1 - Guía de Actividades Prácticas - Microbiología Agrícola

GUÍA DE TRABAJOS
PRÁCTICOS
MICROBIOLOGÍA
AGRÍCOLA
FACULTAD DE CIENCIAS
AGROPECUARIAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
CÓRDOBA – ARGENTINA
2022
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - i
PLANIFICACIÓN DOCENTE
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA PARA INGENIERÍA AGRONÓMICA
AÑO 2022
1. Ubicación del espacio curricular en el Plan de Estudios:

 Ciclo: Conocimientos Básicos Profesionales.
 Año y cuatrimestre: 2º año, 2º cuatrimestre.
2. Características del espacio curricular:
 Carácter: Asignatura
 Condición: Obligatoria
 Carga Horaria Total: 65 hs.
 Carga Horaria Semanal: 5 hs.
 Créditos: 6.5
3. Asignaturas Correlativas:
Para cursar:
Regularizado: Química Biológica.
Acreditado: Química Orgánica.
Para acreditar:
Acreditado: Química Orgánica y Química Biológica.
Página Web: http://www.agro.unc.edu.ar/~wpweb/microbiologia/inicio/
4. Equipo docente
Coordinador: Ing. Agr. Dr. Enrique Iván Lucini
Categoría docente y
Nombre y Apellido Función Docente
dedicación
Ing. Agr. Dr. Enrique Dictado de Teóricos y

Prof. Titular (DE)
Iván Lucini Actividades Prácticas.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - ii
Dictado de Teóricos y
Dra. Carolina Merlo Prof. Asociado (DS)
Actividades Prácticas.
Dra. Carolina Dictado de Teóricos y

Prof. Adjunto (DE)
Vázquez Actividades Prácticas.
Dictado de Actividades
Dra. Marina Bruno Prof. Adjunto (DSE)
Prácticas.
Ing. Agr. Lucas Dictado de Actividades

Prof. Asistente (DS)
Esteban Dubini Prácticas.
Dra. María Paula Dictado de Actividades

Prof. Asistente (DE)
Martín Prácticas.
Dra. Romina Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Pizzolitto (DS) Prácticas.
Ing. Agr. (MSc) Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Ezequiel D. Bigatton (DS) Prácticas.
Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Biol. Mariela Archilla
(DE) Prácticas.
Ing. Agr. Ibrahim Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Ayoub (DS) Prácticas.
María Ángeles Ayudante Alumno Colaboración en

Gentili “B” Actividades Prácticas
Ayudante Alumno Colaboración en

Bautista Lacioni
“B” Actividades Prácticas
Ayudante Alumno Colaboración en

Erika Rivarolo
“B” Actividades Prácticas
Funciones en las que participan todos los docentes de la Cátedra de

Microbiología Agrícola:
- Dictado de clases
- Atención de horarios de consulta
- Elaboración y corrección de la Guía de Actividades Prácticas
- Elaboración y corrección del Complemento Teórico
- Elaboración y corrección de las evaluaciones de Suficiencia,
Recuperatorios y de Integración y Transferencia.
- Formación de recursos humanos, estando a cargo de los Ayudantes
Alumnos.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - iii
5. Fundamentación del espacio curricular:

Se asume que la Ingeniería Agronómica es la consciente aplicación de la ciencia
a los problemas económicos de la producción agraria. Se entiende que el
ingeniero profesional es competente en virtud de haber recibido adecuada
educación fundamental y adiestramiento para manejar métodos científicos y de
tener habilidad para el análisis y solución de los problemas de la ingeniería. Por
ello debe recibir una educación que le permita progresar en forma sostenida en
su especialidad, asimilando la información y aplicándola con criterio
independiente.
El ingeniero agrónomo debe responder no sólo a los requerimientos
productivos, sino también velar por el mantenimiento de esa productividad, en lo
que se conoce como "manejo sustentable" de los recursos. Debe tomar
conciencia que la producción no es un proceso aislado de los ecosistemas
naturales, por lo que responde a las leyes que regulan dichos sistemas. El
desentendimiento de tal situación provoca graves desequilibrios, que solamente
son visualizados cuando disminuye la productividad.
En la actualidad el ingeniero agrónomo se enfrenta con problemas de
agotamiento, pérdida y contaminación de los recursos ambientales, a causa del
inadecuado uso de agroquímicos, los monocultivos, las talas, quemas,
sobrepastoreos, inadecuados sistemas de labranza, etc. Al mismo tiempo tiene
a su alcance nuevas tecnologías de manejo racional que incluyen, desmontes
selectivos, labranzas conservacionistas, coberturas vegetales y de rastrojos,
manejo integrado de plagas, fertilización biológica, etc.
Por lo tanto, en su formación se deben aportar elementos conceptuales
claros que brinden fundamentos para la práctica profesional. De esta manera
surge como necesidad el conocimiento de procesos biológicos en los cuales
están involucrados microorganismos. La Microbiología Agrícola brinda los
criterios básicos para el entendimiento de los principales procesos biológicos que
desarrollan los microorganismos del suelo y otros procesos microbianos de
interés agropecuario (metabolismo ruminal, fermentaciones agroindustriales,
calidad microbiana de alimentos, etc.), con un criterio biológico sólido y
actualizado. En la actualidad, la Microbiología Agrícola cobra especial relevancia
teniendo en cuenta que se persigue una productividad agrícola sustentable, la
preservación del medio ambiente y la producción de alimentos sanos.
6. Objetivos del espacio curricular

Generales
• Comprender el rol de los microorganismos en los diferentes procesos

relacionados con la producción agropecuaria y agroindustrial, con la
finalidad de facilitar la identificación y resolución de problemas en forma
crítica y responsable en el ámbito regional y nacional.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - iv
Específicos
• Comprender la importancia de los microorganismos en los diferentes

sistemas productivos.
• Analizar críticamente los efectos de los diferentes sistemas productivos

sobre la actividad biológica del suelo.
• Adquirir conocimientos sobre el manejo de microorganismos de interés

agronómico y agroindustrial.
• Formar criterios de fundamentación para el manejo de agroecosistemas.
• Utilizar correctamente equipos y material de laboratorio.
• Desarrollar capacidad para la realización e interpretaión de productos e

insumos agropecuarios.
• Incorporar vocabulario técnico especifico.
• Desarrollar capacidad de síntesis integrando los nuevos conceptos al

contenido cognitivo previo.
• Fomentar el intercambio de opiniones entre los estudiantes.
• Generar espíritu de colaboración a partir de trabajos grupales.
7. Programa Analítico
UNIDAD I: Grupos microbianos: características generales, célula procariótica y
eucariótica. Estructuras de las células procariotas. Técnicas de laboratorio para
el estudio de microorganismos de suelo: esterilización, cultivo, aislamiento y
observación microscópica.
UNIDAD II: Metabolismo de los microorganismos del aire, agua, suelo, rumen y
alimentos. Metabolismo quimio-órgano-heterótrofo: respiración aeróbica y
anaeróbica, fermentación y oxidaciones incompletas. Metabolismos quimio-lito-
autótrofo y foto-lito-autótrofo.
UNIDAD III: Taxonomía microbiana convencional y molecular. Crecimiento
bacteriano. Determinación de abundancia y biomasa microbiana. Curva de
crecimiento. Productos microbiológicos de carácter industrial. Factores que
afectan el crecimiento microbiano.
UNIDAD IV: Ecología microbiana. Ecosistemas microbianos. Biofilmes
microbianos. Sistemas “quorum sensing”. Hábitats microbianos. Distribución de
los microorganismos en el suelo. Interacciones biológicas entre
microorganismos, microorganismos-planta, microorganismo-animal.
UNIDAD V: Degradación de compuestos orgánicos en el suelo. Tipo de materia
orgánica. Sucesiones microbianas de la descomposición. Balance humificación
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - v
y deshumificación. Tasa de descomposición (k). Técnicas para el análisis de la

actividad microbiana.
UNIDAD VI: Disponibilidad de nutrientes para las plantas. Degradación de restos
orgánicos nitrogenados: amonificación y nitrificación. Pérdidas de nitrógeno del
suelo: lixiviación, volatilización y desnitrificación. Disponibilidad de fósforo:
mineralización y solubilización (micorrizas). Disponibilidad de azufre:
sulfidrilación y sulfooxidación. Desulfatación.
UNIDAD VII: Microorganismos Fijadores de Nitrógeno. Ciclo del nitrógeno.
Fijación Biológica del nitrógeno: proceso bioquímico, enzima nitrogenasa
(NASA) y su mecanismo de acción. Grupos de microorganismos fijadores de
nitrógeno y sus mecanismos adaptativos para el funcionamiento de la NASA.
Simbiosis rizobio-leguminosa: mecanismo de formación del nódulo, formación
del bacteroide. Producción y control de inoculantes. Normas de calidad. Técnicas
de aislamiento e identificación de microorganismos diazótrofos.
UNIDAD VIII: Microorganismos Promotores del Crecimiento (MPC).
Clasificación. Mecanismos de acción de los MPC, efectos directos e indirectos.
Los MPC como biofertilizantes: mecanismos de acción. Micorrizas: concepto,
clasificación, metabolismo y mecanismo de acción. Bacterias rizosféricas:
ejemplos y mecanismos de acción. Los MPC como biocontroladores:
Trichoderma y bacterias rizosféricas, mecanismos de acción.
UNIDAD IX: Microbiología del agua: Ciclo Hidrológico. Microorganismos en los
ecosistemas acuáticos. Contaminación de los ecosistemas acuáticos. Carga
microbiana de las aguas según su origen. Sanidad y calidad del agua. Bacterias
indicadoras de contaminación. Definición de agua potable según CAA (Código
Alimentario Argentino). Calidad de agua de riego. Tratamiento de efluentes de
origen pecuario. Métodos de análisis microbiológico de calidad de agua.
UNIDAD X: Microbiología de los alimentos. Las fermentaciones en la elaboración
de alimentos: Fermentación láctica: bacterias ácido-lácticas, producción de
yogurt (microorganismos que participan y mecanismo de acción), producción de
quesos blandos, semiduros y duros, etapas del proceso de producción.
Fermentación alcohólica: microorganismos responsables, proceso de
vinificación.
UNIDAD XI: Microbiología de la conservación de alimentos. Las fermentaciones
en la conservación de alimentos: Conservación de forrajes: Henificación,
Henolaje y Ensilaje.
UNIDAD XII: Degradación residuos sólidos orgánicos: compostaje,
vermicompostaje y producción de biogás. Tratamiento de efluentes líquidos.
Biorremediación y Fitorremediación.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - vi
Programa de Actividad Prácticas

TTPP 1: Técnicas de muestreo de suelo y rastrojo (Campo experimental de la
FCA-UNC).
TTPP 2: Técnicas de esterilización y cultivo de microorganismos.
TTPP 3: Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de
microorganismos.
TTPP 4: Análisis de fertilidad microbiana del suelo.
TTPP 5: Actividad heterótrofa total.
TTPP 6: Fertilizantes biológicos: desarrollo y control de calidad de inoculantes.
TTPP 7: Microorganismos promotores del crecimiento vegetal. Biofertilizantes y
Biocontroladores.
TTPP 8: Trabajo Práctico de campo (Campo Experimental de la FCA-UNC).
TTPP 9: Control de calidad de alimentos y agua.
8. Metodología de Enseñanza y de Aprendizaje

El curso cuenta con clases Teóricas y Trabajos de Laboratorio y de Campo, en
las cuales se fomenta la comunicación fluida entre docentes y estudiantes,
haciendo propicias las instancias de diálogo y la participación continua del
estudiantado.
Las clases Teóricas se desarrollan mediante exposición dialogada.
En las clases de laboratorio y de campo el docente trabaja en dos etapas:
en la primera se exponen los fundamentos de las actividades prácticas a realizar
y en la segunda etapa los estudiantes trabajan en forma grupal con la asistencia
de una Guía de Trabajos Prácticos impresa y otras publicaciones realizadas en
la Cátedra. En ambos tipos de clases, se utilizan técnicas de trabajo en grupos
reducidos para que los estudiantes puedan tener mejor acceso al material
didáctico disponible y posibilitar el intercambio directo con el docente y los demás
compañeros.
Para poder realizar adecuadamente todas las actividades de la asignatura
se requiere que las comisiones no superen los 20 estudiantes.
La asignatura utiliza el recurso de un Aula Virtual
(http://www.fca.proed.unc.edu.ar/), donde además de interaccionar con el
estudiante, se realizan actividades con frecuencia semanal. Cada semana se
sube al aula virtual, el power point del teórico, el power point de la actividad
práctica correspondiente y un cuestionario de preguntas teóricas de desarrollo,
como así también cualquier material adicional para uso del Estudiante.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - vii
9. Plan de actividades obligatorias

Tabla 1.
CARGA
UNIDAD
SEMANA MODALIDAD LUGAR HORARIA
TEMÁTICA
(horas)
1 Clase teórica Aula 2 UNIDAD I
Clase teórica Aula 2 UNIDAD I y II

2 Actividad Campo
3 TTPP 1
Práctica experimental
Clase teórica Aula 2 UNIDAD II

3 Actividad Laboratorio
3 TTPP 2
Práctica 318 y 323
Clase teórica Aula 2 UNIDAD III

3 TTPP 3
Práctica 318 y 323
Clase teórica Aula 2 UNIDAD IV

3 TTPP 4
Práctica 318 y 323
Clase teórica Aula 2 UNIDAD V

3 TTPP 5
Práctica 318 y 323
7 PRIMER PARCIAL (26 de septiembre)
Clase teórica
Aula 2 UNIDAD VI
8
Actividad Laboratorio
3 TTPP 6
Práctica 318 y 323
Clase teórica UNIDAD VII y

Aula 2
VIII
9
3 TTPP 7
Práctica 318 y 323
Clase teórica Aula 2 UNIDAD IX

10 Actividad Campo
3 TTPP 8
Práctica experimental
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UNIDAD X Y
Clase teórica Aula 2
XI
11
3 TTPP 9
Práctica 318 y 323
12 Clase teórica Aula 2 UNIDAD XII
13 SEGUNDO PARCIAL (7 DE NOVIEMBRE)
14 RECUPERATORIO (14 DE NOVIEMBRE)
EVALUACIÓN DE INTEGRACIÓN Y TRANSFERENCIA (24

15
DE NOVIEMBRE)
10. Evaluación
Tipos e instrumentos de evaluación
• Evaluación Diagnóstica.
Se realiza en la primera semana de actividades áulicas mediante un
cuestionario de opciones múltiples a través del aula virtual. Los temas
abordados se relacionan con contenidos correspondientes a materias
correlativas como Biología Celular y Química Biológica.
Instrumentos: cuestionario de opciones múltiples.
• Evaluación formativa:
Esta evaluación se realiza de forma sistemática y continua durante el
cursado de la materia. La misma se implementa a través de preguntas
orales que realizan los docentes a sus estudiantes para evaluar el avance
del proceso de enseñanza-aprendizaje. Normalmente se realiza durante
la actividad y al término de cada unidad.
Instrumentos: cuestionarios orales.
• Evaluación sumativa:
Comprenden cuestionarios escritos que evalúan contenidos teóricos y de
actividades, se realiza mediante autoevaluaciones de preguntas de
opciones múltiples utilizando para ellos el aula virtual, previo a la
realización de la actividad áulica.
Instrumentos: cuestionario de opciones múltiples.
• Evaluaciones de suficiencia:
Comprende 2 parciales escritos. Con posibilidad de recuperar 1 de los
parciales. Se aprueban con nota igual o superior a 4 (cuatro).
Instrumentos: Exámenes escritos semiestructurados.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - ix
• Evaluación de Integración y Transferencia:

Solamente para estudiantes que tengan acreditados todas las
Asignaturas correlativas y aprobado las evaluaciones de suficiencia.
Comprende un examen integrador oral que se aprueba con nota igual o
superior a 4 (cuatro).
Instrumentos: Examen oral.
• Criterios de evaluación
a) aspectos cognitivos: nivel de comprensión, capacidad de
aplicación de los conocimientos adquiridos y coherencia teórico-
práctica.
b) aspectos procedimentales: habilidad para la aplicación de
procedimientos, habilidad para resolver problemas y capacidad de
transferencia hacia la práctica de campo.
c) aspectos actitudinales: actitud crítica y responsabilidad como
estudiante.
11. Condición de los estudiantes:

▪ Estudiante promocionado: El que habiendo asistido al 80% de las
actividades obligatorias, aprueba las evaluaciones de suficiencia y la
evaluación de integración y transferencia con una nota igual o superior a
4 (cuatro) o aprueba las evaluaciones de suficiencia con una nota igual o
superior a 7 (siete) en aquellos espacios curriculares que así lo
consideren. Para acceder a la acreditación por promoción el estudiante
deberá haber cumplimentado los requisitos de correlatividad al momento
de iniciar el cursado del respectivo espacio curricular.
▪ Estudiante regular: El que habiendo asistido al 80% de las actividades
obligatorias, aprueba las evaluaciones de suficiencia con una nota igual o
superior a 4 (cuatro). Esta condición se mantendrá por el término de dos
años y medio desde la finalización del espacio curricular.
▪ Estudiante libre por nota: El que habiendo asistido al 80% de las
actividades obligatorias no obtenga cuatro puntos en las evaluaciones de
suficiencia.
▪ Estudiante libre por faltas: El que no asistió al 80% de las actividades
obligatorias o a alguna de las evaluaciones de suficiencia.
▪ Estudiante ausente: El que nunca asistió al espacio curricular.
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - x
12.. Bibliografía
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Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - xii
GUIA DE ACTIVIDADES PRÁCTICAS

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
- Año 2022 –
INDICE
TTPP Nº 1: TÉCNICAS DE MUESTREO DE SUELO Y RASTROJO…...…pág. 1

TTPP Nº 2: TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y CULTIVO DE
MICROORGANISMOS………………………………………………………….pág. 9
TTPP Nº 3: TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN, AISLAMIENTO Y
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS…………………………..….pág. 22
TTPP Nº 4: ANÁLISIS DE FERTILIDAD MICROBIANA DEL SUELO…..….pág.32
TTPP Nº 5: ACTIVIDAD HETERÓTROFA TOTAL………………………….pág. 43
TTPP Nº 6: FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO Y CONTROL DE
CALIDAD DE INOCULANTES……………………………………………..….pág. 48
TTPP Nº 7: MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL. BIOFERTILIZANTES Y BIOCONTROLADORES……………..pág. 63
TTPP Nº 8: EVALUACIÓN DE INOCULACIÓN A CAMPO…………………pág. 82
TTPP Nº 9: CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS Y AGUA……….…pág. 87
Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 1
TRABAJO PRÁCTICO N° 1: TÉCNICAS DE MUESTREO DE SUELO Y

RASTROJO
Objetivos:
• Conocer los criterios básicos para realizar un diseño de muestreo de suelo y

rastrojo.
• Conocer la metodología utilizada para el muestreo de suelo y rastrojo
realizado para análisis microbiológicos.
• Adquirir las habilidades y/o destrezas para correcto manejo de los materiales
e instrumentos de muestreo.
• Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto a fin de
fomentar una eficiente labor grupal.
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos del suelo presentan interés agropecuario debido al rol que
desempeñan en numerosos procesos edáficos (por ejemplo, la descomposición
de rastrojos y la disponibilidad de nutrientes para los cultivos) que condicionan
las características de un suelo y su productividad. El análisis de las
características químicas y microbiológicas del suelo y/o rastrojos (hojas, tallos,
raíces y detritos de cultivos), brinda información que permite diagnosticar,
predecir y planificar manejos sustentables, los cuales son luego transferidos al
agricultor/productor. Los estudios de suelo y/o rastrojos incluyen como etapa
principal el muestreo y procesamiento de las muestras.
Muestreo
La toma de muestras es fundamental para el análisis de suelo/rastrojo, pues de

ella depende que los resultados obtenidos sean representativos de la situación
en estudio. Por ello, el muestreo se efectúa de acuerdo con un método
normalizado teniendo en cuenta las características del lote que se va a analizar,
como las características propias del suelo (estructura y textura del suelo), del
paisaje (topografía), y también del manejo del suelo (tipo y fenología del cultivo,
sistema de labranza, rotación, etc.).
Para poder realizar un muestreo representativo, es necesario detectar

ambientes de zonas homogéneas en el lote de estudio. Para esto, se pueden
usar fotografías aéreas, mapas o cartas de suelo, como así también la tecnología
digital.
La tecnología digital es una importante herramienta para la planificación

del diseño de muestreo. Los mapas satelitales y la agricultura de precisión
facilitan la diferenciación de los ambientes en estudio. En el caso de la agricultura
de precisión se utilizan los mapas de rendimiento obtenidos mediante GPS
instalados en las cosechadoras, cuyos datos son procesados mediante
programas específicos generando un mapa donde se visualiza la
heterogeneidad del lote a analizar. Mientras más datos intervengan en el proceso
para determinar un ambiente mejores predicciones podrán hacerse en base a la
muestra extraída.
Otras herramientas en la actualidad son los sistemas GIS (Geographic

Information Sistem) o SIG (Sistema de Información Geográfica) los cuales podría
decir que son un tablero de control que integra información de diferentes fuentes,
(maquinarias, equipos GPS, mapas de productividad, mapas de rindes,
imágenes satelitales etc.) constituyéndose en una herramienta para resolver
problemas de planificación y de gestión, siendo útil para la toma de decisiones.
En el caso de estudios microbiológicos se recomienda una profundidad

de muestreo de 0-20 cm, debido a que en esa zona se localiza la mayor
abundancia y actividad microbiana. Debido a la gran heterogeneidad que
presenta el suelo, es necesario extraer submuestras que juntas conformarán
nuestra muestra a analizar. Para extraer las submuestras, se recomienda utilizar
pala (no barreno) para no disturbar el perfil original del suelo y conservar el
material superficial.
Tipo y cantidad de muestras
La variabilidad de las propiedades del suelo en el espacio y el tiempo presentan

un desafío para la evaluación de un sitio y la detección de cambios dentro y entre
sitios. La variación espacial incluye la variación horizontal y vertical en el espacio.
En sistemas no agrícolas la variabilidad es debida a numerosos factores
incluyendo micro relieve, actividad animal, la acción del viento, el ingreso de
restos vegetales (hojas, tallos, etc.), cualquier actividad humana, y el efecto de
la planta individual sobre el microclima suelo. Por otra parte, la variabilidad en
sistemas agropecuarios es causada por las enmiendas, las labranzas, las

secuencias de cultivos, aportes de heces de animales y la compactación a partir
de pastoreo y el equipamiento agrícola. La historia de manejo es un factor clave
en muchos sistemas para poder realizar la evaluación de distintos procesos o
parámetros. La incapacidad para apreciar y ajustar la variabilidad por sitio puede
comprometer el diseño de una cuidadosa investigación y/o recolección de
información.
Para garantizar la representatividad de toda la heterogeneidad del suelo

es fundamental hacer un diseño de muestreo estipulando la forma y el número
de muestras a tomar teniendo en cuenta que debe recogerse una muestra por
cada porción de terreno con características particulares (replicas). Las replicas
a campo monitorean la precisión del procedimiento y la variabilidad total a
campo.
La muestra puede ser:
- Muestra simple: es la que se obtiene mediante una sola extracción.

