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INTERNACIONAL YO ASI

ESTÁNDAR 4832

Tercera edicion
2006-02-15

Microbiología de alimentos y alimentos para

animales. Método horizontal para el recuento de
coliformes. Técnica de recuento de colonias.

Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le

dénombrement des coliformes — Méthode par comptage des colonies

Número de referencia
ISO 4832:2006(E)

©ISO 2006
ISO 4832:2006(E)

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electrónico copyright@iso.org
Web www.iso.org

Publicado en Suiza

yo © ISO 2006 – Todos los derechos reservados

 ISO 4832:2006(E)

Prefacio
ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales de normalización
(organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de Normas Internacionales normalmente se lleva a cabo a través de los
comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en un tema para el cual se ha establecido un comité técnico tiene
derecho a estar representado en ese comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no gubernamentales, en
coordinación con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional
(IEC) en todos los asuntos de normalización electrotécnica.

Las Normas Internacionales se redactan de acuerdo con las reglas dadas en las Directivas ISO/IEC, Parte 2.

La tarea principal de los comités técnicos es preparar Normas Internacionales. Los proyectos de Normas Internacionales
adoptados por los comités técnicos se distribuyen a los organismos miembros para su votación. La publicación como norma
internacional requiere la aprobación de al menos el 75 % de los organismos miembros con derecho a voto.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan ser objeto de derechos de
patente. ISO no será responsable de identificar cualquiera o todos los derechos de patente.

ISO 4832 fue preparado por el Comité Técnico ISO/TC 34,Productos alimenticios, Subcomité SC 9,Microbiología.

Esta tercera edición de ISO 4832 cancela y reemplaza ISO 4832:1991 e ISO 5541-1:1986. Los principales cambios son los
siguientes:

— se ha suprimido el procedimiento alternativo de incubación a 35 °C (véase 4.2);

— se ha introducido una prueba de confirmación en caldo verde brillante de lactosa y bilis (véanse 5.4 y 9.4).

Considerando la naturaleza de los cambios a la edición anterior de esta Norma Internacional, se considera que la validación de
métodos alternativos basados en la Norma ISO 4832:1991 no se ve afectada por esta revisión.

© ISO 2006 – Todos los derechos reservados iii

ISO 4832:2006(E)

Introducción

Debido a la gran variedad de alimentos y piensos, este método horizontal puede no ser apropiado en todos los detalles para
determinados productos. En este caso, se pueden utilizar diferentes métodos que son específicos para estos productos si es
absolutamente necesario por razones técnicas justificadas. Sin embargo, debe hacerse todo lo posible para aplicar este método
horizontal en la medida de lo posible.

La próxima vez que se revise esta Norma Internacional, se tendrá en cuenta toda la información disponible en ese
momento con respecto a la medida en que se ha seguido este método horizontal y las razones de las desviaciones de este
método en el caso de productos particulares.

La armonización de los métodos de prueba no puede ser inmediata, y para ciertos grupos de productos ya pueden
existir Normas Internacionales y/o normas nacionales que no cumplan con este método horizontal. Se espera que
cuando se revisen dichas normas, se modifiquen para cumplir con esta Norma Internacional, de modo que
eventualmente las únicas desviaciones restantes de este método horizontal sean las necesarias por razones
técnicas bien establecidas.

La técnica descrita en esta Norma Internacional es más precisa que la descrita en la Norma ISO 4831[1], pero no permite
que se lleve a cabo un examen microbiológico en una porción de prueba tan grande. Por lo tanto, es el método preferido
cuando hay un gran número de coliformes. Además, dado que la definición de “coliformes” adoptada en los dos
documentos es diferente, los microorganismos enumerados no son necesariamente los mismos. Para cualquier producto
en particular, el método a elegir se especificará en la Norma Internacional que trata con ese producto.

A los efectos de un método de prueba practicable, la definición de "coliformes" que se da en la Cláusula 3 y que se usa como base
para el procedimiento no es necesariamente idéntica a las definiciones correspondientes que se dan en otros textos publicados. El
método descrito en esta norma internacional detectará, en promedio, solo alrededor del 90 % de las cepas de los
microorganismos mencionados en otras publicaciones como "coliformes (presuntos)" (p. ej., ciertas cepas decitrobacter,
Enterobacter,Klebsiella) (ver Referencia [2]).

