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Virología 562 (2021) 92–102

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Inactivación basada en CRISPR/Cas9 de los oncogenes E6 o del virus del papiloma humano
E7 induce la senescencia en las células de cáncer de cuello uterino

1
Raviteja Inturi *,1, Por Jemth
Departamento de Bioquímica Médica y Microbiología, Universidad de Uppsala, BMC, Box 582, SE-75123, Uppsala, Suecia

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: Los virus del papiloma humano (VPH), como el VPH16 y el VPH18, pueden causar cáncer de cuello uterino, sitios anogenitales y
Virus del papiloma humano orofaríngeos. La expresión continua de las oncoproteínas E6 y E7 del VPH es esencial para la transformación y el mantenimiento de las
CRISPR/Cas9 células cancerosas. Por lo tanto, la orientación terapéutica de los genes E6 o E7 puede potencialmente tratar los cánceres relacionados
Cáncer de cuello uterino
con el VPH. Aquí informamos que la desactivación de E6 o E7 basada en CRISPR/Cas9 puede desencadenar la senescencia celular en
Senectud
las células HeLa inmortalizadas de HPV18. Específicamente, las células HeLa inactivadas con E6 o E7 exhibieron marcadores de
virus de ADN
senescencia característicos como área de superficie celular aumentada, expresión aumentada de ÿ-galactosidasa y pérdida de lamina B1.
oncogenes
Dado que E6 y E7 son transcritos bicistrónicos, la inactivación de HPV18 E6 dio como resultado la desactivación de E6 y E7 y niveles
crecientes de p53/p21 y pRb/p21, respectivamente. La desactivación de HPV18 E7 resultó en una disminución de la expresión de E6 con
la activación de la vía pRb/p21. En conjunto, nuestro estudio demuestra la senescencia celular como un resultado alternativo de la
inactivación del oncogén del VPH por CRISPR/Cas9.

1. Introducción
Los virus del papiloma humano (VPH) son virus pequeños, sin envoltura, con un
genoma de ADN circular de doble cadena. Las infecciones por VPH se transmiten
principalmente por vía sexual y el virus muestra tropismo por el epitelio escamoso cutáneo
o mucoso (Zur Hausen, 1996). Los VPH de alto riesgo contribuyen a más del 99 % de los
casos de cáncer de cuello uterino y también se identifica que causan otros cánceres
anogenitales, así como carcinomas de cabeza y cuello (de Martel et al., 2020). Hasta el
momento se han identificado más de 200 tipos de VPH y, entre estos, el VPH16 y el
VPH18 de alto riesgo causan el 71 % de los casos de cáncer de cuello uterino en todo el
mundo. El cáncer de cuello uterino es el cuarto más
cáncer frecuente en mujeres con un estimado de 570 000 casos nuevos y 311 000 muertes
en 2018 (Bray et al., 2018).
La progresión de las infecciones persistentes por VPH hacia el desarrollo de un tumor
es una consecuencia desafortunada para el huésped, considerando que esto no tiene
ningún beneficio aparente para el virus. Al ser un virus de ADN pequeño de
aproximadamente 8 kilopares de bases en el tamaño del genoma, el VPH no codifica
polimerasas de ADN viral, sino que depende completamente de la maquinaria de replicación de laprogramada
célula huésped.
del ciclo celular. La progresión del ciclo celular activado por E7 da como
Un ciclo de vida productivo del VPH requiere inicialmente proliferación de células epiteliales
epidérmicas o mucosas, donde el ADN viral y las proteínas tempranas se mantienen en
niveles bajos en las células hijas (Doorbar et al., 2012; Harden y Munger, 2017). Cuando
las células pierden el potencial de proliferación y
diferenciarse, el ADN viral se amplifica a niveles muy altos junto con una mayor expresión
de genes tardíos (Doorbar et al., 2012). Las células epiteliales no infectadas detienen la
proliferación y experimentan una diferenciación terminal después de un cierto número de
divisiones celulares. Estas células están desprovistas de ADN.
replicación y, por lo tanto, no puede admitir la replicación de virus. Para contrarrestar este
problema, los VPH de alto riesgo codifican los dos oncogenes virales E6 y E7, que
prolongan la diferenciación de las células epiteliales y mantienen las células infectadas en
la fase de síntesis de ADN para que el virus utilice herramientas de replicación celular (Nar
isawa-Saito y Kiyono, 2007). En los VPH de alto riesgo, E6 y E7 se traducen a partir de un
transcrito bicistrónico mediante un promotor común (Johansson y Schwartz, 2013; Smotkin
et al., 1989; Smotkin y Wettstein, 1986).