Generalmente, este tipo de muestreos no se llevan a cabo a campo debido a la
gran heterogeneidad del suelo.
- Muestra compuesta: se refiere a la muestra de suelo y/o rastrojo obtenida por

la extracción de varias muestras simples o submuestras, reunidas en un
recipiente o bien mezcladas (homogeneizadas) de aproximadamente 0,5 a 1 Kg
de suelo. Se recomienda la extracción de 15-20 submuestras por sitio de
muestreo. El peso de cada submuestra debe ser de aproximadamente 200
gramos de suelo o por lo menos de igual volumen que las demás submuestras.
En el caso de rastrojo se colecta una superficie de 0,16 m2 (cuadrado de 40 x 40
cm). La utilización de muestras compuestas para el análisis es un efectivo
método para obtener una adecuada estimación de la media de un parámetro
reduciendo los costos y tiempo de análisis. Las muestras compuestas: a) deben
ser homogéneas; b) cada submuestra debe contribuir de igual manera (mismo
volumen) a la muestra compuesta; c) cada submuestra debe ser tomada
siguiendo el mismo procedimiento en cuento a instrumento utilizado,
profundidad, etc.; y d) las submuestras deben ser independientes y no presentar
interacción.
Frecuencia y época de muestreo
Además de la variabilidad espacial, los suelos presentan variabilidad temporal

(días, meses y años) que pueden ser substanciales para muchas propiedades.
Los cambios temporales pueden reflejar variaciones estacionales y/o anuales del
clima y microclima como así también los regímenes de manejo (por ejemplo:
arado, abonos, fertilización, tala, etc.) y alteraciones en la cantidad y calidad
química de los aportes de compuestos orgánicos (rastrojos). Muchos procesos
biológicos del suelo (por ejemplo: respiración microbiana y mineralización de
nitrógeno) son fuertemente controlados por la temperatura y la humedad y a
menudo presentan patrones estacionales específicos para un sitio o ecosistema
en particular. El tiempo y frecuencia de muestreo serán establecidos según los
objetivos del estudio y las condiciones del sitio a analizar.
Diseño de muestreo
El diseño debe estipular la forma y el número de muestras a tomar teniendo en

cuenta que debe recogerse una muestra por cada porción de terreno con
características particulares (ambiente homogéneo). Las muestras deben ser
tomadas al azar, recorriendo la parcela o el lote en cuadrículas, zigzag o
diagonales (Fig. 1) o sobre el trazado de una transecta lineal. La transecta es
una línea recta imaginaria con puntos de muestreo localizados a intervalos
regulares.
Figura 1: Tipos de diseños de muestreo sistemáticos.
Instrumentos de muestreo
Un instrumento de muestreo requiere dos condiciones importantes: a) que tome

una capa uniforme desde la superficie hasta la profundidad determinada y b) que
se pueda obtener el mismo volumen de suelo en cada extracción. Entre los

instrumentos de muestreo de suelo se encuentran: el barreno (existen diferentes
tipos) y la pala. Para extraer las submuestras para realizar un análisis
microbiológico se recomienda el uso de pala para no disturbar el perfil original
del suelo y conservar el material superficial. No se deben tomar muestras de
suelo a la orilla de los caminos, bebederos, dormideros, antiguas construcciones
y sectores de carga de fertilizantes o agroquímicos. Las muestras de suelo sin
disturbar se deberán tomar en ecosistemas naturales (monte/bosque) o debajo
de los alambrados en ecosistemas agrícolas. Estos sitios sin disturbar sirven
como puntos de comparación con los suelos en estudio.
Otros elementos auxiliares que hacen a un mejor muestreo es el uso de GPS y

los sistemas informáticos (ej: SIG)
Acondicionamiento de las muestras
En el campo las muestras deben ser colocadas en bolsas de polietileno

debidamente rotuladas y acondicionadas en una conservadora hasta su llegada
al laboratorio. De esta manera, se evita que sufran exceso de calor e insolación
y que se alteren sus condiciones originales. El rótulo de cada muestra estará
identificado (letras o números) y correlacionado con la información de la parcela
o lote obtenida (cultivos, insumos, labores culturales, ubicación geográfica,
topografía, rotación, y catastral), y del responsable de la muestra (nombre,
dirección, localidad, teléfono, lote y establecimiento).
Preparación de las muestras en el laboratorio
Las técnicas seleccionadas y el tiempo requerido para la preparación de las

muestras en el laboratorio deben ser cuidadosamente consideradas para
minimizar los cambios producidos en las propiedades de interés y para evitar
comprometer futuros análisis. El protocolo de procedimiento debe ser el mismo
para todas las muestras.
Antes de proceder al análisis, las muestras de suelo y/o rastrojos deben

ser secadas al aire (oreadas) para detener los procesos biológicos. El
procedimiento del oreado consiste en esparcir el suelo/rastrojo (formar una fina
capa) sobre una bandeja de papel o plástico en una habitación libre de
contaminantes y dejar secar el suelo a temperatura y humedad ambiente durante
un mínimo de 24 horas. Los suelos oreados tienen relativamente peso constante

y mínima actividad biológica.
Convencionalmente, las muestras de suelo para análisis químicos, físicos

y microbiológicos se tamizan por una malla de 2 mm para separar el rastrojo del
suelo y romper los agregados, donde se realizan la casi totalidad de los procesos
biológicos del suelo. En el caso del rastrojo, las muestras son molidas con
molinillo eléctrico para homogeneizar los restos orgánicos provenientes de las
diferentes estructuras (hojas, tallos, frutos, etc).
Almacenamiento y/o conservación
Dependiendo del tipo de análisis que se realicen sobre las muestras de suelo y/o
rastrojo será el método de almacenamiento o conservación que se utilice:
1- Refrigeración (4-5ºC): utilizado para almacenar por mínimos períodos de

tiempo (no más de un mes) muestras oreadas y tamizadas de suelo y/o molidas
de rastrojo, para la evaluación de parámetros biológicos. El almacenamiento de
muestras húmedas por largos períodos de tiempo no es recomendado porque
posiblemente ocurran muchos cambios en la comunidad de microorganismos y
el potencial desarrollo de condiciones anaeróbicas.
2- Congelación (-20 a - 80 ºC): puede ser adecuado para el almacenamiento por

largos períodos de tiempo dado que la actividad microbiana es efectivamente
minimizada. Generalmente, es utilizado para análisis biomoleculares o para
determinar la diversidad genética de las comunidades microbianas.
3- Temperatura ambiente (25ºC): utilizado para el almacenamiento por largos

períodos de tiempos (años) de las muestras oreadas y tamizadas de suelo y/o
molidas de rastrojo, para la evaluación de parámetros químicos y/o físicos.
Recomendaciones para almacenamiento de muestras:
1. Las muestras almacenadas a temperatura ambiente deben estar en un

ambiente seguro, con baja probabilidad de daños por humedad, contaminación
química, etc. Las fluctuaciones de temperaturas en el almacenamiento deben ser
mínimas para evitar la potencial condensación en el interior de los recipientes.
2. Los recipientes deben tener tapa segura y ser de materiales que perduren en
el tiempo (plástico o vidrio) con bajo potencial de contaminación de la muestra y
alteración de las propiedades químicas del material.
3. Las etiquetas siempre deben estar sobre el recipiente y no sobre la tapa y

contener la identificación de la muestra indicando su número y el tamaño de
tamiz o molienda utilizado, por ejemplo 2 mm.
TRABAJO DE LABORATORIO
Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades:
1. Realizar muestreo de suelo y rastrojo en lotes del campo escuela
- Tomar con pala una muestra compuesta de suelo (10 submuestras) por lote.
- Con un aro de ¼ de metro cuadrado tomar una muestra compuesta de

rastrojo por lote (4 submuestras).
- Las muestras deben ser colocadas en bolsas de polietileno debidamente

rotuladas y llevadas al laboratorio.
2. Realizar conteo de plantas de garbanzos
- Determinar una transecta con 10 estaciones, siendo cada una de ellas de “1

metro lineal” y tomar el conteo del número de plantas de garbanzo emergidas
por tratamiento. Cada grupo trabajará con dos de los seis tratamientos.
- Con los datos del conteo realizado calcular un promedio de plantas

emergidas por tratamiento y a partir de ello calcular la densidad de plantas
en el lote:
Promedio del conteo = X
Distancia entre línea de siembra 0,52 cm
Metros lineales por Ha = 100 m/0,52m x 100 m
N° de plantas por Ha = X x 19230 m

3. Preparación de las muestras de suelo en laboratorio
- Tamizar el suelo previamente oreado en tamiz de malla de 2 mm.
- Embolsar, rotular y colocar en heladera.
4. Muestras de rastrojo
- En una balanza pesar la muestra de rastrojo y a partir del dato obtenido,

calcular el valor de biomasa de rastrojo por hectárea (kg / ha).
Si la superficie del aro es de 0,25 m2 y las muestra está compuesta por 4

submuestras, la superficie a la que corresponde el pesaje obtenido
corresponde a 0,25 m2 x 4 = 1 m2. Con regla de tres simple, calcular la
biomasa de rastrojo por hectárea.
TRABAJO PRÁCTICO N° 2: TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y CULTIVO DE

MICROORGANISMOS
Objetivos:
● Conocer las metodologías actuales de control y eliminación de
microorganismos.
● Obtener dominio de los métodos básicos de esterilización y desinfección.
● Conocer los medios de cultivo más utilizados en el laboratorio y las
diferentes metodologías para el cultivo de microorganismos.
● Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de
microorganismos de interés agropecuario.
● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto a fin de
INTRODUCCIÓN: ESTERILIZACIÓN
La esterilización es el proceso por el cual se destruyen o remueven las células

vivas, esporas de hongos, endosporas bacterianas, virus y viroides presentes en
un objeto o superficie, mediante el uso de agentes físicos o químicos (Tabla 1).
Un objeto estéril es aquel que está libre de microorganismos, esporas y otros
agentes infecciosos. El término esterilización tiene un significado absoluto, es
decir, un objeto está estéril o no lo está. Debido a que los microorganismos se
encuentran ampliamente distribuidos en el agua, el aire y el suelo, es
indispensable cumplir con una etapa de esterilización y/o desinfección previa de
todo el material de trabajo (ansas de siembra, material de vidrio, medios de
cultivo, frascos de toma de muestras, mesadas, etc.), que se utilizará para
realizar el estudio de los microorganismos de interés. La desinfección, a
diferencia de la esterilización, es un proceso que destruye o inhibe la mayor
proporción de los microorganismos potencialmente patógenos presentes en
objetos o superficies. Otro término muy utilizado es el término “antisepsia”. Éste
hace referencia al conjunto de procedimientos destinados a la inhibición o
destrucción de microorganismos potencialmente patógenos presentes en la
superficie de la piel y mucosas. Por ejemplo, el alcohol al 70% actúa como
desinfectante cuando lo colocamos sobre una superficie inerte y como
antiséptico, cuando lo usamos en la piel.
Previo a la esterilización, el material debe ser: lavado con detergente, enjuagado

con agua destilada y secado. Además, el material debe ser envuelto (previo a su
esterilización) para que una vez esterilizado esté protegido de la contaminación
ambiental durante el transporte y almacenamiento hasta el momento de su
utilización.
Tabla 1. Métodos de esterilización más comunes:
- Vapor de agua a presiones superiores a la

atmosférica
Calor húmedo
-Vapor de agua a presión atmosférica
(Tindalización)
Métodos físicos -Horno

Calor Seco -Flameado
-Calor al rojo
Radiaciones -No ionizantes
-Ionizantes
Filtraciones
Métodos químicos Sustancias líquidas y gaseosas
Métodos físicos
Calor húmedo
Mecanismo de acción: el calor húmedo destruye los microorganismos en forma

gradual. No hay un único mecanismo de acción, sino que se van sumando
distintos eventos a medida que aumenta la temperatura. El primer efecto letal es
la ruptura de la cadena de ADN que provoca la muerte celular por activación de
endonucleasas. A medida que aumenta la temperatura comienza a perderse la
integridad de la membrana celular, generando inconvenientes en la síntesis
proteica y los procesos respiratorios, y fallas en el intercambio con el medio
externo. Finalmente, se produce desnaturalización y coagulación irreversible de
enzimas y proteínas estructurales.
Modo de acción: difusión del vapor de agua sobre los microorganismos.
✔ Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica

La esterilización por calor húmedo se realiza con vapor de agua a presiones
superiores a la atmosférica mediante el uso de autoclaves. Los autoclaves que
comúnmente encontramos en los laboratorios son aparatos herméticos que
trabajan en forma similar a una olla a presión. El autoclave es básicamente una

caldera metálica (en general de cobre), en cuya parte inferior se encuentra la
fuente de calor (quemador o mechero) en autoclaves a gas, o bien, una
resistencia eléctrica, en el caso de autoclaves eléctricas. La caldera lleva en su
interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el
material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa hermética que ajusta
mediante una junta de goma de siliconas y una serie de tornillos.
La tapa presenta tres elementos básicos que comunican el exterior con el

interior de la caldera: el manómetro (que indica presión), la válvula de seguridad,
y la llave de salida de vapor o espita. Para comenzar un ciclo de esterilización,
primero debe colocarse agua en el autoclave procurando que su nivel no
sobrepase el fondo perforado sobre el cual se ubicará el material. Luego, se
colocan los objetos a esterilizar y se cierra la tapa ajustando los tornillos, a fin de
asegurar un cierre hermético. El aire es un mal conductor del calor, lo que impide
llegar a la temperatura deseada para lograr la esterilización. Es por ello que una
vez cargado y cerrado el autoclave, éste debe purgarse. Para ello se enciende
la fuente de calor manteniéndose la espita abierta. De esta manera, el vapor
generado a partir del agua contenida en el fondo del recipiente, desplazará, por
arrastre, al aire presente en el equipo y éste será expulsado a través de la espita.
Una vez que la caldera se satura de vapor de agua (sale un chorro continuo y
abundante de vapor a través de la espita) se cierra la espita y comienza a
aumentar la presión de la cámara. La presión se regula con la cantidad de calor
suministrado y se controla mediante un manómetro. Cuando se alcanza la
presión deseada, la misma se mantiene constante y se controla el tiempo de
esterilización.
Para la esterilización de volúmenes pequeños se utiliza una combinación

tiempo-temperatura de 20 minutos a 121ºC. Esta temperatura se logra
generando 1,1 kg/cm2 atmósferas de presión. Los autoclaves poseen
normalmente indicadores de presión (manómetros) y no de temperatura. La
presión se corresponde con la temperatura cuando el vapor de agua es puro y
no está mezclado con aire. Para lograr la correspondencia entre presión y
temperatura debe tenerse especial cuidado de “purgar” el autoclave hasta que
salga todo el aire del recipiente hermético.
Para permitir la libre circulación del vapor, los tapones utilizados en los
frascos, tubos, etc. y los papeles para las envolturas deben ser de material
permeable (ej. tapones de algodón-gasa). Los recipientes que se utilicen para
esterilizar medios de cultivo u otros materiales líquidos deben llenarse hasta la
mitad de su volumen para permitir una buena circulación del vapor y evitar
posibles derrames del líquido. El vapor saturado se condensa sobre los objetos
líquidos compensando la cantidad de agua que se evapora. De esta manera, los
materiales esterilizados no se deshidratan.
El autoclave sólo debe abrirse cuando la presión del manómetro baje a

cero. De la misma manera, no debe provocarse una salida brusca del vapor
abriendo la llave de salida de vapor o espita antes que descienda
adecuadamente la presión, debido a que, si hay líquidos en el interior, van a
alcanzar rápidamente el punto de ebullición y se van a derramar.
✔ Vapor de agua a presión atmosférica (Tindalización)

Es un método de esterilización que se aplica cuando el material puede alterarse
si es expuesto a temperaturas por encima de 100°C y se denomina
“Tindalización”. El proceso consiste en calentar el material por media hora a
temperaturas de 80-90ºC. Luego, el material a esterilizar se incuba a 37ºC
durante 24 horas. Se repite el proceso 3 días consecutivos. Durante la
incubación las esporas germinan, generando células vegetativas, las cuales se
eliminan en la siguiente exposición al calor. Este método puede utilizarse por
ejemplo para la esterilización de soluciones de azúcares con concentraciones
superiores al 10 % o medios de cultivo que contengan antibióticos, los cuales se
alteran por la temperatura superior a 100 ºC.
Calor seco
Mecanismo de acción: el calor seco provoca desnaturalización de proteínas,

lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos.
Modo de acción: la acción letal es resultado del calor transmitido por el material
que está en contacto directo con los microorganismos y no por el aire caliente
que los rodea.
✔ Hornos o estufas de esterilización

Se emplean para esterilizar materiales de vidrio (pipetas, vasos, cajas de

Petri), material de porcelana, material metálico (pinzas, cucharas, etc.). Debido
a que la conducción del calor es más lenta en el aire que en el vapor, para
esterilizar con calor seco se requiere mayor intensidad de calor y mayor tiempo
de esterilización. La combinación temperatura-tiempo más usada es 160 °C,
durante 2 horas. Los elementos deben envolverse en papel para evitar su
contaminación una vez que finaliza el proceso. No corroe vidrio ni metal.
✔ Flameado
Consiste en sumergir en alcohol el material (puntas de bisturís, varillas de vidrio,
cucharas, etc.) y luego pasarlo por la llama de mecheros, colocando la pieza en
el cono amarillo de la llama y luego lentamente en el azul (mayor poder
calorífico).
✔ Calor al rojo
Consiste en colocar materiales metálicos sobre la llama de un mechero de la
forma en la cual se describe anteriormente, hasta que alcancen color rojo vivo.
Se utiliza para esterilizar instrumental metálico (puntas de ansas, agujas, pinzas,
etc.).
Radiaciones
✔ No ionizantes
Luz ultravioleta (UV): La porción ultravioleta del espectro que se utiliza para
esterilizar corresponde a radiaciones que oscilan entre 200 y 300 nm. Para ello
se utilizan lámparas de vapor de mercurio, que producen radiaciones con escasa
capacidad para poder penetrar los materiales, por lo que sólo los
microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos son sensibles
a este tratamiento. El mecanismo de esterilización se basa en un fenómeno físico
por el cual las ondas cortas de la radiación ultravioleta inciden sobre el material
genético (ADN) de los microorganismos y los virus, y los destruyen en corto
tiempo, sin producir cambios físicos o químicos notables en el material a
esterilizar. Al momento de utilizar luz UV es importante tener en cuenta que la
intensidad de la radicación emitida por la lámpara se disipa a medida que la
distancia a la lámpara aumenta. Las radiaciones UV se utilizan para desinfectar
superficies, aire y agua. Las cámaras de flujo laminar utilizadas para trabajar
asépticamente vienen equipadas con lámparas de luz UV para descontaminar

las superficies.
✔ Ionizantes
Rayos gamma: son radiaciones emitidas por ciertos isótopos radiactivos, como
el cobalto (60Co) o el Cesio (137Cs), ambos productos colaterales de la fisión
nuclear. Los rayos gamma esterilizan mediante acción letal contra los
microorganismos al alterar el ADN. La radiación ionizante suele utilizarse para la
esterilización y descontaminación de materiales de uso médico y en la industria
alimentaria. Esta técnica de esterilización está indicada para materiales
termosensibles (gomas, polietilenos, materiales quirúrgicos y farmacéuticos).
Requiere instalación compleja por lo que es solo aplicable a gran escala.
Filtraciones
Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero de animales, soluciones

de enzimas, algunos azúcares, algunas vitaminas y antibióticos) son
termolábiles. Cuando no es posible utilizar las radiaciones, se utiliza el método
de filtración. Para ello, se procede a hacer pasar la solución por un filtro de poros
muy pequeños que retienen a los microorganismos (logrando la exclusión en
base al pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte a la adsorción a las
paredes del poro debido a la carga eléctrica del mismo y de los
microorganismos). El tipo de filtro más utilizado es el filtro de membrana que
consiste en un disco duro generalmente compuesto de ésteres de celulosa con
poros pequeños que evitan el paso de los microorganismos. La filtración se
realiza utilizando una jeringa o una bomba de vacío para forzar el paso del líquido
a través del filtro hasta un recipiente estéril. La desventaja de este método es
que partículas muy pequeñas (como algunos virus) pueden atravesar los poros
y quedar en la solución.
Métodos químicos
Los desinfectantes químicos pueden clasificarse en 3 niveles (alto, mediano y

bajo), según su concentración o su acción. Estos productos químicos se suelen
utilizar para descontaminar materiales que se alteran por el calor (plásticos,
semillas, papel, etc.) y varían en cuanto a su toxicidad siendo selectivos según
los microorganismos. Además, deben ser solubles en agua o en lípidos para
obtener una penetración más eficiente en los microorganismos, tener baja

tensión superficial y ser fácilmente eliminables luego del proceso.
Sólo los desinfectantes de alto nivel pueden provocar una verdadera

esterilización química, si el tiempo de acción es el adecuado. Además, pueden
ser utilizados en superficies inertes, pero no como antisépticos, es decir, no
sobre piel o mucosas. Dentro de este grupo se encuentran: óxido de etileno,
formaldehído al 8% en alcohol al 70%, glutaraldehído al 2% y peróxido de
hidrógeno. Su modo de acción es modificar en forma irreversible grupos
funcionales de proteínas y/o ácidos nucleicos. Esto provoca inhibición celular y
lleva a la muerte. El más utilizado en el laboratorio es el peróxido de hidrógeno,
que actúa como un agente oxidante. Los otros son agentes muy tóxicos,
altamente mutagénicos y carcinogénicos, por lo tanto, deben ser manipulados
con extrema precaución.
Los desinfectantes de mediano nivel, si bien no destruyen esporos, sí

destruyen hongos, virus no lipídicos y al agente causal de la tuberculosis
(Mycobacterium tuberculosis). Algunos ejemplos son: hipoclorito de sodio,
alcohol iodado y alcoholes. Su modo de acción es actuar a nivel de proteínas y
ácidos nucleicos como agentes oxidantes (hipoclorito de sodio, alcohol iodado)
o producir precipitación, desnaturalización de proteínas y lesiones en la
membrana citoplasmática (alcoholes). Es importante destacar que algunos
agentes químicos, como es el caso del alcohol etílico, son más efectivos cuando
se aplican diluidos en agua (por ej.: alcohol al 70%) debido a que el agua les
otorga mayor poder de penetración en los microorganismos. La mayoría de ellos
pueden ser utilizados como desinfectantes y antisépticos.
En el caso de los desinfectantes de bajo nivel (compuestos de amonio

cuaternario y agentes mercuriales), en la actualidad su uso solo se reserva para
la limpieza doméstica ya que no destruyen ni esporos, ni virus no lipídicos ni m.
tuberculosis.
INTRODUCCIÓN: CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Para cultivar microorganismos en el laboratorio se utilizan medios de cultivo que