IV © ISO 2006 – Todos los derechos reservados

ESTÁNDAR INTERNACIONAL ISO 4832:2006(E)

Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Método

horizontal para el recuento de coliformes. Técnica de recuento de
colonias.

1 Alcance

Esta norma internacional brinda pautas generales para la enumeración de coliformes. es aplicable a
— productos destinados al consumo humano y a la alimentación de animales, y
— muestras ambientales en el área de producción y manipulación de alimentos,

mediante la técnica de conteo de colonias tras incubación en medio sólido a 30◦C o a los 37◦C.

NOTA La temperatura está sujeta a acuerdo entre las partes interesadas. En el caso de la leche y los productos lácteos, la
temperatura de incubación es de 30◦C.

Esta técnica se recomienda cuando se espera que el número de colonias buscadas sea mayor a 100 por mililitro o
por gramo de la muestra de prueba.

2 Referencias normativas

Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento. Para las referencias
con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha, se aplica la última edición del documento de
referencia (incluidas las modificaciones).

ISO 6887 (todas las partes),Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras de ensayo,
suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico.

ISO 7218:—1),Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Requisitos generales y orientación para los
exámenes microbiológicos.

norma ISO 8261,Leche y productos lácteos: orientación general para la preparación de muestras de ensayo, suspensiones
iniciales y diluciones decimales para el examen microbiológico

ISO/TS 11133-1,Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Directrices para la preparación y producción de medios de
cultivo. Parte 1: Directrices generales sobre garantía de calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio.

ISO/TS 11133-2:2003,Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Directrices sobre la preparación y producción de
medios de cultivo. Parte 2: Directrices prácticas sobre las pruebas de rendimiento de los medios de cultivo.

1) Para ser publicado.

© ISO 2006 – Todos los derechos reservados 1

ISO 4832:2006(E)

3 Términos y definiciones

A los efectos de este documento, se aplican los siguientes términos y definiciones.

3.1
coliformes
bacterias que, a la temperatura especificada (es decir, 30◦C o 37◦C, según lo acordado) forman colonias características en agar
cristal violeta, rojo neutro, bilis y lactosa, y que en la prueba de confirmación provocan la fermentación de la lactosa con
producción de gas en las condiciones de prueba especificadas en esta norma internacional.

4 Principio

4.1Se preparan dos placas vertidas utilizando un medio de cultivo selectivo sólido, con una cantidad determinada de la muestra
de ensayo si el producto inicial es líquido, o con una cantidad determinada de una suspensión inicial en el caso de otros
productos.

Se preparan otros pares de placas vertidas en las mismas condiciones, utilizando diluciones decimales de la muestra de ensayo o
de la suspensión inicial.

4.2Las placas se incuban a 30◦C o 37◦C (según lo acordado) durante 24 h.

4.3 Se cuentan las colonias características y, si es necesario, se confirma un número de colonias por
fermentación de lactosa.

4.4El número de coliformes por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir del número de colonias características
obtenidas en las placas elegidas (ver ISO 7218).

5 Medios de cultivo y diluyentes

5.1 Generalidades

Consulte las normas ISO 7218, ISO/TS 11133-1 e ISO/TS 11133-2 para la preparación, producción y pruebas de rendimiento de los medios
de cultivo.

5.2 Diluyentes

Ver ISO 6887 (parte relevante), ISO 8261 o la Norma Internacional específica que trata con el producto bajo
examen.

5.3 Medio selectivo sólido: agar cristal violeta, rojo neutro, bilis, lactosa (VRBL)

5.3.1 Composición

Digerido enzimático de tejidos animales. 7 gramos

Extracto de levadura 3g
Lactosa (C12H22O11·H2O) 10g
Cloruro de sodio 5 gramos

sales biliares 1,5g

rojo neutro 0,03 gramos

Cristal violeta 0,002 gramos

agara 12 g a 18 g
Agua 1 000ml
aDependiendo de la fuerza de gel del agar.

2 © ISO 2006 – Todos los derechos reservados

 ISO 4832:2006(E)

5.3.2 Preparación

Proceda de la siguiente manera para conservar el poder de selectividad y la especificidad del medio.

