firme y
profunda y se limpia la primera gota de sangre con un algodón limpio y seco. Se comprime de
nuevo la yema o el lóbulo hasta que se forme una gota esférica. Se toca la parte superior de la
gota con un portaobjetos muy limpio y con un extremo de otro portaobjetos, se extiende la sangre
para hacer un frote. La sangre se deja secar a temperatura ambiente y en posición horizontal.
Envío: Cada laminilla se protege individualmente con cartón preferentemente. El conjunto se
empaqueta cuidadosamente en un recipiente con doble cubierta para evitar la ruptura y se envía
lo antes posible al laboratorio. No hay que refrigerar el paquete.

M8. GARGARISMO
Toma: Se proporciona al paciente un frasco de boca ancha con tapón de rosca, estéril, con 5 ml
de solución salina y se le instruye de modo que mantenga la solución en la garganta el mayor
tiempo posible mientras hace gárgaras y depositándo nuevamente el líquido en el frasco.
Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato, protegido con un refrigerante.

M9. GOTA GRUESA

Toma: Se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón empapada
en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Con una lanceta estéril se hace una punción firme y
profunda y se limpia la primera gota de sangre con un algodón limpio y seco. Se comprime de
nuevo la yema o el lóbulo hasta que se forme una gota esférica, la cual se hace depositar sobre
el centro de un portaobjetos limpio. Con ayuda de una arista de un portaobjetos se extiende
sobre una superficie de aproximadamente 0.5 a 1cm. La gota se deja secar a temperatura
ambiente y en posición horizontal.
Envío: Cada laminilla se protege individualmente con cartón preferentemente y se empaqueta
cuidadosamente con doble cubierta para evitar la ruptura y se envía lo antes posible al
laboratorio. No hay que refrigerar el paquete, pero si protegerlo de la humedad y la luz solar.

M10. HEMOCULTIVO
Toma: Se limpia el sitio de la punción con una torunda de algodón impregnada con etanol al 70%
o solución de yodo al 2%. Si se trata de un adulto, se toman de 5 a 8 mL de sangre total, sin
anticoagulante, o de 2 a 3 mL si se trata de un niño, siguiendo las indicaciones que se describen
en el inciso M20. De inmediato la sangre se inyecta a través del tapón (previamente desinfectado
con alcohol) de un frasco con medio bifásico para hemocultivo.
Envío: El frasco del hemocultivo se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta para
evitar su ruptura. No hay que refrigerarlo.

M11. HISOPO RECTAL

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Toma: La muestra se toma introduciendo la punta de un hisopo de algodón humedecido en
solución salina o medio de transporte en el recto y haciéndolo rotar ligeramente. Estará bien
tomada si observamos un ligero color café en el hisopo. Una vez tomada la muestra se introduce
el hisópo hasta el fondo en un tubo con medio de transporte Cary-Blair que debe estar bien
tapado (tapón de rosca). Para estudios bacteriológicos se envía inmediatamente después de
haberse tomado. En caso de ser para estudios virales mandarlo en refrigeración, aunque no se
recomienda usar hisópo para el caso de virus.
Envío: Si se trata de estudios bacteriológicos no hay que refrigerar el paquete, pero sí en el caso
de estudios virales.

M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS

Toma: En caso una lesión ulcerosa, se presiona un portaobjeto perfectamente bien
desengrasado sobre la lesión. Si la lesión está cicatrizada con la punta de un portaobjeto se
levanta la cicatriz y se toma la muestra como se indicó anteriormente. En caso de una lesión
nodular, se pincha el nódulo con una lanceta y se presiona con un portaobjeto sobre la lesión
hasta que salga líquido tisular el cual contendrá al parásito.Hay que evitar en lo posible el
sangrado durante la toma de la muestra. Se fija con alcohol metílico absoluto.
Envío: Las laminillas se envuelven individualmente y se empaquetan bien en un recipiente con
doble cubierta para evitar su ruptura y se envía lo antes posible al laboratorio. Hay que proteger
el paquete de la humedad y de la luz solar.

M13. LAVADO FARINGEO

Toma: Se pide al paciente que se siente cómodamente e inclina la cabeza hacia atrás. Se mide
la distancia media entre la fosa nasal y la base del pabellón auricular, para saber la profundidad
a la que se debe introducir la sonda. Se aplicará 1 mL de solución salina o PBS estéril e
inmediatamente se introducirá la sonda, que estará conectada a través de una trampa a un tubo
o recipiente estéril para la recepción del material.
Envío: La muestra se coloca en hielo hasta su procesamiento (dos a cuatro horas en las técnicas
rápidas).

M14. LAVADO GASTRICO

Toma: Debe ser efectuada por personal médico bien entrenado. Se introduce una sonda por vía
bucal hasta el estómago en ayunas. La muestra se deposita en un frasco de boca ancha y de
preferencia estéril.
Envío: El frasco se envía lo antes posible al laboratorio, donde no debe llegar después de 6 horas
de tomada la muestra. Se debe acompañar de refrigerante.

M15. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)

Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico quien la tomará bajo
rigurosas condiciones de asepsia. Se deben recuperar unos 5 mL los cuales se conservan en
tubos de vidrio estériles con tapón de rosca.
Envío: Cuando se trate de estudios virológicos, la muestra se envía refrigerada. Si se sospecha
de una infección bacteriana, la muestra no debe refrigerarse, ni acompañarse de hielo. Cuando
el envío tarda más de 24 horas, la muestra debe enviarse inoculada en medios específicos.

M16. LIQUIDO PLEURAL

Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico, quien la tomará bajo
condiciones rigurosas de asepsia. Se obtiene una muestra de aproximadamente 5 mL en tubos
de vidrio estériles con tapón de rosca.
Envío: El tubo se envía lo antes posible al laboratorio acompañado de refrigerante.

M17. MATERIA FECAL

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Toma: Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con
tapa hermética que permitan su fácil transporte, de preferencia que no sea de vidrio. Las heces
obtenidas del suelo, excusado así como del pañal no son satisfactorias, debido a que pueden
contaminarse con material extraño.
Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio.
Estudios virales: el tiempo de envío debe ser menor a los tres días y en condiciones de
refrigeración, con la cantidad de 10 gramos. Si se trata de hisopo rectal en solución salina, sueros
y L.C.R. en envases apropiados correctamente sellados.
Estudios bacteriológicos: se inocula en un medio de transporte (Cary Blair o Amies) y se envía a
temperatura ambiente
Estudios parasitológicos: se adiciona formol al 10% v/v neutralizado y se homogeniza bien. El
envío se hace a temperatura ambiente.
Estudios para determinación de coproantígenos por ELISA: el tamaño que se envía será similar
al tamaño de una nuéz independientemente de la consistencia.
Estudios parasitoscópicos : tres muestras consecutivas (de diferente día),
El envío se hace a temperatura ambiente. Cuando la muestra presente sangre y/o moco de
preferencia mandar de esa parte.

M18. MEDULA OSEA

Toma: La muestra deberá ser tomada exclusivamente por el médico en condiciones rigurosas
de asepsia. Se obtienen aproximadamente de 0.25 a 0.3 mL de material con una jeringa
heparinizada estéril de 1 mL de capacidad. La jeringa se gira cuidadosamente para mezclar el
material aspirado y se deposita en un tubo estéril con 0.5 mL de solución salina fisiológica.
Si se dispone de medios de cultivo se recomienda sembrar de inmediato la muestra:
Bacterias: caldo soya-tripticasa
Hongos: medios de Sabouraud simple y de Sabouraud con antibióticos
Leishmaniosis: medio de Marin NNN y/o RPMI con 10% de suero de ternera fetal
Envío: Si el laboratorio está cerca la muestra se puede transportar en la misma jeringa solamente
cuidando que la aguja quede bien protegida para evitar la contaminación. Si el transporte se
tarda más de 24 horas, las muestras (jeringa o tubo) se conservan en refrigeración. El tubo o
tubos sembrados se mantienen a temperatura ambiente y se envían lo más rápido posible al
laboratorio.

M19. ORINA
Toma: Se usa un recipiente estéril, de boca ancha con tapa de rosca. Aunque el sondeo vesical
es la forma ideal para evitar la contaminación, debido a la posibilidad de extender la infección en
el paciente, se utiliza en casos muy excepcionales en el hospital. Por esto, la micción espontánea
es la técnica más aconsejable: después de una cuidadosa limpieza de la región urogenital con
agua y jabón y después con benzal al 1%, se instruye al paciente para que deseche la primera
parte de la micción y se colecta el chorro medio. Sólo en caso de sospecharparásitos, se usa la
primera parte de la micción.
Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio con refrigerante. Estudios virales:
el envío debe tardar menos de un día.

M20. RASPADO DE LESIONES Y/O COSTRAS

Toma: Se lava bien el sitio de la lesión, primero con agua y jabón y luego con alcohol al 70%,
utilizando gasa (no debe utilizarse algodón) y se deja secar. Con bisturí estéril, se raspa el borde
de la lesión y se recoje el material que se desprende. Si la epidermis está desprendida se toman
porciones de ésta. Para la búsqueda morfológica del agente, las costras o escamas se colocan
en una caja de petri estéril y se asegurar la tapa con cinta adhesiva para que no se abra, o bien
se pueden colocar en sobres de papel que se sellan.
Envío: El material sólo debe congelarse cuando la muestra es para estudios virológicos. Para
estudios bacteriológicos la muestra se siembra en los medios de transporte adecuados.

15
M21. SANGRE TOTAL
Toma: La toma deberá hacerse en un lugar perfectamente iluminado y con el paciente
cómodamente sentado. Se localiza una vena adecuada en el brazo del paciente y se coloca el
torniquete. Se desinfecta el área de punción con un algodón impregnado de alcohol al 70%, se
introduce la aguja con el bisel hacia arriba. Si la muestra necesaria es sangre total hay que utilizar
el anticoagulante adecuado según el proceso que vaya a seguirse, ya que algunos
anticoagulantes pueden ser inhibitorios. Si la toma de sangre es para la obtención de suero, no
debe usarse ningún anticoagulante. Si la sangre no fluye espontáneamente y se está utilizando
una jeringa, se jala el émbolo y se aspira con suavidad; si se está empleando equipo al vacío se
presiona el tubo de ensaye hacia arriba. Al empezar a fluir la sangre el torniquete se retira y hasta
que se haya obtenido la cantidad de sangre que se requiere (generalmente 6-10 mL) se retira la
aguja y se coloca una torunda con alcohol sobre el sitio de punción ejerciendo presió n para
detener la hemorragia. Si la toma se hizo con jeringa, la sangre se vierte de la jeringa ya sin
aguja sobre un tubo estéril dejándola resbalar lentamente por la pared para evitar hemólisis. El
tubo se tapa cuidadosamente.
Envío: Es muy importante estar seguro que para el estudio a realizar es correcto el envío de
sangre total, ya que ésta puede sufrir hemólisis y dejar de ser útil. Si efectivamente es el caso,
el tubo con la muestra se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta y hermético y se
envía de inmediato, protegiéndolo del calor excesivo con un refrigerante y de la luz solar.

