BRASILIA UNIVERSIDAD CIENCIAS DE LA

SALUD UNIVERSIDAD
PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS DE LA SALUD

efusiones PREPARACIÓN muestra de CITOLOGICO, se lavó (broncoalveolar y

peritoneal) y CSF POR MÉTODO
"PLASMA-TROMBOPLASTINA".

Tercia MARIA CASTRO MENDES LOUSA

Brasilia-DF

2016
 Tercia MARIA CASTRO MENDES LOUSA

efusiones PREPARACIÓN muestra de CITOLOGICO, se lavó (broncoalveolar y

peritoneal) y CSF POR MÉTODO
"PLASMA-TROMBOPLASTINA"

Tesis presentada en el requisito parcial para

la obtención de un título de Master en Ciencias de la Salud

Programa de Posgrado en Ciencias

Salud de la Universidad de Brasilia.

Asesor: Prof. .. El Dr. Pirani Fabiana Carneiro

Brasilia-DF

2016
 Tercia MARIA CASTRO MENDES LOUSA

efusiones PREPARACIÓN muestra de CITOLOGICO, se lavó ( BRONCOALVEOLAR Y

peritoneal) y LCR POR MÉTODO

"PLASMA-TROMBOPLASTINA"

Tesis presentada en el requisito parcial para

la obtención de un título de Master en Ciencias de la Salud

Programa de Posgrado en Ciencias

Salud de la Universidad de Brasilia.

aprobada en 02/29/2016 .

JUNTA EXAMINADORA

____________________________________
Prof. Dr. Pirani Fabiana Carneiro
(Presidente) FM -
Universidad de Brasilia

____________________________________
Prof. El Dr. Albino Magalhães Verçosa
(Titular interna miembros) FM -
Universidad de Brasilia

____________________________________
El Dr. Bravo Livia Maia (elemento de
soporte externo) HUB - Universidad de
Brasilia

_________________________________ Prof. Dr.

Andrea Barreto Motoyama
(Alternos externa miembros) FS -
Universidad de Brasilia
 CATALOGRÁFICA HOJA

CASTRO, MARIA Tercia Mendes de LOUSA

Preparación de la muestra citológica de los derrames, se lavó ( broncoalveolar y peritoneal) y CSF

Por el Método "Plasma-Tromboplastina" , 2016.

Asesor: Fabiana Pirani Carneiro

Tesis de Maestría - Universidad de Brasilia, Facultad de Salud, 2016.

Departamento de Patología.

1. "Block Cell" 2. "Plasma-tromboplastina"

3. muestras citológicas 4. inmunocitoquímica

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

Castro, TMML (2016). Preparación de la muestra citológica de los derrames, se lavó ( broncoalveolar y
peritoneal) y CSF a Método "Plasma-Tromboplastina" Tesis de maestría, Departamento de Patología de la
Universidad de Brasilia, Brasilia, DF, 51 p.

ASIGNACIÓN DE DERECHOS

NOMBRE DEL AUTOR: tercia Maria Mendes Lousa Castro Título de la tesis de la Maestra: Preparación de la
muestra citológica de los derrames, se lavó ( broncoalveolar y peritoneal) y LCR a Método
"Plasma-Tromboplastina".

GRADO / AÑO: Maestro / 2016

Se concede permiso a la Universidad de Brasilia para reproducir copias de esta tesis doctoral y para prestar o vender
dichas copias sólo para fines académicos y científicos. El autor se reserva los derechos de publicación y otros no
forma parte de la tesis de máster pueden ser reproducidos sin el permiso por escrito del autor.

__________________________________ tercia María

Mendes Lousa Castro Brasilia - DF - Brasil
tercialousa@gmail.com
Dedico este trabajo a mis padres Jovelino Pedro

y Benedicta, siendo la base de lo que me he convertido.

Mis hijos y Marillia Jovellino Pedro, por

entender mis ausencias.

 GRACIAS

• Para el Espíritu Santo y mi Ángel de la Guardia, lo que me permitió

la sabiduría y la ligereza en el tiempo requerido;

• Para el Prof. Fabiana Pirani, que creía en mi potencial académico para y me dio

todo el apoyo y el apoyo para este trabajo fueron a desarrollarse; por su

paciencia para conducir en las pistas científicas;

• A mis padres que me enseñaron a ser persistente, no se rinda antes

contratiempos que la vida nos puede ofrecer;

• Mis hijos que eran capaces de comprender la necesidad de mi

aislamiento;

• Los pacientes debido a que los datos proporcionados en esta investigación

una aplicación de la disposición a aliviar el sufrimiento de los demás, la transformación

su propio sufrimiento con la esperanza de mejorar el diagnóstico de ese

Ellos llegan a tener enfermedad similar;

• El Centro de Patología, Hospital de la Universidad de Brasilia, mi

más sincero agradecimiento a todos por su cooperación con la recogida de

datos, en particular la deisiane (recepción) y Celso (citología), por su

la contribución estimada;

• El Centro de Patología Clínica, Hospital de la Universidad de Brasilia, en especial

Aluízio a Smith (hematología) por su valiosa contribución;

• El hueso y Elizabeth por su dedicación en la ejecución de los trabajos técnicos

de laboratorio necesarios para la investigación;

• Los estudiantes de talento joven a la ciencia, la escuela de medicina, Rafael,

William y Larissa, la contribución importante en el desarrollo de este

trabajar;

• Profesores del Departamento de Patología, Facultad de Medicina,

Universidad de Brasilia, especialmente los maestros Leonora Vianna, Andrea

Motoyama y Vania Ferreira, por el apoyo y cálida bienvenida;

• Para todas las personas que me dieron fuerza, en especial a mi amigo Maria da

Gloria, para los amigos "Glorinha" que ha estado siempre presente en todo

momentos;
• Para el personal del Programa de Posgrado en Ciencias de la Salud,

Universidad de Brasilia, en particular la Edigrês, por su atención y orientación

preciosa;

• El Programa de Ciencias de la Salud de Posgrado de la Universidad de

Brasilia, por el apoyo financiero;

• La gente que me declararon un enemigo y me hizo llorar, porque ellos

Ellos me están enseñando a la estrategia de articular, sortear y superar las dificultades

Yo estaba expuesto.
"Tomar en su memoria por el resto de su vida las cosas buenas que
venían en medio de las dificultades. Ellos serán una prueba de su
capacidad para superar las pruebas y darle confianza en la presencia
divina, que nos ayuda en cualquier situación, en cualquier momento antes
de que cualquier obstáculo ".

Chico Xavier

"El futuro depende de lo que hacemos en el presente."

MAHATMA GANDHI
 RESUMEN

El análisis de muestras citológicas es un procedimiento de rutina en el diagnóstico y seguimiento de

pacientes con una baja incidencia de cáncer y la alta incidencia y mortalidad y cánceres. "Bloque de la
célula" consiste en una forma de preparación citológica en el que el precipitado de la muestra centrifugada
se incrusta en parafina y se sometió al procesamiento histológico habitual. A pesar de la "bloque de celdas"
ser considerado como un método de diagnóstico de gran aplicabilidad en el diagnóstico de rutina, los
estudios que utilizan esta técnica son escasos, con pequeñas cantidades de muestras y no hay variación
en la descripción de los diferentes métodos de preparación. Además, no está bien establecida la indicación
de cada método, de acuerdo con los diferentes tipos y aspectos de muestras citológicas. Por lo tanto, El
objetivo de este estudio fue evaluar la aplicabilidad del método de "-tromboplastina plasma" en la
preparación de "bloque de celdas" 299 muestras citológicas (líquido pleural, ascitis y pericárdico, se lavó y
BAL peritoneal, líquido cefalorraquídeo, orina y aspirados de lesiones quísticas) en el laboratorio patología
del HUB en la UnB. Citocentrifugado, "bloque de celdas" y la inmunocitoquímica se prepararon para cada
muestra citológica. El método de "plasma-tromboplastina" para preparar el "bloque de células" se aplicó
técnicamente en las muestras de pellets sin o pequeña cantidad de sedimento y otra pellet sangre, que
corresponde a 88,3% (264/299) de ellos. Las muestras con cantidades grandes de sedimento y con el
anticoagulante, 11,7% (35/299) fueron preparados por el método de "agar". Celularidad y distribución
celular adecuado preservar la morfología de las células y los racimos se observaron en muestras
preparadas por los métodos de "plasma-tromboplastina" y "agar". La tinción inmunohistoquímica estándar
era similar a la observada en general en citocentrifugadas. Se observó concordancia en 96,9% (290/299),
kappa = 0,88 (positivo y negativo para malignidad) entre los diagnósticos el "bloque de células" y
citocentrifugado. El método de "plasma-tromboplastina" se aplica en el diagnóstico de rutina de laboratorio
de patología a ser un método técnicamente factible. La alta correlación entre el citocentrifugado y "bloque
de celdas", preparado por el "tromboplastina plasma," Método para el diagnóstico de cánceres y,
especialmente,

palabras clave: muestras biológicas; "Cell Block"; inmunocitoquímica; "Plasmatromboplastina".