La proteína E7 del VPH de alto riesgo interactúa con la proteína supresora de tumores
de retinoblastoma (pRb) y sus proteínas relacionadas p107 y p130 a través de un motivo
conservado Leu-X-Cys-X-Glu (LXCXE) y altera el complejo represor transcripcional Rb/E2F
(Chellappan et al., 1992; Dyson et al., 1989). Esto da como resultado la liberación y
activación de la familia E2F de factores de transcripción que inducen una progresión no
resultado la estabilización y acumulación de la proteína p53, lo que provoca la detención
del ciclo celular, la senescencia y la apoptosis (McLaughlin-Drubin y Münger, 2009). La
proteína E6 de los VPH de alto riesgo se dirige a la proteína p53 para la degradación
proteasómica al formar un

* Autor correspondiente.
Direcciones de correo electrónico: Raviteja.Inturi@imbim.uu.se (R. Inturi), Per.Jemth@imbim.uu.se (P. Jemth).
1
Dirección actual: Departamento de Bioquímica Médica y Microbiología, Universidad de Uppsala, BMC, Box 582, SE-75123 Uppsala, Suecia.

https://doi.org/10.1016/j.virol.2021.07.005 Recibido el 6
de mayo de 2021; Recibido en forma revisada el 2 de julio de 2021; Aceptado el 8 de julio de 2021
Disponible en Internet el 14 de julio de 2021
0042-6822/© 2021 El(los) autor(es). Publicado por Elsevier Inc. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Descargado para Alberto Iracheta Garza (a440236735@my.uvm.edu.mx) en ClinicalKey Spain Guest Users de ClinicalKey.es por Elsevier en
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complejo trimérico con proteína asociada a E6 (E6AP) (Huibregtse et al., 1991; Scheffner et al.,
1990). De esta forma, las proteínas E6 y E7 conspiran para inducir y mantener la transformación
celular al interferir con las proteínas p53 y pRb que controlan el ciclo celular, la senescencia y
la apoptosis (Dyson et al., 1989; McLaughlin-Drubin and Münger, 2009; Werness et al. ., 1990).
Debido a que las proteínas E6 y E7 son cruciales para la célula transformada, pueden explotarse
como objetivos terapéuticos potenciales para controlar los cánceres relacionados con el VPH.
La proteína E2 del HPV18 o del virus del papiloma bovino (BPV) se une a las regiones
reguladoras de los promotores virales E6/E7 y reprime la transcripción (Bernard et al., 1989;
Thierry y Yaniv, 1987). Como resultado, la expresión de la proteína HPV18 o BPV E2 puede
bloquear eficazmente la transcripción y expresión de HPV E6 y E7. Estudios previos sobre la
inactivación de E6 o E7 por interferencia de ARN o expresión de la proteína E2 de HPV18 o
BPV dieron como resultado la inducción de senescencia y/o apoptosis (DeFilippis et al., 2003;
Goodwin et al., 2000; Hall y Alexander, 2003; Pozos, 2000). Sin embargo, la aplicación de
métodos de interferencia de ARN o BPV E2 no ha estado disponible para el tratamiento clínico.
CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas)/Cas9 es
un método de edición de dsDNA en el que la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, guiada
por pequeños ARN, se puede utilizar para editar el ADN objetivo (Cong et al., 2013; Jinek et al.,
2012). ). Se ha informado que la inactivación de los genes E6 o E7 mediante la metodología
CRISPR/Cas9 induce la detención del crecimiento celular y la apoptosis, pero no la senescencia
(Hu et al., 2014; Jubair et al., 2019; Kennedy et al., 2014). Sin embargo, la aplicación de la
tecnología CRISPR/Cas9 para el tratamiento del cáncer de cuello uterino debe abordarse con
más detalle para una aplicación clínica exitosa.
Aquí investigamos el efecto CRISPR/Cas9 de la inactivación del oncogén del VPH en
células de cáncer de cuello uterino. Descubrimos que la inactivación específica de CRISPR/
Cas9 de las proteínas E6 o E7 de HPV18 producía un fenotipo similar a la senescencia en las
células de cáncer de cuello uterino. El fenotipo de senescencia en las células de cáncer de
cuello uterino se confirmó por el aumento del área de la superficie celular, el aumento de la
actividad de la ÿ-galactosidasa asociada a la senescencia y la pérdida de la proteína lamina B1.