M22. SUERO
Toma: Se debe seguir la misma técnica que para la obtención de sangre total (M21), pero sin
anticoagulante. El coágulo formado se separa de las paredes del tubo con un aplicador de
madera. Se debe esperar el tiempo necesario para que se retraiga el coágulo y el suero se
separa por centrifugación a 2,500-3,000 rpm. El suero no debe mostrar indicios de hemólisis, ni
debe estar lipémico y se debe conservar refrigerado o congelado, a menos que se dé otra
indicación. Actualmente existe un equipo comercial de tubos al vacío con un gel especial, con
este sistema se puede separar el suero directamente en los tubos centrifugando a 3,000 rpm por
5 minutos. El suero se conserva en los mismos tubos por varios días. Este procedimiento tiene
la ventaja de que no se destapan los tubos en ningún momento, así el contenido se conserva
estéril y además representa un riesgo mínimo.
Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato, protegiéndolo del calor con hielo o un
refrigerante. Si es necesario congelarlo, hay que empaquetarlo bien con hielo seco. Si el suero
muestra indicios de contaminación debe desecharse de inmediato.

M23. OTRAS MUESTRAS

Para diversos diagnósticos especiales y para las investigaciones de brotes se pueden requerir
otros tipos de muestras. En estos casos dirigirse directamente al laboratorio correspondiente
para recibir la información respectiva.

PRÁCTICA Nº 5

TEMA: Cuantificación Viral

16
 SUSTRATO

CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS.

CULTIVOS CELULARES DE LÍNEA.
 (HOMÓLOGOS Y HETERÓLOGOS)

ANIMALES DE LABORATORIO
 HUEVOS EMBRIONADOS
 PEQUEÑOS ROEDORES
MUESTRAS
O SIMPLES
O COMBINADAS
O COMPLEMENTARIAS

O SEROLOGÍA - HISTOPATOLOGÍA

PROCEDIMIENTO

17
 EFECTO CITOPÁTOGÉNICO LÍTICO POR HERPESVIRUS

EFECTO CITOPATOGÉNICO: SINCICIOS, C. DE INCLUSIÓN

PLACAS NECRÓTICAS EN MCA (VIRUELA AVIAR)

18
 SÍNTOMAS NERVIOSOS (MENINGOENCEFALITIS POR VIRUS DE THEILER

Sustrato

Sustrato + Muestra
(1er pasaje) Detección
Positiva

D. Negativa

IDENTIFICACION
Sustrato
(2do pasaje) FINAL

D. Negativa
SUSTRATO
(3er PASAJE)

a) SIN AISLAMIENTO VIRAL

NEGATIVO????

19
 ¿COMO HAGO PARA SABER CUÁNTO VIRUS TENGO?

TITULACIÓN VIRAL
MÉTODOS EMPLEADOS

 BASADOS EN LA CONSTITUCIÓN FÍSICO-QUÍMICA

 BASADOS EN SUS PROPIEDADES BIOLÓGICAS

MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS
 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
 HEMAGLUTINACIÓN
 PRESENCIA DE ENZIMAS ESPECÍFICAS
 PROPIEDADES ANTIGÉNICAS (PRECIPITACIÓN, FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Nº DE PARTÍCULAS X VOLUMEN DE LAS MUESTRA

20
HEMAGLUTINACIÓN

PROPIEDADES BIOLÓGICAS
DETERMINAR LA ACTIVIDAD O POTENCIA DE UNA SUSPENSIÓN VIRAL

21
TITULACIÓN VIRAL
¿COMO SE HACE?
APLICANDO MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN ADECUADOS Y PERFECTAMENTE
ESTANDARIZADOS.
(BIOMETRÍA: ESTADÍSTICA APLICADA A LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS).

PROPIEDADES BIOLÓGICAS
SE TOMA EN CUENTA LA INTERACCIÓN DE LA PARTÍCULA VIRAL CON LA CÉLULA
HUÉSPED.
VIRUS + CÉLULA  EFECTO OBSERVABLE

1) SE UTILIZAN DILUCIONES SUCESIVAS DE LA SUSPENSIÓN VIRAL (DE UN

FACTOR CONSTANTE DETERMINADO)

DILUCIONES

2) SE CONTABILIZAN EL NÚMERO DE RESPUESTAS POSITIVAS SOBRE EL

NÚMERO TOTAL DE RESPUESTAS POSIBLES PRODUCIDAS EN UN SISTEMA
HOSPEDADOR
 MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR
 MÉTODO DEL PUNTO FINAL 50%

MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR

 ENUMERATIVO
 UN EFECTO OBSERVABLE = UNA PARTÍCULA VIRAL
 DIFERENTES SUSTRATOS:
-CULTIVOS CELULARES .............. PLACAS
-E. DE POLLO (MCA) ..................... POCKS
-PEQUEÑOS ROEDORES ............. FOCOS NEOPLÁSICOS

MATERIALES
 MONOCAPAS CELULARES
 INÓCULO (5 RÉPLICAS POR CADA DILUCIÓN)
 MEDIO DE CULTIVO SEMISÓLIDO
22
  COLORANTE
(ROJO NEUTRO: CÉLULAS VIVAS)
(CRISTAL VIOLETA: CÉLULAS MUERTAS)

MÉTODO DE PLACA

MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR

CALCULO
_
X
N= ------
VXD
_
X= PROMEDIO DE LESIONES OBSERVADAS POR DILUCIÓN EN
LAS 5 MUESTRAS
V= VOLUMEN DEL INÓCULO
D= DILUCIÓN EMPLEADA

MÉTODO DEL PUNTO FINAL 50%

 ESTADÍSTICO
 RESPUESTAS POSITIVAS SOBRE EL TOTAL DE LAS POSIBLES
 GRADIENTE DE ACTIVIDAD
 (A > DILUCIÓN < ACTIVIDAD)

 SI O NO
 POSITIVO O NEGATIVO

MATERIALES
 SISTEMA HOSPEDADOR

CÉLULAS
EMBRIÓN DE POLLO

23
 PEQUEÑOS ROEDORES
 INÓCULO DILUCIONES EN BASE 10
5 RÉPLICAS POR CADA DILUCIÓN
MEDIO DE CULTIVO
 EL PUNTO FINAL 50% EN LA TITULACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN VIRAL, ES LA
DILUCIÓN DE VIRUS QUE PRODUCE EL 50% DE EFECTOS POSITIVOS.
 EL TÍTULO ES LA INVERSA DE AQUELLA DILUCIÓN A LA CUAL REACCIONA,
ESTADÍSTICAMENTE, LA MITAD DE LOS SUJETOS INFECTADOS O UNIDADES
REVELADORAS

MÉTODO DE RM. CÁLCULO I

-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7

A + + + + + + -

B + + + + + - -

C + + + + + - -

D + + + + - - -

E + + + + - - -

MÉTODO DE RM. CÁLCULO II

-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8

24
 FREC.ACUM. + 24 19 14 9 4 1 0 0
FREC.ACUM. - 0 0 0 0 2 6 11 16
24/24 19/19 14/14 9/9 4/6 1/7 0/11 0/16

100% 100% 100% 100% 66% 14% 0% 0%

(AM/AM+ AV) 100 50%

MÉTODO DE RM. CÁLCULO III

(% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR ENCIMA DEL 50%) - 50%

= DP
(% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR ENCIMA DEL 50%) - (% DE
POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR DEBAJO DEL 50%)
66-50
DP = --------- = 0,3 (-0,3)
66-14

MÉTODO DE RM. CÁLCULO III

DILUCIÓN DONDE ESTÁN LOS EFECTOS POSITIVOS POR ARRIBA DEL 50% = -5
DIST. PROPORCIONAL (-0,3) X LOG DEL FACTOR DE DILUCIÓN (LOG 10=1) = -0,3

SUMA (PUNTO FINAL 50%) = -5,3

ES DECIR QUE EN LA DILUCIÓN -5,3 TENEMOS 1DICT50%

INVERSA DE LA DILUCIÓN DONDE REACCIONA EL 50% = 5,3

TÍTULO DICT 50% / X 50 L = 10 5.3
ES DECIR QUE EN LAS SUSPENSIÓN PURA TENEMOS 199526 PARTÍCULAS
INFECCIOSAS (DETERMINADO POR ANTILOGARITMO)

MÉTODO DE RM. CÁLCULOIII

10 5.3 DICT 50% / 50 L

25
 199526

Dosis infectantes o partículas virales que infectan el 50% de las

unidades reveladoras en 50 ul de suspensión viral pura.

PRÁCTICA Nº 6

TEMA: INOCULACION DE HUEVOS EMBRIONADOS

Materiales:
 Huevos embrionados (de preferencia)
 Ovoscopio
 Alcohol
 Algodón
 Parafina (1 vela)
 Fosforo o encendedor
 Mechero
 Jeringa de tuberculina con aguja 21 x 1 ½

PROCEDIMIENTO:
1. Seleccione los huevos embrionados de 10 a 11 días de incubación y verifique la viabilidad
de los embriones por transiluminación.
2. Ordene los huevos en el soporte con la cámara de aire hacia arriba. Rotule con número de
material y fecha.
3. Con un algodón embebido en alcohol al 70%, limpie el área correspondiente a la cámara
de aire y deje secar.
4. Perfore con un punzón la cáscara al centro de la cámara de aire.
5. Con una jeringa de 1 ml. cargue 0.8 ml del material a inocular a una dilución adecuada
según las características del mismo (a los efectos de practicar el estudiante realizará las
inoculaciones con una solución de Azul de Metileno).Con el huevo colocado sobre la
lámpara, inserte la aguja en dirección del embrión, y pinche suavemente el mismo. Verifique
que el embrión sigue el movimiento de la aguja, (lo que indica que esta en el lugar deseado),
e inyecte 0.2 ml del material y de esa manera se inocula el saco amniótico.
6. Retire algo la aguja, de modo de caer en la cavidad alantoidea, e inocule 0.2 ml.
7. Retire la aguja del huevo y selle el orificio con parafina o esmalte de uña.
8. Incube los huevos inoculados de acuerdo al procedimiento antes indicado, a 33oC durante
3 días.