 RESUMEN

El análisis citológico es un procedimiento de rutina en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con cáncer

altos de incidencia y mortalidad. "Bloque de la célula" consiste en una forma de preparación citológica del
precipitado en la que de la muestra centrifugada se incrusta en parafina y se sometió al procesamiento
histológico habitual. A pesar de la "bloque de celdas" Considerado como método de diagnóstico de amplia
aplicabilidad en la práctica habitual, los estudios que utilizan esta técnica son escasos, con pequeñas
cantidades de muestras y no hay variación en la descripción de los diferentes métodos de preparación. Por
otra parte, la indicación de cada método de acuerdo con los aspectos de diferentes tipos y muestras
citológicas no está bien establecida. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la aplicabilidad de
la "plasma-tromboplastina" Método en la preparación de la "bloque de celdas" de muestras citológicas
(derrame pleural, ascitis, líquido pericárdico, lavado peritoneal y broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo,
orina aspiró y las lesiones quísticas) en el laboratorio de Anatomía Patológica del HUB. frotis citológico
convencional "bloque de celdas" y la inmunocitoquímica se prepararon para cada muestra citológica. El
método de "-tromboplastina plasma" para preparar el "bloque de celdas" era aplicable, técnicamente, en
muestras sin o pequeña cantidad de sedimento y sedimento en la muestra de sedimento de la sangre, que
corresponde a 88,3% (264/299) de las muestras. Las muestras con gran cantidad de sedimento y
anticoagulante, 11,7% (35/299) fueron preparados por el método de "agar". celularidad adecuada y
distribución celular con la preservación de la morfología de las células eran grupos observado y en las
muestras preparadas por "tromboplastina plasma", y métodos "agar". El patrón de tinción
inmunocitoquímica fue similar a Que observa generalmente en frotis citológicos convencionales. Observado
en Acuerdo fue 96,9% (290/299), kappa = 0,88 (positivo y negativo para malignidad) entre los diagnósticos
del "bloque de celdas" y frotis convencionales. El método de "-tromboplastina plasma" es aplicable para la
rutina de diagnóstico de laboratorio de patología para ser un método técnicamente viable. La alta
correlación entre frotis convencionales y "bloque de celdas", preparado por el método de "-tromboplastina
plasma" para el diagnóstico de cáncer y la detección de cáncer sólo en el "

palabras clave: muestras biológicas; "Cell Block"; inmunocitoquímica; "Tromboplastina del plasma".
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Método "tromboplastina plasma". .................................................. .......... 21

Figura 2 - Los diferentes aspectos y tipos de muestras. (A) líquido cítricos

ascitis. (B) líquido del quiste muscular purulenta. (C) ascitis hemorrágico.

(D) opaca y de color marrón, el lavado peritoneal. (E) con una mucosidad acuosa, la sangre y

coágulo "Natural" (la flecha), lavado broncoalveolar. (F) acuoso (CSF). ................... 34

Figura 3 - no (A) muestras con baja (B) y con las cargas de

pellet (C) después de la centrifugación. .................................................. ....................... 35

Figura 4 - ascítico muestra de fluido antes de la centrifugación (A), coágulo

preparado por el método de "-tromboplastina plasma" formalina (B) y el casete (C)

antes del procesamiento histológico. .................................................. 35 ......................

Figura 5 - "bloque de celdas" histológico preparado por el método de "plasma

tromboplastina, "HE. (A) numerosos grupos celulares de adenocarcinoma y

bien distribuido (40X). (B) atipia nuclear en las células dispuestas en racimos

glandular (200X). fragmentos (C) de tejido con carcinoma de células escamosas (100X).

(D) estructuras fúngicas (flecha) y células degeneradas (punta de flecha) (200X) ........ 37

Figura 6 - muestra hemorrágico antes de la centrifugación (A), después de la centrifugación (B)

y después de eliminar el sobrenadante (c) halo (flecha) y capa de glóbulos rojos

por debajo de halo (asterisco). (D), (E) y (F) secciones histológicas de la "bloque de celdas"

preparado por la "-tromboplastina plasma" HE (100X) el método: (d) halo; (E) capa

RBC y (f) precipitar. .................................................. ................................ 38

Figura 7 - Clot "natural" en la muestra de líquido pleural. (A) en el coágulo botella

(Flecha) y (B) en el coágulo cassette. (C) y (D) coágulo histológico "natural"

el "bloque de celdas", preparado por el método de "plasma-tromboplastina" HE. ..................... 39

Figura 8 - (A) y (B) expresión inmunocitoquímica MOC-31, 200X. agrupaciones

de células de adenocarcinoma de manchado marrón en el citoplasma y membrana. (A)

con la muestra fijado con formalina. (B) muestra fijada con alcohol. (C) y (D)

inmunocitoquímica, la expresión del receptor de estrógeno, 200X. agrupaciones

células de adenocarcinoma tiñeron de color marrón en el núcleo. (C) muestra fija con

formaldehído. (D) muestra fijada con alcohol. (E) y la expresión inmunocitoquímica (F)

Ki67, 200X. Agrupado con células de adenocarcinoma manchado marrón en

núcleo. (E) muestra fijada con formalina al 4% (10% de formaldehído). muestra (F) fijado

alcohol .. .............................................. .................................................. ............... 40

Figura 9 - muestra de lavado peritoneal con una gran cantidad de sedimento

antes (A) y después de la centrifugación (B). Gel formado por el "agar" en formalina

4% (a 10% de formaldehído) (C) y el casete antes de (D) y después (E) el procesamiento

histológico. .................................................. .................................................. ............. 41

Figura 10 - Las secciones histológicas de "bloque de celdas", preparado por el "agar", HE

(Intensidad de tinción débil). grupos de células de adenocarcinoma (A)

numerosos y bien distribuida (40X). (B) grupos de glandular

atipia celular de adenocarcinoma y el cuerpo psammoma (flecha) (100X). ......... 42

Figura 11 - La inmunocitoquímica, la expresión de MOC-31 (A) y Ki67 (B) 200X. (A)

grupos con células de adenocarcinoma tiñeron de color marrón en el citoplasma y

membrana (muestra fijada en formalina). grupos (B) adenocarcinoma

con células teñidas de color marrón en el núcleo (formalina muestra fija) ............ 43
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1 - Distribución de los estudios sobre el método de "plasma-tromboplastina" de

Según el tipo, número y volumen de muestras. ................................................. 20

Tabla 2 - Los cambios en la técnica de preparación de coágulo con la velocidad y

tiempo de centrifugación, las cantidades de plasma, la trombina / tromboplastina .............. 22

Tabla 3 - distribución de los tipos de muestras de acuerdo con el método de preparación

el "bloque de celdas" ............................................. .................................................. ............. 36

Tabla 4 - La frecuencia de resultados concordantes y discordantes entre

citocentrifugadas y "bloque de celdas" en las muestras preparadas por el método de "plasma

tromboplastina "y" agar" ............................................ 43 ................................................

 LISTA de abreviaturas y acrónimos

CEP-FM ................ Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la UNB

DAB ................................................. ........................................ 3-4 diaminobencidina

DH 2 El ................................................. .................................................. Agua destilada

H 2 la 2 .................................................. ...................................... Peroxido de hidrogeno

HCl ................................................. .................................................. .. Ácido clorhídrico

HE ................................................. ........................................... hematoxilina y eosina

HRP ................................................. ...................................... peroxidasa de rábano picante

HUB ................................................. ........................ hospital de la Universidad de Brasilia

INCA .................................................. ............................. Instituto Nacional del Cáncer

KCI ................................................. .............................................. Cloruro de potasio

KH 2 correos 4 .................................................. ................. fosfato de potasio monobásico

LSAB ................................................. .............................. estreptavidina marcada con biotina

NaCl ................................................. ................................................. cloruro de sodio

en 2 HPO 4 .................................................. ........................... fosfato dibásico de sodio

PBS .................................................. .................................. salina tamponada con fosfato

rpm ................................................. la rotación por minuto ..............................................

TBS ................................................. ............................................. salina tamponada con Tris

 RESUMEN

1. INTRODUCCIÓN ................................................ .................................................. ..... 17

1.1 "CELL BLOCK" ............................................. .................................................. ..... 19

1.2 MÉTODO "PLASMA-TROMBOPLASTINA " ................................................. ........ 20

1.2.1 TIPOS DE muestras citológicas ........................................... ............. 20

1.2.2 Descripción de las ............................................ ................................ 20

1.2.3 Comparación con otros Métodos de preparación "CELL BLOCK" 0.22

1.2.4 COMPARACIÓN CON CITOCENTRIFUGADO ............................................ ... 24

Antecedentes ................................................ 2 .................................................. ... 25

OBJETIVOS 3 ................................................ .................................................. ......... 26

3.1 Generalidades ................................................ .................................................. .................. 26

3.2 específico ................................................ .................................................. ........ 26

4 Materiales y métodos .............................................. ....................................... 27

4.1 MUESTRAS ................................................ .................................................. ...... 27

4.1.1 Criterios para la inclusión .................................................. .......................... 27

4.1.2 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN .................................................. ........................ 27

4,2 CITOCENTRIFUGADO ................................................ ....................................... 27

4.3 "CELL BLOCK" ............................................. .................................................. ..... 28

4.3.1 Método "plasma-tromboplastina" ......................................... ............................. 28

4.3.2 Método "agar" ........................................... .................................................. ...... 29

4.3.4 inmunocitoquímica .............................................. ........................................ 30

4.4 Análisis estadístico ............................................... ...................................... 33

5 RESULTADOS ................................................ .................................................. ..... 34

5.1 MUESTRAS ................................................ .................................................. ...... 34

5.2 MÉTODO "PLASMA-TROMBOPLASTINA" ........................................... .............. 35

5.3 MÉTODO "AGAR" ............................................. .................................................. 41

6 DISCUSIÓN ................................................ .................................................. ........ 44

Características de la muestra 6,1 .............................................. .................... 44

6,2 viabilidad técnica y económica DEL MÉTODO "PLASMATROMBOPLASTINA" ........................................
.................................................. ...... 45

6.3 calidad de los resultados de las muestras preparó por el Procedimiento .........................................
.................................................. ........................ 47

6.4 ACUERDO ENTRE EL "bloque de celdas" preparado por el método "PLASMA-TROMBOPLASTINA"

CITOCENTRIFUGADO Y PARA LA CÉLULA DE BÚSQUEDA NEOPLÁSICAS .........................
.................................................. ....... 49

6.5 APLICACIÓN DE LA "AGAR" MÉTODO ........................................... ........................ 49

6.6 PERSPECTIVAS ................................................ ................................................. 51

CONCLUSIONES 7 ................................................ .................................................. .... 52

Referencias 8 ............................................... ....................... 53

 17

1 INTRODUCCIÓN

De acuerdo con estimaciones 2016/2017, Brasil debe registrarse con

el próximo año 596.000 nuevos casos de cáncer, de acuerdo con el INCA (Instituto

Nacional del Cáncer) 1. El análisis de muestras citológicas es un procedimiento

rutinaria en el diagnóstico y seguir pacientes con altos cánceres

incidencia y la mortalidad como los carcinomas de mama, de colon,

estómago y tiroides 2.