Mostramos que la orientación CRISPR/Cas9 de HPV18 E6 resultó en la eliminación combinada
de las proteínas E6 y E7, lo que resultó en la activación de las vías p53 y pRb que condujeron
a la senescencia celular. Estas células senescentes carecen de marcadores apoptóticos y la
reintroducción de la proteína HPV18 E6 en las células senescentes disminuyó los niveles de
p53, lo que confirma la solidez del uso de CRISPR/Cas9 para eliminar HPV18 E6 o E7.
2. Materiales y métodos
2.1. plásmidos y construcciones
El plásmido de expresión de S. pyogenes Cas9 pX330-U6-Chimeric_BB CBh-hSpCas9
(PX459) (plásmido Addgene 62988) se digirió con BbsI y los gRNA dirigidos a los genes E6 o
E7 de HPV18 y HPV16 se diseñaron utilizando el kit de clonación NEBuilder® HiFi DNA
Assembly ( NUEVA INGLATERRA BioLabs). Brevemente, se diseñó un oligonucleótido de ADN
monocatenario de 71 nucleótidos que contenía una secuencia diana de 21 pares de bases
flanqueada por una secuencia promotora U6 parcial y una secuencia de ARN de armazón y se
adquirió de Integrated DNA technologies. El oligonucleótido ssDNA y el vector digerido con BbsI
se mezclaron con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix y se incubaron durante 1 h a 50
ÿC, seguido de la transformación en NEB® 5-alpha Competent E. coli (NEB#C2987).
Los ARN guía pequeños (ARNg) se diseñaron utilizando la herramienta en línea Benchling
(Software de biología 2019). Se diseñaron dos ARNg contra cada gen objetivo y se usaron dos
plásmidos de control en cada experimento. El plásmido px459 que expresa Cas9 solo se usó
como control primario común en todos los experimentos (Ctrl-1), mientras que el plásmido que
expresa Cas9 con gRNA contra HPV16 E6 o E7 se usó como control secundario en los
experimentos con células HeLa (Ctrl-2). En este estudio se utilizaron las siguientes secuencias
de ARNg: HPV18 E6-1 (TGGAAAAACTAACTAACACT), E6-2 (GTGCTGCAACCGAGCACGAC),
HPV18 E7-1 (ACGTTGTGGT TCGGCTCGTC), HPV18 E7-2 (CCCTGTCCTTTGTGTGTCCG),
HPV16 E6-1 utilizado como control ( TGCAGCTCTGTGCATAACTG), HPV16 E7-1 utilizado
como control (GCAAGTGTGACTCTACGCTT).
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Se usó un plásmido de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) como control para
la eficiencia de transfección y la selección de puromicina. Para generar E6 de HPV18 con
codones modificados, la secuencia de nucleótidos del gen E6 se cambió para el uso de codones
modificados mientras que la secuencia de aminoácidos original de la proteína E6 se mantuvo
intacta. El gen E6 de HPV18 modificado por codón fue sintetizado por GenScript Biotech (Países
Bajos) y el gen fue clonado en el vector pcDNA3.1.
2.2. Líneas celulares y transfección.
Las líneas celulares HeLa (CCL-2, RRID: CVCL_0030) obtenidas de la American Type
Culture Collection se cultivaron en DMEM complementado con suero bovino fetal inactivado por
calor al 10 % (v/v) y 100 unidades/ml de penicilina G y 100 ÿg/ml solución de estreptomicina
(Gibco) a 37 ÿC, 5% CO2.
Todos los experimentos se realizaron dentro del paso celular 7 al paso 17. Las células se
transfectaron usando el reactivo de transfección Turbofect (Thermo Scientific) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
2.3. Extracción y análisis de ADN
El ADN genómico de las células que expresan Cas9 se aisló utilizando un tampón de
extracción de ADN genómico (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, Triton X 100 al 0,2 % y
proteinasa K 200 ÿg/ml). El ADN extraído se amplificó por PCR utilizando cebadores dirigidos a
las regiones inicial y final de los genes HPV18 E6 o E7. Los productos de ADN purificados en
gel se sometieron a una reacción de clonación TA de acuerdo con las instrucciones del
fabricante, usando el kit de clonación TOPO TA para secuenciación (Invitrogen, 450030). Las
colonias se secuenciaron para el ADN que codifica E6 o E7 para confirmar las mutaciones
introducidas por CRISPR/Cas9. Se utilizaron cebadores dirigidos a las regiones inicial y final del
ADN de E6 o E7. Las mutaciones se confirmaron mediante alineación de secuencias con
muestras de ADN de control de HeLa.