26
COSECHA
1. Al finalizar el plazo de incubación, coloque los huevos inoculados durante la noche a 4oC
para lograr una vasoconstricción que minimice el sangrado durante la cosecha.
2. Limpie con alcohol al 70% el área del saco de aire y deje secar y prepare 2 tubos por cada
huevo inoculado: uno con el número del material y AMN y el segundo con igual número
pero marcado ALA.
3. Rompa la cáscara del huevo que recubre la cámara de aire y con una pinza y una pipeta
estéril proceda a romper la membrana alantoidea y aspire el líquido contenido en la cavidad
depositándolo en el tubo marcado ALA.
4. Coseche el líquido amniótico con jeringa de 1 ml. Manipule con la pinza el embrión de modo
que no interfiera con la aspiración del líquido, y deposítelo en el tubo AMN.
5. Una vez terminada la cosecha e inspeccionado, los materiales en buenas condiciones
procedentes de varios huevos inoculados con la misma muestra podrán mezclarse, para
luego proceder a su testado por hemoaglutinación para verificar la presencia de virus y
determinar su concentración (título).

6. Inoculación de huevos embrionados. Se seleccionan huevos de planteles libre de

infecciones virales, observándolos en un ovoscopio o con iluminación adecuada. De
acuerdo al agente viral que se sospecha, será la vía de inoculación y por ende, la edad
del embrión (ver cuadro 1) a utilizar.

CUADRO 1

AISLAMIENTO VIRAL

CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES DE

LABORATORIO
PRIMARIOS LINEAS OTROS
Bovine RFB-TFB MDBK
Herpesvirus
Type 1(BHV-1) BOV. TURB.
Bovine Viral RFB-TFB MDBK
Diarhoea
Virus(BVDV) BOV. TURB.
Parainfluenza RFB-TFB MDBK
Type 3 (PI-3)
BOV. TURB.
Bovine RFB-TFB MDBK
Adenovirus
(BAdV) BOV. TURB.

27
Foot and RFB-TFB BHK Ratón lactante (im., ic. o ip)
Mouse Disease
(FMDV) TirFB MDBK Cobayo (adap)

IBRS2

BOV. TURB

28
Vesicular EP.BOV VERO Ratón lactante
Stomatitis Virus
(VSV) CERDOS Huevos embrionados

MONO.COB. Cobayo-Conejo
Bovine Entero RFB-TFB BHK
Virus (BEV)
MDBK

BOV. T (RB)
Bovine RFB MA 104
Rotavirus
(BRV)
Bovine Corona Explantos
Virus (BCV)
Pox V Homólogo Huevos embrionados. MCA.
Clasical Swine RFP (sin ecp) PK15 (sin ecp)
Fever Virus
(CSFV) TFP
African Swine C Leucocitos VERO
Fever Virus
(ASFV) MS
Porcine RFP (IF HA)
Parvovirus
(PVP)
Pseudorabies RFP y B BHK Conejo (sc.)
Virus (PRV)
TFP y B MDBK Ratón lactante (ic.)

Fibroblasto de IBRS2 Huevo embrionado

pollo
PK15
Blue Tongue VERO Huevos embrionados (ev.)
Virus (BTV)
BHK
Ovine - - Histopatología -
Pulmonar
Adenomatosis
(OPA)

VÍAS DE INOCULACIÓN

a. Cavidad Amniótica: el material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y

respiratoria, pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de
10-14 días de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y
allí se perforará con un trócar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo,
orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material (Ver figura 1).
Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
29
b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpéticas
o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el punto de
inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la membrana.
Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena superficie, se
desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto de inoculación.
Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en el punto de
inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona con una
perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se depositará el
inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina (ver figura 1). Sellar los orificios
con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

c. Cavidad alantoidea: el virus se difundirá en el fluido e infectará las células ectodérmicas

de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad, Observándose el
ovoscopio, se marca en el extremo de la cámara de aire, el punto de inoculación que
debe ser opuesto a la ubicación del embrión y con pocos vasos sanguíneos. Se
desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2 ml) con una aguja
de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo (ver figura 2). Se sella
con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

d. Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se
desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en
línea recta (0,1 - 0,2 ml.) (ver figura 2). Se sella con parafina líquida u otro sellador no
tóxico.

e. Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose al ovoscopio

se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se dibuja en la
cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca un rectángulo, enmarcando
la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la membrana que se encuentra por
debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe
observarse cómo el inóculo al diluir la sangre, circula por la vena). Ver figura 2. Se sella
con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

30
31
 PARTES DE UN HUEVO

partes:

1.- Embrión
2.- Cavidad amniótica
2 .-Membrana amniótica
3.-Saco vitelino
4.-Albúmina
5.-Cavidad alantoidea
6.-Membrana corioalantoidea
7.-Membrana externa del huevo
8.-Cáscara
9.-Cámara de aire

32
 PRÁCTICA Nº 7

TEMA: INOCULACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO

Materiales:
 Ratones de 11 a 15 gr machos de preferencia 1 x grupo de 4 a 5 personas
 Ratones lactantes 3 a 5 , Con su madre. 3 x grupo de 4 a 5 personas
 Alcohol
 Algodón
 Jeringa de tuberculina con aguja 26 G
 1 rejilla

Introducción
Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la infección
por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicará en el hospedador
experimental con la producción de diferente sintomatología, hasta en algunos casos puede
causarle la muerte.
Es un método sencillo, sensible y rápido aunque son pocos los virus animales de nuestro interés
que poseen huéspedes de laboratorio susceptibles (ver Cuadro 1). No obstante, constituye una
importante técnica en la identificación y caracterización de agentes (diagnóstico diferencial).

Inoculación de Ratón Lactante

a) Vía Intracerebral: el punto de inoculación es la intersección de dos líneas una que va

desde el ojo a la oreja y la otra perpendicular a esta línea y cortándole por el centro. Se
utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml.
b) Vía Intramuscular: se realiza la inoculación en la masa muscular del miembro posterior,
aspirando previamente pra asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y jeringa
similar al anterior
c) Vía intraperitoneal: sujetando el animal por la piel de la nuca con el índice y pulgar y
con el resto de los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cúbito
dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza aguja
y jeringa de tuberculina.

TECNICAS DE INOCULACIÓN Y SANGRIA DE ANIMALES

El animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador experimentado que, siempre que
sea posible, deberá ser conocido por los animales. No hay tampoco que sobre valorar el papel
clave desempeñado por la persona que sujeta al animal y evidencia la vena.
La vena debe localizarse claramente (si se tienen dudas, es mejor no hacerlo y buscar ayuda) y
la punción llevada a cabo decididamente mejor que con vacilaciones. Puede que el animal
muestre signos de incomodidad (¡como nosotros!) por ejemplo, puede chillar, pero se le debe
tranquilizar, tratándole con suavidad y hablándole. Puede que se necesite alguna presión
próxima al lugar de oclusión del retorno venoso con el fin de obtener suficiente volumen de
sangre.
La gota de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar o con una micropipeta con punta
de plástico.
Después de haber sacado la sangre, se debe mantener una presión suave pero firme sobre el
lugar durante unos 30 segundos, lo que detendrá rápidamente cualquier sangrado. También hay
varios preparados hemostáticos de alginato de calcio, fibrillas de colágeno y esponja gelatinosa
que pueden servir de ayuda si persiste el sangrado.
1) ¿Cuales son los animales comúnmente utilizados para estas pruebas?
33
 a) Ratón
b) Rata
c) Hámster
d) Gerbo
e) Cobayo
f) Conejo

2) Describa La Técnica De Inyección intravenosa, intraperitoneal, Subcutánea,

Intramuscular.

A. RATÓN :

Intravenosa
Equipamiento: agujas de 27 - 30 g, jeringas 1 ml de TB, sujetador para ratón, lámpara de
calentamiento.
La vena lateral de la cola del ratón es el sitio más común para esta técnica. Mejores resultados
se logran si la cola se introduce en agua caliente o el ratón es calentado en la jaula con una
lámpara. Las venas se observan cuando la cola es levantada y girada lentamente en cualquier
dirección. La punta de la aguja puede verse como penetra en la vena. No obstante ser una
técnica de fácil aplicación práctica y entrenamiento es fundamental.

Intraperitoneal
Equipamiento: jeringas y agujas 23 - 27 g, ½ a 1 pulgada, preferiblemente con el
Bisel pequeño.
La inyección se aplica en el cuadrante izquierdo bajo como se observa, en la figura 7.

Figura 7.- Sujeción para la aplicación de la inyección intraperitoneal en ratón.

El uso del bisel pequeño en la aguja y su inserción a través de la piel, levantando la aguja en
contra de la pared abdominal, evita la posibilidad de punción en el intestino. Una rápida
administración del fluido puede causar daños en el tejido y hemorragia debido a la presión.
Si no se inmoviliza la pata derecha del ratón pudiera existir el riesgo de punción en los intestinos.
El máximo posible de administrar por esta vía a un ratón de 20 g es de 2 ml.

Subcutánea
Equipamiento: agujas de 25 a 27 g, ½ a ¾ pulgada con jeringas de TB.

34
Esta vía es utilizada como alternativa a la intramuscular en los ratones. El área escogida es el
hombro.
Como alternativa el abdomen ventral es usado utilizando la técnica de restricción de la figura 1.

Figura 1.- Métodos de sujeción y manipulación en el ratón para inyecciones intraperitoneales o

intramusculares.

Bibliografía

• Proceeding of 75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971

"Recommended Standard Laboratory Techniques for diagnosing infectious bovino
rhinotracheitis. Bovine virus diarrhea and Shipping fever (Parainfluenza-3)".
• Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial
Disease". Third Edition.

35
 PRACTICA Nº 8
TEMA: CULTIVOS CELULARES

LOS CULTIVOS CELULARES Y SUS APLICACIONES I (CULTIVOS DE CÉLULAS

ANIMALES)

Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener poblaciones celulares
homogéneas, que luego pueden ser incluso mantenidas y multiplicadas in vitro (“en vidrio” = en
recipientes especiales, en el laboratorio). Los cultivos celulares son esenciales en la
investigación científica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, y en
diversas aplicaciones de la biotecnología, como la producción de moléculas de interés industrial,
ingeniería de tejidos, etc.