La citología es una, método de diagnóstico rápido, de bajo coste asequible y

poco pesado, pero tiene una sensibilidad y especificidad variables,

dependiendo de muchos factores, lo que resulta en una escasez de células neoplásicas,

a menudo es difícil diferenciar en este examen, las células benignas de

maligno o incluso identificar el origen de una célula neoplásica 3-5.

Un método complementario al laboratorio de citología también se puede aplicar

La patología es la inmunocitoquímica se utilizan marcadores

Los teléfonos que permiten diferenciar benigno de células malignas, identifican la

tejido de origen de la célula neoplásica y también sugieren el sitio primario probable de

neoplasia, en los casos de metástasis 6.7.

"Bloque de la célula" consiste en una forma de preparación en la que el citológico

el precipitado se centrifuga la muestra se incluyeron en parafina y se sometieron a

procesamiento histológico habitual 2. En el diagnóstico de rutina, es un método

Preparación adicional de muestras citológicas (derrames / líquido

la pleural, peritoneal, pericárdica, y lavado peritoneal

BAL, CSF) y citología por aspiración 2.

en muestras en las que existe la necesidad de llevar a cabo la inmunocitoquímica, la

"Bloque de la célula" tiene algunas ventajas sobre citocentrifugado:

facilidad de interpretación morfológica menor costo efectivo,

posibilidad de realizar más reacciones inmunocitoquímicas y

La presentación de bloque de parafina para su uso en el futuro técnico 8.9. entre los

sus métodos de preparación descritos, el "plasma thromboplastin- / trombina" ha sido

 18

considerada una técnica de juego fácil y mejor calidad para su aplicación

inmunocitoquímica 10-17.

Actualmente, la mayoría de los laboratorios de Anatomía Patológica, solamente

Parte de las muestras se citocentrifugadas, muestra residual siendo descuidada y

"bloque de celdas" preparados sólo aquellas muestras que muestran residuos

sólidos. Mediante la adición de la tromboplastina plasmática y se precipitó el centrifugado

permite la formación de coágulos que contienen células de muestra, que

Pueden ser incluidos en parafina. Al principio, por este método " plasma

tromboplastina / trombina, "y todo Cualquier muestra se puede archivar y

utilizado para inmunocitoquímica.

 19

1.1 "Bloque de celdas"

Este es uno de los métodos más antiguos de preparación para la microscopía y

Es la inclusión de muestras citológicas de sedimentos en parafina 18.19.

Varios estudios demuestran que se debe utilizar para procesar todo

material residual que queda después de la finalización de los preparativos

citológico 18.19. Este material normalmente contiene fragmentos de tejido

importante que no se pueden procesar por técnicas citológicas 18.19.

El método utiliza técnicas de procesamiento histológico y por lo tanto

Ofrece la ventaja: varias secciones del mismo material se pueden teñir

con tintes de rutina, tales como hematoxilina y eosina, o tinciones especiales

para la identificación de mucina, la melanina, bacterias y hongos. Además, puede

También servirá para inmunocitoquímica 18,19,20.

El fijador de formalina tamponada es el más utilizado y permite

procedimientos adicionales 18,19,20. La ventaja de la técnica es la presencia de residuos

sólidos que permite el reconocimiento de patrones histológicos de lesión que no

Pueden ser identificados en frotis y citocentrifugación 18,19,20. muestras

citológico, más a menudo se envía al laboratorio de anatomía

Patológicos son efusiones (fluido pleural, ascitis y pericardial), se lavó

(Broncoalveolar y peritoneal), líquido cefalorraquídeo, aspirado de muestras y las lesiones quísticas

en citología líquida 2.

Varios métodos de preparación "bloque de celdas", utilizando diferentes

sustancias ya se han descrito: "agar" 21-26, "HistoGel" 27-29 "Albúmina de gelatina" 10

"Colodión" 30, "Almidón gelatinizado Pre-" 31, "El alginato de sodio" 32, "El alcohol de polivinilo

espuma " 33, "Las cápsulas de gelatina" 34, "Tejido coágulo coágulo" 35-37 y "plasma

tromboplastina / trombina " 10-16. La preparación automatizada también ha sido

descrito 23,38-44. Hay una variación significativa en la descripción de cada técnica

la proporción de la muestra, el volumen y la concentración de las sustancias

empleado, por lo que es difícil comparar la eficacia de los métodos 45-46. Entre estos,

los métodos más comúnmente usados ​son el "agar" y "-tromboplastina plasma / trombina" 45.
 20

1.2 MÉTODO "PLASMA-TROMBOPLASTINA / trombina"

1.2.1 Tipos de muestras citológicas

El método de "tromboplastina plasma", ha sido descrito en la preparación

diferentes muestras citológicas: efusiones, lavado peritoneal, se aspiraron y

muestras en medio líquido. En la Tabla 1, los estudios se distribuyen de acuerdo

con el tipo, número y volumen de muestras.

Tabla 1. Los estudios de distribución en el método de "plasma-tromboplastina", según el tipo, número y volumen de
muestras.

especie Estudios Número Volumen

efusiones 29 - Fetsch et al. (2002) 13

38 10- Kulkarni et al. (2009) 11

20 ml

25 50 ml Jing et al. (2013) 12

100 10 ml Shukla et al. (2015) 16

lavado peritoneal 10 - Selvaggi (2003) 14

aspirado con aguja fina 32 - Kulkarni et al. (2009) 11

Non citología de base líquida 12 30 ml Nigro et al. (2007) 10

ginecológico

citología de base líquida 125 50 ml Keyhani-Rofagha y

ginecológico Vesey-Shecket (2002) 15

1.2.2 Descripción de la técnica

La técnica consiste en la adición de la formación de coágulos en el plasma y

trombina / tromboplastina centrifugó para precipitar. El coágulo se forma en

después se transfiere a papel de filtro, envuelto en cinta, ajuste en

4% de formalina (formalina al 10%) y se sometió al tratamiento histológico habitual

(Figura 1).
 21

Figura 1. Method "tromboplastina plasma"

Fuente: Jain et al. (2014).
 22

Las muestras se fijaron en formalina o alcohol deben ser lavados con solución salina

o PBS (Inglés, salina tamponada con fosfato) para evitar que la impiden sujetador,

la formación de coágulos 11.15. las descripciones técnica de voluntad no se realizó en algunos

estudios o se ha realizado sólo parcialmente y con variaciones entre ellos con

la velocidad y el tiempo de centrifugación, las cantidades de plasma trombina

y tromboplastina (Tabla 2). El tiempo para la formación del coágulo es de hasta 5

min 15 y 4% de formalina DH diluye 2 El coágulo se utiliza para la fijación de 11,13,15 .

Hasta dos intentos sucesivos adicionales se presentan a la formación de

coágulo 15.

Tabla 2. Los cambios en la técnica de preparación de coágulo con la velocidad y el tiempo de centrifugación,
las cantidades de plasma de trombina / tromboplastina.

Velocidad de centrifugado 1200 rpm 13 1500 rpm 15i 2320 rpm 12 2500rpm 16

tiempo de centrifugación 10min 13,16, 5 min 12.15

plasma 6 gotas 10 2 gotas 11,16, 2,3 gotas 12 2 3 gotas

<3 ml de sedimentos> 4-10gotas 15

trombina 2,3 gotas 12 1ou2 gotas <3 ml

sedimentos> 3ou4gotas 15

tromboplastina 6 gotas 10 4 gotas 11 2 gotas 16

1.2.3 Comparación con otros métodos de preparación de "Cell Block"

El "bloque de celdas" puede prepararse sin muestras de sedimentos en

muestras con cantidad grande o pequeña de sedimento, así como la

Los residuos sólidos y la formación de coágulos naturales presentes en la muestra 20.

El simple sedimentación es un método de preparación de la muestra con gran

cantidad de sedimento, ampliamente utilizado en los laboratorios de anatomía

Patológico, la implementación técnica de la instalación. Esto consiste en centrifugar la

muestra de sedimento a un papel de transferencia con una espátula,

embalar en la cinta, se fijaron en formalina, someter el pellet a

procesamiento histológico habitual y la incrustación en parafina 47-49. Sin embargo,

 23

sedimentos es friable y sin pérdida durante el procesamiento y dilución significativa

células resultantes en baja celularidad en secciones histológicas de la "célula

bloque " 45.

La mayoría de las muestras no presenta ninguna o una pequeña cantidad de

pellet, siendo el "bloque de celdas", preparado por la adición de ellos al precipitado

sustancias como agar, albúmina, histogel y plasma con

tromboplastina / trombina 10,22,28,45. Entre estos, los más utilizados son agar y

"Plasma thromboplastin- / trombina" 45. En general, la desventaja en

El uso de estas técnicas es el tiempo más largo requerido para preparar la "célula

bloque "; artefactos relacionados con las células de agar calefacción y histogel

También se describen 12.45.