proveen todos los requerimientos nutritivos para el desarrollo de los
microorganismos, y además se les brindan todas las condiciones ambientales
óptimas para su crecimiento (temperatura, pH, etc.).
Medios de cultivo
Un medio de cultivo es una mezcla balanceada de los requerimientos nutritivos

que tienen los microorganismos a concentraciones tales que permiten el buen
crecimiento de estos. Los medios de cultivo deben proporcionar los ingredientes
químicos (nutrientes) que las células requieren para sintetizar las moléculas que
las componen, permitiendo así la supervivencia y multiplicación de los
microorganismos. Están constituidos en general por: base mineral, fuente de
carbono, fuente de energía, fuente de nitrógeno y factores de crecimiento si son
necesarios. La combinación entre los diferentes componentes químicos varía de
acuerdo con las características nutricionales de cada microorganismo a cultivar.
No hay ningún medio o condiciones de cultivo que permita el crecimiento de
todos los microorganismos que se encuentran en la naturaleza. No obstante, hay
medios que permiten el desarrollo de un gran número de microorganismos y
otros en los cuales se desarrollan sólo algunos de ellos.
Los requerimientos nutricionales varían entre microorganismos,

dependiendo del tipo de metabolismo que presenten y de su capacidad
biosintética. Algunos nutrientes se necesitan en grandes cantidades
(macronutrientes) y otros en menor abundancia, incluso en cantidades muy
pequeñas (micronutrientes).
Los macronutrientes incluyen los principales elementos que constituyen

las macromoléculas, es decir carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y
azufre, entre otros. Los micronutrientes son tan importantes para el
funcionamiento celular como los macronutrientes, pero se requieren en
cantidades tan pequeñas que generalmente no es necesario agregarlos a los
medios de cultivo. Estos suelen ser metales (cromo, cobalto, cobre, manganeso,
molibdeno, etc.), muchos de los cuales tienen función estructural en varias
enzimas. Algunos microorganismos necesitan, además, compuestos orgánicos
que son incapaces de sintetizar (factores de crecimiento). Estos compuestos se

requieren en bajas cantidades e incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y
pirimidinas.
Además de los nutrientes, al momento de preparar un medio de cultivo

debe tenerse en cuenta el pH que va a tener. En general el pH al cual desarrollan
la mayoría de las bacterias es cercano a la neutralidad, aunque puede variar
entre 5 y 9 según las especies. Los hongos se desarrollan preferencialmente en
pH ácidos (5 a 6,5) y los actinomycetes suelen crecer a pH más básicos. Es por
ello que cuando se prepara un medio, el pH se ajusta de acuerdo al organismo
que se desea cultivar.
Clasificación de los medios de cultivos
Los medios de cultivo pueden clasificarse según distintos aspectos:
Por el estado físico:
● Líquido (caldo)
● Semisólido (0,2 % agar)
● Sólido (1- 2 % agar)
Por su composición química:
● Sintético o químicamente definido: se conoce la composición química

exacta de sus constituyentes y las cantidades en que deben agregarse para
formular el medio de cultivo.
● Complejo o químicamente indefinido: contienen al menos un componente
cuya composición química exacta no se conoce, por ejemplo, extracto de
levadura, triptona o peptona.
Por su uso en el laboratorio (función):
● Generales: son medios que permiten el desarrollo de microorganismos

con bajos requerimientos nutricionales. Por ejemplo: agar nutritivo, caldo
nutritivo, etc. (Tabla 2).
● Selectivos o inhibitorios: contienen además de los nutrientes, sustancias

que inhiben selectivamente el desarrollo de algunos microorganismos
permitiendo el crecimiento de otros. Por ejemplo: caldo Mc Conkey.
● Diferenciales: permiten distinguir microorganismos por su crecimiento
diferencial en el medio (Tabla 3). Para formularlos se consideran las propiedades
metabólicas particulares del/de los microorganismo/s que se desea/n detectar y
se agrega al medio un indicador que las evidencie. Por ejemplo: medio Y.E.M.
con rojo Congo.
Preparación de un medio de cultivo
La mayoría de los medios de cultivo están disponibles comercialmente en polvo

por lo que sólo debe pesarse la cantidad a utilizar e hidratarse en agua destilada
en la concentración indicada por el comerciante. En cambio, existen otros medios
de cultivo que no se encuentran disponibles en el mercado y que deben
prepararse a partir de sus componentes.
Medios de cultivo líquidos:

Para ello, se debe leer atentamente la composición química del mismo y pesar
la cantidad necesaria de cada constituyente, según el volumen de medio de
cultivo a preparar. Luego se deben disolver los ingredientes del medio en el
volumen requerido de agua destilada, agitando el recipiente con una varilla de
vidrio o barra magnética y llevar a volumen final en recipientes aforados. En el
caso de los medios disponibles comercialmente no debe regularse el pH; en
cambio, en los medios preparados en el laboratorio debe medirse el pH y de ser
necesario, el mismo debe ajustarse con soluciones de NaOH o H3PO4 (1 N). No
se debe utilizar HCl para disminuir el pH debido a la alta toxicidad del cloro sobre
las bacterias. Finalmente, el medio se coloca en tubos de ensayo, matraces,
frascos, botellas, o en cualquier recipiente acorde al uso que se le vaya a dar y
al método de esterilización. La boca del recipiente debe taparse con algodón-
gasa y papel de aluminio.
Medios de cultivo sólidos:

Se procede de la misma manera descripta para los medios de cultivo líquidos
pero se agrega un agente solidificante. Si bien, existen varios tipos de agentes
solidificantes, el más utilizado es el agar-agar, que es un polisacárido extraído
de algas marinas. Este compuesto puede estar incluido en la mezcla comercial

o agregarse durante la preparación. El agar-agar no es soluble en agua a
temperatura ambiente por lo tanto, previo a la esterilización, el medio debe
fundirse a 100 ºC para lograr una mezcla homogénea. El agar-agar es muy
utilizado como solidificante, debido a que gelifica a 40-45°C y no es degradado
por los microorganismos. Además, su poder de gelificación no es afectado por
varios ciclos de calentamiento y solidificación. Los medios sólidos suelen
fraccionarse en tubos de ensayo. Luego de la esterilización pueden ser utilizados
para cultivos en caja de Petri o cultivos en pico de flauta. Para lograr el pico de
flauta se deja enfriar el medio sólido en una disposición inclinada. En el caso en
que se requiere preparar un medio de cultivo semisólido se disminuyen las
concentraciones del agente solidificante para lograr la consistencia deseada.
Tabla 2. Composición química de un medio de cultivo general

COMPUESTO CANTIDAD
Fuente de C y energía Almidón 12 g
Fuente de N NaNO3 0.5 g
Base mineral KH2PO4 1.0 g
MgSO4 .7H2O 0.5 g
Agente solidificante Agar-agar 15 g
Agua Agua destilada 1000 mL
pH = 7.0
Tabla 3. Composición química de un medio diferencial para Fijadores de

nitrógeno
COMPUESTO CANTIDAD
Fuente de C y energía Sucrosa 20 g
Base mineral K2HPO4 0.15 g
CaCl2 0.01 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
Na2MoO4 0.002 g
FeCl3 0.01 g
CaCO3 0.1 g
Agua Agua destilada 1000 mL
pH = 7.0
Pasos a seguir para preparar un medio de cultivo:
1. Pesar los componentes sólidos.

2. Disolver los componentes en agua destilada (hidratación).
3. Regular el pH. Si el medio es ácido subir el pH con NaOH (1N) y si es alcalino
bajar con H3PO4 (1N).
4. Si el medio es sólido, pesar el agar-agar y fundir al calor hasta ebullición para
que pueda gelificar cuando se enfría (40-45°C).
5. Fraccionar los medios líquidos en frío y los sólidos en caliente (colocar 15-20
mL de medio de cultivo en tubos de ensayo si se van a utilizar para cajas de Petri
y colocar 5 mL si se harán tubos en agar inclinado o pico de flauta).
6. Acondicionar los envases para esterilizar con tapones de algodón-gasa
envueltos en papel poroso o papel aluminio.
7. Esterilizar en autoclave: los medios deben siempre esterilizarse en el día.
8. Para obtener medios en “pico de flauta”, después de la esterilización y antes
que solidifiquen, apoyar los tubos en un ángulo adecuado para obtener mayor
superficie de crecimiento.
9. Conservar los medios estériles en heladera (4-5°C).
1. Preparación de medios de cultivo generales
- Preparar 50 mL de medio de cultivo sólido general (agar nutritivo) y 25 mL

de medio de cultivo general líquido (caldo nutritivo).
- Fraccionar el medio de cultivo sólido: 15 mL de medio en cada tubo de
ensayo (para cajas de Petri) y 5 mL en cada tubo de ensayo (para tubos pico de
flauta).
- Rotular
- Acondicionar para esterilizar
- Esterilizar
2. Preparación de cajas de petri y picos de flauta
- Pasar el medio de cultivo sólido preparado a cajas de Petri y colocar los

tubos para pico de flauta inclinados sobre la mesada hasta su solidificación.
3. Siembra de microorganismos del suelo
Trabajando en condiciones de asepsia:

- Colocar un gramo de suelo en 25 mL de medio de cultivo líquido general
(preparado en el práctico).
- Rotular.
- Incubar a 28-30°C.
TRABAJO PRÁCTICO N° 3: TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN,

AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
Objetivos:
● Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el

laboratorio de microbiología.
● Conocer las técnicas básicas para la realización de coloraciones simples y
dobles.
● Ser capaz de explicar el fundamento de la coloración de Gram y mencionar
sus utilidades diagnósticas.
● Conocer las técnicas de aislamiento de microorganismos para obtener cultivos
puros.
● Adquirir conocimientos sobre las distintas técnicas de conservación de
cultivos puros.
● Adquirir habilidad para la observación de microorganismos.
● Adquirir habilidad en el aislamiento de microorganismos en medio sólido.
● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar
una eficiente labor grupal.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias son organismos pequeños y translúcidos, por lo que su

visualización es muy dificultosa. Para estudiar a los microorganismos es
necesario observarlos vivos o muertos y con este fin se utilizan lentes que
incrementan su tamaño. En este sentido, para los trabajos de rutina en
microbiología se utiliza el microscopio óptico, mientras que para el examen de
las estructuras intracelulares se utiliza el microscopio electrónico. Los
microscopios ópticos usan lentes para aumentar el tamaño de los organismos
que se examinan. La capacidad de aumento de un microscopio óptico se calcula
multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Aumentos de
1500 veces están cercanos al límite de lo que se puede conseguir con un
microscopio óptico. Dentro de los microscopios ópticos más comunes tenemos:
los de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases y de fluorescencia.
En cambio, con los microscopios electrónicos se obtiene mayor resolución, ya
que la muestra es atravesada por un haz de electrones en lugar de la luz. Existen
varios tipos de microscopios electrónicos, sin embargo, los más utilizados son:
el microscopio electrónico de transmisión (MET) y el microscopio electrónico de
barrido (MEB).
El poder de resolución es la capacidad de poder ver dos puntos muy

cercanos como unidades distintas y separadas. Aunque el aumento puede
incrementarse prácticamente sin límites en los microscopios ópticos, no ocurre
lo mismo con la resolución porque está limitada por las propiedades físicas de la
luz. El poder de resolución es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y
fineza detallada de la imagen. El máximo poder de resolución en un microscopio
óptico es de 0,2 µm, en cambio, en un microscopio electrónico es mucho menor
(0,01 µm) y es por ello que con él se pueden observar las estructuras
subcelulares.
Observación microscópica
Para observar una muestra en el microscopio óptico, que es el que se utiliza de

rutina en el laboratorio, podemos realizar:
1- Preparaciones húmedas: se realizan colocando una gota de la suspensión

de microorganismos entre un portaobjeto y un cubreobjetos y se observan
directamente sin colorear ni disturbar la muestra.
2- Preparaciones fijadas: se coloca con ayuda de un ansa una gota del cultivo
a analizar sobre el portaobjetos (extendido) y se fija (mediante calor o agentes
químicos). En el caso de la fijación por calor se pasa el portaobjetos por la llama
del mechero con lo cual se logra adherir (fijar) el material al vidrio. La fijación se
produce principalmente debido a la coagulación de las proteínas presentes en
las células. Este paso es crucial ya que si no fijamos el preparado
adecuadamente no podremos observar los microorganismos en el microscopio
a la hora de realizar la coloración. Al realizar el proceso de fijación, las bacterias
mueren y sus paredes se vuelven más permeables a los colorantes. Otra manera
de realizar la fijación es mediante agentes químicos (alcoholes, ácido acético,
etc). Luego de fijado el preparado puede ser sometido a diferentes tipos de
coloraciones dependiendo la estructura u organismo que se quiera poner de
manifiesto.
Métodos de coloración
Las coloraciones o tinciones son técnicas que permiten observar

microorganismos en función de la afinidad de diversas estructuras celulares con
determinadas sustancias colorantes. Los colorantes son compuestos orgánicos
que tienen las siguientes funciones: a) permiten hacer visibles los objetos
microscópicos y transparentes; b) revelan su forma y tamaño y c) producen
reacciones químicas específicas.
Existen dos tipos de colorantes:
- Catiónicos: son sustancias que están cargadas positivamente y por ello se

combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los
ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos: azul de metileno, cristal
violeta y safranina.
- Aniónicos: son sustancias cargadas negativamente y se combinan con

componentes celulares cargados positivamente como es el caso de algunas
proteínas. Ejemplos: fucsina ácida, rojo congo, etc.
Distintos caracteres son utilizados para la identificación de los microorganismos,

entre ellos sus características morfológicas: forma celular, agrupamiento, tipo de
pared, presencia de cápsulas, endosporas y flagelos. La observación al
microscopio utilizando distintas técnicas de tinción permite obtener esta
información. Además, dependiendo de la cantidad de colorantes que se utilizan
y de qué estructuras celulares se quieren resaltar, las coloraciones pueden ser:
- Simples: utilizan un solo colorante y se basan en el hecho de que las células

tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que
ambos se comportan de forma diferente frente al colorante (Figura 1).
- Diferenciales: utilizan más de un colorante y se fundamentan en que distintos

tipos de células tienen distinta composición o estructura química, y por lo tanto
reaccionan de forma diferente frente a uno u otro colorante. En este grupo se
encuentra incluida la tinción de Gram.
Figura 1. Secuencia de una coloración simple
Tinción de Gram
Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica
a los microorganismos en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y Gram
positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884,
a quien debe su nombre. Los fundamentos de la tinción de Gram están basados
en las características de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo
y determina sus características tintoriales. (Ver complemento teórico, Pared
celular Unidad 1) (Tabla 1).
Tabla 1. Secuencia de una tinción de Gram
Pasos Observación Gram + Gram -

1- Se tiñe el extendido
Todas las bacterias se
con el colorante cristal
tiñen de violeta.
violeta durante 1 minuto.
2- Se añade Lugol
(solución de yodo-ioduro
Todas las bacterias se
potásico) para fijar el
tiñen de violeta.
colorante durante 1
minuto.
3- Se decolora el Las bacterias Gram
extendido con una positivas se mantienen
mezcla de alcohol- de color violeta y las
acetona. Se enjuaga el Gram negativas se
extendido con agua. decoloran.
4- Se tiñe el extendido
con fucsina durante 30
segundos, que funciona
Las bacterias Gram
como un colorante
positivas se mantienen
secundario y sirve para
violetas y las Gram
teñir las bacterias que no
negativas se tiñen de
pudieron retener el
rosa.
complejo cristal violeta-
yodo. Enjuagar el
extendido con agua.
Obtención de cultivos puros
Los microorganismos por su pequeño tamaño se estudian como poblaciones

denominadas “cultivos”. Se denomina cultivo puro a un conjunto de
microorganismos genéticamente iguales, obtenidos a partir de una sola célula o
de una colonia formada por una sola célula. Esta célula inicial se obtiene
mediante aislamiento en medio sólido, que es el procedimiento que permite
separar un microorganismo de una población mixta, que es la forma en la cual
se encuentran generalmente en la naturaleza.
Métodos de aislamiento
Existen numerosos métodos para aislar microorganismos. Los de mayor utilidad

en microbiología de suelo son: aislamiento en medio sólido y aislamiento
biológico.
1. Aislamiento en medio sólido
Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio agarizado. De esta

manera cada célula al multiplicarse formará una colonia visible
macroscópicamente. La técnica más común de aislamiento es la de “estrías en
superficie o método de aislamiento por agotamiento” (Figura 2) y consiste en
diluir progresivamente una alícuota de un cultivo (inóculo) mediante el trazado
de líneas sobre la superficie del agar (estrías). Se inocula la muestra sobre un
extremo de la placa con un ansa y se extiende formando estrías sobre la
superficie en varios sentidos, en las primeras estrías se obtiene crecimiento
confluente debido a que el inóculo está muy concentrado y en las últimas estrías
al quedar menos microorganismos en el ansa, se obtienen colonias aisladas
originadas a partir de cada célula.
Figura 2. Aislamiento por agotamiento o estriado.
2. Aislamiento biológico
Consiste en inocular organismos vivos (animales o plantas) con las bacterias en

estudio para posteriormente aislarlas en estado puro a partir de la sangre o
células especiales de los organismos. Es muy utilizado cuando se trabaja con
bacterias patógenas y simbióticas (por ej. aislamiento de cepas de rizobios a
partir de nódulos de leguminosas).
Conservación de cultivos puros
La conservación de cultivos puros tiene el propósito de poder mantener y

preservar los cultivos puros por períodos largos de tiempo con el objetivo de: a)
preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus
propiedades bioquímicas; b) preservar los niveles de su productividad inicial y c)
lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.
Técnicas de conservación de cultivos puros:
- Liofilización: consiste en congelar rápidamente una suspensión de

microorganismos y eliminar el agua (desecación) como vapor directamente
desde hielo sin pasar por el estado intermedio líquido. Luego los liófilos se
conservan entre 0 y 5°C durante muchos años. Para su recuperación se
resuspende el liófilo en soluciones y temperaturas adecuadas.
- Congelación: se coloca un cultivo puro de microorganismos suspendidos en

medio líquido y luego se congela a -90°C recubiertos con glicerol (agente
crioprotector). Con esta técnica se disminuye o anula el metabolismo del
microorganismo, realizando un cultivo en fase estacionaria (alta resistencia a
daños). El cultivo puede descongelarse y usarse incluso varios años después.
- Subcultivos seriados: esta técnica consiste en cultivar los microorganismos en

medio sólido pico de flauta y conservarlos en la heladera (4-5ºC), repicando el
cultivo de manera periódica en un medio nutritivo fresco para garantizar la
viabilidad y pureza del mismo.
Manejo del material en condiciones de asepsia
Las condiciones de asepsia son clave para trabajar con microorganismos. Los
principales requisitos para trabajar asépticamente son:
- La atmósfera del laboratorio debe ser lo más limpia posible (evitar corrientes de
aire, polvo, humo, etc.). Lo más adecuado es manejar los cultivos de
microorganismos en cámaras de flujo laminar. Estas cámaras consisten en
gabinetes cerrados con flujo de aire filtrado hacia el operador, con lo que se
evita la introducción de elementos contaminantes en la mesa de trabajo. Es
conveniente que toda la habitación sea sometida a radiación UV antes de
trabajar.
- La superficie de la mesa de trabajo debe desinfectarse con alcohol o hipoclorito

antes de comenzar y al finalizar el trabajo.
- Cuando se toma material desde un cultivo de microorganismos, el ansa debe

ser previamente esterilizada a la llama, proceso que se repite después de ser
utilizada.
- Cuando se destapa un recipiente conteniendo material estéril o un cultivo, se

debe flamear la boca del recipiente y mantenerlo cerca de la llama mientras se
trabaja. Al calentar la boca del recipiente se produce una corriente de aire
caliente desde adentro hacia afuera que no permite la entrada de elementos
contaminantes. Los recipientes deben flamearse nuevamente antes de
taparlos.
1. Trabajando en condiciones de asepsia, realizar coloraciones simples

(con el colorante fucsina) a partir de los cultivos de suelo en medio general
y diferencial para fijadores de nitrógeno sembrados en el práctico anterior.
Procedimiento:
- Extender con el ansa una alícuota de cultivo de manera uniforme sobre el
portaobjeto.
- Fijar los extendidos sobre la llama del mechero
- Cubrir el portaobjeto con fucsina.
- Dejar actuar durante un minuto.
- Lavar con agua destilada.
- Secar en la columna de aire caliente del mechero.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100 x).
2. Coloración simple (fijación con ácido acético)
Realizar una coloración simple con fucsina a los portaobjetos enterrados

(Técnica de Rossy-Cholodny) preparados en el práctico anterior.
- Sacar los portaobjetos con cuidado (remover el suelo en exceso).

- Fijar el material con ácido acético al 40% durante 5 minutos.
- Cubrir el portaobjeto con fucsina.
- Dejar actuar durante un minuto.
- Lavar con agua destilada.
- Secar en la columna de aire caliente del mechero.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
3. Coloración diferencial
Trabajando en condiciones de asepsia, realizar una coloración diferencial de

Gram, siguiendo los pasos descriptos anteriormente en la guía de trabajos
prácticos.
4. Aislamiento por agotamiento (estriado)
En condiciones de asepsia tomar con un ansa una alícuota del cultivo en medio
general preparado en el Práctico anterior, colocar la alícuota en un extremo de
la caja de Petri y extenderla formando estrías sobre la superficie del medio de un
cultivo sólido (agar nutritivo) con el objetivo de obtener colonias aisladas. Luego
incubar a 28-30°C.
5. Actividad extra. Sembrar cultivo puro en pico de flauta.
En condiciones de asepsia tomar con un ansa una alícuota del cultivo puro,
colocar la alícuota en un extremo basal del pico de flauta y extenderla en forma
de estriado sobre la superficie del medio de un cultivo sólido. Luego incubar a
28-30°C.
TRABAJO PRÁCTICO N° 4: ANÁLISIS DE FERTILIDAD MICROBIANA DEL

SUELO
Objetivos:
• Conocer las técnicas de recuento de microorganismos.