¿Cómo se obtienen las células?

El primer paso para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado
por células de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas
1
. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina
y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan agentes (como el
EDTA -ácido etilendiaminotetraacético) que secuestran al ión calcio, del cual depende la
adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene una suspensión
celular que contiene a todas las células presentes en ese tejido.
Para separar los diferentes tipos celulares se
pueden utilizar varios métodos:
I. La centrifugación, que permite separar a las células por tamaño.
II. La capacidad de adherencia al vidrio o al plástico que tienen algunos tipos celulares.
III. La unión a ciertos anticuerpos específicos para determinados componentes celulares.
Estos anticuerpos se usan unidos a diferentes matrices (colágeno, bolitas de
polisacáridos, de látex o de plástico). Las células unidas a la matriz (a través de los
anticuerpos) se recuperan por agitación, tratamiento con tripsina (digiere a las proteínas
que median la adhesión) o, en el caso de una matriz digerible (como el colágeno),
degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa).
IV. La unión a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes. Las células que
contienen un determinado componente son reconocidas y “marcadas” por los
anticuerpos. Las células marcadas son separadas de las no marcadas en un separador
de células activado por fluorescencia o cell sorter (Figura 1).
V. La disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido preparada para
microscopía. La región que contiene las células de interés es irradiada con un láser, que
funde un pequeño círculo con las células que están por debajo. Estas células capturadas
son luego removidas para un posterior análisis. La técnica, denominada “microdisección
de captura por láser”, puede utilizarse para aislar y estudiar diferentes partes de un tumor,
por ejemplo. Otra técnica relacionada emplea un láser para disertar un grupo de células
y “catapultarlas” a un contenedor apropiado para un posterior análisis (Figura 2).

Figura 1. Equipo para la separación de células marcadas por fluorescencia. Las células
individuales viajan a través de un conducto muy delgado y son iluminadas por un láser. El equipo
puede detectar qué células emiten fluorescencia (por el anticuerpo adherido). Cada célula es
36
incorporada en una gota que es “cargada” eléctricamente como negativa o positiva en función
de la presencia o ausencia del colorante fluorescente. Luego, las gotas son separadas por un
campo eléctrico hacia los recipientes colectores según su carga (adaptado de Alberts y col., MBC
2002).
1
La matriz extracelular está compuesta por diferentes tipos de moléculas, entre las que se
encuentran los proteoglicanos, polisacáridos como el ácido hialurónico, y proteínas como el
colágeno, laminina, fibronectina, fibrina y elastina.

Figura 2. Técnica de microdisección para aislar células a partir de secciones de tejidos.

Este método emplea un láser para escindir una región de interés y eyectarla a un contenedor,
permitiendo el aislamiento de determinadas células (hasta células individuales) a partir de un
tejido (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).

¿Cómo se cultivan las células?

La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso
presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios
de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio
o analizadas bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas
específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden estudiar las
interacciones entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los
experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro” (“en vidrio”),
para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos
2
“in vivo” (“en organismo viviente”) .
Como se mencionó anteriormente, los cultivos se establecen principalmente a partir de
suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos. A diferencia de las bacterias, la
mayoría de las células que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren
una superficie sólida sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base
de una placa o frasco de plástico, aunque a veces los requerimientos son más complejos y el
plástico debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea
y contiene a las células en los tejidos, y con la cual interactúan), como por ejemplo el colágeno
y la laminina.

Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porción de tejido neural, incluido
en una gota de linfa. Adaptado de www.corning.com.

El cultivo de tejidos y células comenzó en 1907 con un experimento diseñado para esclarecer
una controversia en el área de la neurobiología. El investigador Dr. Ross Harrison, quien
trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, publicó un breve pero crítico artículo (“Observaciones
de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) que introdujo exitosamente una nueva técnica, el cultivo
de tejidos, para demostrar experimentalmente cómo se originan las fibras nerviosas. Los
experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeños fragmentos
de tejidos, llamados “explantos”. Utilizando técnicas asépticas, Harrison tomó fragmentos del
tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso) de un embrión de rana, y lo
depositó en una gota de líquido linfático fresco (“medio de cultivo”) de rana colocada sobre un
cubreobjetos estéril. Una vez que la linfa coaguló, invirtió el cubreobjetos sobre un portaobjetos
de vidrio que poseía una depresión, creando así un cultivo en gota suspendida, técnica utilizada
por los microbiólogos para estudiar las bacterias. Luego de periódicas observaciones al
microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas
presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar sólidamente la “doctrina neural”,
resolvió los problemas básicos del cultivo celular, como el medio, la observación y la
contaminación.

37
2
En los laboratorios de bioquímica, por in vitro se entienden aquellas reacciones químicas que se
llevan a cabo en un tubo de ensayo en ausencia de células, mientras que in vivo se refiere a las
reacciones químicas que ocurren dentro de la célula, aún en cultivo.

CULTIVOS PRIMARIOS
Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u órgano.
Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En
estos cultivos las células están vivas, conservan sus características originales y su proliferación
es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios
(figura 3).

CULTIVOS SECUNDARIOS
En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de
cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor). Como consecuencia del
contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las subcultiva
a un recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante semanas o meses. En este
estadío, las células frecuentemente mostrarán distintas propiedades según su origen. Por
ejemplo, los fibroblastos (células que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido
de muchos animales) secretarán colágeno, las células derivadas de tejido muscular esquelético
se fusionarán para generar fibras musculares con capacidad contráctil espontánea, las células
nerviosas extenderán prolongaciones (axones) eléctricamente excitables que podrán conectarse
(establecer sinapsis) con otras células nerviosas, las células epiteliales formarán largas capas
con varias propiedades de un epitelio intacto (figura 4). Gracias a que estos fenómenos ocurren
en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos
intactos.

CULTIVOS CONTINUOS O LÍNEAS CELULARES

La mayoría de las células de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado número
de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los
fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de
detenerse. En estas células, así como en muchas otras, la capacidad limitada de proliferación es
el resultado de un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se encuentra
en los extremos de los cromosomas). En las células somáticas (todas las células que no son
células sexuales) se encuentra “apagado” el gen que codifica para la enzima telomerasa,que se
encarga de mantener la integridad de los telómeros; como consecuencia, los telómeros se
acortan en cada división celular.
A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el
gen que codifica para la telomerasa; así, pueden propagarse como una línea celular
“inmortalizada”.
Pero como se mencionó, no todas las células humanas se inmortalizan de la misma manera.
Algunas células, a pesar de que sus telómeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones
celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos de control”
(check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas células, hay que lograr la inactivación de
los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos “oncogenes” (genes promotores del
cáncer) que pueden obtenerse de virus que causan cáncer, como algunas cepas del virus del
papiloma humano, adenovirus, etc.

Figura 4. Células en cultivo.

A) Micrografías de contraste de fase de fibroblastos en cultivo.
B) Micrografías de mioblastos en cultivo mostrando las células fusionadas para formar células
musculares multinucleadas.

38
C) Células precursoras de oligodendrocitos en cultivo.
D) Células de tabaco en cultivo

Figura 3. A diferencia de las células humanas, las de los roedores no tienen “apagado” el gen
de la telomerasa, por lo que sus telómeros mantienen el largo a través de las divisiones celulares.
Pero cuando son cultivadas, esas células experimentan cambios genéticos que inactivan los
mecanismos de check-point, produciendo líneas celulares inmortalizadas espontáneamente.
Ambos tipos de líneas celulares son muy útiles en la investigación celular, como fuente de un
gran número de células uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno
líquido (a -196 °C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen
modelo experimental para las primeras etapas de una investigación.
A pesar de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no son idénticas. La
uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, a través del cual
se aísla una sola célula, la que prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas).
Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas celulares
mutantes que poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir para inferir el papel
que tiene la proteína ausente o alterada en las células normales.
Entre los cultivos celulares más promisorios, desde el punto de vista médico, se encuentran las
líneas de células madre embrionarias humanas. Estas células, obtenidas del macizo celular
interno de un embrión en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente
reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares
podrían revolucionar la medicina al proveer de células capaces de reemplazar o reparar tejidos
dañados. Hay otras fuentes de células madre que se están investigando en tejidos adultos, como
la médula ósea y el cordón umbilical.

LOS HIBRIDOMAS
Se sabe que es posible fusionar dos células formando un heterocarionte (o heterocarion), es
decir, una célula con dos núcleos separados pero con los contenidos citoplasmáticos
compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensión de células con compuestos que inducen la
fusión de membranas (fusógenos), tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus.
Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una célula híbrida en la
cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de
ambos en un único gran núcleo. Tales células híbridas pueden clonarse estableciendo una línea
celular, pero se sabe que en muchos casos la línea resultante es inestable genéticamente, y
tiende a perder parte del material genético.
En 1975, un equipo integrado por el científico argentino César Milstein, desarrolló, mediante la
técnica de fusión, una línea celular híbrida clave para la producción de anticuerpos monoclonales
(todos iguales) para fines terapéuticos y de diagnóstico: los hibridomas (este desarrollo llevó al
Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nóbel). Los hibridomas son líneas resultantes de la
fusión de dos tipos celulares: linfocitos B secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y células
derivadas de una línea tumoral de linfocitos B (figura 5 de la fusión se obtiene una mezcla
heterogénea de células, y con un medio de cultivo especial se seleccionan las células fusionadas
que producen anticuerpos y proliferan indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como
clones individuales, y cada uno de ellos sirve como una fuente estable y permanente de un
anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo reconoce un único epítope antigénico (es decir, una
pequeña porción de una proteína). Una de las ventajas de los hibridomas, en comparación con
los cultivos clonales de linfocitos B, es que estos últimos tienen una vida limitada en cultivo.

Figura 5. Preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un

antígeno en particular. El medio de cultivo selectivo utilizado luego de la fusión celular contiene
un inhibidor que bloquea las rutas de síntesis de los nucleótidos. Como consecuencia, las células

39
deben utilizar una vía alternativa para fabricar sus ácidos nucleicos. Esta vía es defectiva en la
línea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero está intacta en las células de bazo
(linfocitos B) obtenidas del ratón inmunizado. Debido a que ninguna de las células utilizadas para
la fusión inicial puede crecer por sí sola, sólo las células híbridas o hibridomas sobreviven.

