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Avance de la fase 2: Identificación de la infección activa del patógeno.

Bruno Trejo Rosales A01654065

Gustavo Adolfo Sandoval Guerrero A01654436

Marian Farrera Borraz A01653953

Mary Anel Cuervo Medina A01655563

Paola Arciga Portela A01653960

Paulina Ramos Madrid A01653890

Grupo 303

Agosto 2021

Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

Profesor José Eduardo Rodríguez Bustamante

Fundamentación de la biología molecular

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Identificación de la infección activa del patógeno.

1. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)

En una neoplasia cervical intraepitelial de alto nivel CIN2/3, los oncogenes E6 y E7

del VPH son expresados a través del espesor del epitelio cervical. Estos oncogenes están muy

regulados cuando se tienen neoplasias de bajo nivel (CIN1), lo cual indica que el ARNm

E6/E7 son marcadores más específicos para el cáncer o displasias cervicales que el ADN del

VPH (Boulet, et. al., 2010).

El método de amplificación basado en secuencias de ácidos nucleicos, NASBA, por

sus siglas en inglés, es un sensitivo sistema de amplificación basado en la transcripción para

replicación específica de ácidos nucleicos in vitro (Deiman, et. al., 2002). Se utilizan balizas

moleculares para la detección a tiempo real e identificación de E6/E7 ARNm de VPH tipo 16,

18, 31, 33 y 45 (Boulet, et. al., 2010), las cuales se refieren a oligonucleótido de ADN que

poseen en su extremo 5' un fluorocromo y en el 3' una molécula que inhibe la fluorescencia.

Puesto que las secuencias en los extremos 3' y 5' son complementarias, se crea una estructura

de horquilla o hairpin. En presencia de una secuencia diana complementaria, la sonda se

hibrida con la diana, por lo que se abre la horquilla, separando así el fluorocromo con el

inhibidor. Este proceso resulta en un aumento medible de fluorescencia (Lanciotti & Kerst,

2001;Deiman, et. al., 2002).

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Figura 1. Representación esquemática de NASBA incluyendo la detección de la baliza molecular.

Obtenida de Deiman, et. al. (2002).

En el esquema de la Figura 1 se muestra el proceso de NASBA, donde la flecha

naranja representa la fase de iniciación y la flecha azul representa la fase cíclica. El proceso

se fundamenta en una transcripción y amplificación coordinada por tres enzimas;

transcriptasa reversa (RT), RNasa H, y T7 RNA polimerasa (T7 DdRp) (Deiman, et. al.,

2002). También se tienen primers, que contienen las secuencias promotoras necesarias para

que las enzimas sinteticen el ARN. También podemos observar que toda la amplificación

ocurre a una temperatura de aproximadamente 41 grados, por lo que es un proceso isotérmico

(Boulet, et. al., 2010).

Finalmente, el producto del T7 DdRp amplificado en la fase cíclica es un ARN

monocatenario con una polaridad opuesta a la del ácido nucléico objetivo o diana. El

producto del ARN amplificado puede ser posteriormente detectado por medio del uso de

sondas de baliza molecular explicado anteriormente (Lanciotti & Kerst, 2001;Deiman, et. al.,

2002).

En México, NASBA “es el primer sistema automatizado que combina una secuencia

de amplificación basada en el ácido nucléico, amplificación y detección en tiempo real”

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(Biomérieux, 2021). El método NASBA funciona amplificando el ácido nucléico por

condiciones isotérmicas, utiliza 3 enzimas. Replica el ciclo de vida retroviral. Por esto, da un

diagnóstico preciso y en tiempo real sobre el virus. Tiene una interfase amigable para los

usuarios, y las pruebas se entregan de 1.5 a 3 horas (Nuclisens® EASYQ®, n.d.). Es por

esto, que para las mujeres mexicanas es una alternativa muy viable para la detección de VPH.