Mezclar bien los componentes o el medio completo deshidratado en el agua y dejar reposar durante varios minutos. Ajustar el pH
para que, después de hervir, sea de 7,4±0,2 a los 25◦C. Calentar hasta que hierva, revolviendo de vez en cuando.

Dejar hervir durante 2 min. Enfriar inmediatamente el medio al baño maría (6.5) a 44◦C a 47◦C.

Para evitar el sobrecalentamiento, no caliente el medio durante demasiado tiempo ni lo recaliente. En consecuencia, no lo
esterilice en autoclave y verifique la esterilidad del medio en el momento de su uso (ver 9.2.2).

Utilice el medio dentro de las 4 h de su preparación.

5.3.3 Pruebas de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo

Para las definiciones de selectividad y productividad, consulte ISO/TS 11133-1. Las pruebas de rendimiento relacionadas con el agar bilis
rojo neutro cristal violeta lactosa (VRBL) se proporcionan en ISO/TS 11133-2:2003, Tabla B.1.

5.4 Medio de confirmación: caldo de bilis de lactosa verde brillante

5.4.1 Composición

Digerido enzimático de caseína 10g

Lactosa (C12H22O11·H2O) 10g
Bilis de buey deshidratada 20g
Verde brillante 0,013 3 gramos

Agua 1 000ml

5.4.2 Preparación

Disolver los componentes del medio completo deshidratado en el agua calentando suavemente si es necesario al baño
maría (6.5). Si es necesario, ajuste el pH para que, después de la esterilización, sea 7,2±0,2 a los 25◦C.

Distribuir el medio, en cantidades de 10 ml, en tubos de ensayo (6.7) que contengan tubos de Durham (6.8). Esterilizar en
autoclave (6.1) a 121◦C durante 15 min. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

6 Aparatos y cristalería

Equipo habitual de laboratorio microbiológico (ver ISO 7218) y, en particular, los siguientes.

6.1 Aparatos para esterilización en seco(horno) oesterilización húmeda(autoclave).

Ver ISO 7218.

6.2 Incubadora, capaz de operar a 30◦C±1◦C o 37◦C±1◦C.

6.3 Placas de Petri, de vidrio o plástico, de diámetro 90 mm a 100 mm.

6.4 Pipetas de entrega total, con capacidades nominales de 1 ml.

6.5 Baño de agua, o aparato similar, capaz de operar a 44◦C a 47◦C o al 100◦C.

6.6 Equipo de conteo de colonias, compuesto por una base iluminada y un contador digital mecánico o
electrónico.

© ISO 2006 – Todos los derechos reservados 3

ISO 4832:2006(E)

6.7 Tubos de ensayo, de dimensiones aproximadas 16 mm×160 mm.

6.8 tubos Durham, de dimensiones apropiadas para su uso con los tubos de ensayo (6.7).

6.9 Botellasomatraces, para hervir y almacenar medios de cultivo.

6.10 pH-metro, exacto a±0,1 unidad de pH a 25◦C.

6.11 Bucle, de platino-iridio o níquel-cromo, de aproximadamente 3 mm de diámetro, o asas desechables.

7 Muestreo

El muestreo debería haberse realizado de acuerdo con la norma internacional específica apropiada para el
producto en cuestión. Si no existe una Norma Internacional específica, se recomienda que las partes
interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.

8 Preparación de la muestra de prueba

Preparar la muestra de prueba de acuerdo con ISO 6887 (parte relevante), ISO 8261 o la Norma Internacional
específica apropiada para el producto en cuestión. Si no existe una Norma Internacional específica, se recomienda
que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.

9 Procedimiento

9.1 Porción de prueba, suspensión inicial y diluciones

Preparar la porción de prueba, la suspensión inicial (dilución primaria) y las diluciones posteriores de acuerdo con ISO
6887 (parte relevante), ISO 8261 o la Norma Internacional específica apropiada para el producto en cuestión.

9.2 Inoculación e incubación

9.2.1Preparar dos platos para el producto líquido y/o de cada dilución elegida. Transferencia, con una pipeta estéril
(6.4), 1 ml de producto líquido o las diluciones adecuadas al centro de cada plato. Use otra pipeta estéril para
inocular cada dilución en los platos.