2.4. Ensayo de ÿ-galactosidasa asociada a la senescencia
El ensayo de ÿ-gal asociado a la senescencia se realizó a partir de células transfectadas
seleccionadas con puromicina como se describió anteriormente (Debacq-Chai niaux et al.,
2009). Brevemente, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se fijaron
con solución de fijación (formaldehído al 2 % (v/v), aldehído glutárico al 0,2 % (v/v)) durante 5
min a temperatura ambiente. Se eliminó la solución de fijación y las células se lavaron
nuevamente dos veces con PBS. Solución de tinción (ácido cítrico 40 mM/ tampón Na2HPO4,
K4[Fe(CN)6] 3H2O 5 mM , K3[Fe(CN)6] 5 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 6H2O 2 mM y 5-Bromo-4-
cloro -3-indolil ÿ-D-galactósido o X-gal (Sigma, B4252, disuelto en dimetilformamida) como
solución madre de 1 mg/ml, se añadió a las placas y se incubó durante la noche a 37 ÿ C. Al día
siguiente, las placas se se lavaron dos veces con PBS, una vez con metanol y se secaron al
aire.Se tomaron imágenes de las células con un microscopio de contraste de fase (Microscopio
invertido Zeiss Axio Observer).
2.5. transferencia occidental
Las células que expresan Cas9 con o sin sus respectivos ARNg fueron seleccionadas
positivamente por diclorhidrato de puromicina (Sigma, P8833, disuelto en agua), utilizado a una
concentración final de 1 ÿg/ml en células HeLa durante 5 a 8 días, hasta que el control que
expresa gfp las células estaban completamente muertas. Como control positivo para la
apoptosis, las células HeLa se trataron con estaurosporina (Sigma, S4400, disuelta en DMSO)
utilizada en concentraciones finales de 0,4 ÿM y 0,8 ÿM. Las células se lisaron en tampón que
contenía Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %,
SDS al 0,1 %, suplementado con inhibidor de proteasa (Complete Mini EDTA-free, Roche
Applied Sciences) y cóctel inhibidor de fosfatasa (ThermoFisher, 78440). Los lisados se
incubaron en hielo durante 20 min, se sonicaron y se aclararon mediante centrifugación a
máxima velocidad durante 10 min, 4 ÿC (Inturi et al., 2017). Los sobrenadantes se cuantificaron
mediante el ensayo de Bradford y se sometieron a electroforesis utilizando geles de gradiente
caseros al 8%-15% o al 8%-18%. Las proteínas separadas se transfirieron
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a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 ÿm (Amersham Protran, GE Life Sciences) utilizando el
método de transferencia húmeda durante 2 h a 200 mA, 4 ÿC. Todas las membranas se bloquearon
utilizando tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR) a temperatura ambiente durante 1 hora. Todos los
anticuerpos primarios, incubados durante la noche a 4 ÿC y los anticuerpos secundarios IRDye (LI-
COR), incubados a temperatura ambiente durante 30 min, se diluyeron en tampón de bloqueo
Odyssey. La membrana se lavó tres veces en PBS con tween 20 al 0,05% antes y después de la
incubación con anticuerpos secundarios IRDye. Se obtuvieron imágenes de las membranas con el
escáner Odyssey (LI-COR) y se cuantificaron con el software Image Studio, versión 5.2.5 (LI-COR).
Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio son GAPDH anti-conejo (Santa Cruz;
sc-47724), GAPDH anti-ratón (Ambion; Am4300), HPV18 E6 anti-ratón (Arbor Vita Corporation;
AVC399), HPV18 E7 anti-ratón (Santa Cruz; sc-365035), anti-ratón Flag (Sigma; M2, F1804), anti-
ratón p53 (Santa Cruz; DO-1, sc-126), anti-rabbit p21 (Cell Signaling; 2947), anti-ratón fosfo -Rb
(Santa Cruz; sc-271930), PARP anti-conejo (Gene Tex; GTX100573), Caspase 3 anti-conejo (Gene
Tex; GTX110543), Actina anti-cabra (Santa Cruz; sc-1616) Rb anti-ratón (Tecnología de señalización
celular; 9309T), fosfo-Rb anti-conejo (Tecnología de señalización celular; 8516T).