• Conocer la importancia del monitoreo de abundancia, actividad y diversidad
de los microorganismos edáficos.
• Obtener dominio en el análisis de grupos funcionales microbianos que
intervienen en la fertilidad del suelo.
• Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de
microorganismos.
• Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar
INTRODUCCIÓN
La vida microbiana tiene un rol esencial en la formación y el mantenimiento de la

fertilidad del suelo. El monitoreo de la abundancia, actividad y diversidad de los
microorganismos edáficos es de suma importancia en ecosistemas agrícolas a
fin de evaluar el impacto de las diferentes prácticas de manejo productivo. El
análisis microbiológico del suelo estudia la presencia, abundancia y actividad de
las poblaciones microbianas y las interacciones entre los microorganismos y
entre ellos y las plantas. Por tal motivo, se debe recurrir al uso de técnicas de
laboratorio que respeten lo más fielmente posible las condiciones presentes en
el ambiente natural.
Las técnicas de análisis más utilizadas para estimar la abundancia

microbiana incluyen:
1- Recuento de células totales (células vivas y muertas).
2- Recuento de células viables (células que aún presentan capacidad para

reproducirse).
1- Recuento de células totales
a) Método directo (Cámara de Petroff‐Hausser)
Este método consiste en el contaje de células microbianas (vivas y muertas) por

visualización al microscopio. Para ello, se utilizan portaobjetos especiales con
una graduación en superficie que retiene un volumen de inóculo conocido. La
cámara de recuento cuenta con las siguientes medidas conocidas:
- Tiene 0,02 mm de profundidad;
- Presenta un área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes
- Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 16 cuadrados pequeños
Es decir, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 cuadros pequeños.
El método de recuento directo (Figura 1) es una manera rápida de

estimar el número de células microbianas pero tiene una serie de limitaciones,
por ejemplo, las células muertas no se distinguen de las vivas y las células
pequeñas son difíciles de visualizar. Además, si el número de células vistas en
el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo este método no
es una forma adecuada de evaluar el número de células.
Forma de calcular el número de

células por mL de muestra
Portaobjeto
12 células x 25 cuadrados x 50 x 103
Número x mm2
Sitio donde se coloca la muestra. Número x mm3

El espacio entre cubre y porta es Observación microscópica: todas las
de 0,02 mm (1/50 mm). La rejilla células son contadas dentro de un Número x cm3 o /mL
tiene 25 cuadrados grandes, un cuadrado grande (16 cuadrados
área de 1 mm2 y un volumen pequeños). Ej. 12 células
total de 0,02 mm3
Figura 1. Cámara de recuento

b) Método indirecto (Método Turbidimétrico)
El cálculo indirecto de masa celular, consiste en la medición de la cantidad de

luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.
El método turbidimétrico, se basa en la capacidad de las células para

dispersar la luz que incide sobre ellas, siendo el grado de dispersión proporcional
a la biomasa o cantidad de células presente. La turbidez es la disminución de la
luz transmitida a través del tubo (Transmitancia), lo que equivale a mayor
cantidad de luz absorbida (Absorbancia). Para poder medir la absorbancia se
utiliza un espectrofotómetro donde las lecturas obtenidas en el aparato se
expresan en unidades de densidad óptica (DO). Este método requiere realizar
previamente una curva patrón relacionando la DO con recuentos (mediante otros
métodos) realizados para cada tipo de microorganismo estudiado. Estos
métodos son ampliamente usados para evaluar el crecimiento de una población
sin disturbar la muestra (Figura 2).
Luz incidente
Filtro (filtra diferentes longitudes de onda)
Muestra con células

Luz no dispersada
Fotocélula (mide la luz no dispersada)
Figura 2. Espectrofotómetro
2- Recuento de células viables:
a) Recuento en medio sólido:
Consiste en contar las colonias que se desarrollan sobre o dentro del agar
asumiendo que cada célula origina una sola colonia. Como no siempre una
colonia se forma a partir de una sola célula, los resultados se expresan en
unidades formadoras de colonias (UFC). A pesar de esta limitación es un método
ampliamente utilizado debido a su practicidad. Antes de realizar la siembra de
una muestra mediante este método, usualmente se realizan diluciones seriadas.
El resultado se expresa en UFC/mL o UFC/g.
UFC/mL o UFC/g = colonias contadas x (1/factor de dilución) x (1/volumen de

inóculo).
Factor de dilución: Dilución utilizada
Volumen de inóculo: 1 mL (para siembra por embebido) o 0,1 mL (para siembra

en superficie).
Existen básicamente dos formas de realizar recuento en medio sólido:
- Siembra por inmersión o embebido: se siembra el inóculo (generalmente 1

mL) en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo
previamente fundido (a una temperatura de aproximadamente 45-50ºC para
evitar la muerte de microorganismos) (Figura 3).
Solidificación e
incubación
Colonias creciendo en
superficie
Colonias creciendo
embebidas en el agar
El inóculo es pipeteado Medio estéril es adicionado y
dentro de una placa mezclado con el inóculo
estéril
Figura 3. Método de siembra por inmersión o embebido

- Siembra en superficie: se vierte sobre una placa o caja de Petri el medio de

cultivo fundido y se deja solidificar. Luego, se coloca sobre la superficie el inóculo
a sembrar (generalmente 0,1 mL). Con ayuda de una espátula de Drigalsky
estéril se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo
(Figura 4).
Colonias creciendo en
Incubación superficie
Se coloca una alícuota (0,1 mL) Se esparce el inóculo con

sobre la superficie del agar espátula de Drigalsky
Figura 4. Método de siembra en superficie
b) Recuento en medio líquido:
Sirve para estimar la población de microorganismos viables en muestras de

suelo, agua o alimentos. La metodología de la técnica se basa en la siembra de
volúmenes secuenciales de base 10 (diluciones) de la muestra pura o 1 mL de
las diluciones decimales. El número de diluciones dependerá de la cantidad de
microorganismos presentes en la muestra (a mayor cantidad de
microorganismos mayor cantidad de diluciones) (Figura 5).
El método de número más probable (NMP) es una estrategia eficiente

de estimación de las densidades poblacionales especialmente cuando una
evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa
en la determinación de la presencia o ausencia (tubos positivos o negativos) en
réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de los
microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes.
Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de

poder reconocer un atributo particular de la(s) población(es) en el medio de
crecimiento a utilizarse. Generalmente se evalúa el consumo de algún sustrato
y/o la aparición de algún producto microbiano (ácido, gas, etc.). El estimado de
densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en las
diluciones seriadas y del uso de una tabla probabilística (tabla de Mc. Grady)
(Tabla 1). Para ingresar a la tabla de Mc. Grady es necesario formar un número
conformado por la cantidad de tubos con actividad metabólica positiva (número

característico).
Algunas de las ventajas del método del Número más Probable son: (a)
la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos
relacionados a un proceso: selectividad (por ejemplo, se puede determinar la
densidad poblacional de organismos con capacidad de degradar la celulosa en
una muestra de suelo utilizando medios de cultivo que contengan celulosa como
única fuente de carbono), (b) proveer una recuperación uniforme de las
poblaciones microbianas de suelos diversificados, (c) determinar sólo
organismos vivos y activos metabólicamente, y (d) ser más rápido e incluso más
confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo.
Diluciones seriadas
Suspensión o inóculo
a sembrar
Batería de tres tubos
Figura 5. Método del Número Más Probable

Recuento de células viables aplicadas a grupos funcionales
Grupo funcional: conjunto de microorganismos que realizan procesos

metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía. Para el análisis
de la fertilidad del suelo se suelen analizar cuatro grupos microbianos:
amonificadores, celulolíticos, nitrificadores y fijadores de nitrógeno.
Pasos para determinar la abundancia de los grupos funcionales que intervienen

en la fertilidad del suelo.
1- Suspensión y dilución de suelo
Para poder realizar los recuentos, el suelo debe ser suspendido/diluido

(generalmente 10 g de suelo se colocan en 90 mL de solución salina estéril).
Como en el suelo la cantidad de microorganismos es muy grande se deben
realizar diluciones de la suspensión/dilución para obtener un número factible de
microorganismos que pueda ser contado. Por ejemplo, cuando se realizan
métodos de recuento en medio sólido, el número factible de microorganismos
que puede ser contado en una caja de Petri debe estar en el rango de 30 a 300
colonias por caja. Asimismo, en el caso del método de recuento en medio líquido
(Número Más Probable), para poder ingresar a la tabla de Mc. Grady se requiere
al menos que exista un tubo negativo. Para poder cumplir con estos requisitos,
comúnmente se realizan diluciones al décimo (1 mL de la muestra en 9 mL de
solución salina estéril) (Figura 6).
2- Siembra en medios selectivos líquidos y sólidos
Para realizar la siembra de los microorganismos se procede a colocar 1 mL de

cada dilución de suelo utilizada en medios selectivos estériles para los distintos
grupos funcionales. Para optimizar el procedimiento se recomienda comenzar la
siembra con las diluciones más altas, de esa manera se puede utilizar solo una
pipeta estéril por muestra.
Grupos funcionales a evaluar:
Amonificadores: Debido a que es el grupo más abundante en el suelo, se

siembran las tres diluciones más altas. La siembra se realiza por triplicado: se
coloca 1 mL de las diluciones -9, -8 y -7 en tubos conteniendo el medio líquido
selectivo (con asparagina). Se incuba a 28- 30ºC durante 7 días.
Celulolíticos: Se siembra por triplicado 1 mL de las diluciones -6, -5 y -4 en

tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con papel de filtro). Se incuba a 28-
30ºC durante 15 días.
Fijadores de nitrógeno de vida libre: Se siembra 1 mL de la dilución -4 en una

caja de Petri y se agrega el medio sólido selectivo (sin N). Se incuba a 28- 30ºC
durante 5 días.
Nitrificadores: Debido a que es el grupo menos abundante en el suelo se

siembran en las tres diluciones más bajas. Se siembra por triplicado 1 mL de las
diluciones -4, -3 y -2 en los tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con
sulfato de amonio). Se incuba a 28- 30ºC durante 21 días.
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
X g suelo
en
X mL de solución
salina estéril Suspensión/dilución
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
10-1
Agitar 2 o 3 minutos
Recuento en medio sólido Recuento en medio líquido

(Embebido) (NMP)
Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores
Incubación
ESTUFA
LECTURA
Figura 6. Esquema de siembra de los grupos funcionales

3- Lectura
Una vez que cada uno de los grupos funcionales han sido incubados se procede
a la lectura. En el caso de realizar recuento en medio líquido, para poder obtener
el NMP se procede de la siguiente manera: 1) se ordenan los tubos desde la
dilución más concentrada a la más diluida que se utilizó para sembrar cada grupo
funcional; 2) se cuentan los tubos positivos de cada dilución (número
característico) y 3) se ingresa a la tabla de Mc Grady con el número característico
para obtener el NMP.
Amonificadores: se agregan 2 o 3 gotas de reactivo de Nessler en cada tubo y

se cuentan los tubos positivos (color ocre por presencia de amonio). Se ordena
la cifra para obtener el número característico y se ingresa a la tabla de Mc. Grady
para obtener el número más probable.
Celulolíticos: se cuentan los tubos positivos (colonias sobre el papel o alteración

del mismo). Se ordena la cifra para obtener el número característico y se ingresa
a la tabla de Mc. Grady.
Fijadores de nitrógeno de vida libre: se cuentan las colonias (UFC) que se

formaron en la caja de Petri.
Nitrificadores: se agrega 0,1 mL de ácido sulfúrico concentrado y unas gotas

de di fenilamina sulfúrica en cada tubo y se cuentan los tubos positivos (color
azul por presencia de nitrato). Se ordena la cifra para obtener el número
característico y se ingresa a la tabla de Mc. Grady.
Tabla 1. Tabla de Mc. Grady para tres tubos
Nº Nº
NMP Nº Característico NMP NMP
Característico Característico
000 ‹0.3 111 1.1 222 3.5
001 0.3 112 1.5 223 4.2
002 0.6 113 1.9 230 2.9
003 0.9 120 1.1 231 3.6
010 0.3 121 1.5 232 4.4
011 0.61 122 2.0 233 5.3
012 0.92 123 2.4 300 2.3
013 1.2 130 1.6 301 3.9
020 0.62 131 2.0 302 6.4
021 0.93 132 2.4 303 9.5
022 1.2 133 2.9 310 4.3
023 1.6 200 0.91 311 7.5
030 0.94 201 1.4 312 12
031 1.3 202 2.0 313 16
032 1.6 203 2.6 320 9.3
033 1.9 210 1.5 321 15
100 0.36 211 2.0 322 21
101 0.72 212 2.7 323 29
102 1.1 213 3.4 330 24
103 1.5 220 2.1 331 46
110 0.73 221 2.8 332 110
Cada grupo de alumnos deberá realizar la siguiente actividad:
1. Siembra de grupos funcionales
- Trabajando en condiciones de asepsia, realizar una suspensión (10 gramos

de suelo en 90 mL de solución salina estéril).
- A partir de la suspensión realizar diluciones al décimo.
- Realizar la siembra de grupos funcionales (nitrificadores, celulolíticos,
amonificadores y fijadores de N2) en medios de cultivo selectivos y
diferenciales.
- Incubar a 28-30ºC.
2. Recuento de microorganismos de diferentes grupos funcionales
- Realizar el recuento de microorganismos: fijadores de nitrógeno,

celulolíticos, amonificadores y nitrificadores.
3. Actividad extra para trabajar en el Práctico Nº 5
Utilizando suelo oreado y tamizado realizar la siguiente actividad:
- Pesar y colocar 20 gramos de suelo en un frasco de 300-400 cc.

- Regar al 60% de la capacidad de campo.
- Colocar (con pipeta) 15 mL de NaOH 0,2 N en dos cubetas.
- Colocar una de las cubetas dentro del frasco con suelo y la otra dentro de un
frasco de 300-400 cc vacio.
- Rotular y cerrar ambos frascos lo más herméticamente posible (usar
polietileno y cinta para sellar los frascos).
- Incubar a 28-30ºC.
TRABAJO PRÁCTICO N° 5: ACTIVIDAD HETERÓTROFA TOTAL
Objetivos:
• Incorporar conocimientos generales sobre las técnicas de análisis para la

determinación de la actividad heterótrofa total microbiana.
• Conocer la importancia del monitoreo de la actividad de los microorganismos

edáficos.
• Adquirir habilidades y/o destrezas en el análisis de la actividad heterótrofa

total.

INTRODUCCIÓN
La actividad microbiana total evalúa el metabolismo de todos los

microorganismos del suelo en su conjunto. Debido a que el metabolismo más
importante de los microorganismos es la respiración aeróbica, los métodos para
medir la actividad heterótrofa total se basan en determinar la respiración del
suelo mediante el consumo de O2 o la producción de CO2. La técnica para medir
la producción de CO2 es la más difundida debido a su practicidad y simplicidad
metodológica. La respiración del suelo puede medirse en condiciones
controladas de laboratorio (respiración potencial) o directamente a campo (in
situ). Los métodos de medición a campo reflejan de manera más realista la
situación analizada pero suelen ser más difíciles de implementar.
Producción de CO2 del suelo en condiciones de laboratorio
El método se basa en captar el dióxido de carbono (CO 2) producido por una

muestra de suelo en una solución alcalina y transformarlo en carbonato. Para
ello se coloca una muestra de suelo y una cubeta con hidróxido de sodio (NaOH)
en un frasco cerrado herméticamente en condiciones óptimas de humedad (60%
de capacidad de campo) y temperatura (28-30°C) por un período de tiempo
determinado. Simultáneamente, debe prepararse un frasco con las mismas
condiciones pero sin muestra de suelo, este frasco es utilizado “Blanco” para
descontar el CO2 proveniente del aire.
Principio químico de la medición del CO2
El CO2 liberado durante la respiración aeróbica en el suelo puede ser absorbido

en solución alcalina y medido como un índice de la tasa de respiración. La
reacción en la cual el CO2 es absorbido durante la incubación es:
CO2 + 2 NaOH Na2CO3 + H2O
Luego de la incubación se debe proceder a la medición de la cantidad

de CO2 producido. Para ello, se realiza una reacción de titulación. La titulación
es un método que permite conocer la concentración de una solución básica a
partir de la neutralización (ácido-base) con una solución ácida de concentración
conocida (o viceversa). Para poder determinar el momento en el cual ocurre la
neutralización se utiliza a menudo indicador de pH. Cuando la solución de
concentración conocida y la solución de concentración desconocida se hacen
reaccionar al punto en el que el número de equivalentes de ácido es igual al
número de equivalentes de base (neutralización), se alcanza el punto de
equivalencia y el indicador de pH cambia de coloración.
base + ácido sal + agua
En este caso para medir el CO2 primero se debe precipitar el carbonato

(CO3-2) con una solución de cloruro de bario (BaCl2):
Na2CO3 + BaCl2 2 NaCl + BaCO3
La titulación se realiza con HCl y como indicador se utiliza la

fenolftaleína. La fenolftaleína en una solución básica es rosa virando a incolora
cuando el pH es neutro y permaneciendo incolora en soluciones ácidas. La
reacción química general que ocurre durante una titulación es:
NaOH + HCl NaCl + H2O
Calculando la diferencia entre la cantidad de mL de HCl utilizados para

titular el blanco y la cantidad de mL de HCl utilizados para titular la muestra, se
obtiene la cantidad de CO2 producido por respiración mediante la siguiente
fórmula:
(Blanco – Muestra) 4.4

= mgCO2 /d / g
pS
donde :
Blanco: mL de HCl gastados para titular el blanco
Muestra: mL de HCl gastados para titular la muestra
d: días de incubación
pS: peso suelo (g)
4.4: factor de conversión entre mL de HCl y mg de CO 2, que se origina del

siguiente cálculo:
HCl equivale a CO2/2
HCl 0,2 N = HCl/5 equivale a CO2/2 x 5
Peso molecular del CO2 = 44
Por lo tanto: HCl 0,2 N = 44/10 = 4,4
Síntesis del proceso para medir CO2 en laboratorio:

Producción de CO2 del suelo en condiciones a campo
Para ello, se utilizan recipientes herméticos de un volumen conocido que se

entierran hasta cierta profundidad (10 cm) durante un periodo de tiempo. La
cantidad de CO2 formado en ese período se evalúa mediante un detector de
gases graduado acoplado a una jeringa extractora de gases.
Casos prácticos del análisis microbiano del suelo
Para evaluar los cambios en la fertilidad de un suelo, los parámetros biológicos

son más sensibles que los químicos, particularmente los grupos microbianos
poco diversos y poco abundantes (por ejemplo, los microorganismos
nitrificadores). Sin embargo, para poder interpretar los análisis microbianos de
fertilidad de manera adecuada hay que considerar una serie de factores:
1) No existen valores óptimos absolutos para la fertilidad microbiana de un

suelo debido a que cada lugar tiene características propias en cuanto a
cantidad y actividad de las diferentes poblaciones microbianas. Los
resultados de un suelo problema siempre deben compararse con un suelo
testigo sin disturbar de sitios cercanos.
2) No siempre un mayor número de microorganismos ni una mayor actividad

se corresponden con suelos de mayor fertilidad, ya que los procesos
microbianos en el suelo deben estar balanceados.
3) Los índices que relacionan parámetros químicos y biológicos como el

índice de mineralización de C (IMC), resultan ser más representativos de
la dinámica del suelo que los parámetros biológicos de manera aislada.
IMC= producción de CO2/contenido de materia orgánica
IMC= 1 balanceado
> pierde C
< gana C
TRABAJO DE LABORATORIO:
1. Titular las muestras preparadas e incubadas a 28-30°C en el práctico

anterior y calcular el CO2 producido.
Procedimiento:
- Transferir la solución de cada una de las cubetas a un erlenmeyer.
- Agregar 1 mL de BaCl2 al 2% y 1 gota de fenolftaleína a cada una de las

cubetas.
- Titular con HCl 0,2 N.
- Calcular la cantidad de CO2 producido por gramo de suelo y comparar los

resultados con los demás grupos.
2. Resolver los siguientes problemas de actividad heterótrofa total
a. ¿En cuál de los siguientes resultados de actividad microbiana de suelo se

utilizó más HCl 0,2 N para titular?
- 0,98 mg CO2/g en una muestra de 15 g de suelo con un blanco de 14,5

mL de HCl 0,2 N
- 0,12 mg CO2/g en una muestra de 25 g de suelo con un blanco que gastó

13,3 mL de HCl 0,2 N
- 0,21 mg CO2/g de suelo en una muestra de 10 g de suelo con un blanco

de 13,9 mL de HCl 0,2 N
b. Calcule la actividad microbiana del suelo expresada como mg CO 2 /g suelo/

7días, con los siguientes datos: HCl 0,2 N gastado para titular el blanco 14,7
mL; HCl 0,2 N gastado para titular la muestra 9,3 mL; peso de la muestra de
suelo 15 g. Siete días de incubación.
TRABAJO PRÁCTICO N° 6: FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO

Y CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES
Objetivos:
● Conocer los parámetros para la selección de cepas.
● Conocer las metodologías y procedimientos microbiológicos para la
evaluación y control de los inoculantes más utilizados en la actualidad.
● Adquirir habilidades y/o destrezas para la evaluación de la inoculación a
campo.
● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para
INTRODUCCIÓN
El uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ocasiona

graves problemas de contaminación, ya que no todo el fertilizante que se aplica
lo aprovecha la planta, sino que una cantidad importante acaba en aguas
superficiales y subterráneas. En este sentido, una alternativa para disminuir la
utilización de fertilizantes químicos puede ser la utilización de microorganismos
con fijación biológica de nitrógeno (FBN), ya que además de no poseer riesgo de
contaminación ambiental, su efecto está fuertemente sincronizado con los
requerimientos de la planta y generalmente son de menor costo.
En general, se estima que alrededor del 50 % de un fertilizante

nitrogenado cuando es aplicado a los cultivos es absorbido por las plantas y el
otro 50 % o más es almacenado en el suelo para la nutrición de los cultivos
subsiguientes; pero una gran parte de este es transformado en nitrógeno
atmosférico mediante los procesos de denitrificación y otra gran parte es lixiviado
a capas inferiores donde produce contaminación de las aguas subterráneas y el
manto freático en forma de nitrato (NO3-).
Los procesos naturales de FBN juegan un importante rol en la activación

de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. La
contribución de la FBN al ciclo global del nitrógeno es importante, presentando
un balance con el proceso de denitrificación. Algunos de los compuestos de
nitrógeno gaseoso originados por denitrificación juntamente con el CO 2,
producen el efecto invernadero causante en gran medida del calentamiento

global.
Por lo tanto, el incremento de FBN en el suelo, puede mitigar la necesidad

del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto
benéfico al ciclo de nitrógeno, el calentamiento global y el saneamiento de las
aguas subterráneas y superficiales. Este proceso depende básicamente de la
acción de los microorganismos en conjunto con las plantas (interacción
microorganismo-planta).
Fertilizantes biológicos (inoculantes)
La legislación argentina define como fertilizantes biológicos a los productos que

contienen uno o varios microorganismos como principal componente sobre un
determinado soporte sólido, líquido u oleoso. Estos productos están formulados
con microorganismos viables benéficos, seleccionados para favorecer la
nutrición y/o promover el crecimiento de las plantas. La calidad de un inoculante
está definida en principio por la eficiencia de la cepa presente en el producto,
que debe ser escogida en base a un riguroso proceso de selección de cepas en
diferentes condiciones agroecológicas. En segundo lugar, dependerá de la
formulación del inoculante, la que deberá garantizar el número mínimo de células
viables desde su elaboración y hasta el periodo de vencimiento en condiciones
de almacenamiento determinados y durante el periodo de vida útil o tiempo de
vigencia establecido por los entes de fiscalización. En general, el periodo de
validez de los inoculantes está condicionado principalmente por las
características del soporte y el mismo va desde los 6 hasta los 18 meses.
Si bien, en nuestro país y en el mundo se ha despertado gran interés en

el uso de microorganismos como los Rizobios para fabricar inoculantes, otros
microorganismos como Pseudomonas y Azospirillum, también son utilizados
como inoculantes. Ese interés ha ido acompañado del desarrollo de productos
microbianos de calidad obteniendo resultados favorables en las investigaciones
y ensayos realizados que provocaron que se incremente en los últimos años su
producción y utilización, en especial como tratamientos a la semilla previos a la
siembra.
Clasificación de los inoculantes
En general, los inoculantes pueden clasificarse según:
- El soporte: puede ser: a) líquido (acuosos con o sin turba en suspensión y

oleosos) o b) sólido (generalmente turba). El soporte constituye la mayor
proporción o volumen del inoculante y su función es la de nutrir y proteger a los
microorganismos frente a factores adversos, durante el periodo que transcurre
desde su elaboración hasta su uso en los sistemas de producción. Los soportes
deben ser capaces de mantener elevadas las concentraciones de
microorganismos viables, sin producir alteraciones en sus propiedades
fisiológicas durante periodos de almacenamiento prolongados. Además, deben
proveer los elementos imprescindibles para la vida de las bacterias (alimento,
oxígeno y humedad), evitar la competencia con otros organismos y no poseer
sustancias tóxicas que alteren a las bacterias.
- La cantidad de cepas con las que estén formulados: Los inoculantes

efectivos pueden integrarse con una sola cepa (inoculantes monocepa), o
pueden contener varias cepas (inoculantes multicepa).
Cualidades de un inoculante efectivo:
- Deberá contener microorganismos seleccionadas por su capacidad para fijar

grandes cantidades de nitrógeno.
- Los microorganismos utilizados deberán ser específicos para el cultivo a tratar.
- Los microorganismos deben estar adaptados a las condiciones ambientales del

lugar del cultivo.
- Que los microorganismos estén presentes en número adecuado (1 x 109

bacterias/g o mL de inoculante a la fecha de fabricación y 1 x 10 7 bacterias/g o
mL de inoculante a la fecha de vencimiento). Ley Nº 20466/80.
- Presentar un soporte que debe proteger al microorganismo, debe ser fácil de

aplicar y adherirse bien a la semilla.
- No deben poseer contaminantes, es decir, deben estar libre de otras bacterias

que puedan ser perjudiciales a los microorganismos, al ambiente o a la planta.
- Debe estar envasado para proteger a los microorganismos hasta que sea usado
por el productor. Para ello, el envase debe permitir el intercambio de gases y la
retención de la humedad.
- Que el envase provea instrucciones claras y una lista de las especies con las
cuales nodula efectivamente.
- El nombre y dirección del fabricante deben estar impresos en el paquete.
Recomendaciones al comprar un inoculante:
- Observar que el envase cuenta con la siguiente información: a) nombre del

cultivo para el cual es efectivo (nombre común y científico); b) nombre científico
de las especies de microorganismos que contiene el inoculante; c) número de
microorganismos viables por gramo o mL de soporte al momento del vencimiento
y d) fecha de vencimiento, número de lote, instrucciones de uso y peso neto del
inoculante.
- Observar las características del envase (permeable al oxígeno, cámara de aire,

no presentar daño, etc.)
- Controlar la fecha de vencimiento ya que es un producto perecedero.
- Controlar que no esté formulado (mezclado) con productos químicos

(curasemillas o insecticidas).
- Observar las condiciones de comercialización (cadena de frío).

Desarrollo de un inoculante para leguminosas
1º etapa: selección de cepas
Antes de comenzar con la preparación, deben elegirse cepas infectivas,

específicas y efectivas para el cultivo a inocular. Estas pueden provenir de
colecciones de cultivos especializadas o pueden aislarse a partir de plantas bien
noduladas (Fig. 1). En el caso de realizar los aislamientos a partir de nódulos, se
seleccionan los nódulos turgentes y se los desinfecta para eliminar los
contaminantes del suelo. Luego, los nódulos son macerados en agua estéril
(liberando los bacteroides a la solución) y posteriormente se procede a la
siembra por estriado en cajas de Petri con medio Y.E.M. (yeast extract medium)
diferencial para el crecimiento de rizobios, con el objetivo de obtener colonias
aisladas (cepas).
Figura 1. Esquema de aislamiento de rizobios a partir de nódulos de plantas

leguminosas.
Las cepas seleccionadas deben ser buenas competidoras con respecto a

las cepas nativas o naturalizadas y deben estar seleccionadas para las
condiciones agroecológicas de la zona o región donde se desarrollarán las
plantas o los hospedantes para los cuales se recomienda. Estas cepas deberán
poseer habilidad para sobrevivir y multiplicarse en el suelo, y sobrevivir en la
semilla. La primera etapa de la selección de cepas se realiza en cámaras de
cultivo en el laboratorio (Fig. 2), en las cuales las cepas que se desean comparar
se prueban en macetas. Para ello, se realizan dos tipos de ensayos:
- Ensayos de infectividad: en los cuales se realiza la preselección de las

mejores estirpes, evaluando la nodulación. Esta queda determinada por la
cantidad de nódulos que producen, ubicación, tamaño y calidad al corte (color
rojo) y actividad fijadora de nitrógeno. Dichas observaciones se realizan en
distintos momentos del ciclo del cultivo, generalmente a los 30 y 60 días, y se
relacionan con su crecimiento y aspecto vegetativo. Con este paso se realiza la
preselección de las cepas de mayor capacidad de nodulación, para luego realizar
una evaluación más compleja del sistema simbiótico.
- Ensayos de efectividad: las cepas elegidas se evalúan en un ambiente óptimo

(cámara de cultivo), con el fin de que desarrollen toda su capacidad potencial de
fijación. Las variables que se evalúan en este caso son nodulación, materia seca,
% de nitrógeno, etc., y por diferencia con los testigos se puede obtener la
cantidad aproximada de nitrógeno que fija una cepa.
La etapa final de selección se realiza a campo. Consiste en realizar

ensayos con las cepas más destacadas de las etapas anteriores a las cuales se
somete a las condiciones que se quieren seleccionar. Este tipo de ensayos debe
repetirse por lo menos tres años con el objeto de contemplar las variaciones
climáticas. Para evaluar los resultados se consideran los parámetros nodulación,
peso seco de nódulos, % de nitrógeno, rendimiento en grano, entre otros.
Figura 2. Ensayo tipo para selección de cepas de leguminosas.
En el país el IMYZA (INTA-CASTELAR) dispone de una selección de 150

cepas de Bradhyrizobium japonicum (para soja) evaluadas por su eficiencia para
distintas condiciones de suelo, clima y variedad. Este instituto realiza ensayos
en invernáculos, realizando pruebas a campo con las cepas de mayor eficiencia.
De los ensayos allí realizados surgen las recomendaciones de cepas altamente
eficientes para ser empleadas por los fabricantes de inoculantes nacionales e
incluso de otros países.
2º etapa: preparación del cultivo a nivel industrial
En este caso, el primer paso consiste en el desarrollo y crecimiento de la cepa

elegida a pequeña escala (cultivo de iniciación o starter) para posteriormente
inocular el biodigestor (cultivo a nivel industrial).
a) Cultivo de iniciación o pie de cuba: se prepara medio de cultivo Y.E.M.

líquido estéril (cultivo de iniciación). La cantidad de mL de medio de cultivo a
preparar dependerá de la escala a la que se trabaje (por ej: 500 mL de medio de
cultivo Y.E.M. líquido para un biodigestor de 25 mL o 50 mL para un biodigestor
de 2,5 L). Luego, se inocula el medio de cultivo con la cepa elegida (conservada
en pico de flauta), se coloca el cultivo en un agitador (para asegurar la aireación

del medio) y se incuba a 28-30ºC por 3 o 4 días.
Posteriormente, se controla la viabilidad y pureza del cultivo. Para ello, se

realiza el recuento de microorganismos en medio Y.E.M. sólido y coloraciones
Gram para determinar pureza de la cepa.
b) Siembra en el biodigestor: el cultivo de iniciación o starter previamente

controlado se siembra en el biodigestor representando un 2% del volumen a
inocular (por ej 500 mL se utilizan para inocular un fermentador de 25 litros de
volumen total). El biodigestor es un recipiente destinado a la multiplicación y
desarrollo de cultivos de microorganismos a gran escala. Los biodigestores
pueden ser de vidrio (usados en producciones de escala más pequeña) o
grandes cubas de acero inoxidable con gran capacidad. Dentro de estos
biodigestores encontramos medio de cultivo Asbhy estéril (la diferencia con el
medio Y.E.M., radica en que posee una fuente de carbono menos eficiente pero
más económica para la multiplicación a gran escala de rizobios). El biodigestor
se inocula con el cultivo de iniciación y se pone en funcionamiento (presenta un
mecanismo de aireación que favorece la disolución de oxígeno). Luego de 3 o 4
días los microorganismos se desarrollan durante la incubación y se obtiene el
producto cuando llegan a una concentración de: 10 9 células de rizobios por mL.
Nuevamente, en esta etapa se controla la viabilidad y pureza del cultivo
(recuento en medio Y.E.M. sólido y coloraciones Gram para determinar pureza
de la cepa) (Fig. 3).
Figura 3. Producción de inoculantes
Control de calidad de inoculantes
Como todo producto biológico, los inoculantes pueden perder rápidamente su

calidad por variaciones o mutaciones de los cultivos, presentar pérdida de
viabilidad por no poseer el número adecuado de rizobios o por una inadecuada
preservación del producto una vez que este se encuentra en el mercado.
Metodología para el control de calidad de inoculantes de Bradirhizobium

japonicum para cultivo de soja
Si el inoculante es sólido:
- Sanitizar el envase con alcohol 70%.
- Homogeneizar el envase mediante agitación manual (durante 30 segundos).
- En forma aséptica abrir el envase, extraer y pesar 10 gramos de producto en

forma aséptica y colocarlos en 90 mL de solución salina estéril
(suspensión/dilución: 1/10).
- Mezclar con agitador por 15 a 20 minutos.
- En forma aséptica extraer 1 mL de la suspensión/dilución con pipeta estéril bajo

llama de mechero o cámara de flujo laminar.
- Realizar diluciones al décimo con solución salina estéril.
- Sembrar por triplicado y mediante el método de inmersión (sólo se siembran

las últimas tres diluciones: 10-6, 10-7 y 10-8).
- Verter el medio de cultivo diferencial (Y.E.M. con rojo Congo) previamente

fundido (a una temperatura de aproximadamente 45-50ºC para evitar la muerte
de microorganismos).
- Dejar solidificar e incubar las placas en estufa a 28-30ºC por 7 días.
- Realizar la lectura a los 7 días y verificar a los 10 días.
- Se cuentan las placas que presenten entre 30 y 300 colonias. Las colonias
típicas de Bradirhizobium japonicum son normalmente blancas y circulares si
crecen sobre el agar y de forma lenticular si se encuentran embebidas en el
mismo (Fig. 4).
Figura 4. Siembra de un inocúlate sólido.
Si el inoculante es líquido:
- Sanitizar el envase con alcohol 70%.
- Homogeneizar el envase mediante agitación manual (durante 30 segundos).
- En forma aséptica abrir el envase y extraer 1 mL de inoculante líquido con

pipeta estéril bajo llama de mechero o cámara de flujo laminar.
- Realizar diluciones al décimo con solución salina estéril.
- Continuar como indica el protocolo para inoculante sólido (Fig. 5).

Figura 5. Siembra de un inocúlate líquido.
Técnicas de inoculación a campo
Inocular consiste en contactar la semilla con el inoculante. Las técnicas más

recomendadas son las que utilizan métodos húmedos ya que permiten mayor
adherencia de las bacterias al tegumento de la semilla.
El inoculante debe diluirse antes de su aplicación para que pueda ser

distribuido de manera homogénea en todas las semillas. El volumen total de
líquido (agua + inoculante + curasemilla) para la dilución depende del tamaño de
las semillas; en función de ello se recomienda:
♦ semillas grandes: hasta 2,4 litros cada 100 kg de semilla (soja: 900
mL/100 kg, ya que el exceso de humedad provoca ruptura de tegumentos)
♦ semillas chicas: hasta 4 litros cada 100 kg de semillas (alfalfa 1000
mL/100 kg)
En la dilución, puede utilizarse agua azucarada al 10%, para disminuir la

mortandad de rizobios durante la desecación de las semillas. La mezcla puede
realizarse en hormigonera, inoculadora o directamente en la tolva de la
sembradora.
Existen distintas técnicas de inoculación:
- Sobre la semilla: se denomina inoculación directa cuando sólo se le aplica

el inoculante y pelleteado cuando además del inoculante, se aplican otros
compuestos con la finalidad de proteger las bacterias y/o las semillas (por
ej. CaCO3). Se recomienda realizar esta operación inmediatamente antes
de la siembra para asegurar la viabilidad de los microorganismos; además
es frecuente la aplicación de curasemillas durante la misma operación, lo
que puede afectar la efectividad del inoculante.
- En el surco: el inoculante se “chorrea” en el fondo del surco previo a la

siembra. Generalmente, la siembra e inoculación se realizan en una sola
operación, a tal fin se equipan las máquinas sembradoras con sistemas
que permitan distribuir el inoculante diluido, preferentemente en el fondo
del surco, antes que caiga la semilla.
Recomendaciones generales para inocular a campo
- Realizar la inoculación a la sombra.
- Inocular la cantidad necesaria para un día de siembra.
- Si debe aplicar curasemillas, realice la mezcla de ambos productos respetando

el volumen de agua y sembrar inmediatamente.
- No conservar el inoculante mezclado con el curasemillas durante mucho

tiempo.
- No usar herramientas o recipientes que hayan estado en contacto con

combustibles o pesticidas.
- Si durante la operación se aplica también inoculante, deben respetarse las

normas de manejo seguro de agroquímicos:
• Leer atentamente el marbete del producto antes de su utilización y

proceder según lo indicado en el mismo.
• Utilizar ropa de protección: guantes y overol o ropa cubierta, para evitar el
contacto dermal con el agroquímico.
• Utilizar respirador o barbijo, para proteger boca y nariz.
• Preparar la mezcla al aire libre y lejos de viviendas.
• No ingerir alimentos ni tocar boca o rostro durante la operación.
• No colocar agroquímicos en botellas de bebida, ni utilizar éstas para
realizar la mezcla.
• Realizar el triple lavado de los envases vacíos (no liberar el agua de
lavado a cursos de agua), perforarlos y disponerlos en sitios autorizados.
• Finalizada la operación, se recomienda lavar manos y brazos con
abundante agua y jabón.
1. Aislamiento de rizobios y visualización de bacteroides a partir de

nódulos de leguminosas.
Trabajando en condiciones de asepsia, realizar el aislamiento de rizobios a partir

de 2 plantas leguminosas noduladas.
Procedimiento:
- Cortar las raíces de plantas noduladas.
- Lavar las raíces con cuidado y sin romper los nódulos.
- Extraer de 5 a 10 nódulos turgentes
- Desinfectar los nódulos extraídos con agua oxigenada durante 5 minutos.
- Enjuagar los nódulos con agua destilada estéril.
- Macerar los nódulos extraídos en 2 mL de agua destilada estéril.
- Realizar estrías en medio Y.E.M. e incubar durante 7 días a 28- 30°C.
- A partir del macerado realizar una coloración de Gram.
- Visualizar el carácter Gram y la forma de los bacteroides.
2. Análisis de calidad de inoculante
- Observar el crecimiento en cajas de Petri.

TRABAJO PRÁCTICO N°7: MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL

CRECMIENTO VEGETAL. BIOFERTILIZANTES Y BIOCONTROLADORES.
Objetivos:
● Conocer los fundamentos de las PGPR para hacer uso de estas como
fertilizantes biológicos y biocontroladores.
● Conocer los fundamentos de endomicorrizas y ectomicorrizas para hacer
uso de las mismas como fertilizantes biológicos.
● Adquirir habilidades y/o destrezas en metodologías y procedimientos
microbiológicos para la realización de ensayos de biocontrol en condiciones in
vitro.
● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para
INTRODUCCIÓN
Cambios en los paradigmas productivos, tecnológicos y sociales, demandan a la

cadena agroalimentaria incrementos en la producción de alimentos y una
reducción en la utilización de insumos de síntesis industrial como fertilizantes
químicos y pesticidas en la producción agropecuaria frente a un contexto de
aumento de la población mundial y escenario de cambio climático. La utilización
de productos de síntesis biológica es una opción viable para mantener la
dinámica de funcionamiento natural de los agroecosistemas y asegurar la
productividad de los sistemas agropecuarios para las futuras generaciones. Una
alternativa productiva es la incorporación de microorganismos asociados a la
rizósfera de los cultivos comúnmente denominadas Rizobacterias Promotoras
del Crecimiento Vegetal o PGPR (siglas en inglés) y Hongos Promotores del
Crecimiento Vegetal (PGPF) como es el caso de Trichoderma y las micorrizas.
Las PGPR y los PGPF y los cultivos interactúan principalmente en la

rizósfera, y en el rizoplano. La relación que se establezca no solo va a depender
del tipo de microorganismo y el cultivo, sino que también de factores ambientales
y las formas de aplicación o utilización de estos organismos. La rizósfera es
definida como aquella región o nicho ecológico que comprende un determinado
volumen de suelo influenciado por el contacto de las raíces de las plantas con el
propio suelo, donde las propiedades fisicoquímicas y biológicas del suelo son
afectadas o modificadas por la liberación de exudados que estimulan el
crecimiento y desarrollo de microorganismos con propiedades positivas (PGPR-
PGPF) o negativas (patógenos) al crecimiento vegetal. Dentro de la rizosfera,
existe una región muy importante donde las PGPR crecen y se desarrollan que
se denominada rizoplano. El rizplano es una región del suelo conformada por
partículas que están en íntimo contacto con la rizodermis de las plantas y que se
extiende unos pocos milímetros (2-5 mm) desde la superficie de las raíces al
interior del suelo. El rizoplano a su vez, es la región con mayor diversidad y
riqueza microbiana de los suelos y es el sitio donde ocurren los principales
procesos relacionados con la absorción de agua, nutrientes, promoción del
crecimiento y defensa contra patógenos. La mayoría de las PGPR crece y se
desarrolla en la rizósfera y el rizoplano y pueden establecer relaciones
simbióticas o no simbióticas del tipo mutualista con las plantas.
Según sea el tipo de interacción y efecto que ejerzan sobre los cultivos
las PGPR-PGPF pueden ser clasificadas como biofertilizantes, bioestimulantes,
rizoremediadores, biocontroladores o biopesticidas. Dentro de los principales
tipos de PGPR podemos encontrar bacterias de los géneros Bacillus,
Pseudomonas, Azospirillum, Burkholderia, Serratia, etc. y dentro de los PGPF a
especies del género Trichoderma y a las micorrizas.
Las PGPR pueden inducir el crecimiento vegetal en forma directa o

indirecta. En general, la influencia directa incluye la producción de fitohormonas
(auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno, etc.) solubilización de fosfatos y
micronutrientes por acción de ácidos orgánicos y fosfatasas acidas, y la fijación
biológica de nitrógeno. Los efectos indirectos resultan de la modificación del
ambiente rizosférico, actuando las PGPR como agentes de biocontrol de
fitopatógenos mediante la liberación de sustancias como sideróforos,
compuestos orgánicos volátiles (COVs), enzimas hidrolíticas, antibióticos y
cianidas.
Las bacterias del género Pseudomonas intervienen con mecanismos

especializados en la solubilización de fósforo mediante la producción y liberación
al suelo de ácidos orgánicos y fosfatasas. Estas a su vez, son productoras de
fitohormonas y COVs con actividad promotora del crecimiento vegetal y actúan

como agentes de control biológico mediante la producción de antibióticos,
sideróforos, y la inducción de resistencia sistémica interna en los vegetales.
Además, existen estudios que indican el potencial de Pseudomonas en la
inducción de tolerancia a estrés de tipo abióticos como salinidad, frío, térmico,
etc.
Por otra parte, las bacterias del género Bacillus se encuentran

extensamente distribuidas en diversos ambientes, debido a su versatilidad
metabólica y a la presencia de una estructura de resistencia como la endospora.
Estas características generan un potencial biotecnológico para la obtención de
inoculantes que permitan llevar a cabo los tratamientos profesionales de
semillas, como lo son el pelleteado o la pre-inoculación en plantas industriales,
asegurando la cantidad mínima necesaria de bacterias al momento de la siembra
sobre la semilla. Estas bacterias poseen diversos mecanismos de acción como
PGPR, tanto directos (producción de auxinas, solubilización de fosfatos y fijación
del nitrógeno), como indirectos actuando como agentes de control biológico
mediante la producción de antibióticos, sideróforos y enzimas líticas.
El género Azospirillum está constituido por bacterias mutualistas no

específicas capaces de habitar en la rizósfera de muchas especies vegetales.
Promueven el crecimiento de las plantas por una sinergia de mecanismos tales
como la producción de fitohormonas, la fijación de N, y la producción de
sideróforos y de óxido nítrico. En la producción de gramíneas como trigo, maíz,
etc. la inoculación con Azospirillum spp. es una práctica económicamente
conveniente y se aplica principalmente como tratamiento a las semillas. Al
inocular con Azospirillum spp., se observan mayores rendimientos y contenidos
de proteína en grano, atribuidos a un incremento en la absorción radical de N. El
mayor crecimiento inicial de las raíces contribuye a mejorar la eficiencia de uso
del agua y el aprovechamiento de las fuentes de nutrientes de las que disponen
las plantas. Los cambios en el crecimiento de las raíces se asocian
principalmente a la producción de auxinas como producto del metabolismo de
esta rizobacteria. La acción como biocontrol, es casi nula, ya que los
mecanismos metabólicos más desarrollados y especializados de este género
son la acción como biofertilizante.
Ensayos de actividad Biofertilizante
Para evaluar la acción biofertilizante de las PGPR, podemos realizar ensayos de

germinación y crecimiento en cámaras de condiciones controladas. El objetivo
de este tipo de ensayos es evaluar las modificaciones que puedan ocurrir como
consecuencia de la acción de las PGPR sobre la producción de biomasa aérea
y radical de los cultivos, cambios en el sistema radical (estructura y arquitectura),
modificación en el índice verde (contenido de clorofilas), cambios en la superficie
foliar de las plantas tratadas, modificaciones en los contenidos de nutrientes de
los tejidos y variaciones del tipo molecular.
Estudios en condiciones controladas

Se pueden realizar pruebas de germinación de los cultivos, en cámarasde
condiciones ambientales de crecimiento controladas, según las normas
establecidas en el manual de Reglas ISTA (International Seed Testing
Association) sobre la germinación en cuanto a temperatura, fotoperiodo y
humedad ambiental. En el caso particular del maní (Arachis hypogaea L.) el
cultivo se debe mantener a una temperatura de 28°C, un fotoperiodo de 16 hs
de luz y 8 hs de oscuridad. Para sembrar el cultivo se deben preparar macetas
de 3 L de capacidad con un sustrato estéril (1:1 suelo-arena) y por métodos
gravimétricos determinar la Capacidad de Campo (CC) del sustrato, para que
previo a la siembra, las macetas se rieguen con una cantidad de agua
equivalente al 60% de CC. Durante la duración del experimento las macetas
deben permanecer en esta situación hídrica.
Procedimiento:
Para proceder a la inoculación con las PGPR, las cepas bacterianas deben
sembrarse en un medio de cultivo general como Tripteina Soya Caldo, hasta
alcanzar una concentración de 109 bacterias mL-1. Una vez preparado el
inoculante debemos proceder a la inoculación de las semillas con las cepas,
teniendo en cuenta los cálculos del trabajo práctico de inoculación a campo, tanto
para el inoculante, como así también para el cura-semillas (Fungicida). A su vez
a fondo de surco (orificio de siembra) debemos colocar 40 µL. para simular la
aplicación chorreada a campo. Las semillas se siembran a 3 cm de profundidad.
TRABAJO PRÁCTICO PGPR BIOFERTILIZANTES
A partir de macetas con plantas de albahaca de 20 días de edad, se determinarán

los siguientes parámetros al momento de finalizar los ensayos (Fig.1):
● Altura de planta tomada desde el cuello de la planta (zona de transición
entre el tallo y la raíz).
● Longitud de la raíz principal.
● Número de hojas.
● Peso seco aéreo y peso seco radicular: debemos colocar el material en
bolsas de papel y llevarlo a estufa a 55°C hasta quitarle toda el agua y alcanzar
peso constante.
● Área foliar: para ello debemos tomar una de las plantas y quitarles
completamente los folíolos (Fig. 2). Podemos tomar una fotografía y realizar los
cálculos con el programa ImageJ.
PGPR
CONT
ROL
Biomasa aérea
Cuello de
la planta
BiomasaRadical
Figura 1. Plántulas de maní de 10 días de crecimiento en cámara de

germinación. Dos tratamientos con PGPR comparadas con una planta control
sin microorganismos.
Figura 2. Foliolos de una planta de maní de 10 días de crecimiento.