¿Qué contienen los medios para el cultivo de células?

Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía ser producto de una mezcla de ciencia y alquimia.
De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados
por placas con medios líquidos que contenían pequeñas cantidades de una serie de moléculas
necesarias para la supervivencia y multiplicación celular: sales, glucosa, aminoácidos y
vitaminas. Además, la mayoría de los medios incluían una mezcla poco definida de
macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de
embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de
rutina, y por lo tanto es difícil saber qué macromoléculas requiere un determinado tipo celular
para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos medios
químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas
moléculas mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y
proliferación, como los factores de crecimiento. Así, gracias a estudios que buscaban establecer
las condiciones mínimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado, se descubrieron
muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y
proliferación de determinados tipos celulares.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y
tienen, además, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que
aparecen catabolitos ácidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse también
antibióticos y antimicóticos para impedir la contaminación con microorganismos.

Composición de medios Vitaminas Sales Otros Proteínas

de cultivo para células compuesto requeridas en
de mamífero s* los medios
Aminoácidos definidos libres
de suero
Arginina Biotina NaCl Glucosa Insulina
Cisteína Colina KCl Penicilina Transferrina
Glutamina Folato NaH2PO4 Estreptomic Factores de
Histidina Nicotinamid NaHCO3 ina crecimiento
a Anfotericina específicos
Isoleucina CaCl2
Leucina Pantotenato Rojo fenol
Piridoxal MgCl2 Suero fetal
Lisina
Tiamina bovino
Metionina
Fenilalanina Riboflavina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina

40
 PRACTICA Nº 9

TEMA: OBTENCIÓN DE BACTERIOFAGOS DE E. COLI.

1. Aislamiento de Bacteriófagos:
Introducción:
• Los bacteriófagos son parásitos de las bacterias importantes como instrumento de
identificación de especies bacterianas.
• Así como instrumento epidemiologico en la tipificación de fagos de staphylococcus y
salmonella.
• Sirve como vector de material genético, estudio en biología molecular y genética.

2. Objetivos:
• Demostrar la contaminación en la muestra por fagos como indicadores de contaminación
en forma rápida y segura.

3. MATERIALES Y EQUIPO:
• Tubos de ensayo
• Tubos de dunkan.
• Placas petri.
• Pipeta de 10, 1 ml
• Probeta de 100 ml.
• Erlenmeyer de 250 ml
• Mechero Bunsen
• Baño maría.
• Balanza de platillo.
• Estufa.
• Autoclave.
• Incubadora.

4. PROCEDIMIENTO:
• Autoclave los materiales antes de limpiarlos.
• Limpiar con cepillo y agua corriente.
• Colocarlos en detergente y hervir por 15´.
• Enjuagar 6 veces.
• Embeber 1h. En Hcl 0.05% 1N.
• Enjuagar 3 veces.

5. REACTIVOS:
5.1 Caldo enriquecido para fagos (C.E.F):
• ClNa 5 g.
• Peptona 5 g.
• MgSO4.7H2O0.20g.
• MgSO4.4H2O0.05g.
• Estrac. de lev.3g.
NOTA: Autoclave a 121°c por 15´ a 15 Lbrs.

41
6. Método Directo: Demostración cualitativa.
6.1 Trabajo de la cepa:
• Uso de cepa E. Coli B.
• Repicar unas colonias al C.E.F incubar 24h a 35°c.
• Tomar 0.2ml de la primera incubación y colocarlo en otro tubo con C.E.F. Incubar por
3h a 35°c.
• En este caso la bacteria se encuentra en etapa logaritmica de desarrollo.

6.2 Trabajo con la Muestra:

• Tomar 10 ml de muestra de agua contaminada.
• Proceder a diluir 1/10, 1/100,1/1000, etc, en 90ml de agua.

6.3 Obtención de Colifagos:

• Licuar 3ml de A.B.E.F. Mantenerlo a 45-50 °c.
• Agregar 2 gotas de Cl2Ca al 1.5%.
• Agregar 0.2 ml de del C.E.F con las bacterias incubadas x3h.
• 1ml de la muestra diluida y homogenizada.
• Vertirlo a la placa petri q tiene el A.E.F.
• Homogenizar e incubar a 35°c por 24h.

7. Resultados:
• Luego de incubarlos la lisis aparecera a las 4h.de incubación.
• Esto demuestra la rapidez de la prueba.

PRÁCTICA N° 10
42
 TEMA: DE HEMOAGLUTINACIÓN E INHIBICIÓN DE HEMOAGLUTINACIÓN

Una de las propiedades de muchos virus es la habilidad para poder aglutinar (hemoaglutinación)
puede ser dividido dentro de tres categorías:

1. El grupo de los myxovirus en el cual las partículas virales misma es el agente

hemoaglutinante.
La propiedad infecciosa de los virus no puede ser separada de la propiedad
hemoaglutinante. Estos virus tienen la propiedad enzimática con el subsecuentemente
se produce elución con los glóbulos rojos.
2. Virus con los cuales la partícula infectiva no puede ser separado de las partículas
infectivas no puede ser separado de las partículas hemoaglutinante, pero las cuales no
posen actividad enzimática por elución con el virus. Este grupo incluye a los arbovirus.

3. Virus que durante la replicación produce una hemoaglutinina que es distinta de la

partícula infecciosa. Esto incluye algunos poxvirus y miembros de la psitasicosis.

La hemoaglutinación es inhibida por antisuero específico esto es llamado como inhibición a

la hemoaglutinación y puede ser usado para el serodiagnóstico o identificación de partícula
viral.

ESPECIE DE GR SUSCEPTIBLES A LA AGLUTINACIÓN POR DIFERENTES VIRUS

VIRUS ESPECIE DE GR OBSERVACION

SUSCEPTIBLES PARA
HA
Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex
Varicella
Herpes Zoster
Poxvirus Pollo. Solo 50 % de los GR La hemoaglutinación es
de ave es susceptible a la separable de la partícula
Vaccinia
HA. infecciosa.
Variola
Los GR de pavo es No ay elusión con los GR.
Cowpox (vacuna) susceptible a Vaccinia.
La IHA puede ser usado
para el Dx.
Sarampión GR de monos Rhesus. También produce
hemolisina viral. No ay
elusión del virus por GR.
La IHA puede ser usado
para el Dx.

43
Myxovirus Cobayo, pollo y humano Cepa especifica pu3ede
ser usado para la
Influenza
ident6ificacion de cepas y
Parainfluenza serodiagnóstico. Los virus
Parotiditis son e luidos
enzimáticamente. La
hemaglutinina no se

44
 puede separar de la
partícula infecciosa.
Adenovirus Rata, mono Rhesus Agrupado de acuerdo a la
aglutinación de GR de la
sp. .Hemaglutinina no
separable de la partícula
infecciosa. Virus no eluidos
por los GR
enzimaticamente.
Reovirus humano IHA puede ser usado para
tipificar el serodiagnóstico.
No eluyen los GR por el
virus.
Arbovirus GR de pollo o de ganso Depende del pH La IHA se
usa para el Dx. No hay
elusión del virus por los
GR. La hemaglutinina no
separable de la partícula
infecciosa.
ECHOVIRUS Humano Los tipos difiere con la
temperatura para la
máxima aglutinación.
Coxsackie A Humano Hemaglutinina no
separable de la partícula
Coxsackie B Humano fetal
infecciosa. Los virus no
eluyen los GR
Poliovirus Ninguno
Virus basofilicos Raton, Hamster La elusión ocurre a los
4 °C específica para
Tracoma
agrupar, no especifico
Psitasicosis para tipear hemoaglutinina
Linfogranuloma no separable del virus.

venéreo

HEMOAGLUTINACIÓN (HA) ARBOVIRUS

Principio:
La HA por Arbovirus depende del ph. Es necesario, por lo tanto para determinar el pH óptimo
para cada antígeno (Ag).

Reactivos:

45
  Ag. Preparados en Cultivo celular o en ratones lactante.
 Solución Alsever.
 Hematíes de ganso adulto.
 Solución Stock de Buffer (monobásico, dibásico)
 Solución stock de borato salino pH 9 (BS)
 Solución de albúmina bovina (AB) fracción V al 0.4 % en borato salino (ABBS) pH 9.
 Solución suero fisiológico (NaCl al 0.9 %)
 Desinfectante.

Equipos y materiales:

 Estufa regulada a 37 °C.

 Congeladora a –20 °C
 Refrigeradora.
 Balanza analítica
 Dispensador automático.
 Potenciómetro
 Espejo bicóncavo
 Micropipeta multicanal 25 – 250 ul.
 Micropipeta unicanal 2 – 20 ul y 20 – 200 ul.
 Propipetas
 Papel filtro
 Tubos 13 x 100
 Viales
 Bandeja con hielo

Procedimiento:
Obtención de hematíes de ganso
 Tener un ganso adulto, macho (las hembras no se utilizan ya que los cambios del ciclo
hormonal pueden cambiar los títulos hemoaglutinantes), de preferencia realizar el
sangrado como mínimo una vez por semana.
 Rextraer sangre de la vena radial del ganso, empleando una jeringa con aguja N° 20.
Colectar la cantidad necesatria para la prueba (una parte de sangre mas 3 de Alsever).
Guardar la sangre de ganso a 4 °C. no debe utilizarse pasado los 10 días.
 Lavar el volumen de sangre requerido para la prueba tres veces con solución salina.
Centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos a 4 °C.
 Una vez lavados los hematíes de ganso re suspender al 0.5 % con cada uno de los buffer
de los diferentes (pH Ver Anexo). Comprobar su densidad óptica empleando filtro de 490
nm (La densidad óptima es de 0.75).

Prueba propiamente dicha:

1. Rehidratar cada Ag liofilizado con agua destilada y diluir 1:10 en frío con 0.4 % de
albumina bovina fracción V en borato salino, pH 9.0
2. Permitir a cada Ag para disolverse totalmente toda la noche a 5 °C.
3. Realizar diluciones seriada del Ag en placas de microtitulacion, agregar 0.1 ml a la
primera cavidad.
4. Agregar 0.05 ml de 0.4 % a todas las cavidades de las placas.
5. Utilizando micropipeta de 0.05 ml hacer diluciones seriadas sucesivamente.
6. agitar suavemente.