9.2.2Vierta unos 15 ml del medio VRBL (5.3), a 44◦C a 47◦C, en cada placa de Petri. El tiempo transcurrido entre
el final de la preparación de la suspensión inicial (o de los 10−1dilución si el producto es líquido) y el momento
en que se vierte el medio en los platos no debe exceder los 15 min.

Mezcle con cuidado el inóculo con el medio y deje que la mezcla se solidifique, con las placas de Petri sobre una superficie
horizontal fría.

Preparar también una placa de control con 15 ml del medio para comprobar su esterilidad.

9.2.3Después de la solidificación completa, verter unos 4 ml del medio VRBL (5.3), a 44◦C a 47◦C, sobre la superficie del
medio inoculado. Deje que se solidifique como se describe anteriormente.

9.2.4Invierta los platos preparados e incúbelos en la incubadora (6.2) configurada a 30◦C o 37◦C (según lo acordado) durante 24 h±
2 horas

4 © ISO 2006 – Todos los derechos reservados

 ISO 4832:2006(E)

9.3 Enumeración

Después del período de incubación especificado (ver 9.2.4), seleccione las placas de Petri con, si es posible, 10 o más
colonias y menos de 150 colonias. Contar, utilizando el equipo de recuento de colonias (6.6), las colonias de color rojo
púrpura con un diámetro de al menos 0,5 mm (a veces rodeadas por una zona rojiza de bilis precipitada). Estas se
consideran colonias típicas de coliformes y no requieren confirmación adicional.

Para obtener detalles sobre la técnica de recuento de colonias, consulte la norma ISO 7218.

También cuente y confirme las colonias atípicas (p. ej., de menor tamaño) y todas las colonias derivadas de productos lácteos que
contengan azúcares distintos de la lactosa, inmediatamente después del período de incubación según 9.4. La conversión de
azúcares distintos a la lactosa puede dar como resultado colonias con una apariencia similar a los coliformes típicos.

NOTA La aparición de una zona rojiza de bilis precipitada alrededor de las colonias depende del tipo de coliforme y de la
calidad del medio.

9.4 Confirmación

Inocular cinco colonias de cada tipo atípico, si están disponibles, en tubos de caldo verde brillante de lactosa y bilis (5.4). Incubar
los tubos en la incubadora (6.2) configurada a 30◦C o 37◦C (según lo acordado) durante 24 h±2 horas Considere como coliformes
las colonias que muestran formación de gas en el tubo de Durham. Tener en cuenta los resultados en el cálculo (Cláusula 10).

10 Expresión de resultados

Ver ISO 7218.

11 Precisión

Dada una distribución de Poisson de microorganismos en el sustrato, los límites de confianza de este método varían
según el conteo de colonias examinadas de±16 % a±52 % (ver Referencia [3]). En la práctica, se puede encontrar una
variación aún mayor. En varios estudios colaborativos, la desviación estándar de la repetibilidad (sr) parecía ser 0,20
unidades logarítmicas, la desviación estándar de la reproducibilidad (sR) parecía ser de 0,35 unidades logarítmicas (véanse
las Referencias [4] y [5]).

En ISO 7218 se proporciona más información sobre los límites de confianza.

12 Informe de prueba

El informe de ensayo debe especificar:

— toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra;

— el método de muestreo utilizado, si se conoce;

— el método de ensayo utilizado, con referencia a esta Norma Internacional;

— todos los detalles operativos no especificados en esta Norma Internacional, o considerados como opcionales, junto con los detalles de
cualquier incidente que pueda haber influido en los resultados;

— los resultados de la prueba obtenidos;

— si se ha comprobado la repetibilidad, los resultados finales citados obtenidos.

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ISO 4832:2006(E)

Bibliografía

[1] ISO 4831,Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Método horizontal para la detección y
enumeración de coliformes. Técnica del número más probable.

[2] miENANO, PR y EALA, WHIdentificación de Enterobacteriaceae3.ª edición, Burgess Publishing Company,

Minneapolis, Minnesota, EE. UU., 1972

[3]CO BIENy MORISETTI.J. Ciencia. Alimentación Agrícola.20, 1969, págs. 573

[4] PAGITONy GRAPPIN.J. Asociado. Anal. química74, 1991, págs. 92-103

[5] unLDRIDGEet al.Informe del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, Norwich, NR47UQ, 1993

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.

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