Nigro et al. (2007) observaron que el "bloque de celdas" de muestras en la base de

líquido preparado por el método de "tromboplastina plasma," tiene mejor

celularidad, mejor distribución celular y lo mejor resultados

inmunocitoquímica en comparación con "bloque de celdas", preparado por

sedimentación simple, la solución técnica de filtro invertida y albúmina 10.

Kulkarni et al. (2009) también la conclusión de que el método de "plasma-tromboplastina"

es una técnica de juego fácil en comparación con el método de "agar" 11. la

estudios que comparan el método de "plasma-tromboplastina" con otras técnicas

preparación del "bloque de celdas", utilizando diferentes tipos de muestras son escasos y,

a menudo con un pequeño número de muestras y esto impide una conclusión

ventajas definidas sobre otras técnicas.

El "bloque de celdas" puede también ser preparado de una manera automatizada, pero

alto costo del equipo utilizado sería estrangular a su empleo en la mayoría

laboratorios 38-44. Las principales ventajas de este método son la mayor y la celularidad

velocidad de procesamiento que dura menos de 60 minutos, mientras

el "bloque de celdas" tradicional este tiempo es de aproximadamente 24 horas 23.

 24

1.2.4 citocentrifugado Comparación

En las muestras de efusión (líquido pleural, ascitis y pericárdico) el "célula

bloque " preparado por "-tromboplastina plasma" método, mejor costo

beneficiarse cuando se compara con citocentrifugado y citología en medio líquido,

especialmente cuando se aplica inmunocitoquímica 13.

La inmunocitoquímica "Bloque de la célula" Tiene las ventajas de

facilidad de interpretación, menos la coloración de fondo, permite el uso de

un mayor número de anticuerpos y la disponibilidad de archivado y uso en

Los estudios futuros 13. Entre las desventajas, no es el más alto costo,

necesitar más tiempo para método de ejecución y, en consecuencia,

un retraso en el diagnóstico 13.

en muestras de lavados peritoneales, mientras que el "Bloque de la célula" no se

utilizado rutinariamente en el laboratorio, la ventaja sobre citocentrifugado

es la presencia de fragmentos de tejido con características histológicas de la lesión y del

mejores resultados de inmunocitoquímica 14. En las muestras ginecológicas basado en

red, el uso de "Bloque de la célula" preparado por el método de "plasma

tromboplastina / trombina "puede proporcionar una mayor sensibilidad y

especificidad, aunque la carga de los costos y el tiempo de ejecución 15.

 25

2. Antecedentes

La sensibilidad y baja especificidad de la investigación citología

células neoplásicas de pacientes con cáncer dan como resultado, inevitablemente, en

diagnóstico y tratamiento tardío, los errores en la puesta en escena y el pronóstico y el uso de

técnicas de diagnóstico invasivas. El uso combinado de citocentrifugado con "célula

bloque "aumenta la detección del cáncer, identificación de los sitios respectivos

tipos primarios e histológicos en muestras citológicas 47-50. El método de preparación

el ideal "bloque de celdas" debe ser fácil de usar, de bajo costo, calidad satisfactoria

y aplicable para la muestra citológica más. A pesar de la "bloque de celdas" estar

considerado un método de diagnóstico de gran aplicabilidad en la rutina

diagnósticos, estudios son escasos, con un pequeño número de muestras y allí

variación en la descripción de los diferentes métodos de preparación. Por otra parte, no es

indicación bien establecido de cada método de acuerdo con los diversos tipos

y aspectos de muestras citológicas.

 26

3. OBJETIVOS

3.1 Uso General

Para evaluar la aplicabilidad del método "plasma-tromboplastina" para preparar

"Bloque de celdas" muestras citológicas (líquido pleural, ascitis, líquido pericárdico,

y broncoalveolar lavó peritoneal, líquido cefalorraquídeo, orina y aspirados de lesiones quísticas)

en el Laboratorio de Patología de la Universidad de la Escuela de Medicina

Brasilia.

3.2 Objetivos específicos

• Para evaluar la aplicación del método "de tromboplastina plasma", según la

Características de la muestra: tipo, el aspecto y cantidad de sedimento.

• evaluar técnicamente la viabilidad de utilizar el método "plasma

tromboplastina " en la preparación de "bloque de celdas" Sample citológico.

• Para evaluar la cantidad, distribución y conservación de las células, la expresión

marcadores inmunocitoquímicos en el "bloque de celdas" prepararon por el método

"Plasma-tromboplastina".

• Verificar el acuerdo entre el citocentrifugado y "bloque de celdas" preparada

el método de "plasma-tromboplastina" para buscar células neoplásicas.

 27

4 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 MUESTRAS

4.1.1 Criterios de inclusión: Este trabajo consistió en un estudio de

muestras citológicas que se analizaron (líquido pleural, líquido ascítico

pericárdico, peritoneal y broncoalveolar lavadas, CSF, orina y aspiradas

lesiones quísticas) enviados al Laboratorio de Patología, Hospital

Universidad de Brasilia, en los años 2013 y 2014, puso en el refrigerador,

por un período de hasta 2 semanas.

4.1.2 Criterios de exclusión: Fueron excluidos de las muestras de estudio

pacientes menores de 18 años, los casos indígenas, discapacitados, y negativos en

participación en el estudio.

El proyecto de investigación fue aprobado por el Comité Ético de Investigación -

CEP-FM (768140) como Anexo A (página 60).

4.2 CITOCENTRIFUGADO

indicación Todas las muestras:

material :

• papel de filtro

• micropipetas

• consejos

• Alcohol 99%

Pasos de la técnica :

• Pipetear 1 ml de la muestra en citofunil previamente acoplados a y citoclipe

hoja y el papel absorbente.

• Centrifugar a 2000 rpm durante 2 minutos modelo centrífuga "Cytopro®

Citocentrífuga - Rotor / AC-160 "

• Retire el montaje y desenganche las cuchillas.

• Fijar deslice 99% de alcohol inmediatamente.

• Colorear: método de Papanicolaou.

 28

observaciones :

En esta técnica, las células en suspensión se depositan sobre el portaobjetos de vidrio,

hacer un diámetro de 5 mm, mientras que los medios se absorbe la suspensión

Por un pañuelo de papel propio.

4.3 "bloque de celdas"

4.3.1 Método "plasma-tromboplastina"

indicación: Las muestras con ninguna o una pequeña cantidad de muestra de sedimento, y

con el sedimento de la sangre (sin anticoagulante).

material:

• plasma humano

• Tromboplastina (r NEOPLASTINE IC PLUS 5)

• Tubo de propileno / polietileno cónica columna de 15 ml de fondo.

• micropipetas

• consejos

• Desechables pipeta Pasteur

• pinza dentada

• casete

• El papel de pergamino y tijeras

• De formalina al 4% (a 10% de formaldehído)

Pasos de la técnica:

• Retire el plasma para descongelar.

• Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 1500 rpm

• Descartar el sobrenadante con la pipeta

• Añadir 50 ml de plasma el precipitado y mezclar

• Añadir 50 ml de tromboplastina y se mezcla durante aproximadamente 1 minuto

• Deje que forma un coágulo dentro de 2 min

• Cuando no se forma el coágulo, repita el proceso o utilizar el "agar"

• Después de la formación del coágulo, añadir 2 ml de formalina al 4% para

promover el desplazamiento del fondo de la botella y la fijación del coágulo

muestra.
 29

• Eliminar el coágulo botella, envuelva el papel encerado y poner en

casete habitual procesamiento histológico y tinción

Hematoxilina-eosina (HE).

observaciones:

• Si la muestra se fijó con el alcohol o las envía a un laboratorio con

anticoagulante, el sedimento se debe lavar al menos dos

sucesivos intentos adicionales con una solución salina o PBS, como

estas sustancias inhiben la coagulación de plasma y la tromboplastina.

• Preparación 10X PBS (1 l)

la NaCl (137mm) - 80g

la KCl (2,7 mm) - 2g

la en 2 HPO 4- { fosfato dibásico de sodio} -14,4g

la KH 2 correos 4 ( 2 mM) {} fosfato de potasio monobásico - 2,4 g

la DH 2 El - 800 ml

la Ajustar el pH a 7,4 con HCl

la Completar hasta 1 litro y autoclave.

• En la muestra sin color, se recomienda colocar en el coágulo antes de eosina

procesamiento histológico para facilitar la visualización en el momento de

inclusión en parafina.

• El plasma utilizado en la técnica se obtuvo en Clinical Center Pathology

Hospital de la Universidad de Brasilia / UnB, el laboratorio de hematología,

distribuyen micro túbulos de tipo "tubos Eppendorf" y se conservan en el congelador

para un máximo de 3 meses. Unos pocos minutos antes de su uso, el plasma se mantuvo en

temperatura ambiente hasta que se convierte en líquido.

4.3.2 Método "agar"

indicación: Las muestras con una gran cantidad de sedimento.

material:

• Agar (Agar bacteriológico- Himedia)

• tubo Falcon de 15 ml.

• micropipetas

• consejos

• Desechables pipeta Pasteur

 30

• pinza dentada

• casete

• El papel de pergamino y tijeras

• De formalina al 4% (a 10% de formaldehído)

técnica :

• preparación Agar: 1% a 5% (1 a 5 g disolver agar bacteriana en 100 ml

agua hirviendo)

• Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 1500 rpm

• Descartar el sobrenadante con la pipeta

• Añadir 200? L del agar en 500? L precipitado (según

cantidad de sedimento) y se mezcla durante aproximadamente 1 minuto.