46
7. La suspensión de GR. a diferente pH agregar 0.05 ml /cavidad.
8. Agregar en primera cavidad de la ultima fila 100 ul de la suspensión de GR usada.
9. incubar a T° ambiente.

Interpretación:
 Hemoaglutinación completa: Punto donde a hemoaglutinación es completa +
 Hemoaglutinación parcial: Se considera positiva pero no es leído como punto medio
+/-.
 No hemoaglutinación formación de un botón de hematíes.

47
 PRÁCTICA N° 11
TEMA: PRUEBA DE ELISA, DIAGNÓSTICO RÁPIDO

INTRODUCCIÓN
La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un
antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido
espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo
ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue,
mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción
libre.Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal
(luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos
ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba
la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

Dispositivos empleados en ELISASe han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos
de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para
aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros
para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,
espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y
1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados
(HTS, 'High troughput system').

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con
capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua,
los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas
longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad
óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.

FASES DE UN ENSAYO ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

48
Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El
anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.
El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se
realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la

placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o
empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA
indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más
anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa
se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de
antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del
antígeno.

49
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas
marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución.
Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el
esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

TIPOS DE ENSAYOS ELISA

50
 ENZIMA SUSTRATO TAMPÓN
10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH 5; añadir
OPD
microL de 30% peróxido de hidrógeno 30%
2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato
TMB sódico 0.1M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno
30%
60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0.1 M pH 6; añadir 35
ABTS microL de peróxido de hidrógeno 30%; parar con fluoruro
sódico 1.25%; leer a 405 nm
10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 20
HRP (peroxidasa DAB microL de peróxido de hidrógeno 1%
de rábano) 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50
CNP mM pH 7.4; filtrar y añadir 40 microL de peróxido de
hidrógeno 30%
80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de
AEC tampón acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y añadir 50 microL de
peróxido de hidrógeno 30%
80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0
ASA con 1 mM NaOH y añadir 10 % por volumen de 0.05%
peróxido de hidrógeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M
5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM
PNPP
cloruro de magnesio
(A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de
dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast
NAPFB
Blue BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro
AP (Fosfatasa de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
alcalina)
(A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de
dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red
NAPR
BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de
magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
BCIP 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol)
2.5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM
beta-G ONPG
cloruro de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol
8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua
ureasa BP desionizada; añadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar
elpH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4ºC
Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los
reactivos siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina
en 0.1 M tampón fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidón en
PG IS
agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina
en 0.1 M tampón fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N
ioduro en 0.1 M KI solución stock (en una botella oscura)

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación
de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje

51
de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A
continuación se describen los más comunes.
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo
los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con
anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario
incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,
...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se
incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le
ha añadido).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles
positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno
primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene
mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más
anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la
inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema
enzimático permiten cuantificar una gran cantidad de antígenos.
ELISA 'sandwich'. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se
trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con
un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unido
a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este
ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite
el segundo anticuerpo.

MARCADORES ENZIMÁTICOS MÁS COMÚNMENTE UTILIZADOS

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente empleados en
ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.

ELISA DE CAPTURA DE IGM

PRINCIPIO DE LA TECNICA
Las tiras serán sensibilizadas con una Inmunoglobulina de carnero anti IgM humana, la cual
reaccionara con los anticuerpos de clase IgM presentes en la muestra del paciente. Al adicionar
el antígeno del virus del Dengue (VD) este reaccionara con las Inmunoglobulinas M capturadas
previamente si estas son específicas para el VD. Posteriormente se adiciona el conjugado,
formado por inmuglobulinas anti VD acopladas a la enzima peroxidasa del rábano. Si las
reacciones previas han sido específicas el conjugado reaccionará con el antígeno del VD.
Cuando se adiciona el substrato este es degradado por la enzima peroxidasa traduciéndose en
un cambio de color en la reacción en las muestras positivas.

APLICACIÓN:
La detección de IgM específica contra el virus del Dengue (VD) es un método rápido, sencillo y
económico, que tiene una elevada sensibilidad y especificidad, por lo que constituye el sistema
de elección para la vigilancia seroepidemiológica del Dengue. Los resultados de esta técnica
deben interpretarse con cuidado, porque dependen en gran medida del momento en que se
tome la muestra y del tipo infección (primaria o secundaria) que presente la persona
afectada.

52
ELISA IPK - DENGUE (CUBA)
Todos los reactivos deben retirarse de la refrigeradora para que alcancen la temperatura
ambiente.

MATERIALES, REACTIVOS Y PREPARACION

• Placas de poliestireno de 96 pocillos separables en tiras. Cuando las tiras no estén en uso
guardarlas en la bolsa y mantenerlas en refrigeración.

• Solución para Lavado (1 x 100 ml)

Antes de utilizarlo poner en baño de María para disolver cristales. Preparar una solución 1:25
con agua destilada en un volumen de 450 ml por placa. Se utiliza para los lavados de las placas,
para diluir el antígeno y conjugado.
• Controles Positivos y Negativos listos para usar.

• Diluyente de Muestra (1 x 3 ml)

Se prepara una dilución 1:25 con agua destilada y queda lista para utilizarla en las diluciones de
las muestras (preparar según necesidad).
• Suero Humano Negativo a Dengue (SHN)

Se utiliza en la preparación de la solución diluyente del antígeno y el conjugado, y se prepara

inmediatamente antes de usarlo.

• Antígeno Liofilizado (6 x 2 ml).

Antígeno inactivado de virus Dengue (vienen los 4 serotipos) se van a reconstituir los viales
necesarios para el uso con 2 ml de solución de lavado conteniendo SHN al 0.5%.
3 ml Solución de lavado / SHN 0.5 0.5 100
2 ml al Vial de Ag X 3 ml
= 15 μl SHN
Para 3 ml S.Lavado

• Conjugado Antidengue-peroxidasa (1 x 0.2 ml)

Se prepara una solución de lavado al 5% con SHN.

5 100 ml 250μl de SHN + 5 ml de Soluc. Lavado

X 5 ml
Para la dilución del conjugado se pone 30 μl de conjugado en 2 ml de la solución de lavado -
SHN al 5%. Esto se prepara según necesidad.

• Sustrato (OPD) Liofilizado (6 x 5 ml)

Reconstituir cada vial al momento de su uso con 5 ml de agua destilada, esperar hasta su
completa disolución y añadir 2 μl de Peróxido de Hidrógeno, homogeneizar.

TECNICA DE ANALISIS

1. Preparar un protocolo de trabajo identificando la posición de cada muestra y los controles.

2. Realizar una dilución 1:20 con el diluyente de muestras 1:25.

10μl de muestra + 190μl de diluyente.

3. Dispensar 50 μl de la dilución 1:20 y 50 μl de los controles: 2 positivos y 4 negativos Sin diluir.
4. Incubar 2 horas a temperatura ambiente en Cámara Húmeda.
5. Lavar la placa 5 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla.
6. Dispensar 50μl de antígeno preparado según las instrucciones, incubar toda la noche a 4°C
53
 en Cámara Húmeda.
7. Lavar la placa 5 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla.
8. Dispensar 50μl por pozo del conjugado diluido, incubar 1 hora a 37°C en cámara húmeda.
9. Lavar la placa 7 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla.
10. Reconstituir cada vial de substrato con 5 ml de agua destilada + H2O2
11. Dispensar 100μl en cada pozo e incubar 30 minutos, pasado este tiempo detener la reacción
adicionando 100μl de Acido Sulfúrico al 12.5% en el mismo sentido en que se añadió el
substrato.
12. Leer la microplaca y medir la D.O. a 492 nm ajustar el blanco contra aire.

CALCULO DE RESULTADOS.
• Calcular la media de la D.O. de los controles negativos y multiplicarlo por 2 (Valor de Corte)
• Calcular la media de la D.O. de los controles Positivos. Es válida la prueba si la media de los
controles positivos es mayor o igual a 5 veces el valor de la media de los controles negativos.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS EN LA DETERMINACION DE IgM ESPECÍFICA

CONTRA EL VIRUS DEL DENGUE
La presencia de IgM específica contra el virus del Dengue en una de muestra de suero significa que
esta persona se ha infectado recientemente con este virus. Los resultados negativos deben
interpretarse cuidadosamente. Una muestra tomada antes del 7mo día de iniciados los síntomas
puede resultar negativa. En este caso debe tomarse una segunda muestra o auxiliarse de otro
método diagnóstico. En las infecciones secundarias o terciarias la IgM puede fallar en un porciento
bajo, en ese caso se puede auxiliar de otros métodos serológicos que determinen
fundamentalmente IgG anti virus del dengue.

CONTROL DE CALIDAD
En cada ensayo debe incluirse 3 controles negativos y 2 controles positivos, un positivo alto y un
positivo bajo. Los controles negativos deben presentar valores de absorbancia inferiores a 0.2. El
control positivo alto debe presentar valores de absorbancia superiores a 1.00 y el control positivo
bajo debe resultar siempre con valores de absorbancia superiores al valor de corte.
Periódicamente un panel de sueros conocidos (aproximadamente de 20 muestras) debe
procesarse para evaluar el comportamiento de la técnica.
Se debe participar en las pruebas de proficiencia organizadas por IPK y CDC.

54
55
 PRÁCTICA N° 12
TEMA: PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA

Materiales

 Uno a dos 2 ratones de 11 a 15 gr de preferencia machos.

 Laminas cubre y porta objetos
 Microscopio de inmunofluorescencia
 Cámara húmeda
 Micropipetas (20ul, 50 ul, 100ul)
 Pipetas
 Equipo de disección
 Guantes de cirugía
 Mandil (guardapolvo)
 Mascarilla
 Recipiente con desinfectante (solución jabonosa)
 Estufa 37°C

PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE MUESTRAS

.
 Sujetar firmemente la cabeza del animal a una superficie de trabajo.
 Realizar una incisión profunda a lo largo de la línea media del cráneo, empezando por
delante y encima de los ojos hasta la base del cráneo o cuello, a través de la piel, fascia
y músculo.
 Separar la piel lo máximo posible, exponiendo los huesos del cráneo.
 Realizar cuatro cortes al cráneo con una sierra, asegurándose de atravesar todo el
cráneo: un corte transversal inmediatamente detrás de los cuernos, dos cortes
longitudinales al lado izquierdo y derecho del hueso frontal y un corte transversal encima
de los ojos uniendo los dos cortes anteriores.
 Levantar la tapa del cráneo con un desarmador para exponer las meninges y el cerebro.
 Cortar las meninges, levantar el cerebro y colocarlo en un papel absorbente limpio.
 Retirar porciones (del tamaño del cerebro de un can) de corteza, cerebelo, asta de Ammón
y médula y depositarlas en una placa petri o en envases primarios para su envío
respectivo.
 Rotular la muestra con el código correspondiente.