2.6. Inmunofluorescencia y cuantificación
La microscopía de inmunofluorescencia se realizó como se describió anteriormente (Inturi et
al., 2013). En resumen, las células cultivadas en cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4 %
durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,1 %
durante 15 min. Las células se lavaron tres veces con BSA al 2 % en PBS complementado con
Tween 20 al 0,1 % (PBST) y se bloquearon con BSA/PBST durante 1 hora a temperatura ambiente.
A continuación, las células se incubaron con anticuerpos primarios: anti-lamin B1 de conejo (Abcam;
ab16048), anti- ÿ-tubulina de ratón (Santa Cruz; sc-69969), diluidos en BSA/PBST durante la noche
a 4 ÿC. Al día siguiente, se agregaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (Life
Technologies) después de tres lavados con solución BSA/PBST. Las células se incubaron con
anticuerpos secundarios en BSA/PBST durante 1 h a temperatura ambiente y luego se lavaron tres
veces con BSA/PBST. El ADN se marcó mediante la incubación de las células con solución DAPI
(Sigma, D9542, disuelta en dimetilformamida) a una concentración de trabajo de 300 nM en PBS
durante 3 min y se lavó tres veces con PBS. Luego, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos
con ProLong Diamond Antifade Mountant (Life Technologies) y se tomaron imágenes usando un
microscopio Nikon eclipse 90i. La cuantificación de la intensidad de la señal y las mediciones de las
células se realizaron con el software NIS-elements AR (Nikon).
3. Resultados
3.1. La interrupción de CRSIPR/ Cas9 de los genes E6 o E7 de HPV18 da como resultado
la inactivación de las proteínas E6 o E7
Para estudiar el efecto de la interrupción basada en CRISPR/Cas9 de los genes que codifican
HPV18 E6 o E7, respectivamente, en líneas celulares de cáncer HeLa, diseñamos dos ARNg contra
cada región codificante. Los ARNg se expresaron constitutivamente utilizando un vector PX459 que
porta el gen Cas9 y un casete de resistencia a la puromicina (Ran et al., 2013). A lo largo del estudio,
usamos el vector PX459 que expresa Cas9 (sin gRNA) con resistencia a la puromicina como control
común (Ctrl-1) y como control de especificidad usamos un vector PX459 que expresa gRNA dirigidos
a los genes HPV16 E6 o E7 (E6Ctrl-2 o E7Ctrl-2) en células HeLa positivas para HPV18. Por lo
tanto, la expresión de Cas9 sola o Cas9 con ARNg dirigidos contra los genes E6 o E7 de HPV16 no
debería actuar sobre E6 o E7 de HPV18 dentro de las células HeLa debido a la diferencia de
secuencia entre los genes E6 y E7 de HPV16 y HPV18. Las células HeLa seleccionadas con
puromicina se dividieron en dos porciones, una porción se usó para el análisis de proteínas y la otra
para la extracción de ADN.
De este modo, podríamos correlacionar la inactivación de la proteína con la escisión del ADN.
Las células HeLa se analizaron para detectar la inactivación de las proteínas E6 o E7 mediante
la extracción de lisados de proteínas de células completas de puromicina seleccionada
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Células que expresan CRISPR/Cas9 con gRNA contra las regiones E6 o E7 de los tipos HPV18 y
HPV16. Como se muestra en la Fig. 1A y C, el análisis de transferencia Western usando anticuerpos
contra las proteínas E6 o E7 de HPV18 confirmó la inactivación eficiente de las proteínas E6 o E7
en lisados con ARNg específicos de HPV18. Los lisados de proteínas que expresan Cas9 sin gRNA
o con gRNA no específico fueron positivos para las proteínas E6 o E7 endógenas, lo que confirma
la especificidad de la desactivación de CRISPR/Cas9. La intensidad de las proteínas E6 o E7
endógenas de al menos cuatro experimentos diferentes se normalizó a niveles de GAPDH y se
comparó con Ctrl-1 como estándar (Fig. 1B y D). Para validar si la desactivación de las proteínas E6
o E7 en las células HeLa se debió a la escisión CRISPR/Cas9 del ADN endógeno en las regiones
E6 o E7 predichas, aislamos el ADN genómico de la porción de células utilizadas para el análisis de
proteínas y secuenciamos las regiones que codifican E6 o E7. Se predijo que la enzima Cas9
cortaría de 3 a 4 pb aguas arriba de la secuencia PAM de la región E6 o E7 (Jinek et al., 2012; Ran
et al., 2013). Por lo tanto, diseñamos cebadores al principio y al final de los genes E6 y E7 para
detectar inserciones o deleciones. Las mutaciones presentadas (Fig. 1E) solo representan una parte
de las posibles indeles causadas por la escisión de Cas9 de clones de células individuales.