• Después de la formación del gel, añadir 2 ml de formalina al 4% en vial

promover el desplazamiento del fondo de la botella y el gel de la muestra.

• Retire el vial y poner el gel en el cassette para el procesamiento

, Y la tinción histológica habitual con hematoxilina-eosina (HE).

observaciones:

• El agar disuelto se debe colocar en viales de vidrio estériles con un

tapón de rosca. El cierre debe ser vagamente cerrado hasta

enfriamiento y endurecimiento, y luego completamente cerrada

herméticamente y el vial se almacena en un refrigerador. cuando

uso, fundir el agar en un baño de agua a 60 ° C o en el microondas.

• Deseche el resto de agar al final del día.

4.3.4 La inmunocitoquímica

Las reacciones inmunocitoquímicas se realizaron en centrifugado

previamentes emblocados. Los anticuerpos se emplean comúnmente utilizados

en la rutina (Apéndice A). El método utilizado para la reacción de amplificación fue el

Estreptoavidina-biotina-peroxidasa (LSAB) y la revelación se ha realizado mediante una

usando 3-4 diaminobencidina (DAB). El protocolo de reacción

La inmunocitoquímica se realizó de acuerdo a los siguientes pasos:

 31

material:

• Lâmianas silalizadas con la 4μ de corte o citocentrifugado

• tampón de citrato (10 mM - pH 6,0) + Tween

• tanques propios y literas resistente a temperaturas y disolventes

• vaporizador

• agua destilada y agua del grifo

• Peroxido de hidrogeno

• tampón TBS (Tris solución salina tamponada) con o sin Tween

la Preparación de las soluciones:

la Tris 0,2 M

• Trizma - 24,22g

• DH 2 El - 1000ml

la N / 10 HCl

• HCl - 8,5mL

• DH 2 El - 1000ml

la Tris pH 7,3

• 0,2 M Tris - 125 ml

• N / 10 HCl - 225ml

• DH 2 El - 150 ml

la TBS (solución de uso) almacenar en el refrigerador

• Tris de pH 7,3 - 500 ml

• DH 2 El - 4,5L

• El cloruro de sodio - 38,25g

• Ajustar el pH a 7,3 con HCl

la cuchillas TBS Lavado

• TBS (solución de uso) - 500 ml

• Tween 20 - 500 ml

• Toalla de papel

• habitación húmeda

• micropipetas

• consejos

• microtubos
 32

• albúmina bovina a una dilución de 1% del cuerpo contra primaria

• habitación húmeda

• nevera

• El anticuerpo primario (Apéndice A) y el anticuerpo secundario (kit LSAB)

• cromogénico 3-4, diaminobencidina (DAB Kit)

• hematoxilina de Harris

• Alcoholes 70%, 80%, 95% y dos por 99,5%

• Xileno (xileno)

• medio de montaje permanente

• cubreobjetos

técnica :

• la recuperación de antígeno: se realiza con tampón de citrato (10 mM - pH 6,0)

+ tween en el vaporizador (vapor) a partir de 96 a 99 ° C durante 20 min, con el

esta regulación sumergido diapositivas.

• El enfriamiento a temperatura ambiente, con las palas todavía inmersos en el

tampón de citrato durante aproximadamente 20 minutos o hasta que la temperatura en la memoria intermedia está

50 ° C.

• Lavado de los portaobjetos en agua destilada en cinco cuartos de baño.

• Bloquear la peroxidasa endógena: peróxido de hidrógeno DH + 2 la de

relación de 26 ml de H 2 la 2 a 230 ml DH 2 S - 2 baños 15

minutos cada uno.

• Lavados en agua destilada en tres baños.

• Inmersión en tampón TBS (Tris solución salina tamponada) + tween, y la eliminación de

El exceso de cuchillas TBS + Tween con la toalla de papel que se

presentado a la inmunotinción.

• La incubación de las placas que contienen las muestras con el anticuerpo primario

(Apéndice A) en una cámara húmeda " durante la noche "( 18 horas) bajo refrigeración (2-8

° C).

• Lavar los portaobjetos con TBS + Tween para eliminar el excedente

anticuerpo en 3 baños minutos 3min materiales cada uno, para eliminar el exceso

TBS + Tween con toallas de papel.

 33

• La incubación con el anticuerpo secundario biotinilado (LSAB "kit", Dako

Cytomation) en una cámara húmeda a temperatura ambiente (aire acondicionado

18 a 22 ° C.

• Lavado de los portaobjetos con TBS + Tween en 3 baños de 5 minutos cada uno,

eliminar el exceso de TBS con toallas de papel + Tween.

• La incubación con (kit LSAB complejo de estreptavidina-peroxidasa, Dako

Cytomation) en una cámara húmeda a temperatura ambiente (aire acondicionado

18 a 22 ° C) durante 30 minutos.

• Lavado de los portaobjetos con TBS + Tween en 3 baños de 5 minutos cada uno,

eliminar el exceso de TBS con toallas de papel + Tween.

• INSIGHT inmunotinción se desarrolló mediante la adición del sustrato

3-4 cromógeno, diaminobencidina (DAB) (100 mg%) con tampón

dilución.

• Lavado en agua destilada.

• Contra tinción con hematoxilina de Harris.

• Lavados en agua del grifo.

• La deshidratación de alcoholes baños (Baños 5).

• Eliminación de baños de xileno (xileno) (4 cuartos de baño).

• Montaje con medio de montaje permanente (Entellan, Merck

Alemania) y la hoja de la cubierta.

4.4 Análisis estadístico

coeficiente Kappa se utilizó para evaluar el grado de concordancia

entre el diagnóstico de "bloque de celdas" y el diagnóstico de citocentrifugado: 0,01-0,20

En consecuencia discreta, 0.21- 0.40 pobre concordancia según 0,41-0,60

moderada, 0,61 a 0,80 y 0,81 acuerdo sustancial, casi el 99 por acuerdo

perfecto.
 34

5 RESULTADOS

5.1 MUESTRAS

Se utilizó un total de 299 muestras distribuidas de la siguiente citológico

tipos: líquido pleural, n = 70; fluido peritoneal, o n ascitis = 64; líquido pericárdico

n = 3; lavado peritoneal = 70; lavado broncoalveolar, n = 58; CSF, n = 19; orina, n = 1 y

aspirado, n = 14. Los diagnósticos de los pacientes según el tipo de muestra

Están dispuestos en el Apéndice B. El volumen de las muestras utilizadas en la preparación de

"Bloque de la célula" varió de 2 a 50 ml. Los mayores volúmenes enviados al laboratorio

muestras eran fluido pleural y peritoneal y CSF más pequeño.

La apariencia de las muestras mostró una variación con la densidad respecto

y colorante (agua, cítricos amarillo, quilosa, húmedo, de color marrón,

sangrado, etc.). Todas las muestras tenían un aspecto CSF

ac. El lavado broncoalveolar también realizó acuosa, pero

con cantidades variables de sangre y moco. El lavado peritoneal

a menudo opaco y de color marrón realizado. El líquido pleural,

peritoneal y pericárdico presentan diferentes aspectos con diversos grados de

sangre (Figura 2). Otras muestras todavía tenían residuos sólidos y

coágulo natural antes o después de la centrifugación (flecha, Figura 2).

la B C D y F

La Figura 2. Los diferentes aspectos y tipos de muestras. (A) de cítricos, líquido ascítico. (B) líquido del quiste muscular
purulenta. (C) ascitis hemorrágico. (D) opaca y de color marrón, el lavado peritoneal. (E) con una solución acuosa de
moco, sangre y coágulo "natural" (la flecha), lavado

broncoalveolar. (F) acuoso (CSF).

 35

Después de la centrifugación, las muestras se dividieron en: ningún sedimento,

con una cantidad pequeña o grande de sedimento (Figura 3).

la B C

Figura 3. Las muestras sin (A) con pequeño (B) y con grandes cantidades de sedimento (C) después de la centrifugación.

5.2 MÉTODO "PLASMA-TROMBOPLASTINA"

El método de "plasma-tromboplastina" para preparar el "bloque de celdas" era

aplicable, técnicamente, no hay sólo en muestras de sedimentos o pequeña

cantidad de sedimento de la sangre de la muestra y los sedimentos (Figura 4).

la B C

La Figura 4. Ascitis muestra de fluido antes de la centrifugación (A) preparado por el coágulo método "de tromboplastina
plasma," en formalina al 4% (B) y el casete (C) antes de su procesamiento histológico.
 36

Las muestras con gran cantidad de sedimento y anticoagulante

Ellos fueron preparados por el método de "agar" (Tabla 3). El "plasma método

tromboplastina "se aplicó a 88,3% (264/299) de las muestras: 94,3% (66/70) de

líquido pleural; 95,3% (61/64) o fluido de ascitis peritoneal; 100% (3/3) de

líquido pericárdico; 67,1% (47/70) de lavado peritoneal; 94,8% (55/58) de lava

broncoalveolar; 100% (19/19) de CSF y en la muestra de orina; 85,7% (12/14) de

aspirado.