56
 MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA

1.1 FUNDAMENTO

1.1.1 La función del microscopio de fluorescencia es proveer luz necesaria para excitarun
colorante fluorescente y luego transmitir esta luz al observador. En inmunofluorescencia, el
colorante más utilizado es el isotiocianato de fluoresceína (ITCF), debido a su gran
afinidad por las proteínas (globulinas).

1.1.2 Para entender el fundamento de esta técnica es necesario conocer el fenómeno que
ocurre cuando un compuesto es irradiado con energía luminosa. Al irradiar el coloranteITCF,
la energía excita las moléculas, desubicando los electrones de los átomos de su núcleo
central (absorción de energía). Como el ITCF es un compuesto luminiscente, emitirá
nuevamente energía luminosa en forma de luz visible de una longitud de onda más
larga.
1.1.3 Para el diagnóstico de rabia se emplea este principio, utilizando un microscopio de
fluorescencia que presenta una fuente de iluminación de luz ultravioleta y mediante un
sistema de lentes y filtros se amplifica la imagen de la reacción del compuesto marcado con
ITCF con el antígeno. Para realizar la observación es necesario contar con una habitación
poco iluminada (“cuarto oscuro”).

1.2 OBJETIVO

Establecer los procedimientos a seguir para el empleo y mantenimiento del microscopio

de fluorescencia

1.3 MATERIALES

 Microscopio de fluorescencia (epifluorescente)

 Aceite de inmersión no fluorescente (Merck) o glicerina pura
 Lámina control positiva (coloreada con ITCF)

1.4 PROCEDIMIENTOS DE USO

1.4.1 Antes de encender el microscopio, verificar que los objetivos y oculares estén limpios.
Si es necesario, limpiar con papel lente seco. Nunca tocar los lentes con los dedos.

1.4.2 Enchufar el microscopio y encender la fuente de poder (algunos microscopios poseen

un indicador de prendido). El encendido debe realizarse de 3 a 5 minutos antes de iniciarcada
sesión de lectura, para permitir que la lámpara emita energía con adecuada intensidad.

1.4.3 Colocar la lámina porta-objeto coloreada en la platina, sin tocar el objetivo

1.4.4 Enfocar el campo con el objetivo de 40X, utilizando el micrométrico, evitando que la
lámina toque al objetivo. Con el micrométrico, enfocar para lograr una imagen clara.

1.4.5 Mover el sistema, agregar aceite de inmersión no fluorescente o glicerina pura y

enfocar con el objetivo de 100X.
1..4.6 Ubicarse en el extremo superior izquierdo, recorrer la lámina a la derecha y
57
 luego hacia abajo recorriendo ordenadamente toda la lámina.

1.5 PROCEDIMIENTOS DE MANTENIMIENTO

1.5.1 El microscopio presenta una lámpara de mercurio, la cual debe encenderse en una
sola sesión de lectura debido a que cada encendido equivale a 3 horas de vida de la
lámpara. Cuando la intensidad de luz disminuye notoriamente es necesario cambiar
la lámpara por otra, de acuerdo a los siguientes pasos:

1.5.1.1 Desconectar el equipo y dejar enfriar la lámpara a temperatura ambiente (caso

contrario, existe el peligro de explosión).

1.5.1.2 Abrir la caja que contiene la lámpara y retirarla aflojando los tornillos ubicados en
ambos lados.

1.5.1.3 Coger la nueva lámpara por los extremos (sin tocar el bulbo con los dedos) y colocarla
en la caja portadora ajustando en ambos lados.

1.5.1.4 Cerrar adecuadamente la caja portadora.

1.5.1.5 Si hubieran manchas en la superficie de la lámpara, limpiarla con un algodón

embebido en alcohol.

1.5.1.6 Los objetivos y oculares se limpiarán al inicio y término de cada sesión de lectura con
bencina ligera o alcohol, para remover las manchas y/o el aceite de inmersión.

1.5.1.7 Proteger el equipo contra temperaturas superiores a 50ºC, humedad, sustancias

químicas y contra el polvo, utilizando fundas protectoras de tela.

SECCION 2

ENSAYOS O ANÁLISIS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE

RABIA

2.1 RESUMEN DE LOS ENSAYOS (Anexo D)

2.1.1 Para el diagnóstico de rabia se emplean dos pruebas de rutina: la prueba de

inmunofluorescencia directa (IFD) y la prueba biológica de inoculación en ratones
(IR). Ambas pruebas poseen una alta sensibilidad y especificidad.

2.1.2 La prueba de IFD es una prueba rápida, con alta sensibilidad y que permite obtener
resultados en unas pocas horas. Por el contrario, la prueba de IR posee una mayor
especificidad, pero los resultados
se obtienen en 21 días, además que confirma el diagnóstico de pruebas negativas
por IFD.

2.1.3 En la prueba de IFD es necesario titular el conjugado antirrábico, buscando encontrar

la dilución óptima de éste.
2.1.4 De acuerdo a las recomendaciones del Comité de Expertos de Rabia de la
Organización Mundial de la Salud (OMS), un diagnóstico positivo en cualquiera de
las dos pruebas es concluyente.
2.1.5 La prueba de seroneutralización (neutralización del suero) en ratones es un
58
 procedimiento serológico que se utiliza para determinar si una persona o un animal
está protegido contra la rabia.

2.2 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INMUNOFLUORESCENCIA

DIRECTA
La IFD, debido a su rapidez y sencillez, es la primera prueba que se utiliza para el diagnóstico
de rabia. Si el resultado de la prueba es negativo, se procederá a realizar la inoculación en
ratones. La prueba de IFD detecta el antígeno rábico de la impronta mediante el uso del
conjugado antirrábico que contiene globulinas marcadas con ITCF.

2.3 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INOCULACIÓN EN RATONES

La prueba de inoculación en ratones es una técnica sencilla, basada en procedimientos
rigurosos. Esta inoculación se realiza en ratones debido a su alta susceptibilidad al virus rábico
y se manifiesta con una sintomatología clásica (erizamiento, parálisis, postración y muerte). Una
vez muerto el animal se procede a realizar la prueba de IFD para determinar si la muestra
inoculada es positiva a rabia.

2.4 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE SERONEUTRALIZACIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTIRRÁBICOS

La prueba de neutralización del suero en ratones es un procedimiento serológico que se utiliza

para determinar si una persona o un animal está protegido contra la rabia. Este método
determina la cantidad de anticuerpos presentes en el suero y se basa en la neutralización de
una serie de diluciones de suero con una dosis constante de un virus de desafío previamente
titulado. Los resultados son expresados en términos de títulos serológicos, definidos como
la dilución más elevada que neutraliza una cantidad estándar de virus.

SECCIÓN 3

TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA LA DETECCIÓN DEL

ANTÍGENO RABICO

3.1 PRINCIPIO Y UTILIDAD

La técnica de inmunofluorescencia directa está basada en la reacción antígeno-
anticuerpo que ocu-
rre al enfrentrar la impronta positiva (antígeno) con el conjugado antirrábico
(anticuerpos). Esta reac- ción puede ser detectada mediante la luz ultravioleta del
microscopio de inmunofluorescencia.

3.2 ESQUEMA Y SIMBOLOGÍA

Figura Nº 1. Esquema de lámina de IFD para rabia

59
 SIMBOLOS

Antígeno
rábico

Isotiocianato de
fluoresceína

Conjugado
antirrábico

Figura Nº2. Simbología empleada en la técnica de inmunofluorescencia

3.3 FUNDAMENTO

3.3.1 Si las improntas de cerebro y cerebelo contienen virus rábico, el resultado de la

prueba será positiva

60
3.3.2 El antígeno está fijado y permeabilizado. Se añade una gota de conjugado antirrábico+
CRN a la impronta cercana al lado pavonado y otra gota de conjugado antirrábico +
CVS a la impronta alejada del lado pavonado. Luego, se incuba los porta-objetos a
37ºC por 30 minutos. Si la impronta tiene antígeno rábico, se unirá el conjugado
antirrábico + CRN a la impronta del lado izquierdo, formando el complejo antígeno-
anticuerpo. En la impronta que contiene el conjugado + CVS no se unirán los
anticuerpos a la impronta porque ya están tomados por el CVS. Estos complejos
conjugado + CVS serán retirados durante los lavados con el PBS.

CRN + conjugado CVS + conjugado

3.3.3 La unión del conjugado antirrábico al antígeno rábico es detectada mediante la

excitación de la luz ultravioleta que se observa por la fluorescencia de color verde limón emitida
por el fluorocromo (FITC).

LÁMPARA DE
MERCURIO
3.3.2

Luz ultravioleta

Fluoresce
ncia
CRN + conjuga CVS + conjugado

3.4 MATERIALES Y REACTIVOS

 Solución salina tamponada, pH 7,2-7,4

 Conjugado antirrábico diluído 1/5 con CRN al 20%
 Conjugado antirrábico diluído 1/5 con CVS al 20%
 Acetona Q.P.

61
  Aceite de inmersión (Merck) ND 1,515 o glicerina pura
 Porta-objetos pavonados en un extremo
 Pipeta de transferencia o gotero
 Agua destilada
 Beaker de 1000 mL

3.5 PROCEDIMIENTO

3.5.1 Examen y lavado de la muestra

3.5.1.1 Luego de desembalar y verificar la codificación de las muestras se procede a codificar

las fichas con el código del laboratorio y el respectivo día de procesamiento, así como su ingreso
en el registro de muestras para diagnóstico de rabia (Anexo E).

3.5.1.2 Si la muestra fue remitida conteniendo glicerina 50%, se procederá a realizar un

lavado utilizando suero fisiológico (solución salina estéril 0,09%).