Descubrimos que los sitios de escisión CRISPR/Cas9 previstos dentro de las regiones E6 o E7
contenían inserciones o deleciones que interrumpían la expresión funcional de la proteína E6 o E7.
Los clones analizados de células que expresan ARNg E6 de HPV18 contenían tres secuencias con
mutaciones de deleción y una secuencia con una inserción que resultó en una mutación de cambio
de marco (Fig. 1E). Los clones analizados de células que expresan ARNg E7 de HPV18 contenían
mutaciones de deleción y una secuencia con una inserción. En conjunto, mostramos que la escisión
CRISPR/Cas9 específica del sitio eliminó de manera eficiente las proteínas E6 o E7 endógenas de
las células HPV18 HeLa (Fig. 1E).
Las células HeLa desprovistas de proteínas E6 o E7 exhiben senescencia asociada
Actividad de ÿ-galactosidasa y morfología celular alterada.
Para generar poblaciones de células individuales homogéneas con expresión de CRISPR/Cas9,
las células HeLa se transfectaron con plásmidos que expresaban ARNg y Cas9 durante 40 h y luego
se seleccionaron en puromicina durante más de 4 días para eliminar las células no transfectadas.
Cuando se observaron bajo el microscopio óptico, las células seleccionadas con puromicina con
gRNA contra HPV18 E6 o E7 aparecieron agrandadas con una morfología distinta, mientras que las
células de control con Cas9 solo o con gRNA de HPV16 inespecíficos formaron colonias individuales
compactas en crecimiento activo (Fig. 2A). Las células seleccionadas con puromicina transfectadas
con ARNg E6 o E7 de HPV18 no lograron formar colonias individuales, detuvieron la proliferación
celular y mostraron una morfología celular alterada. Se sabe que las células senescentes exhiben
características distintas, como células alteradas.
morfología y niveles elevados de actividad de ÿ-galactosi dasa endógena lisosomal detectable a pH
6,0 en comparación con las células en crecimiento normales (Hernandez-Segura et al., 2018). Para
probar la senescencia, realizamos un ensayo de ÿ-galactosidasa en células tratadas con CRISPR/
Cas9. Las células knockout E6 o E7 morfológicamente alteradas exhibieron una mayor tinción azul,
lo que confirmó la actividad de ÿ-galactosidasa asociada a la senescencia (Fig. 2B). Las células
HeLa de control crecieron como colonias compactas y se tiñeron negativamente para la actividad de
ÿ-galactosidasa (Fig. 2B). En resumen, la inactivación específica de los genes E6 o E7 por CRISPR/
Cas9 dio como resultado una mayor actividad de la ÿ-galactosidasa lisosomal y una morfología
celular alterada, consistente con la senescencia.
Las células HeLa inactivadas con HPV18 E6 o E7 muestran un área de superficie celular y
nuclear aumentada y pérdida de lamina B1.
El cuerpo celular agrandado y la forma irregular debido a los reordenamientos en el citoesqueleto
se consideran una de las características distintivas de las células senescentes (Hernandez-Segura
et al., 2018). En consonancia con eso, las células inactivadas HeLa E6 o E7 aumentaron de tamaño
de manera detectable y tenían un área de superficie mayor que las células de control. Para estudiar
el alcance de los cambios en el tamaño y la morfología, medimos el área de superficie celular y el
área de superficie del núcleo celular después de realizar una microscopía de inmunofluorescencia.