Tabla 3. Distribución de los tipos de la muestra de acuerdo con el método pr y pARADA D la "Bl Cell Ock "

Tipos de muestras
método total
líquido ascitis líquido lavado BAL CSF
aspirado de la orina
pleural pericárdico peritoneal

plasma
tromboplastina 66 61 3 47 55 19 1 12264

agar 4 3 0 23 3 0 0 2 35

total 70 64 3 70 58 19 1 14299
 37

microscópicamente Se observaron celularidad y distribución celular

Adecuado preservar la morfología de las células y los racimos

(Figura 5A y 5B). fragmentos de tejido de mantenimiento arquitectura

Ellos fueron identificados histológicamente en muestras líquidas y se lavaron (Figura 5C).

la contaminación fúngica y artefactos degeneración / muerte celular eran

observado en las muestras con mayor intervalo de tiempo entre la recolección y la preparación

"Cell Block" (Figura 5D).

la

C DB

La Figura 5. Las secciones histológicas "bloque de celdas" preparados por el método de "plasma-tromboplastina" HE. grupos

(A) de células de adenocarcinoma de numerosos y bien distribuida (40X). (B) atipia nuclear, células glandulares dispuestas en

grupos (200X). fragmentos (C) de tejido con carcinoma de células escamosas (100X). (D) estructuras fúngicas (flecha) y

células degeneradas (punta de flecha) (200X).

 38

Todas las muestras de pellets con grandes cantidades de sangre, después de

centrifugación se formó en algunos de ellos, un halo blanquecino anteriormente

capa de RBC con alta celularidad consistentes en leucocitos, células

mesoteliales y células epiteliales malignos (Figura 6).

*
B C

DE y F

La Figura 6. muestra hemorrágico antes de la centrifugación (A), después de la centrifugación (B) y después de la eliminación del halo

sobrenadante (c) (flecha) y la capa de eritrocitos a continuación haloalquilo (asterisco). (D) (E) y (F) secciones histológicas de la "bloque

de celdas", preparado por el método de "plasma-tromboplastina", HE (100X): (d) halo; (E) capa de eritrocitos y (f) precipitan.
 39

coágulos naturales residuos sólidos y encontrados se separaron a

inclusión y generalmente tenían mayor celularidad que el coágulo formado

el método de "tromboplastina plasma", la misma muestra (Figura 7).

la B

C D

La Figura 7. Clot muestra "natural" pleural fluido (A) en el coágulo de botella (flecha) y (B) en el coágulo de casete). (C) y
(D) secciones histológicas del "bloque de celdas", preparado por el método de "plasmatromboplastina" HE (100X): (C)
coágulo "natural" con numerosos grupos de adenocarcinoma de la glándula; (D) preparado por el coágulo de método "de
tromboplastina plasma," clusters glandulares con pocos adenocarcinoma.
 40

La tinción inmunohistoquímica estándar fue generalmente similar al

citocentrifugadas visto en la (Figura 8)

la B

la

C D

F
y

Figura 8. ( A) y (B) expresión inmunocitoquímica MOC-31, 200X. agrupaciones

células de adenocarcinoma tiñeron de color marrón en el citoplasma y membrana. (A) muestra fijada con formalina. (B)
muestra fijada con alcohol. (C) y la expresión del receptor (D) inmunocitoquímica estrógeno, 200X. células de
adenocarcinoma de clúster tiñeron de color marrón con el núcleo. (C) con muestra de formaldehído-fijo. (D) muestra fijada
con alcohol. (E) y (F) inmunohistoquímica, la expresión de Ki67, 200X. células de adenocarcinoma de clúster tiñeron de
color marrón con el núcleo. (E) con la muestra fijada en formalina. (F) muestra alcohol-fijo.
 41

5.3 MÉTODO "AGAR"

El método de "agar" para preparar el "bloque de células" se utilizó en las muestras con

gran cantidad de sedimento y anticoagulante, y 11,7%

(35/299) de todas las muestras: 5,7% (4/70) de muestras de líquido pleural; 4,7%

(3/64) muestras o fluido de ascitis peritoneal; 0% (0/3) de las muestras

líquido pericárdico; 32,9% (23/70) de las muestras de fluido peritoneal; 5,2% (3/58)

muestras de fluido de lavado bronquial, 0% (0/19) de las muestras de LCR, sin

muestra de orina y el 14,3% (2/14) de las muestras aspiradas. En la Figura 9, muestra

lavado peritoneal antes y después de la centrifugación y el coágulo antes y después de

procesamiento.

la B D y
C

La Figura 9. muestra de lavado peritoneal con una gran cantidad de sedimento antes y después de la centrifugación (A) (B).

Geles formados por el formol "agar" (C) y el casete antes (D) y después (E) de procesamiento histológico.
 42

La celularidad, la distribución de células y la preservación de la morfología celular

Adecuado se observaron en las muestras preparadas por la "agar"

(Figura 10). Tinción HE mostró una intensidad más débil en las muestras

preparado por este método.

la

B B

La Figura 10. Las secciones histológicas "bloque de celdas" preparados por el HE (intensidad de tinción débil)
"agar". grupos (A) de células de adenocarcinoma de numerosos y bien distribuida (40X). (B) grupos glándula
atipia celular de adenocarcinoma y el cuerpo psammoma (flecha) (100X).
 43

La tinción inmunohistoquímica estándar fue generalmente similar al

citocentrifugadas visto en la (Figura 11).

B
la

La Figura 11. La inmunocitoquímica, la expresión de MOC-31 (A) y Ki67 (B) 200X. grupos (A) con células de
adenocarcinoma teñidas de color marrón en el citoplasma y la membrana (muestra fijada en formalina). grupos (B)
de células de adenocarcinoma tiñeron con el núcleo marrón (formalina muestra fija).

Acuerdo (positivo y negativo para malignidad) entre el diagnóstico

el "bloque de celdas" y el diagnóstico de citocentrifugado se observó en 96,9%

(290/299), kappa = 0,88.

Tabla 4. Frecuencia de resultados concordantes y discordantes entre citocentrifugado y "bloque de celdas" en

muestras preparadas el método de "tromboplastina plasma," y "agar".
"Block Cell"
Citocentrifugado total
positivo negativo
positivo
43 2 45

negativo 7 247 254

total 50 249 299
 44

6 DISCUSIÓN

El "bloque de celdas" es un método complementario para el análisis de citocentrifugado

muestras citológicas enviados al Laboratorio de Patología

para las células neoplásicas. Este estudio fue evaluar la aplicabilidad de

método de "plasma-tromboplastina" para preparar el "bloque de celdas" teniendo en cuenta la

características de la muestra, la viabilidad técnica y económica y, sobre todo,

la calidad y el cumplimiento de los resultados en comparación con el

citocentrifugado.

6.1 Características de la muestra

muestras citológicas, lo más a menudo se envían al laboratorio

de Patología, en el que el método "-tromboplastina plasma" es

potencialmente aplicables son los derrames (líquido pleural, ascitis y pericárdico)

se lavó (broncoalveolar y peritoneal), líquido cefalorraquídeo, lesiones quísticas aspirados, orina y

muestras citológicas en medio líquido. Este método ha sido descrito en la muestra

efusiones 11-13,16, lavado peritoneal 14, aspirado 11 y entre muestras

neto 10.15. La aplicación de este método en muestras de lavado broncoalveolar,

No se encontró líquido cefalorraquídeo y la orina. En las presentes muestras de estudio se utilizaron para

derrames (fluido pleural, ascitis y pericardial), se lavó (peritoneal y

Broncoalveolar), CSF, orina y aspirado. Entre las limitaciones de este estudio

Se destaca la no obtención de muestras de citología en medio líquido y

la aplicación del método en un pequeño número de muestras de orina y aspiraron

de las lesiones quísticas.

La apariencia de las muestras fue variable con respecto a la densidad (sin con

cantidad pequeña o grande de sedimento) y color (acuoso, amarillo

cítricos, verde, marrón, sangrado, etc.), y las muestras

el más sangrado propensos a la formación de coágulos. La característica de

probar más importante para determinar la aplicabilidad de la técnica era

cantidad de sedimento / precipitado. El método de "plasma-tromboplastina"

preparación del "bloque de celdas" ha demostrado ser aplicable principalmente en las muestras sin

pellet o pequeña cantidad de sedimento observaron, antes y / o

después de la centrifugación. Las muestras de fluido peritoneal fueron las

 45

Ellos presentaron con mayor frecuencia gran cantidad de sedimento. los de

CSF generalmente tenía el aspecto acuoso y todo lleva a cabo sin

sedimentos. Por lo tanto, se puede decir que el método es aplicable en cada

Tales muestras. Una característica importante de algunas muestras fue

presencia de residuos sólidos y la formación de coágulos naturales que estaban incluidos

por separado. Estos coágulos naturales generalmente mostró mayor

celularidad un coágulo formado por el método de "plasma-tromboplastina".

Por lo tanto, con respecto a las características de la muestra, en principio, el método

"Plasma-tromboplastina" es aplicable en cualquier tipo de material citológico,

especialmente aquellos con aspecto hemorrágico, con poco o ningún

cantidad de sedimento.

6.2 Viabilidad técnica del método "plasma-tromboplastina"

El método de "-tromboplastina plasma" consiste básicamente en la centrífuga

muestra, descartar el sobrenadante, añadir plasma y tromboplastina en la botella y

mezclar con el precipitado se centrifugó, lo que permite la formación de una

células de la muestra que contiene coágulo y que pueden ser incluidos en parafina. ellos son

descrito en la literatura hasta dos sucesivos intentos adicionales para la formación

el coágulo. Uno de los factores que pueden dificultar la formación del coágulo es

de la muestra antes de la formalina o alcohol, y anticoagulantes 12.

En estas situaciones mencionadas anteriormente, no se indica con lavado

solución salina o PBS antes de añadir el plasma y la tromboplastina. en

Este estudio se intentó aplicar el método en muestras con anticoagulantes y

fijo en alcohol sin lavado. En las muestras con anticoagulante, era

necesitar más de un intento de la formación del coágulo de las muestras y

fijo con etanol exhibido un precipitado después de la centrifugación, que

la formación de coágulos con impedimento estérico. Por lo tanto, la muestra ideal para la aplicación de

"Método, la tromboplastina plasmática" no debe ser sometido a la fijación y

anticoagulación.