Esta técnica, por su precisión debería implementarse en todos los laboratorios del país. Es

más rápida que la PCR y no necesita termociclador. A continuación, se encuentra un

diagrama de las causas de los posibles resultados que arroja la prueba (Figura 2).

Figura 2. Mapa conceptual de posibles resultados obtenidos por la prueba NASBA (elaboración propia).

2. Aptima HPV

El ensayo APTIMA HPV está basado en la amplificación de ácidos nucleicos para la

detección del mRNA de VPH E6 y E7 de las 14 variantes más riesgosas del virus sin

especificar de cuál se trata (Docktera et al., 2009). Los genes E6 y E7 son los responsables de

la generación de replicaciones celulares anormales que pueden derivar en la aparición de

cáncer (Roche Cervical Cancer Solutions, 2014). Es por esto que la prueba promete
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incrementar la especificidad al momento de detectar infecciones activas por VPH (Docktera

et al., 2009). La técnica se basa en el proceso de transcripción del DNA.

La prueba requiere de dos sistemas para poder operar: un sistema semi-automático

DTS Systems (Direct Tube Sampling Systems) y un sistema automático TIGRIS DTS system

(Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) (Docktera et al., 2009). A su vez, el proceso se

divide en tres etapas: la captura de diana, la amplificación mediada por transcripción (TMA),

y la detección de los productos de la amplificación mediante el ensayo de protección de la

hibridación (HPA).

En la primera etapa, se colocan las muestras en un tubo con el medio de transporte

STM, que permite lisar las células para liberar el mRNA y protegerlo de la degradación. Se

utilizan oligómeros de captura unidos a micropartículas magnéticas para separar el DNA

diana, pues contiene secuencias complementarias de las regiones del mRNA de VPH que se

busca aislar y una cadena de residuos de desoxiadenosina. Estos oligómeros se unen a las

regiones de mRNA del VPH y se someten las muestras a temperatura ambiente para propiciar

la hibridación entre la región de desoxiadenosina y las moléculas de polidesoxitimidina

unidas a las partículas magnéticas. Las micropartículas híbridas son atraídas hacia las paredes

del tubo utilizando imanes, permitiendo capturar el complejo de la región de mRNA diana

unida a los oligómeros de captura.

Figura 3. Captura de diana mediante oligómeros y micropartículas magnéticas. Imagen creada con BioRender.

Una vez realizada la captura del DNA diana, se hace una amplificación de los ácidos

nucléicos mediante TMA (Transcription-Mediated Amplification), que utiliza dos enzimas: la

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transcriptasa inversa del MMLV (Virus de la Leucemia Murina de Moloney) y la RNA

polimerasa T7. La primera es utilizada para generar una copia de DNA del mRNA diana,

mientras que la segunda se encarga de hacer copias de este RNA a partir del molde de DNA.

Figura 4. Amplificación mediada por transcripción (TMA). Imagen creada con BioRender.

En la tercera etapa, se utiliza el ensayo HPA (Hybridization Protection Assay). Esta

detecta al amplicón (producto de la amplificación) por medio de sondas de ácido nucleico con

marcadores quimioluminiscentes. Con esto se logran diferenciar los híbridos de RNA y DNA

de los no híbridos y posteriormente se miden las señales de fotones de la luz, llamadas

unidades relativas de luz (RLU), emitida por estos en un luminómetro.

Figura 5. Detección de los productos de la amplificación mediante el ensayo de protección de la hibridación

(HPA). Imagen creada con BioRender.

Finalmente, se realiza un control interno (CI) en el que se revisa que cada una de las

etapas se haya realizado de manera correcta y que no haya habido errores del usuario o del

instrumento (Hologic, 2017).