3.5.1.3 Colocar el cerebro y cerebelo en una placa petri y llevar a una mesa de trabajo

3.5.1.4 Realizar con la tijera un corte longitudinal al nivel de la primera circunvolución

caudal cortando para- lelamente a la línea que divide ambos hemisferios. El corte
se extenderá de 3 a 5 cm hacia delante, profundizándose hasta ubicar el ventrículo
lateral a nivel de una estructura de color blanco nacarado
en forma de cuerno, que sobresale lateralmente del suelo del ventrículo. Esta
estructura es el hipocampo o asta de Ammon, que al corte transversal muestra una
estructura típica de contorno espiralado (“pionono”).
3.5.1.5 Se realizarán dos cortes más, uno a nivel de la corteza cerebral y otro en el cerebelo,
siempre procurando coger la sustancia gris con un espesor de 3 a 4 mm.

3.5.1.6 Realizar dos láminas de la corteza, asta de Ammon y cerebelo en el caso de

animales menores (felinos y caninos). Para el caso de animales mayores (bovinos)
se realizarán cuatro láminas de las mismas zonas, con especial interés en el
cerebelo.

3.5.1.7 Los cortes de cada una de las estructuras se colocan sobre una tira de papel secante
o filtro y éste sobre un bajalengua.

3.5.1.8 Tomar un porta-objeto limpio y colocarlo con el bajalengua, formando una cruz.
Realizar dos impresiones en cada lámina procurando que la impronta no sea muy
gruesa. Si la impronta fuera muy gruesa, se podrá adelgazar presionando la
impronta sobre el papel filtro.

3.5.1.9 Colocar las láminas secas en un coplin con acetona fría (-20ºC) por un mínimo de
30 minutos.

3.5.1.10 Una vez seca la impronta, se procederá a delinear los bordes de ambas improntas
con un corrector líquido (liquid paper).

3.5.1.11 Diluir el conjugado antirrábico previamente titulado 1/5 con la suspensión de CRN o
agua destilada

62
3.5.1.12 Diluir el conjugado antirrábico con la suspensión de CVS 1/5

3.5.1.13 Agregar una gota de la mezcla del CRN + conjugado a la impronta más cercana del
extremo pavonado o que contenga el código.
3.5.1.14 Agregar una gota de la mezcla del CVS + conjugado a la impronta más alejada del
extremo pavonado.
3.5.1.15 Llevar a la estufa a 37ºC por 30 minutos
3.5.1.16 Lavar con solución salina tamponada pH 7,2-7,4 y dejar reposar por 10 minutos
3.5.1.17 Lavar con agua destilada
3.5.1.18 Dejar secar y observar a 100X con aceite de inmersión o glicerina pura, sin colocar
laminilla a la impronta.
3.5.1.19 La observación de las láminas se iniciará en el extremo superior izquierdo y
proseguirá hacia la derecha y luego hacia abajo, asegurando la observación
ordenada de toda la impronta.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

3.6.1 Lámina control positivo: La impronta teñida con CRN + conjugado muestra un
campo oscuro con células nerviosas, en cuyo interior o exterior, se observan
estructuras redondeadas (corpúsculos rábicos) o pequeños puntos de color verde
limón (Figura Nº 7). En el lado de la impronta teñida con CVS + conjugado, no
deberá observarse fluorescencia de color verde limón.

3.6.2 Lámina control negativo: Ambas improntas no mostrarán ningún tipo de

fluorescencia.

3.6.3 Láminas problema: Si la lámina se asemeja al control positivo, significará que la

muestra es posi- tiva; si se asemeja al control negativo, significa que la muestra
es negativa, hasta que se emita el resultado de inoculación en ratones.

Figura Nº3. Fotografía microscópica de una impronta de cerebro positivo a rabia

marcada con conjugado antirrábico. (Fotografiada por R López,
Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia)

3.7 PRECAUCIONES

3.7.1 Cuando las muestras contienen glicerina 50% en agua destilada se lavará con

63
 solución salina fisiológica 0,09% por 5 a 10 minutos, pudiéndose utilizar agua
destilada.

3.7.2 Si la muestra contiene preservantes como alcohol o formol, descartarla y obtener

en lo posible una nueva muestra que reúna las condiciones indicadas.

3.7.3 Si la muestra está demasiado contaminada (al punto de liquefacción), descartarla y

avisar al remitente.

1. Preparación de reactivos: Soluc. Stock 10 x hanks Earle y P.B.S., Sclue. Indicadores

de pH, Soluc. De Bicarbonato.
2. Preparación de reactivos: Soluc. Stock 10 x hanks Earle y P.B.S., Sclue. Indicadores
de pH, Soluc. De Bicarbonato.

3.8 PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA

3.8.1 La lámina control positivo de la impronta de CRN + conjugado no presenta

fluorescencia.
Explicación: La lámina tiene muchos días de preparación. En este caso es
necesario volver a preparar láminas control.

3.8.2 La impronta de CVS + conjugado presenta fluorescencia en la lámina control

positivo.
Explicación: El CVS ha bajado su título y ya no inhibe a los anticuerpos coloreados
del conjugado.

3.8.3 La impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado presentan fluorescencia

en la lámina control negativo.
Explicación: Presencia de precipitado o fluorescencia inespecífica. Observe si la
morfología es irregular debido a las sales de fluoresceína.

3.8.4 En la lámina problema la impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado

presentan fluorescencia.
Explicación: Posible contaminación bacteriana. Observe la morfología característica
de bacilos o coco bacilos. Pudiera ser también conjugado inespecífico que se
presenta en forma de cristales. En estos casos, centrifugue el conjugado paraeliminar
la coloración inespecífica.

FUENTE DE REFERENCIA

INS Manual de procedimientos para el diagnóstico de la rabia, Norma técnica N° 3 Año: 2002.

64
 PRÁCTICA N° 13

TEMA: PRUEBA DE WESTERN BLOT, LIA (PRÁCTICA DEMOSTRATIVA)

INTRODUCCION
Propósito para identificar proteínas utilizando anticuerpos. (Este ensayo identifica las
proteínas más específicamente que el ensayo por Inmuno histoquímica).
Pasos básicos: (Estos pasos no incluyen el bloqueo, lavados, etc.)
Aislar las proteínas.
• Ejecutar las proteínas (eléctricamente) a través de un gel Polyarcrilimida
• Seque las proteínas en una membrana nitrocelulosa (eléctricamente)
• Aplicar los anticuerpos primarios a la membrana (unirá a las proteínas de estar
presente).Aplicar anticuerpos secundarios - (unirá al anticuerpo primario). Este
anticuerpo está conjugado con una etiqueta fluorescente o luminosa (o molécula)
que reacciona con un sustrato para producir un resplandor.
 Aplicar sustrato. Este reacciona con la etiqueta en el anticuerpo secundario y si la
proteína fluorescente original estaba presente en el primer lugar.
• Rayos X detecta la luminiscencia, y las bandas se producen en estos puntos.
 Las bandas representan las proteínas de diferentes tamaños medidos en kiloDaltons
(KDa).

Bandas más abajo en la mancha representan proteínas más pequeñas. Esto se puede medir
con relación al testigo. El control contiene proteínas conocidas en kDa conocida, quepuede
ser utilizado como una referencia.

65
 PRÁCTICA N° 14

TEMA: TECNICA DE PCR (PRACTICA DIRIGIDA)

Capitulo 17
Guia practica sobre
la tecnica de PCR
Laura Espinosa Asuar
517

PCR son las siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la
Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento
de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que
proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79°C a 85°C), de
ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reacción de
PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se
mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del
organismo que queremos estudiar –donde se encuentra el fragmento que queremos
sintetizar– , los oligonucleótidos (llamados también primers, iniciadores, cebadores, “oligos”,
etc.) necesarios para que se inicie la transcripción, dinucleotidos (dNTPs), y las condiciones
para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de
magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos,
dependiendo de cada polimerasa). Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas
aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biología
molecular; sus aplicaciones van desde la genética de poblaciones, evolución molecular y
genómica hasta la medicina forense.

Pero como funciona el PCR? Supongamos que ya tenemos los tubos listos con todo lo
necesario para que la síntesis del fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq
polimerasa, dinucleotidos, ADN, agua, buffer con magnesio.

Las herramientas moleculares, magnesio y otras sales, y oligonucleótidos). El siguiente

paso es colocar los tubos en una maquina conocida como termociclador, que básicamente
sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. .Como es que se amplifica
el (o los) fragmento(s) que queremos?

Primero, para hacer más sencilla la explicación, vamos a suponer que esperamos un solo
fragmento de un tamaño determinado, y lo que sucede es lo siguiente (ver el primer ciclo
de la figura 1):

El termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una
y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la primera es a 95oC (y a este paso se
le llama desnaturalización) durante la cual las dobles cadenas del ADN se abren o
desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; después el termociclador ajusta
la temperatura en un intervalo entre 40° y 60°C (llamada de alineamiento), a esta
temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrogeno entre los
oligonucleótidos y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que son complementarias)
duraran mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña
región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño
pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas
bases mas, los puentes de hidrogeno que se forman entre las bases estabilizan mas la

66
unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. Después la
temperatura sube a 72oC (paso que se conoce como extensión), ya que 72oC es la
temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima actividad, y continua la síntesis de
los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleotidos que ya se habían alineado.

En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizaran los primeros fragmentos a
partir del ADN genómico. Estos primeros fragmentos no tendrán el tamaño esperado, serán
un poco mas grandes ya que la taq copiara hasta donde le sea posible, pero como veremos
más adelante, se obtendrán en cantidades tan pequeñas que al final no podremos
detectarlos. Después se repiten una vez más las tres temperaturas, pero en este segundo
ciclo, los oligonucleotidos, además de unirse al ADN que pusimos al inicio, también se
unirán a los fragmentos recién sintetizados del primer ciclo (ver segundo ciclo
de la figura 1), por lo tanto en este segundo paso la polimerasa sintetizara 2 fragmentos
largos copiados directamente del ADN y 2 fragmentos del tamaño esperado, que es el
tamaño que hay entre los dos oligonucleotidos que hemos usado. De esta forma con cada
ciclo aumentara el numero de fragmentos del tamaño que queremos. Cabe mencionar que
antes y después de estos ciclos se programan dos pasos, uno de 95oC durante varios
minutos para iniciar con desnaturalización, y al final de los ciclos, un paso ultimo de
extensión a Guía práctica sobre la técnica de PCR.

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Figura 1. Descripción del proceso de un PCR en los primeros ciclos de reacción.
Comúnmente se utilizan 35 ciclos para amplificar el fragmento que se requiere
(modificada de Parkes, 2003)

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