El volumen de muestra utilizada para la preparación de la "bloque de celdas" varió de 2 a

50 ml. Los volúmenes más pequeños disponibles eran de muestras de líquido cefalorraquídeo. la técnica
 46

No se describe o solamente se describen parcialmente en estudios previos con

variaciones entre ellos con la velocidad y el tiempo de centrifugación,

bajo la trombina de plasma y la tromboplastina 10-16.

Este estudio se estandarizó muestras de centrifugación durante 5 minutos a

1500 rpm y utilizando 50 ml de "plasma-tromboplastina". Con respecto al volumen eran

Probamos de 30 a 300 ul "tromboplastina plasma", y elegimos un volumen

pequeña (50 ul) con el objetivo de una mayor concentración celular. Sin embargo, este volumen

Se puede ajustar de acuerdo con la celularidad muestra observada

citocentrifugado y cantidad de sedimento.

Para las muestras de líquido cefalorraquídeo debido a la baja celularidad, lo ideal sería optar

el volumen más pequeño posible, pero se observa que un menor volumen 50 uL

dado lugar a coágulos difíciles de manejar, especialmente después de la

procesamiento. Los volúmenes más grandes (de 50 a 300? l) de plasma y la tromboplastina

Ellos han sido probados para lograr la formación de coágulos en las muestras con

gran cantidad de sedimento. Sin embargo, la mayoría de las veces, incluso con

, Se necesitan grandes volúmenes de varios intentos.

La pérdida de células resultante y sucesivos intentos de la dilución más alta

precipitado dio lugar a baja celularidad. La mayoría de las muestras

grande de tipo pellet lavado peritoneal, que por lo general ya tienen

celularidad baja en citocentrifugado y "bloque de celdas", que también contribuyó

más a la escasez de células. Debido a la dificultad en la aplicación, la mayor parte

tiempo de preparación y de menor calidad de los resultados es optaron por método

agar para las muestras con esta característica. El tiempo para la formación de

coágulo se describe en un estudio previo de hasta 5 minutos, pero en el presente estudio

se observó la formación de coágulos hasta 5 min y se dio cuenta de que cuando el coágulo

No formada hasta 2 minutos, sería necesario un nuevo juicio 15.

fijación con formalina se utilizó en estudios previos 11,13,15 y el presente

estudio. la fijación alcohol fue probado y resultó la fragmentación de coágulos

algunas muestras.

La presencia de moco, observado principalmente en muestras de lavado

broncoalveolar, dificultado la aplicación de la técnica. El precipitado en la parte inferior de moco

 47

vial después de la centrifugación a prevenir la formación de coágulos. Por lo tanto, la retirada

El moco se recomienda antes de la centrifugación.

Un aspecto interesante observado en las muestras fue hemorrágicas

formación después de la centrifugación de un halo de color blanquecino encima de la capa

las células rojas de la sangre. Los leucocitos, células mesoteliales, células epiteliales malignas eran

encontrado ese halo lo que sugiere que no se debe desechar junto con

la capa de células rojas.

El método adicional y específica del coste de empleo "plasma

tromboplastina "se refiere a la adquisición de tiempo de tromboplastina (alrededor de 25 centavos de dólar,

por examen), ya que el plasma se puede adquirir de forma gratuita en el sector

Hospital de Hematología. Equipos y otros bienes de consumo

empleado en la técnica se suelen utilizar en el procesamiento de la

muestras de biopsia y, por lo tanto presentes en cualquier laboratorio de anatomía

Patológico.

En resumen, con respecto a la viabilidad técnica y económica del método

"Tromboplastina de plasma", que es un "bloque de celdas" método de preparación de

aplicación fácil y rápido y de bajo costo, aplicable en los laboratorios públicos y

privado de Patología.

6.3 Calidad de los resultados a partir de muestras preparadas por el método

"Plasma-tromboplastina"

La calidad de las preparaciones citológicas (citocentrifugado y "bloque de celdas")

Depende del número, disposición, distribución y conservación de las células. la

Los resultados de las muestras preparadas por "plasma-tromboplastina" método eran

satisfactoria cuando se analizan en comparación con los resultados de

citocentifugado.

Se diluyeron las células precipitadas en la estructura tridimensional de

coágulo, pero no había celularidad compromiso ya que el volumen

muestra utilizada en la preparación del "bloque de celdas" (2-50mL) fue siempre mayor que el volumen

el citocentrifugado (1 ml). Sin embargo, en muestras de líquido cefalorraquídeo, el volumen disponible

para la preparación de la "bloque de celdas" era pequeña (hasta 2 ml). Por lo tanto, las células,
 48

que son por lo general ya escaso en este tipo de muestra, se diluye en el coágulo y

varios recortes eran necesarios en algunos casos para detectar la célula

neoplásica.

Los arreglos de las células fueron similares a los observados en

citocentrifugadas. La presencia de fragmentos de tejido ocasionales, permitiendo

la evaluación de la arquitectura, era, en algunas muestras, la importante conclusión

de diagnóstico. La homogeneización del plasma y de tromboplastina con el precipitado,

durante aproximadamente 1 minuto, contribuido a la distribución de las células en todo el

extensión coágulo y sin superposición.

Las muestras preparadas varios días después de la recogida mostró artefactos

degeneración y muerte celular similar a lo que ocurre en citocentrifugadas.

se observó contaminación fúngica en algunas muestras y fue también

asociado con una mayor intervalo de tiempo entre la recogida y preparación de la "bloque de celdas".

La expresión inmunocitoquímica de marcadores utilizados comúnmente en

rutina de diagnóstico se analizó y los resultados similares a los observados en

citocentrifugado.

La fijación con alcohol, centrifugadas y se utiliza para algunos tipos de "célula

bloque", tiene la ventaja de preservación de detalle celular y ácidos

nucleico 45. Sin embargo, con este tipo de configuración, algunos autores obtuvieron

imunocitoquima de resultados inconsistentes, con una alteración de

expresión de marcadores para los receptores nucleares 45. En el presente estudio,

resultados de inmunocitoquímica obtenidos en "bloque de celdas" citocentrifugadas y

fueron consistentes fijo en alcohol. Por lo tanto, un mayor número de pruebas

Se necesitarían muestras para una conclusión definitiva.

La presencia de sedimento rica en proteínas causan reacciones no específicas

Inmunocitoquímica toma de interpretación preparado en citológico

(Citocentrifugadas, la citología de base líquida y "bloque de celdas") 13. consistente

con estudios previos, se observó en este estudio que el uso de "bloque de celdas"

preparado por el método de "plasma-tromboplastina" asociado con citocentrifugado

potencialmente mayor especificidad y por lo tanto disminuye

 49

Los resultados falsos positivos en inmunocitoquímica derivados de las posibles reacciones

inespecífica 13.15.

En conclusión, la presencia de fragmentos de tejido y la facilidad en

interpretación morfológica e inmunocitoquímica se puede considerar

principales ventajas del "bloque de celdas", preparado por el "plasma

tromboplastina "en relación con citocentrifugado.

6.4 La concordancia entre el "bloque de celdas", preparado por el método de "plasma

tromboplastina "y citocentrifugado para la investigación de células

neoplásica s.

El acuerdo entre los resultados del "bloque de celdas" y fue citocentrifugado

significativo (Kappa = 0,88). En siete muestras el diagnóstico de malignidad fue

obtenida sólo en el "bloque de celdas". La presencia de fragmentos de tejido con

preservación de la arquitectura y el mayor volumen de la muestra utilizada contribuyó a la

definición de diagnóstico de "bloque de celdas".

Se puede concluir, por lo tanto, que el alto nivel de coincidencia entre el

citocentrifugado y "bloque de celdas", preparado por el método de "plasma-tromboplastina"

para el diagnóstico de cáncer, y especialmente la detección de cáncer sólo

"Bloque de la célula" en algunas muestras sugiere que el método puede reducir el

resultados falsos negativos de citocentrifugado.

6.5 Aplicación del método de "agar"

El método de "agar" se aplicó para muestras con gran pellet que

En general, es friable, alta en proteínas y baja celularidad. similar a

"Método, tromboplastina plasma", el método de "agar" es más apropiado para muestras

con una pequeña cantidad de sedimento. La técnica es agregar

precipitar una solución de agar climatizada, homogeneizar hasta que la formación de una

gel (por debajo de 50 ° C). La concentración y el volumen de agar usado en la preparación de

"Bloque de la célula" son variables en la literatura. Kersten et al. (2000) 1 ml utilizado

2% de agarosa 22. Choi et al. (2014) que se utiliza de 50 a 100 ul, según
 50

cantidad de sedimento 3% Tipo de agarosa y el tipo estándar de "ultra-baja

temperatura de gelificación "(ULGT) 24.

En este estudio, se probaron concentraciones de 1 a 5% de agar y

se observó que cuanto mayor es la concentración de la dificultad de

homogeneización de la agar con el precipitado y se concluyó que el agar 1% sería

más adecuado para la aplicación técnica. El volumen de la solución de agar utilizado

Se varió entre 200 y 500 uL, de acuerdo con la cantidad de sedimento. Elegimos el

más bajo volumen posible la obtención de mayores concentraciones de células en el "célula

bloque", principalmente porque la mayoría de las muestras era el tipo lavó

peritoneal que normalmente tiene una baja celularidad en citocentrifugado.

La técnica proporciona una relación coste-eficacia satisfactoria 24-26. la

y el costo adicional específica del empleo del método se refiere a la adquisición de agar

bacteriológica. Equipos y otros consumibles utilizados en

técnica se utiliza comúnmente en el procesamiento de muestras de biopsia, y

por lo tanto, presente en cualquier laboratorio de Patología.