Los resultados de esta prueba se obtienen automáticamente con el software de ensayo

y se interpretan utilizando las unidades relativas de luz (RLU), la razón señal/valor de corte

del analito (Analyte Signal/Cutoff, S/CO) y el control interno (CI). El obtener un resultado
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positivo indica que alguno de los 14 tipos de virus del papiloma humano que son

considerados de alto riesgo se encuentra presente; un resultado negativo descarta que el virus

esté presente; y un resultado no válido indica que otros parámetros se encuentran fuera de los

limites normales esperados. Los posibles resultados se pueden observar en la figura 5

(Hologic, 2017).

Figura 6. Mapa de posibles resultados obtenidos a partir de la prueba APTIMA HPV (Hologic, 2017).

Este ensayo se lleva a cabo actualmente en México sin necesidad de modificar los

marcadores o los reactivos empleados. Las únicas consideraciones que se deben hacer, son

relacionadas a los materiales no suministrados para realizar las pruebas, tales como el

luminómetro, pipetas y micropipetas, kits de reactivos, fluidos o de transferencia (Hologic,

2017).

Referencias

Boulet, Gaëlle & Micalessi, Isabel & Horvath, Caroline & Benoy, Ina & Depuydt, Christophe

& Bogers, John-Paul. (2010). Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Assay for

Human Papillomavirus mRNA Detection and Typing: Evidence for DNA

Amplification. Journal of clinical microbiology. 48. 2524-9. 10.1128/JCM.00173-10.

 8

Clara, M. (2013). Biomarkers of Cervical Carcinogenesis Associated with Genital HPV

Infection. Acta Médica Portuguesa. Recuperado de:

https://www.actamedicaportuguesa.com/revista/index.php/amp/article/view/4094/323

Deiman, B., Van Aarle, P., & Sillekens, P. (2002). Characteristics and applications of Nucleic

Acid Sequence-Based Amplification (NASBA). Applied Biochemistry and

Biotechnology - Part B Molecular Biotechnology.

https://doi.org/10.1385/MB:20:2:163

Docktera, J., Schrodera, A., Hilla, C., Guzenskia, L., Monsonegob, J. y Giachettia, C. (2009).

Clinical performance of the APTIMA® HPV Assay for the detection of high-risk

HPV and high-grade cervical lesions. Gen-Probe Incorporated: San Diego, European

Institute of Cervix Federation Mutualiste: Paris. Recuperado de:

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1386653209700095

(consultado el 26 de agosto del 2021).

Hernandez A. (2012). Procedimientos de biología molecular para el estudio de la infección

por el VIH. Recuperado de

https://catedrabiologiamolecularusal.files.wordpress.com/2017/04/tc3a9cnicas-para-la

-determinacion-de-la-carga-viral.pdf (consultado el 26 de agosto del 2021)

Hologic, Inc. (2017). Aptima HPV Assay. Hologic, inc. AW-14517-301 Rev. 003.

Recuperado de:

https://www.hologic.com/sites/default/files/package-insert/AW-14517-301_003_01.pd

f (consultado el 27 de agosto del 2021).

Lanciotti, R. S., & Kerst, A. J. (2001). Nucleic acid sequence-based amplification assays for
 9

rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses. Journal of Clinical

Microbiology, 39(12), 4506–4513.

https://doi.org/10.1128/JCM.39.12.4506-4513.2001

Nuclisens® EASYQ®. (n.d.). Recuperado de

https://www.biomerieux.com.ar/diagnostico-clinico/productos/nuclisensr-easyqr

Oliviera, A., Delgado, C., Verdasca, N., Pista, A. (2013). Biomarkers of Cervical

Carcinogenesis Associated with Genital Human Papillomavirus Infection. Acta

Médica Portuguesa. Recuperado de:

https://www.actamedicaportuguesa.com/revista/index.php/amp/article/view/93/3221

Roche Cervical Cancer Solutions. Natural History of HPV Infection. Youtube. California.

(2014). Disponible en:

https://www.youtube.com/watch?v=WSL8rBMWW1Y&t=435s (consultado el 13 de

agosto del 2021).