Figura 3. Plántulas de albahaca de 15 días. A la izquierda el tratamiento testigo

a la derecha un tratamiento con Bacillus sp.
Ensayos de actividad Biocontroladora
Para la evaluación de la acción biocontroladora de las PGPR, se pueden realizar

diferentes pruebas que permitan dilucidar mecanismos aislados como la acción
enzimática, como ensayos de actividad proteasas, quitinasas, etc. Pero también
es posible probar el efecto de las PGPR sobre los patógenos de forma directa.
Estos ensayos pueden ser realizados en condiciones in vitro, es decir en
laboratorio, donde las condiciones de siembra y crecimiento de los
microorganismos están controladas de forma estricta o mediante ensayos in vivo
donde la planta que cumple la función de hospedera tanto de las PGPR, como
así también de los patógenos es inoculada con ambos y se evalúa la incidencia
(número de plantas enfermas) y la severidad (porcentaje de afección) de la
enfermedad.
Ensayos in vitro
- Ensayo de cultivos duales
Para evaluar el efecto antagónico de los aislados bacterianos sobre los hongos
fitopatógenos y probar mecanismos de inhibición relacionados a la producción
de antibióticos o enzimas hidrolíticas, se pueden realizar este tipo de ensayos
que consisten en la un disco de micelio (conjunto de hifas que constituyen la
estructura vegetativa de los hongos) de 5 mm de diámetro en el centro de una
placa de Petri conteniendo medio de cultivo tipo agar papa dextrosa (PDA), el
cual es un medio de cultivo que presenta como fuente carbonada almidones y la
dextrosa que son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. Debemos
tener en cuenta tanto para estas pruebas duales, como las pruebas de volátiles
que el micelio que debemos utilizar debe ser obtenido de un hongo que se
encuentre en activo crecimiento, es decir lo debemos obtener del frente de
avance cuando lo sacamos de una placa de Petri y a su vez, el micelio que
utilicemos para todos los ensayos debe tener la misma edad para evitar
variaciones del tipo fisiológicas.
Una variante a lo anterior, en el caso de hongos productores de esporas, es
posible la realización de estos ensayos utilizando una suspensión de esporas de
concentración conocida. Para ello deberán prepararse suspensiones de esporas
en solución salina estéril en combinación con surfactantes como el Tween20,
para evitar que por efecto de adsorción las esporas queden adheridas a las
paredes de las micropipetas utilizadas. Para el conteo de esporas, se utiliza la

cámara de Neubauer o hemocitómetro, que es un instrumento utilizado
en medicina y biología para realizar el recuento de esporas y células en un
medio líquido; similar a la Cámara de Petroff‐Hausser que hemos estudiado en
el práctico N° 4 dentro de las técnicas de recuento de células totales.
Una vez colocados los discos de micelio o sembradas las esporas
debemos sembrar por superficie los aislados bacterianos en líneas paralelas a
20 mm de distancia del disco fúngico sin permitir el contacto inicial entre ellos.
Las bacterias deben ser cultivadas en medio de cultivos generales como el Caldo
Nutritivo (CN), Tripteina Soya Caldo (TSC), etc. Las PGPR deben ser sembradas
48 hs antes de realizar los ensayos, para asegurar una concentración mínima de
microorganismos y a su vez previo a la siembra debemos asegurar la pureza de
nuestros cultivos mediante la realización de tinciones diferenciales tipo Gram.
Las placas serán selladas e incubadas a la temperatura óptima necesaria
para el crecimiento de los patógenos. La superficie de crecimiento del micelio se
medirá diariamente, determinando el diámetro de crecimiento en dos direcciones
para obtener un promedio. En este tipo de ensayos es necesario utilizar
controles, por ello se debe sembrar el disco fúngico y reemplazar las líneas
paralelas de bacterias con H2O estéril. Los resultados se expresarán como
porcentaje de inhibición de crecimiento del micelio (PIC) de acuerdo a la
siguiente fórmula: PIC= [(C-T)/C] x 100, donde C es la media del área del control
(mm2), y T es la media del área de cada tratamiento (mm2).
- Efecto inhibitorio de los Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs)

La acción de los COVs en la actividad antagónica frente a fitopatógenos es
posible evaluarla mediante un ensayo de enfrentamiento en placas de Petri entre
hongos y bacterias. Este ensayo tiene como objetivo evaluar la capacidad de las
cepas de producir COVs e inhibir a los patógenos sin necesidad de entrar en
contacto la PGPR con el patógeno. El cultivo bacteriano (tomando los mismos
recaudos que en el ensayo dual) se siembra en placas de Petri conteniendo
como medio de cultivo Agar Nutritivo. La siembra de las PGPR se realiza por
superficie colocando 0.1 mL de cultivo bacteriano y esparciéndolo por toda la
superficie del agar con una espátula de Drigalsky. Estas placas se deben incubar
a 28-30°C durante 24 hs.
Al día siguiente se toma una placa de Petri con PDA y se realiza una
siembra de una pieza de micelio (5 mm de diámetro) o una siembra de
suspensión de esporas (igual que en los ensayos duales). Una vez sembradas
las placas de PDA, para cada tratamiento se deben enfrentar las placas
sembradas con hongos vs. las placas sembradas con bacterias del día anterior.
Para ello ambas placas se enfrentan y se sellan utilizando Parafilm® para evitar
el escape de los COVs, pero permitir el ingreso de oxígeno necesario para los
procesos metabólicos. Las placas se incubarán a 28-30 °C durante 5 a 7 días
dependiendo del tiempo de crecimiento de los patógenos. Todos los días se
medirá el diámetro de micelio para verificar la inhibición del crecimiento. Como
control se enfrenta una placa inoculada con el hongo a una placa sembrada con
H2O estéril. Los resultados se expresarán como PIC de acuerdo con la fórmula
indicada anteriormente (Fig. 3).
Ensayos in vivo
El ensayo de biocontrol in vivo se puede realizar en macetas de 10L con
diferentes sustratos, los utilizados en la catedra generalmente están compuestos
por una mezcla de suelo:arena (1:1) previamente esterilizado y el ensayo se
conduce bajo condiciones controladas en invernadero. Los tratamientos que
normalmente se utilizan son: a) control de una planta sana, b) control con la
planta enferma, c) macetas sembradas con semillas del cultivo seleccionado
embebidas en la suspensión con PGPR. Para llevar adelante el experimento, las
PGPR deben ser sembradas en pie de cuba para formular inoculantes de la
misma forma que se realiza para Bradyrhizobium, pero con medios de cultivo
diferente. Para la inocular las semillas se deben tener en cuenta las proporciones
estudiadas en el práctico de inoculantes. También se aplica en el fondo de surco
1000 µL. de la suspensión bacteriana a concentración mínima de 10 9 UFC/mL.
El objetivo de este tipo de ensayos es evaluar la capacidad de las PGPR para
biocontrolar el hongo durante el periodo susceptible de infección del cultivo.
Posteriormente a la emergencia de las plántulas, todas las macetas
(excepto el control sano) deben ser infectadas con esporas y/o esclerocios
(estructuras de resistencia de los hongos del tipo Deuteromicetes) de los
respectivos hongos. Se debe evaluar la incidencia de la enfermedad cada 15
días como el porcentaje de plantas enfermas y su vez en el caso de los cultivos

a granos, podemos ver como se afectó la generación del rendimiento.
Figura 4. Pruebas duales.

TRABAJO PRÁCTICO PGPR BIOCONTROL

Trabajando en condiciones de asepsia, para las pruebas de actividad antifúngica.
1. Determinar el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento (PIC).

1. A partir de placas ya crecidas determinar el PIC de cada una de ellas.
Fórmulas para el cálculo: Recordar sacar un diámetro promedio.
MICORRIZAS: BIOINOCULANTES FÚNGICOS (PGPF)

Por otro lado, hoy en día se están utilizando las micorrizas como fertilizantes
biológicos. La palabra micorriza, es de origen griego y define a la interacción
simbiótica entre un hongo (mycos) y las raíces (rhizos) de una planta. Ambos
participantes de la relación obtienen beneficios. Por un lado, la planta recibe
principalmente nutrientes minerales y agua del hongo y el hongo obtiene de la
planta hidratos de carbono y vitaminas que él por sí mismo es incapaz de
sintetizar. Se estima que entre el 90 y el 95% de las plantas terrestres presentan
asociaciones micorrícicas de forma habitual. Además, las micorrizas son
comercialmente importantes debido a que con ellas se pueden producir
inoculantes fúngicos, los cuales pueden ser utilizados como estrategia para una
agricultura sustentable. Según su morfología, las micorrizas se dividen en
distintos grupos entre los que cabe destacar dos: las ectomicorrizas y las
endomicorrizas.
- Ectomicorrizas: se caracterizan porque las hifas del hongo se desarrollan

sobre y dentro de la raíz de la planta hospedadora. En este sentido, las hifas del
hongo penetran intercelularmente (entre las células radicales) pero no lo hacen
intracelularmente (en el interior celular). Las ectomicorrizas producen profundos
cambios morfológicos en las raíces los cuales pueden ser observados a simple
vista (las raíces son más cortas, bifurcadas en su extremo y presentan un manto
blanquecino externo). Este tipo de micorrización es el que predomina entre los
árboles de zonas templadas, siendo especialmente característico en árboles
como hayas, robles, eucaliptus y pinos. Los hongos de este grupo pertenecen a
los géneros Basidiomycota y Ascomycota (Fig.4).
Figura 5. Estructuras características de ectomicorrizas
- Endomicorrizas: las hifas se introducen inter e intracelularmente en la raíz de

la planta, formando al ingresar dentro de las células estructuras características
denominadas vesículas alimenticias y arbúsculos. Por ello, a este tipo de
micorrizas también se las suele conocer con el nombre de micorrizas
vesículoarbusculares o MVA. Las endomicorrizas no producen cambios
morfológicos visibles a simple vista en las raíces que infectan. Los hongos de
este grupo pertenecen a la división Glomeromycota y suelen presentar
interacción con todo tipo de plantas, aunque con predominio de hierbas y
gramíneas (Fig. 5).
Figura 6. Estructuras características de endomicorrizas.

Control de calidad de inoculantes formulados con MVA
Actualmente la productividad de los cultivos depende en gran medida del

suministro de fertilizantes e insecticidas. El uso creciente de agroquímicos y la
contaminación ambiental asociada han llevado en los últimos años a la
exploración de estrategias más sustentables desde el punto de vista
medioambiental para mejorar la sanidad de los cultivos. Bajo esta premisa,
existen a nivel global grandes restricciones en el uso de pesticidas químicos y
una tendencia a utilizar métodos naturales u orgánicos. En este sentido, existe
una amplia gama de microorganismos que pueden tener un efecto beneficioso
sobre las plantas. Por un lado se encuentran los denominados Agentes de
Control Biológico o Biocontroladores, los cuales ayudan a prevenir
enfermedades o el daño causado por otros organismos. Otro grupo de hongos,
los hongos formadores de micorrizas arbusculares, pertenecientes al Phylum
Glomeromycota se constituyen en los hongos simbióticos dominantes, forman
asociaciones simbióticas con la mayoría de las especies vegetales y se sabe que
incrementan el status nutricional de las plantas, mejoran las relaciones hídricas
y protegen a las plantas hospedadoras contra el ataque de patógenos. Estas
interacciones se basan principalmente en la transferencia bidireccional de
nutrientes entre ambos simbiontes. Uno de los beneficios importantes que las
plantas obtienen de esta asociación es el incremento de la superficie de
absorción, el total del volumen de suelo explorado por las raíces y la proporción
de nutrientes absorbidos, principalmente de P. El efecto de la micorrización sobre
el crecimiento de plantas es primariamente nutricional.
El desarrollo de técnicas biotecnológicas aportará una solución de esta

problemática, capaces de colaborar con las plantas para superar el estrés
nutricional. En tal sentido los hongos micorrícicos participan en dicho efecto de
un modo integral, abarcando la planta, el suelo y la interacción con otros
microorganismos. Los beneficios de la inoculación con MVA repercuten en una
reducción del aporte de fertilizantes y fitosanitarios, un ahorro del suministro del
agua, un mayor crecimiento y producción de las plantas, una mayor
supervivencia a las condiciones de estrés y un mejor aprovechamiento de los
suelos.
Existen diferentes inoculantes de hongos formadores de MVA en el mercado

que generan la necesidad de establecer estándares ampliamente aceptados
para el control de calidad. Ello es relevante porque son organismos biotrófos,
endosimbiontes obligados. El desarrollo de los inoculantes para MVA es una
industria incipiente y su demanda proviene del hecho que las MVA son
beneficiosas para el desarrollo y la salud de las plantas, para la recuperación de
suelos, la biorremediación y la utilización de tecnologías alternativas a los
agroquímicos y la producción sustentable. Actualmente, los inoculantes
formulados a base de MVA se producen en parcelas inoculadas, en
contenedores con diferentes sustratos y plantas. El desarrollo de la formulación
consiste en colocar propágulos fúngicos (fragmentos de raíces colonizados de
MVA, fragmentos de micelio fúngico y/o esporas, en un soporte como perlita,
vermiculita, turba, arcilla inorgánica o arena).Se requieren protocolos básicos
normalizados para determinar la eficiencia del inoculante a base de MVA y por
ello se detallan las metodologías necesarias y adaptadas para el aislamiento y
análisis de eficiencia del inoculante. La determinación de la abundancia de
esporas por la técnica del gradiente de sacarosa y la tinción vital de las esporas
y raíces son utilizadas para registrar el estado fisiológico de los hongos.
Tinción para endomicorrizas
Tratamiento de las raíces:
▪ Lavar las raíces con agua corriente, colocar en los tubos KOH hasta cubrir
las raíces. Colocar los tubos en una gradilla. Llevar a baño térmico a 80°C
durante 20 minutos.
▪ Lavado: eliminar el KOH y lavar las raíces con abundante agua.
▪ Neutralización: sumergir las raíces en HCl 0,1 N y dejar en reposo durante

20 minutos a temperatura ambiente.
▪ Coloración: eliminar el HCl y añadir azul de anilina o tripán al 0,05 % en ácido

láctico. Calentar a 90 °C durante 20 minutos.
Preparación de los preparados:
Se procede a montar las raíces a los porta objetos (10 raíces por porta ubicadas
verticalmente) y se les coloca una gota de PVLG para fijar el cubreobjetos. Se
los cubre con cubre objeto y se los pone a secar en estufa a 40-60 °C 2-3 días.
TRABAJO PRÁCTICO MICORRIZAS
1. Observación microscópica de endomicorrizas (Fig. 6).
- Realizar la observación en microscopio óptico de diferentes estructuras: hifas,

vesículas y arbúsculos de endomicorrizas
2. Observación de estructuras de ectomicorrizas
- Observar raíces de pino bajo lupa (Fig. 7).
Figura 7. Estructuras correspondientes a endomicorrizas en raíces de Soja

(Glicine max). Fotos gentileza de la Ing. Agr. Dra. Soraya Salloum.
Figura 8. Ectomicorrizas en pino. En la figura de la izquierda se observa

fácilmente el manto blanquecino formado por las hifas de las ectomicorrizas y en
la imagen de la derecha se observa el engrosamiento y acortamiento de las
raíces, sumado a la bifurcación de las mismas en los extremos.
TRABAJO PRÁCTICO N°8: EVALUACIÓN DE INOCULACIÓN A CAMPO
Objetivos:
• Realizar la observación y medición de los parámetros de crecimiento y

desarrollo del cultivo de garbanzo.
• Evaluar la eficiencia de la inoculación: Determinar infectividad y efectividad.
• Adquirir habilidades y/o destrezas en la medición de parámetros de
crecimiento y nodulación del cultivo.
• Adquirir los conocimientos necesarios para la elaboración de tablas para el
análisis de los datos recopilados.
• Realizar el análisis estadístico de los datos y la interpretación de los resultados
obtenidos.
INTRODUCCIÓN
Las leguminosas son cultivos cuyas necesidades de nitrógeno (N) son

sumamente altas. Algunas leguminosas que cobran importancia en nuestro país
son: soja, garbanzo, alfalfa, maní, etc. Por ejemplo, el cultivo de soja puede
necesitar cuatro veces más de N que un cultivo de maíz por cada tonelada
producida. Para lograr este objetivo, la leguminosa tiene la habilidad de
asociarse en forma simbiótica con bacterias fijadoras de N, genéricamente
denominadas rizobios y obtener, a través de la Fijación Biológica de Nitrógeno
(FBN), gran parte del N que requiere para su crecimiento.
La técnica de inoculación se utiliza para agregar sobre la semilla o el

suelo cepas de rizobios (bacterias), seleccionadas, las cuales deben estar vivas
y ser infectivas, efectivas y eficientes a la hora de fijar N. Para logar una
respuesta esperada en la FBN, las cepas aplicadas con sus respectivas
características no son el único factor determinante, sino que también, debemos
pensar que el cultivo debe estar en adecuadas condiciones sanitarias y
nutricionales. La fertilización biológica (inoculación), no se debe realizar con el
único fin de obtener más rendimiento en los cultivos, sino como una manera de
contribuir a un menor agregado de fertilizantes nitrogenados al suelo,

disminuyendo la contaminación ambiental.
La práctica de inoculación data de miles de años ya que existe evidencia

en Egipto y otros lugares de haberse encontrado semillas tratadas, ya sea como
ofrenda o para uso agrícola. En Argentina la difusión de la práctica de inoculación
comenzó en el año 1939 con cepas importadas (principalmente de EEUU) y en
1957 se inauguró la primera fábrica de inoculantes del país. La práctica de
inoculación fue asociada rápidamente por los productores en el país y creció en
forma exponencial con el avance del cultivo de soja
Fertilizantes biológicos (inoculantes)
Si bien existen en el suelo rizobacterias nativas capaces de infectar las semillas

sembradas de leguminosas, la utilización de inoculantes de concentración inicial
adecuada bacterias, pureza de la cepa y en algunos casos aditivos especiales
son fundamentales para lograr el éxito de la técnica de inoculación.
Los parámetros para evaluar la inoculación a campo son:
• Número de nódulos sobre la raíz principal.
• Número de nódulos sobre raíces laterales.
• Porcentaje de nódulos funcionales.
• Peso de nódulos.
• Longitud de raíz
• Altura de planta.
• Diámetro de tallo.
• Altura de inserción de la primera vaina.
• Número de vainas por planta

Se trabajará sobre un cultivo de garbanzo cultivar Felipe, sembrado en el campo

escuela de la FCA-UNC. Se aplicaron 6 tratamientos, un testigo sin inocular y se
inoculó con 4 cepas PGPR, Trichoderma spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.
y Mezorhizobium ciceri:
Descalzar con una pala (cuidando de no romper en demasía las raíces) las 10
plantas a las que les hicieron el seguimiento. Guardar las mismas en una bolsa
identificadas con su número y llevar al laboratorio. Lavar con sumo cuidado las
raíces de cada planta sin perder nódulos ni la identificación de las mismas y
luego proceder a determinar y medir los siguientes parámetros con el
instrumental que le provea el docente:
1. Evaluación de parámetros de nodulación.
- Número de nódulos sobre la raíz principal.
- Número de nódulos sobre raíces laterales.
- Porcentaje de nódulos funcionales: realizando cortes transversales sobre
los mismos y observando una coloración rojiza.
- Peso de nódulos.
2. Evaluación de parámetros de crecimiento:
- Longitud de raíz: se mide desde el cuello de la raíz hasta el meristema radical.
- Altura de planta: se mide desde la superficie del suelo hasta el ápice de la
planta, sin estirar las ramas.
- Diámetro de tallo: se mide con un calibre a un tercio de la base del tallo.
- Altura de inserción de la primera vaina: medida desde la superficie del suelo
hasta el punto de inserción de la primera vaina.
- Número de vainas por planta: se debe contar el número total de vainas
presentes en la planta.
3. Análisis de los datos registrados
Con los datos obtenidos en la comisión, cada grupo deberá realizar un análisis
estadístico utilizando el programa InfoStat y elaborará un informe.
Actividades a realizar:
- Realizar una tabla en Excel con los datos recopilados y copiarla en Infostat.
- Realizar un ANOVA utilizando un comparador de medias (LSD Fisher, DGC,

etc.) y obtener medidas resumen (Medias y desvíos estándar).
- Con los datos obtenidos realizar tablas y gráficos.

N° de N° de % Nodulos Peso de Longitud de Altura de Diametro Altura 1° Vainas/ Peso de Peso de
Cultivar Tratamiento Repetición N°Granos
Nodulos RP Nodulos RL Funcionales Nodulos Raíz Planta de Tallo Vaina Planta Vainas Granos
Tabla1. Datos recopilados actividad de campo.
TRABAJO PRÁCTICO N° 9: CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS Y

AGUA
Objetivos:
• Incorporar conocimientos generales sobre los posibles contaminantes en

alimentos y agua.
• Conocer los parámetros microbiológicos que deben reunir los alimentos y el

agua para ser consumidos y/o utilizados.
• Conocer la metodología analítica disponible para realizar el control de calidad

de alimentos y agua.
• Adquirir habilidades y/o destrezas para evaluar la calidad sanitaria de

muestras de alimentos y agua.

CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS
Introducción
El control de la inocuidad y la calidad de los alimentos forma parte de programas

nacionales en todos los países. Los sistemas nacionales de control de los
alimentos están destinados a proteger la salud y el bienestar de los
consumidores, promover el comercio de los alimentos y de los productos
alimenticios. Se da prioridad a la prevención de los riesgos químicos y biológicos
derivados de la contaminación, la adulteración, manejo inadecuado y al control
de calidad de los alimentos antes de ser consumidos. Para realizar el control, los
países disponen de diversos laboratorios que pueden realizar análisis
organolépticos, físico-químicos y microbiológicos de los alimentos.
El análisis microbiológico de los alimentos tiene dos finalidades: por un

lado, comprobar la calidad microbiológica del alimento o de las prácticas de
elaboración del mismo y por otro, comprobar la aceptabilidad de estos en el

mercado nacional o internacional. En general, la finalidad principal del análisis
no solo es detectar la presencia de microorganismos patógenos sino comprobar
que la probabilidad de la presencia de patógenos en el alimento sea
aceptablemente baja.
Cada tipo de alimento se deteriora por acción de un tipo de

microorganismo concreto ya que cada asociación es alimento-microorganismo
específica. De esta manera, de todos los microorganismos presentes en un
alimento, solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el mismo
resultando seleccionados. Existe una serie de factores intrínsecos o extrínsecos
al alimento que dirigen esta selección: actividad del agua (aw), pH, potencial
redox, nutrientes, agentes antimicrobianos, composición química del alimento,
tratamientos tecnológicos que modifican flora inicial, condiciones físicas del
ambiente y las relaciones entre los microorganismos establecidas como
consecuencia de estos factores. Estos parámetros condicionan la resistencia a
la colonización que posee un alimento.
Desde el punto de vista sanitario, el control de la inocuidad de los

alimentos es importante, debido a que pueden ser vehículos de infecciones (por
ingestión de microorganismos patógenos) o de intoxicaciones (por ingestión de
toxinas producidas por microorganismos). En este sentido, muchas veces la
causa de la contaminación del alimento se debe a medidas higiénicas
inadecuadas realizadas durante la producción, preparación y conservación; lo
que facilita la presencia y el desarrollo de microorganismos.
En el caso de alimentos que son parte de cadenas productivas, la

evaluación que se hace de su inocuidad y aptitud para el consumo es a través
del cumplimiento de diversos criterios microbiológicos designados para el
producto en cuestión. Estos criterios pueden referirse a la demostración de la
aplicación de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) o a la ausencia de
patógenos. Los métodos de laboratorio utilizados para la detección o recuento
de microorganismos forman parte del criterio microbiológico. La elección del
método a utilizar debe privilegiar a aquellas técnicas estandarizadas y de alta
sensibilidad que hayan sido validadas por organismos internacionales o
nacionales. En nuestro país la normativa de referencia para todos los alimentos
comercializados es el Código Alimentario Argentino (CAA). En el CAA se

establecen los valores de referencia y los límites máximos de microorganismos
permitidos para cada alimento.
En los últimos años existieron avances significativos en el desarrollo de

nuevas tecnologías para la detección y la separación de microorganismos de los
alimentos. El desarrollo de técnicas moleculares (PCR) e inmunológicas (ELISA)
brinda ventajas sobre los métodos tradicionales, específicamente en lo que
refiere a velocidad, pero debido a los altos costos su uso todavía no se ha
generalizado.
Microorganismos más buscados en alimentos
Como se mencionó anteriormente, dependiendo del alimento a controlar, se

buscan distintos tipos o grupos microbianos. A continuación, sólo señalaremos
algunos de los más relevantes:
a) Microorganismos mesófilos totales
b) Mohos y levaduras
c) Staphylococcus aureus coagulasa positiva
d) Salmonella spp.
e) Coliformes
f) Escherichia coli
a) Recuento de microorganismos mesófilos totales
En este grupo se incluyen todos los microorganismos, capaces de desarrollar en

presencia de oxígeno a una temperatura comprendida entre 20°C y 45°C con
una temperatura óptima entre 30ºC y 40ºC. El recuento de microorganismos
aerobios mesófilos estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos. La determinación de este grupo nos da idea de la calidad del
alimento, de la materia prima y del proceso de elaboración del producto.
Recuentos altos pueden indicar un proceso de alteración del alimento, sin
embargo, un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la
ausencia de patógenos o sus toxinas. Asimismo, recuento elevado no significa
la presencia de microorganismos patógenos. Ahora bien, salvo en alimentos

obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados, ya que
tasas superiores a 105-107 de microorganismos por mL o gramo de alimento
suelen ser considerados como indicadores de inicio de descomposición.
Este grupo es un indicador importante en alimentos frescos, refrigerados

y congelados, en lácteos y en alimentos listos para consumir. Se determina
mediante recuento en medio sólido por el método de inmersión o embebido
utilizando el medio PCA (Agar plate count) e incubando la muestra en aerobiosis
a 28-30°C por 48 hs (Fig. 1). Otra opción es realizar recuento mediante conteo
en medio sólido por el método de superficie utilizando el medio PCA (Agar plate
count) e incubando la muestra en aerobiosis a 28-30°C por 24 horas. Se cuentan
como máximo 300 colonias por placa.
Figura 1. Bacterias mesófilas creciendo en Agar PCA.
b) Recuento de mohos y levaduras
Los hongos son microorganismos aerobios estrictos, eucariotas,

característicamente miceliares, y con metabolismo quimio-organo-heterótrofo.
Dependiendo de la especie suelen desarrollar en un rango de pH de 2 a 9,
temperaturas entre 10 a 35ºC y pueden crecer en condiciones de actividad de
agua (aw) relativamente bajas, aunque las levaduras generalmente requieren
una mayor actividad de agua. Comúnmente se da el nombre de mohos a ciertos
hongos multicelulares filamentosos, microscópicos, y cuyo crecimiento en los
alimentos se observa fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso.
Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de

agregados sueltos de células independientes, que pueden ser globosas,
ovoides, piriformes, alargadas o casi cilíndricas. Cuando crecen sobre medios
sólidos, forman colonias de aspecto característico que recuerdan a algunas

colonias bacterianas (pequeñas, blancas y cremosas). En casi todas las
especies de interés industrial, el modo habitual de reproducción vegetativa es
por gemación.
Se investiga la presencia de hongos, mohos y levaduras por la capacidad

de estos organismos producir diferentes grados de deterioro y descomposición
en los alimentos. Además, los hongos son potencialmente productores de
metabolitos tóxicos conocidos como micotoxinas, compuestos estables que no
se destruyen durante el procesamiento de alimentos, por lo que son
responsables de intoxicaciones con consecuencias graves en los órganos
afectados. También, los hongos están asociados a reacciones alérgicas e
infecciones sobre todo en la población inmunocomprometida, en ancianos y
niños. Para su determinación, se utiliza habitualmente el medio diferencial YGC
(Agar extracto de levadura-glucosa) que lleva incorporado el antibiótico
cloranfenicol, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano. Se realiza
recuento en medio sólido por el método de superficie incubando la muestra en
aerobiosis a 20-25°C por 48 horas (recuento de levaduras) y 5 días (recuento de
mohos y hongos) (Fig. 2A y 2B). Se cuentan como máximo 150 colonias por
placa.
A B
Figura 2. Agar YGC. A. Colonias de levaduras (blancas y cremosas). B. Colonias

de mohos y hongos.
c) Determinación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
Las bacterias del género Staphylococcus se caracterizan por ser cocos Gram-
positivos, que se encuentran aislados, en pares, tétradas o formando racimos
irregulares (término derivado del griego staphylé: racimo de uva). Son inmóviles,
anaerobios facultativos y no formadores de esporas. Este género incluye al
menos 40 especies, siendo la mayoría inofensivos, residiendo normalmente en
las mucosas, fosas nasales, vías respiratorias superiores y en la piel de los seres
humanos y otros organismos. De estas especies, Staphylococcus aureus es el
principal responsable de la intoxicación alimentaria estafilocócica, ya que
produce una amplia gama de toxinas.
Se los busca como indicadores en alimentos cocidos, en productos que

son sometidos a manipulación excesiva durante su preparación y en aquellos
alimentos que son sometidos a manipulación después del proceso térmico.
Generalmente, los estafilococos se eliminan durante la cocción, sin embargo,
altos recuentos en alimentos sometidos a procesos térmicos pueden deberse a
contaminación posterior por manipulación, contacto con equipos o aire
contaminados y/o conservación inadecuada (como, por ejemplo, falta de
refrigeración).
Los animales también son una fuente importante de infección; se destaca

la mastitis en los bovinos y ovinos que puede determinar en la contaminación de
la leche. La presencia de este microorganismo en cuero, plumas y piel de
animales es habitual, por lo tanto, la contaminación de las carcasas de los
animales a veces es inevitable.
El análisis de S. aureus coagulasa positiva puede realizarse con medio de

cultivo Agar Baird Parker o Agar manitol salado. En medio Agar manitol salado,
el hidrato de carbono fermentable es el manitol. El cloruro de sodio que se
encuentra en alta concentración en el medio es el agente selectivo que inhibe el
desarrollo de la flora acompañante y el rojo de fenol es el indicador de viraje del
pH. Este es un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y
diferencial debido a la capacidad de las bacterias para fermentar el manitol. Las
bacterias que crecen en este medio con alta concentración salina y que
fermentan el manitol, producen ácidos, por lo que se acidifica el medio y se
produce el viraje de color: de rojo a amarillo. Los estafilococos crecen en altas

concentraciones de sal y pueden fermentar o nó el manitol. Los estafilococos
coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas
rodadas de una zona del mismo color (Fig. 3A). Aquellos estafilococos que no
fermentan el manitol se visualizan como colonias rojas, rodeadas del mismo color
o púrpuras (Fig. 3B). Habitualmente, la determinación se realiza mediante
siembra por agotamiento en medio sólido y posterior incubación en aerobiosis a
35-37 °C durante 48 hs. Se deben realizan pruebas posteriores a las colonias
sospechosas de S. aureus cogulasa positiva crecidas en Agar manitol salado
para determinar efectivamente la presencia de la enzima (prueba de coagulasa).
A B
Figura 3. Agar manitol salado. A. Staphylococcus aureus coagulasa positiva

(fermentan manitol y producen ácidos). B. Staphylococcus epidermidis (no
fermentan manitol).
d) Determinación de Salmonella spp.
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos

Gram-negativos, anaerobios facultativos, no formadores de esporas, y
generalmente móviles. Son viables en diferentes condiciones ambientales,
sobreviven a la refrigeración y congelación y mueren por calentamiento (mayor
a los 70°C). Se trata de enterobacterias patógenas causante de importantes
trastornos gastrointestinales en humanos, por lo que resulta de interés su
investigación en los alimentos. La salmonelosis es considerada una zoonosis de
distribución mundial y de origen alimentario. La vía de transmisión es fecal-oral
a través de alimentos y agua contaminada con heces humanas o animales,
materiales y utensilios de cocina contaminados o por contacto directo de persona

a persona. Los principales reservorios de Salmonella son las aves de corral, el
ganado bovino y el porcino. Por lo tanto, la transmisión del patógeno se lleva a
cabo por ingestión de alimentos (especialmente pollos, carne, huevos y
productos lácteos), mediante los manipuladores de alimentos como portadores
y también se han identificado como fuentes de infección los vegetales frescos
consumidos crudos en ensaladas y los eventos de contaminación cruzada.
La legislación actual no admite la presencia de esta bacteria en los

alimentos, por lo que se lleva a cabo un análisis de su presencia en medios Agar
Salmonella-Shigella (SS) contiene sales biliares y verde brillante que inhiben el
crecimiento de la mayoría de los microorganismos Gram-positivos y de algunas
coliformes. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y el tiosulfato de
sodio presente en el medio permite la formación de SH2 que se evidencia por la
producción de sulfuro de hierro. El indicador de pH es el rojo neutro. Los
microrganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar acidifican el
medio haciendo virar al rojo al indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas
o rojas sobre fondo rojizo. Salmonella crece adecuadamente en el medio y
produce colonias transparentes. La producción de SH2 se evidencia como
colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. En
resumen, las bacterias del género Salmonella crecen como colonias
transparentes, delicadas y con centro negro (Fig. 4B). El medio Agar Hektoen
contiene lactosa, salicina y sacarosa como hidratos de carbono fermentables.
Las sales biliares que contiene este medio inhiben el desarrollo de la mayoría de
las bacterias Gram-positivas y de algunas coliformes. El azul de bromotinol y la
fucsina ácida son los indicadores de la fermentación de los hidratos de carbono,
mientras que el citrato de hierro actúa como indicador de la formación de SH2
(color negro). Las colonias sospechosas de Salmonella spp. que crecen sobre
este medio son colonias transparentes y generalmente con centro negro (Fig.
4A). Ambos medios se siembran por agotamiento en medio sólido y se incuban
durante 24 h a 35-37°C. Luego, las colonias consideradas como sospechosas
en cada uno de los medios deben ser re-aisladas y confirmadas en primera
instancia mediante pruebas bioquímicas y luego en una segunda instancia
mediante pruebas serológicas o moleculares.
A B
Figura 4. Medios de cultivo selectivos y diferenciales para la detección de

Salmonella spp. A. Salmonella spp. en medio Agar Hektoen (colonias
transparentes con centro negro). B. Salmonella spp. en medio Agar SS (colonias
transparentes con centro negro).
e) Recuento de Coliformes
Las coliformes son bacterias de forma bacilar, gram negativas, no esporuladas

pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa en 48
horas en presencia de sales biliares. Este grupo incluye a bacterias tales como
de los géneros Klebsiellla, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, entre otros. No
todas las bacterias pertenecientes a este grupo tienen necesariamente origen
intestinal, por lo cual su presencia en los alimentos no significa necesariamente
que hubo una contaminación fecal o que hay patógenos entéricos presentes.
Generalmente, en la leche cruda, vegetales, carne, aves y otros alimentos crudos
se encuentran recuentos bajos de bacterias coliformes naturalmente por lo que
presentan poco o ningún valor para el monitoreo de los mismos. Son
microorganismos que se eliminan fácilmente por tratamiento térmico.
La presencia de este grupo en los alimentos indica:
-Contaminación post-proceso térmico o tratamiento térmico deficiente.
- Fallas (ausencia o deficiencia) en la refrigeración post-cocción.
- Deficientes prácticas de sanitización de superficies inertes.
- Proceso de desinfección deficiente o inadecuado de frutas, verduras y

legumbres.
Los coliformes se estresan subletalmente por congelación, por lo que el

recuento de coliformes en alimentos freezados debe ser interpretado con
cuidado. El uso del recuento de coliformes como indicador requiere un
conocimiento amplio del proceso que el alimento ha sufrido (producción,
procesamiento, distribución, etc.) y del efecto que él ha tenido en las bacterias
coliformes. La metodología utilizada para el recuento de los microorganismos
coliformes se basa en el uso del método del Número más Probable (NMP). El
número de diluciones utilizadas dependerá del grado de contaminación del
alimento y/o de los estándares microbiológicos establecidos. Dentro de este
grupo se encuentran las coliformes totales y las coliformes fecales.
✓ Coliformes totales: este grupo está integrado principalmente por los siguientes
géneros de bacterias: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, además
de algunas cepas de Serratia. Todas son anaeróbicas facultativas, pueden
existir como saprofitas independientemente o como microorganismos
intestinales, excepto el género Escherichia cuyo origen es sólo fecal. Si bien el
hábitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, las
coliformes totales también se pueden aislar de muestras medioambientales
(tierra, polvo, aguas superficiales y vegetales). Así, su procedencia puede ser
tanto fecal como no fecal, por lo tanto, la presencia de coliformes totales en
muestras de alimentos sólo indica existencia de contaminación, sin asegurar su
origen. Metabólicamente, estas bacterias se caracterizan por su capacidad de
fermentar lactosa a 35-37°C con producción de ácido y gas. Si bien existen varios
métodos para determinar coliformes, uno de los más utilizados es el método
británico por recuento en medio sólido (NMP) en medio de cultivo Mac Conkey.
En el caldo Mac Conkey la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis
de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte
de la flora Gram-positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH. El
indicador vira hacia amarillo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada (Fig. 5).
Los tubos utilizados deben contener una campana de Durham para evaluar la
producción de gas (Fig. 5). En resumen, las coliformes totales se incuban en
aerobiosis a 35-37°C durante 48 hs. Una vez que los tubos son incubados se
debe realizar la lectura:
Interpretación de la lectura de los tubos:
- Positivos: tubos en los que simultáneamente se observa viraje del indicador al

amarillo y la producción de gas en la campana de Durham.
- Negativos: tubos sin viraje del medio de cultivo o sin la presencia de gas.
Figura 5. Medio de cultivo Mac Conkey para la detección de bacterias coliformes.

A la izquierda se observa un tubo positivo (fermentación de la lactosa y
producción de gas) y a la derecha un tubo negativo (lactosa no fermentada y no
hay producción de gas).
✓ Coliformes fecales o termotolerantes: este grupo es de origen exclusivamente

intestinal (su hábitat es el intestino de aves y mamíferos) y presentan además de
la capacidad de fermentar lactosa tanto a 35-37°C como a 44-45°C. La especie
predominante en este grupo es Escherichia coli. Al estar presentes en el
intestino, la presencia de coliformes fecales en alimentos indica contaminación
de origen exclusivamente fecal, indicando la posible presencia de otros
microorganismos patógenos de origen intestinal. Para su detección y a partir de
los tubos positivos para coliformes totales, los microrganismos se repican con un
ansa y se siembran en condiciones de asepsia; según la técnica del NMP en
medio líquido Mac Conkey (producción de ácido y gas). En este caso, los tubos
se incuban en aerobiosis a 44-45°C por 48 hs y se realiza la lectura de los
mismos:
Interpretación de la lectura de los tubos:
- Positivos: tubos en los que simultáneamente se observa viraje del indicador al

amarillo y la producción de gas en la campana de Durham.
- Negativos: tubos sin viraje del medio de cultivo o sin la presencia de gas.
✓ Presencia-ausencia de Escherichia coli: la contaminación de alimentos con

E. coli implica el riesgo de que puedan encontrarse en el mismo patógenos
entéricos que constituyan un riesgo para la salud. Sin embargo, la ausencia de
E. coli no asegura la ausencia de patógenos entéricos. Esta bacteria, habitante
normal del intestino humano, es utilizada como indicador de contaminación fecal
en diversos tipos de alimentos. En muchos productos crudos de origen animal,
bajos recuentos de E. coli pueden ser esperados dada la asociación cercana de
estos alimentos con el ambiente animal y por la probabilidad de la contaminación
de las carcasas, reses, etc., con materia fecal animal durante la faena. E. coli se
puede eliminar fácilmente mediante procesos térmicos, por consiguiente, la
presencia de la misma en un alimento sometido a temperaturas elevadas
significa un proceso deficiente o lo que es más común, una contaminación
posterior al proceso atribuible al equipo, manipuladores o contaminación
cruzada. Las cepas patógenas de E. coli causan infecciones del tracto intestinal
(generalmente agudas y no presentan mayores complicaciones, excepto en
niños y adultos con deficiencias nutricionales o inmunosupresión). Sin embargo,
es importante destacar que algunas cepas de E. coli tienen importante poder
patogénico. Escherichia coli productor de toxina Shiga (serotipo O157:H7), es un
patógeno emergente asociado a casos de diarrea, colitis hemorrágica, síndrome
urémico hemolítico (SUH) y trastornos de coagulación en seres humanos. El
SUH afecta particularmente a niños, ancianos y aquellos que, por padecer otras
enfermedades, tengan su sistema inmunológico deprimido. Los rumiantes en
general y el ganado vacuno en particular, han sido señalados como los
principales reservorios de E. coli O157:H7. La contaminación durante la faena es
la ruta primaria que generalmente lleva a la contaminación de la carne picada de
vacuno. La principal vía de transmisión son los alimentos contaminados como
carne molida, productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, embutidos
fermentados, leche y jugos no pasteurizados, vegetales que se consumen
crudos, etc. Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada
durante la preparación de alimentos, el contacto directo del hombre con los

animales y de persona a persona por la ruta fecal-oral. En Argentina el SUH es
endémico; siendo Argentina el país con mayor incidencia a nivel mundial. La
enfermedad está distribuida en todo el país, pero la frecuencia es mayor en las
provincias del centro y sur. La presencia de colonias sospechosas de E. coli se
determina en medio sólido Agar EMB-Levine (inhibe el crecimiento de bacterias
Gram-positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no
fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras (no fermentadoras),
y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras),
siendo las colonias presuntivas de E. coli de color negro con brillo verde
metalizado (Fig. 6). Las colonias sospechosas en medio EMB-Levine deben ser
re-aisladas y deben ser posteriormente confirmadas mediante pruebas
bioquímicas o moleculares.
Figura 6. Medio de cultivo Agar EMB-Levine. Se observan las colonias

sospechosas de E. coli creciendo sobre el medio (color verde metalizado con
centro negro).
Muestreo y criterios para el análisis de alimentos
Para analizar la calidad microbiológica de los alimentos, como se describió

anteriormente, para cada alimento se deben evaluar distintos microrganismos o
grupos microbianos en particular. Dichas normativas están contempladas en los
diversos capítulos (alimentos cárnicos, azucarados, farináceos, lácteos, grasos,
fermentados, etc.) que contiene el CAA. Para tomar la muestra se deben tener
en cuanta ciertos recaudos (rotulado y recipiente estéril) y los planes de
muestreo indicados por el CAA para cada alimento en particular.
Planes de muestreo para análisis microbiológicos en alimentos
El plan de muestreo es uno de los componentes del criterio microbiológico

cuando se quiere analizar un alimento que no sea agua. El plan de muestreo se
aplica para decidir, en base a criterios establecidos, la aceptación o el rechazo
de un producto/lote. El plan de muestreo comprende: a) el procedimiento de toma
de muestra y b) el criterio de decisión a aplicar en el lote de alimentos. Existen
dos tipos de planes de muestreo reconocidos internacionalmente: el plan de dos
clases y el de tres clases dependiendo de si se puede permitir o no la presencia
de una muestra positiva en cualquier unidad de muestra.
- Plan de muestreo de dos clases: los análisis microbiológicos tienen como

objetivo comprobar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular
(generalmente evalúa patógenos).
- Plan de muestreo de tres clases: este tipo de plan se divide la calidad del lote
de alimentos en tres categorías o clases: aceptable, marginal aceptable o
rechazable. Se utiliza generalmente con microorganismos indicadores.
Criterios microbiológicos en alimentos
En la República Argentina, el CAA establece dos categorías principales en

cuanto a los criterios a seguir en la elaboración de patrones microbiológicos:
- Criterio obligatorio: se utiliza para referirse a los microorganismos considerados

patógenos y/o sus marcadores, considerados de importancia en salud pública y
de acuerdo con la clase de alimento. En este caso su hallazgo constituye razón
suficiente para imputar la infracción y proceder en consecuencia, en forma

preventiva o represiva, imponiendo las sanciones que correspondan.
- Criterio complementario (recomendatorio): a diferencia del anterior es el criterio

relativo a la evaluación del proceso tecnológico utilizado para la obtención de un
producto. Puede orientar al fabricante, aconsejarlo acerca de puntos sin control,
y su seguimiento permitirá inferir o determinar la “falla”, que se demuestra en los
protocolos analíticos. No tiene por finalidad la inspección final, con lo que se
indica que de su incumplimiento no derivarán sanciones.
Ejemplos de normativas y criterios microbiológicos establecidos por el