La principal desventaja en el trabajo de Agar en la preparación del "bloque de celdas" es el

dificultad en el mantenimiento de la solución caliente (50-60 °) para evitar su

solidificación hasta homogeneidad y precipitado se completa. en

método de "agar" modificado por Choi et al. 2014 dos tipos de agarosa eran

utilizado para cada muestra: el primer tipo ULGT, que no se solidifica a una temperatura

ambiente y facilita la homogeneización y luego la agarosa estándar 24. la

La modificación propuesta en este estudio previo, a pesar de la mejora de la distribución

Cell y por tanto la calidad de los resultados, aumentando el tiempo y

costo de implementación.

La distribución y la morfología de las células y los racimos eran

Adecuado en este estudio. Jain et al. (2014) puso de relieve las posibles artefactos

técnica relacionada con el calentamiento: grandes vacuolas citoplásmicas,

citoplasma denso y encogimiento celular 45.

En este estudio, las muestras con grandes cantidades de sedimentos

Por lo general son ricos en proteínas que causan reacciones no específicas

 51

Inmunocitoquímica interpretación toma en preparaciones citológicas. la

resultados inmunocitoquímica fueron satisfactorios.

6.6 Perspectivas

Además de su aplicación en el diagnóstico de rutina para la investigación del cáncer

laboratorios anatomía patológica, el método de "plasma-tromboplastina" han sido

descrito recientemente en estudios experimentales a la formación de "bloque de celdas" de

Las células cultivadas en suspensión y adhesión. Se forma el "bloque de celdas"

posteriormente utilizado para las matrices de tejido construcción micro (TMA) y análisis

líneas celulares citológicas y inmunocitoquímica.

 52

7 CONCLUSIONES

• El método de "plasma-tromboplastina" se aplica en muestras líquidas

pleural, peritoneal y pericárdica y peritoneal lavado y broncoalveolar

CSF, especialmente en no hay muestras de sedimentos o pequeña

cantidad de sedimento y el sedimento en muestras de sangre. la

"Agar" método se puede utilizar como una alternativa a las muestras

más sedimento y anticoagulante.

• El método de "plasma-tromboplastina" se aplica el diagnóstico de rutina

laboratorio de patología para ser un método es técnicamente

factible.

• Se observaron en muestras preparadas por el método de "plasma

tromboplastina "celularidad y distribución celular con apropiado

preservación de la morfología y de células clusters. el patrón

marcando inmunocitoquímica era similar a la observada en

citocentrifugadas. La presencia de fragmentos de tejido y la facilidad en

interpretación morfológica e inmunocitoquímica se puede considerar

principales ventajas del "bloque de celdas", preparado por el "plasma

tromboplastina "en relación con citocentrifugado.

• La alta correlación entre el citocentrifugado y "bloque de celdas" preparó

el método de "-tromboplastina plasma" para el diagnóstico de cáncer y,

especialmente la detección de cáncer sólo en el "bloque de celdas" de alguna

muestras sugiere que el método puede reducir los resultados falsos-

el citocentrifugado negativo.
 53

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 58

ANEXO A

Los anticuerpos primarios utilizados en inmunocitoquímica y sus clones, diluciones, controles y

marcando estándares.

anticuerpo marca anti-Cuerpo clon dilución control

anti-células mesoteliales MARQUE LA CÉLULA HBME-1 01:50 carcinoma papilar

(Tiroides)

calretinina DAKO DAK-1 Calret 01:50 carcinoma suprarrenal

CD68 BIOCARE KP1 1: 100 amígdala

CDX2 Abcam AMT28 01:50 carcinoma de colon

cromogranina A DAKO DAK-A3 01:50 tumor endocrino

La citoqueratina (PANCK) DAKO AE1 / AE3 01:50 epitelio

desmina DAKO D33 1:80 hemorroides

Epitelial Atigen Relacionados DAKO MOC-31 1: 100 mucosa intestinal

Receptor de estrógenos LEICA / Novocastra 6F11 1: 100 pecho

IMP3 DAKO 69.1 1: 500 carcinoma gástrico

Ki67 BIOCARE SP6 01:50 amígdala

Melan-A DAKO A103 01:25 piel

El receptor de estrógenos DAKO 6F11 01:50 pecho

Tumor 1 (WT1) de Wilms DAKO 6F-H2 1: 300 riñón

 ANEXO B

diagnósticos histopatológicos y clínicos obtenidos de pacientes que, de acuerdo con el tipo de muestra

diagnóstico oportuno neto neto neto lavado lavado La orina CSF dibujado

pleural ascitis pericárdico broncoalveolar peritoneal

adenocarcinoma de pulmón 1 2 1
escamosas carcinoma de pulmón
7 2

Carcinoma de pulmón de
3 1
células pequeñas
El carcinoma de pulmón no
2 4
especificado
Carcinoma de mama 4 2 3
El carcinoma de ovario 2 2 4 3
carcinoma de endometrio 7
cáncer de cuello uterino 2
carcinoma de colon 1 3 1 1 1
El carcinoma de estómago 7 3
El carcinoma de páncreas 2
carcinoma de vesícula
1
biliar

El carcinoma in pleura 7
El carcinoma in peritoneo 8 2
El carcinoma neuroendocrino del
2
pulmón
El carcinoma papilar de
1
tiroides
melanoma 1
GIST 1
linfoma 3 3
tumor límite ovario 1 3
teratoma de ovario 7
Cistoadenoma del ovario 1 16
tumor de Brenner 1
absceso ovárico 1
quiste ovárico 2
endometriosis 1 3
la duplicación intestinal 1
leiomioma uterino 1
adenoma intestinal 3
neumonía 1 1

tuberculosis 1 1
hidronefrosis 1
fibroadenoma 3
pleuresía 1
Papilar urotelial cáncer de bajo
potencial maligno 1

diagnóstico indefinido 44 32 3 51 2 6 0 10
total 70 64 3 70 58 19 1 14
GIST (tumor estromal gastrointestinal)
 ANEXO C

Ciencias de la Salud Revista Brasileña (GR / UFPB)

EVALUACIÓN DE SCRIPT

ID27002

título APLICACIÓN MÉTODO EN PLASMA-TROMBOPLASTINA CITOLOGICO PREPARACIÓN DE

MUESTRAS CÁNCER DE INVESTIGACIÓN EN Laboratorio de Patología

1. EVALUACIÓN GENERAL El tema tratado es relevante, presenta importancia metodológica para

actividades de laboratorio útiles en impacto epidemiológico de diagnóstico de enfermedades.

2. Evaluación específica: Evaluar el manuscrito en los siguientes artículos:

A) título : Describir adecuadamente lo que se investigó? SÍ

• resumen: El resumen necesita ajustes estructurales, actualizar tensa
cuando se trata de objetivos, una vez que el estudio se ha hecho (y no "deberá")

B) introducción:
• El autor hace un cuestionamiento adecuado del tema investigado, destacando la relevancia del estudio en
relación con el cuerpo de conocimiento existente? SÍ

• Utiliza la literatura actual para justificar el estudio? 20 artículos usados, 6 se muestran los últimos cinco años. La
especificidad del método que puede justificar la presentación de artículos.

• Los objetivos se escriben de forma clara, objetiva y se traducen plenamente lo que se ha investigado? SÍ

• C. método : Métodos y procedimientos para la recogida y análisis de datos se describen claramente y son
adecuados? SÍ

•
• D. resultados Los resultados fueron presentados en el texto clara y adecuadamente disponible en tablas y
figuras (en su caso), y sin duplicación de la información? SÍ

• E. Discusión y conclusión El autor analiza los hallazgos en el estudio y los relaciona con la evidencia de
otros estudios realizados en la zona utilizando argumentos apropiados para apoyar la interpretación de los
datos del estudio? SÍ
•

• Se identifican y justifican algunas limitaciones del estudio? SÍ

• las consecuencias son identificados / aplicaciones del estudio para el área de Ciencias
 Salud? SÍ

• El autor concluye el estudio apropiadamente, en base a lo que se ha investigado y los resultados obtenidos? SÍ

F. referencias Las referencias utilizadas son apropiadas (Vancouver) y corriente?

SÍ

3. CONCLUSIÓN: marca una de las siguientes opciones y, si es posible, justifica su decisión.

() Aceptación sin modificaciones;

(X) con modificaciones menores aceptación sin la necesidad de un nuevo examen;

() La aceptación condicional con la necesidad de grandes modificaciones y nueva revisión;

() Rechazo de la posibilidad de una revisión importante del texto y presentación como un nuevo manuscrito, y
comenzando así un nuevo proceso de evaluación;

() No es adecuado para su publicación.

observaciones:

Existe la necesidad de ajustes en el formato (espaciado)

No se citan autor en el texto sin el número de identificación

dimensiones
Texto completo (título, autores, abstracta, abstracto, cuerpo de trabajo con figuras y referencias) debe estar
contenido en 15 páginas mecanografiadas palabra con márgenes
2.5 Espacio de 1.5 y letra Arial 11 .

El resumen necesita ajustes estructurales, tiempo de actualización verbal cuando se trata de objetivos, una vez que el estudio se
ha hecho (y no "deberá") Tenga en cuenta lo siguiente:

Existe la necesidad de ajustes en el formato (espaciado) no autor citado en el texto sin

número de identificación Dimensiones

Texto completo (título, autores, abstracta, abstracto, cuerpo de trabajo con figuras y referencias) deben estar contenidos en las 15 páginas
mecanografiadas palabra con márgenes de 2,5, 1,5 y espacio Arial 11.
ANEXO A