CAA para algunos alimentos
Tabla 1: Normas y criterios para alimentos cárnicos (carne picada fresca) según
CAA.
Criterio Obligatorio:
Determinaciones Límites
Escherichia coli O157:H7 Ausencia/ 65g
Salmonella spp. Ausencia/ 10 g
Criterio complementario:
Determinación Límites
Recuento de Aerobios Mesófilos /g 107
Recuento de Escherichia coli /g 500
Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva /g 1000

Tabla 2: Normas y criterios microbiológicos para hortalizas
Determinación Valores límites permitidos
E. coli Salmonella spp. E. coli O157:H7
Hortalizas y verduras frescas 100/g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Vegetales mínimamente
procesados (envasados y <0.3/g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
listos para consumir)
Leche
Según el Código Alimentario Argentino en su artículo 554 - (Res 22, 30.01.95)

establece que: "Con la denominación de Leche sin calificativo alguno, se
entiende el producto obtenido por el ordeño total e ininterrumpido, en condiciones
de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación,
proveniente de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria
Bromatológica Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie. La leche
proveniente de otros animales deberá denominarse con el nombre de la especie
producto”. La composición química global de la leche vacuna se resume en la
Tabla 3.
Tabla 3. Composición química global de la leche vacuna.
Componente Raza Holando Argentino (g/100 mL)
Agua 87,8
Grasa 3,1
Proteínas 3,5
Lactosa 4,7
Sales minerales 0,7

Los microorganismos presentes en la leche pueden alterar las

características físico-químicas, organolépticas y nutricionales de la misma.
Además, ciertos microorganismos o sus toxinas pueden generar riesgos para la
salud, siendo por lo tanto deseable que la leche cruda contenga una baja carga
microbiana.
La microbiota inicial de la leche puede provenir de diferentes sitios como:
1. El interior de la ubre: En animales sanos, el tejido secretor de la ubre está libre

de microorganismos. Sin embargo, en la membrana de la mucosa del canal del
pezón podrían estar presente estreptococos, estafilococos, micrococos,
coliformes y bacterias ácido-lácticas. Estos microorganismos pasan a la leche en
una concentración aproximada de 102 a 104 UFC/mL. Ante procesos
inflamatorios en la ubre, como la mastitis, los microorganismos más
frecuentemente implicados son: Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Corynebacterium
bovis, etc. Esta enfermedad se caracteriza por cambios patológicos en el tejido
glandular de la ubre que afectan la cantidad de leche producida, así como su
calidad, causando cambios físicos, químicos y bacteriológicos en la misma.
Además, residuos de antibióticos utilizados para su control pueden pasar a la
leche representando un peligro potencial para la salud del consumidor y
afectando la obtención de productos lácteos fermentados y quesos. Los
rumiantes pueden estar infectados con agentes zoonóticos, que luego son
eliminados en la leche. Los de mayor incidencia son Mycobacterium bovis,
causante de tuberculosis y Brucella abortus, agente causal de la brucelosis. En
nuestro país es obligatorio realizar un plan de sanidad riguroso para obtener el
certificado de “Rodeo libre de brucelosis y tuberculosis”.
2. La superficie de la ubre y los pezones: (deben estar limpios al momento del

ordeñe).
3. El equipo de ordeñe.
4. El medio ambiente (el agua que se utiliza para limpieza de pezones etc. debe
ser potable).
La leche luego de ser tratada (seleccionada, higienizada por medios

mecánicos, estandarizada según su contenido de materia grasa,
homogeneizada, tratada térmicamente, enfriada, envasada y conservada a baja
temperatura) debe además estar exenta de patógenos.
Métodos indirectos para evaluar la calidad de la leche
Existen métodos indirectos y directos para evaluar la calidad microbiológica de

la leche. Los métodos indirectos estiman la carga microbiana, ya que evalúan
propiedades físico-químicas de la leche que pueden ser modificadas por los
microorganismos que la contaminan. Estos métodos son simples y rápidos por
lo que se suelen realizar en el tambo para evaluar la calidad de la leche “in situ”:
- Prueba de Acidimetría: la acidez de la leche aumenta cuando hay producción

de ácido láctico como consecuencia de la fermentación microbiana de la lactosa.
Este parámetro es por lo tanto utilizado como una medida indirecta de la calidad
higiénico-sanitaria tanto de la leche cruda como de aquella tratada térmicamente.
El método consiste en añadir 1,8 mL de NaOH 0,1 N a 10 mL de leche más 3
gotas de un indicador de pH como la fenoftaleína, si la leche permanece de color
rosa es apta y si se decolora se encuentra ácida.
- Prueba del alcohol: cuando se añade a la leche una cierta cantidad de alcohol
etílico se produce una deshidratación, parcial o total, de ciertos coloides
hidrófilos, que puede conducir a su desnaturalización, y con ello a la pérdida de
su equilibrio y floculación. Este resultado sólo se alcanza con un cierto grado
alcohólico de la mezcla final, por debajo del cual las leches térmicamente
estables no floculan, mientras que la leche térmicamente inestable, flocula.
Basándose en este principio se ha ideado un método simple que consiste en
mezclar volúmenes iguales de leche cruda y de una solución acuosa de alcohol
etílico de concentración conocida. La mezcla se agita en frío y se observa, si no
se produce floculación alguna, la leche resistirá perfectamente el calentamiento
correspondiente al grado de la solución alcohólica. Si se observa floculación, la
leche no se mantendrá estable durante el calentamiento.
Los factores que afectan esta prueba pueden ser divididos en tres grupos:
I. Leches con elevada carga bacteriana por falta de condiciones higiénicas

o malas condiciones de refrigeración.
II. Leches de composición anormal (ej. con exceso de albúminas).
III. Leches con desequilibrio salino (por ejemplo, incremento de calcio iónico
soluble a principios y finales de la lactancia).
- Prueba de la reductasimetría: esta prueba se realiza como una medida de la

población microbiana viable. Se determina el tiempo que tarda la leche a 37ºC,
en convertir el colorante azul de metileno de su forma oxidada (azul) a su forma
reducida (incolora). Se mide en forma indirecta, la población bacteriana de la
leche capaz de crecer y consumir oxígeno disuelto en la misma, lo que disminuye
el potencial de óxido-reducción de la mezcla causando la reducción del
colorante. En caso de no producirse la decoloración debe sospecharse la
presencia de inhibidores o conservantes, tales como: hipoclorito de sodio, ácido
bórico, ácido salicílico, formol o agua oxigenada, cuyo uso está prohibido.
Métodos directos para evaluar la calidad de la leche
Las pruebas requeridas para garantizar la calidad microbiológica de la leche

consisten en: a) el recuento de bacterias mesófilas totales, b) el recuento de
bacterias coliformes, y c) la ausencia de Escherichia coli. Los límites en estos
parámetros varían ligeramente entre los distintos tipos de leche.
Tabla 4: Métodos directos que determinan la carga microbiana en la leche.
Parámetro Límite máximo (*)
Recuento Total a 30ºC (UFC/cm3) 200.000
Contenido de células somáticas (por cm3) 400.000
* Valor correspondiente a la media geométrica de los resultados de las muestras analizadas

durante un período de tres meses, con al menos una muestra al mes, de la leche cruda en el
momento de la recepción en el establecimiento de tratamiento térmico y/o transformación.
Tabla 5: Métodos directos que determinan la carga microbiana en la leche

ultrapasteurizada.
Parámetro Límite máximo (*)
Recuento de mesófilos totales (UFC/cm3) 10000
Recuento de coliformes totales <10
Recuento de coliformes fecales <10
CONTROL DE CALIDAD DE AGUA
Introducción
El agua para consumo humano es considerada un alimento esencial, sin

embargo, según los diferentes usos que pueda tener el agua (riego, recreación,
bebida animal, etc.) las normas establecen diferentes límites para la presencia
de patógenos, siendo más restrictivas cuando el agua se utiliza para consumo
humano. El análisis de la calidad microbiológica del agua es fundamental, ya que
a través de ella se pueden transmitir numerosas enfermedades epidémicas. Si
la calidad del agua no es buena, es decir, el número de patógenos o
contaminantes excede los límites establecidos; puede provocar riesgos a la
salud, restricción de la utilización en lugares de recreación y disminución de la
utilización del recurso para usos productivos. Esto genera el aumento de gastos
y costos para su utilización, porque es necesario realizar técnicas de purificación,
que reduzcan la carga microbiana.
Grupos de microorganismos buscados en agua
a) Microorganismos mesófilos totales
b) Coliformes
c) Escherichia coli
d) Pseudomonas aeruginosa (se busca solo en agua potable)

En muestras de agua los microrganismos mesófilos totales, coliformes

totales y fecales y E. coli se determinan con los mismos métodos y medios de
cultivos descriptos anteriormente para alimentos.
a) Recuento de microorganismos mesófilos totales
En muestras de agua, este parámetro se utiliza para evaluar la carga microbiana

total que presenta el agua. El agua no tiene suficientes nutrientes como para
actuar como medio de cultivo, por lo que la reproducción y supervivencia de
microorganismos en el agua no contaminada es escasa. Por tal motivo, la
presencia de alta cantidad de microorganismos siempre está asociada a una
fuente externa de contaminación que aporta las fuentes carbonadas y
nutricionales para el desarrollo de todo tipo de microorganismos incluso los
patógenos.
b y c) Bacterias coliformes y Escherichia coli
Como se dijo anteriormente, las bacterias coliformes totales en gran número

indican existencia de contaminación sin asegurar su origen, ya que su
procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. En agua potable y debido a
que la cantidad de coliformes totales debe ser menor a 3 bacterias/100 mL (el
CAA es muy restrictivo), se utiliza el método del NMP, pero los tres primeros
tubos utilizados deben ser tubos de doble concentración (presentan el doble de
concentración de nutrientes) (Tabla 6). Por otro lado, la presencia de coliformes
fecales o termotolerantes en muestras de agua, indica contaminación de origen
exclusivamente fecal, indicando la posible presencia de otros microorganismos
patógenos. Escherichia coli en agua se utiliza como un indicador de
contaminación fecal y reciente, ya que no vive mucho tiempo fuera del intestino
debido a sus altos requerimientos nutricionales.
Tabla 6. Determinación de coliformes totales en agua mediante NMP.
Número de tubos Volumen de la Volumen de Concentración del

muestra medio medio
3 10 mL (100) 10 mL Doble
3 1 mL(100) 10 mL Simple
3 1 mL (10-1) 10 mL Simple
d) Presencia-Ausencia de Pseudomonas aeruginosa
Las Pseudomonas son bacterias muy comunes en napas freáticas debido a su

versatilidad respecto a las fuentes de carbono (no fermentan glucosa) que
pueden utilizar, su capacidad para formar biofilms y por sus bajos requerimientos
nutricionales (quimio-organo-heterótrofos). Se trata de bacilos Gram-negativos
que producen pigmentos y no forman esporas. Pseudomonas aeruginosa es un
patógeno oportunista (muy importante en pacientes quemados) y un indicador
por excelencia en agua. Por su relativa resistencia al cloro es considerado un
indicador de la eficiencia de los procesos de cloración. Su presencia en sistemas
de almacenamiento, tanque y cisternas responde a un estado deficiente de
limpieza de dichas instalaciones. Para verificar su presencia se realiza siembra
por agotamiento en dos medios de cultivo diferenciales: Agar King A o Agar P y
Agar King B o Agar F. Estos medios de cultivo contienen glicerina lo cual favorece
la producción de pigmentos por parte de la bacteria. En el medio King A, sales
de magnesio y potasio incluidas en su formulación favorecen la producción de
los pigmentos piocianina y piorrubina e inhiben la producción del pigmento
fluoresceína. En este medio la bacteria Pseudomonas aeruginosa produce
piocianina, lo cual se evidencia como una zona color azul-verdoso que rodea la
colonia o se extiende por todo el medio debido a la difusión del pigmento (Fig.
7A). El medio King B contiene fosfato dipotásico el cual estimula la producción
de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina. La producción
de fluoresceína se observa como un color amarillo-verdoso fluorescente cuando
se ubican las placas incubadas bajo luz ultravioleta (Fig. 7B). Ambos medios de
cultivo se incuban en aerobiosis a 28-30°C durante 24-48 hs para observar la
producción de los pigmentos. Las colonias presuntivas de Pseudomonas

aeruginosa deben expresar los dos tipos de pigmentos en cada uno de los
medios de cultivo utilizados para su detección (Fig. 7). Luego, si la expresión de
ambos pigmentos es positiva, se debe realizar confirmación de las colonias
presuntivas mediante la realización de pruebas bioquímicas.
A B
Figura 7. Medios de cultivo para la detección de Pseudomonas aeruginosa. A.

Medio King A o Pseudomonas P (se observan las colonias rodeadas de color
azul-verdoso). B. Medio King B o Pseudomonas F (se observan las colonias color
amarillo-verdoso bajo luz ultravioleta).
Instructivo para la toma de muestras de agua
Antes de analizar el agua en el laboratorio, debemos tomar la muestra. Las

muestras siempre deben ser homogéneas y representativas. Durante el proceso
de extracción, se deben tomar todas las medidas de asepsia posibles, para evitar
que se modifiquen a las propiedades del agua a analizar por la introducción en
el recipiente de contaminantes externos.
Para recolectar muestras de agua y poder realizar análisis microbiológicos

se deben utilizar 2 recipientes estériles (se pueden conseguir en farmacias) y
realizar la operación con el mayor cuidado y asepsia posible. En cambio,
muestras de agua para análisis químicos, se deben tomar dos litros de agua en
recipientes perfectamente limpios (para ello se puede lavar el recipiente con
jabón o detergente, enjuagar varias veces con agua potable y por último enjuagar
con el agua a analizar). En este caso, los recipientes no necesariamente deben

ser estériles y deben ser preferentemente de vidrio y con tapa hermética para
impedir la salida del líquido o entrada de contaminantes. En ambos casos la
muestra tiene que ser rotulada y enviada inmediatamente al laboratorio, de lo
contrario debe mantenerse refrigerada (4-5 °C). Cuanto menor sea el tiempo
transcurrido desde la toma de la muestra hasta el envío al laboratorio, más
exacto serán los resultados obtenidos.
- Toma de muestras para análisis microbiológicos desde un grifo situado en una

cañería de agua corriente: previamente, limpiar la boca del grifo con un cepillo
con detergente, cuidando de eliminar la suciedad que habitualmente se acumula
en la parte interna del orificio. Después, dejar salir agua abundante durante 2 o
3 minutos y cerrar el grifo para esterilizarlo. El grifo se esteriliza quemando el
alcohol previamente colocado con un algodón, tanto por la superficie externa,
como por la superficie interna. Luego, abrir con cuidado (no tocando la boca del
grifo) y dejar salir el agua durante un minuto hasta que se enfríe. Una vez que
se ha enfriado el grifo y sosteniendo el recipiente estéril por la parte inferior,
destapar cuidadosamente evitando el contacto de los dedos con la boca del
recipiente, llenarlo y taparlo.
Toma de muestras para análisis microbiológicos desde un grifo situado en una

cañería de un pozo semisurgente: en este caso puede tratarse del grifo de una
bomba accionada a mano, molino o bomba mecanica. Es importante cuando se
examinan aguas provenientes de pozos, extraer muestras cuyas características
bacteriológicas correspondan exactamente a las del agua del pozo, por ello
conviene tomar las muestras de grifos que estén conectados directamente a las
cañerías ascendentes del pozo. En caso contrario, el agua evaluada puede
provenir de depósitos de reserva o antepozos que se pueden llegar a encontrar
en malas condiciones de higiene, influyendo en los resultados del examen que
no indicaran fielmente la calidad del agua. Para tomar las muestras se debe
limpiar la boca del grifo eliminando toda la suciedad acumulada en su interior
(con un cepillo con detergente). Si el pozo es de uso continuo, basta dejar correr
el agua durante 30 minutos. En cambio, si el pozo está fuera de servicio o se
utiliza muy poco, se debe dejar correr el agua durante 5 horas como mínimo
antes de tomar la muestra. Luego, se limpia la boca del grifo y se toma la muestra
tal como se explicó en el punto anterior.
Agua para consumo humano y otros usos
Dentro del Capítulo XII del CAA, se encuentran todas las consideraciones
referidas a las bebidas hídricas, agua y aguas gasificadas. En agua para
consumo humano, el criterio microbiológico y los límites establecidos según el
CAA se refieren a: recuento de bacterias mesófilas totales, recuento de bacterias
coliformes totales, presencia/ausencia de Escherichia coli y de Pseudomonas
aegurinosa (Tabla 7). En el caso del agua de efluentes, para riego o recreacional
son otros los organismos que dictan las normativas y los microorganismos a
evaluar (Tabla 7 y 8).
Tabla 7: Normas de calidad de agua para consumo humano, uso recreacional y

efluentes. CAA: Código Alimentario Argentino. NE: no especifica. EPA: Agencia
de Protección Ambiental de los EE. UU. SRH: Subsecretaría de Recursos
hídricos de la Provincia de Córdoba.
Valores límites permitidos
Mesófilos Coliformes Coliformes Pseudomonas

E. coli
totales totales fecales aeruginosa
(UFC/mL) (Ausencia/ (Ausencia/

(Bac/100 mL) (Bac/100 mL)
100 mL) 100 mL)
Agua potable
500 <3 NE Ausente Ausente
(CAA)
Agua envasada
500 <3 NE Ausente Ausente
(CAA)
Recreacional
NE NE NE NE 126
(EPA)
Efluentes
NE < 5000 <1000 NE NE
(SRH)
Tabla 8: Normas de calidad de agua para riego según la Organización Mundial

de la Salud (OMS).
Valores límites permitidos /100 mL
Coliformes fecales E. coli
Categoría A: riesgo para consumidores y

trabajadores (cultivos hortícolas, campos de <100 Ausente
deportes y parques públicos)
Categoría B: riesgo para trabajadores

<1000 Ausente
(cereales, forrajeras, árboles
Categoría C: sin riesgo para consumidores ni

<1000 <1
trabajadores (forestaciones)
1) Métodos indirectos para establecer calidad de la leche
- A partir de muestras de leche provistas por el profesor, cada grupo deberá

realizar las siguientes determinaciones:
a) Prueba de acidimetría:
Procedimiento:
- Colocar 10 mL de leche en un tubo de ensayo.
- Agregar 1,8 mL de solución Dornic (solución de NaOH 0,1 N).
- Añadir 3 gotas de fenolftaleína.
- Agitar suavemente.
- Si se mantiene la tonalidad rosada, la leche es apta. Si se decolora

rápidamente la leche se encuentra ácida.
b) Prueba del alcohol:
Procedimiento:
- Colocar 2 mL de leche en un tubo de ensayo.
- Agregar 2 mL de alcohol etílico al 70 % v/v.
- Agitar suavemente.
- Observar la presencia o ausencia de floculación, en caso positivo la leche

no es térmicamente estable.
2) Observación de determinaciones realizadas en distintas muestras de

agua
- Cada grupo deberá realizar el recuento de bacterias mesófilas totales y

coliformes totales a partir de los elementos provistos por el profesor. Además,
deberán observa la presencia de E. coli y de Pseudomonas aeruginosa. Con los
resultados obtenidos, cada grupo deberá comparar con normas de referencia
para consumo humano de agua (CAA).

1 - Guía de Actividades Prácticas - Microbiología Agrícola

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GUÍA DE TRABAJOS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA

1. Ubicación del espacio curricular en el Plan de Estudios:

Página Web: http://www.agro.unc.edu.ar/~wpweb/microbiologia/inicio/

Ing. Agr. Dr. Enrique Dictado de Teóricos y

Dra. Carolina Dictado de Teóricos y

Ing. Agr. Lucas Dictado de Actividades

Dra. María Paula Dictado de Actividades

Dra. Romina Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Ing. Agr. (MSc) Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

Ing. Agr. Ibrahim Prof. Ayudante “A” Dictado de Actividades

María Ángeles Ayudante Alumno Colaboración en

Ayudante Alumno Colaboración en

Ayudante Alumno Colaboración en

Funciones en las que participan todos los docentes de la Cátedra de

5. Fundamentación del espacio curricular:

6. Objetivos del espacio curricular

• Comprender el rol de los microorganismos en los diferentes procesos

• Comprender la importancia de los microorganismos en los diferentes

• Analizar críticamente los efectos de los diferentes sistemas productivos

• Adquirir conocimientos sobre el manejo de microorganismos de interés

• Formar criterios de fundamentación para el manejo de agroecosistemas.

• Utilizar correctamente equipos y material de laboratorio.

• Desarrollar capacidad para la realización e interpretaión de productos e

• Incorporar vocabulario técnico especifico.

• Desarrollar capacidad de síntesis integrando los nuevos conceptos al

• Fomentar el intercambio de opiniones entre los estudiantes.

• Generar espíritu de colaboración a partir de trabajos grupales.

y deshumificación. Tasa de descomposición (k). Técnicas para el análisis de la

Programa de Actividad Prácticas

8. Metodología de Enseñanza y de Aprendizaje

9. Plan de actividades obligatorias

1 Clase teórica Aula 2 UNIDAD I

Clase teórica Aula 2 UNIDAD I y II

Clase teórica Aula 2 UNIDAD II

Clase teórica Aula 2 UNIDAD III

Clase teórica Aula 2 UNIDAD IV

Clase teórica Aula 2 UNIDAD V

7 PRIMER PARCIAL (26 de septiembre)

Clase teórica UNIDAD VII y

Clase teórica Aula 2 UNIDAD IX

12 Clase teórica Aula 2 UNIDAD XII

13 SEGUNDO PARCIAL (7 DE NOVIEMBRE)

14 RECUPERATORIO (14 DE NOVIEMBRE)

EVALUACIÓN DE INTEGRACIÓN Y TRANSFERENCIA (24

• Evaluación de Integración y Transferencia:

11. Condición de los estudiantes:

BARTON LL y NORTHUP DE. 2011. Microbial Ecology. Wiley-Blackwell, New

PAREDES MC. 2013. Fijación biológica de nitrógeno en leguminosas y

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