Las células que expresan Cas9 con gRNA contra E6 o E7 junto con gRNA de control se
permeabilizaron, fijaron y analizaron para ÿ-tubulina como marcador citoplasmático y tinción DAPI
para los límites del núcleo (Fig. 3A y B). Mediante el uso del software de imágenes Nikon NIS
Elements, las células individuales se seleccionaron manualmente para las mediciones del área de
superficie. La superficie total
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las medidas de las células y del núcleo se trazaron por separado (Fig. 3C y D). El área
de superficie total de las células HeLa inactivadas con E6 o E7 parecía 4 veces mayor
en comparación con las células de control que expresaban Cas9 solo o con ARNg de
E6 o E7 de HPV16 (Fig. 3C). Además, el área de la superficie del núcleo de las células
positivas para la senescencia aumentó más de 2 veces en comparación con las células
HeLa de control (Fig. 3D). El fenotipo asociado a la senescencia en las células es
variable y heterogéneo, y no existe un único marcador universal para detectar la
senescencia. Con el aumento de la complejidad de los fenotipos asociados a la
senescencia, es fundamental utilizar más de dos marcadores y una combinación de
métodos para confirmar la senescencia en las células. Por lo tanto, para validar aún más
el fenotipo senescente, investigamos los cambios en la proteína de la envoltura nuclear,
lamin B1 (Fig. 3B)
(Freund et al., 2012). Se usaron anticuerpos contra lamin B1 para detectar señales
específicas de células que expresan CRISPR/Cas9 y la señal media
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Fig. 1. Inactivación de la proteína E6 o E7 de HPV18
como resultado de la escisión específica de Cas9
en los sitios previstos del genoma de HPV. (A)
Análisis de transferencia Western de células HeLa
seleccionadas con puromicina que expresan Cas9
(Ctrl-1), Cas9 con gRNA específicos de E6 de
HPV18 (E6gRNA-1 y E6gRNA 2) y Cas9 con gRNA
específicos de E6 de HPV16 (Ctrl-2). La transferencia
se sondeó en busca de anticuerpos contra HPV18
E6 y GAPDH. Se muestra una imagen representativa
de cuatro experimentos independientes. (B)
Cuantificación de la intensidad de la señal HPV18
E6 normalizada con GAPDH y comparada con
Ctrl-1. (C) Las células HeLa que expresan Cas9
(Ctrl-1), Cas9 con gRNA específicos de HPV18 E7
(E7gRNA-1 y E7gRNA 2) y Cas9 con gRNA
específicos de HPV16 E7 (Ctrl-2) se analizaron
mediante transferencia Western. La transferencia se
sondeó en busca de anticuerpos contra HPV18 E7
y GAPDH. Se muestra una imagen representativa de cuatro experi
Cuantificación de la intensidad de la señal HPV18
E7 normalizada con GAPDH y comparada con Ctrl-1.
Las barras de error representan valores medios con
desviación estándar; *P < 0.05, **P <
0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, se usó la prueba
t de Student de dos colas para evaluar la significación
estadística. (E) Alineación de secuencias de ADN
de secuencias E6 o E7 de HPV18 recuperadas de
células HeLa tratadas con Cas9
y los gRNA respectivos como se indica. El motivo
adyacente al protoespaciador (PAM) se indica en
negrita y las letras rojas en negrita indican las
inserciones de nucleótidos.
la intensidad se cuantificó utilizando el software de imágenes Nikon NIS Elements (Fig.
3B y E). La intensidad media de la lámina B1 cuantificada se representó gráficamente y
se muestra en la Fig. 3E. Como es evidente a partir de la cuantificación, las células HeLa
knockout E6 o E7 exhibieron niveles reducidos de lamin B1 en relación con
control de células HeLa tratadas (Fig. 3E). En conjunto, estos resultados confirman la
senescencia celular en células HeLa inactivadas con E6 o E7.
3.2. La señalización de p53 y pRb se activa en las células knockout de HPV18 E6
El papel significativo de la proteína E6 de HPV18 es promover la degradación
proteosomal de la proteína p53 mediante el reclutamiento de la ligasa de ubiquitina E3
E6AP (Huibregtse et al., 1991; Scheffner et al., 1990). La expresión continua de proteína
E6 en células HeLa da como resultado una disminución de los niveles de proteína p53
endógena. Por lo tanto, la desactivación mediada por CRISPR/Cas9 de
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Fig. 2. Las células HeLa inactivadas con HPV18 E6 o E7 muestran un fenotipo de senescencia. (A) y (B) Imágenes microscópicas de luz que muestran una morfología alterada y un ensayo
de ÿ-galactosidasa asociado a la senescencia de células HeLa que expresan Cas9 (Ctrl-1), Cas9 con gRNA específicos de 18E6 (E6gRNA-1, E6gRNA-2) o gRNA específicos de 18E7
(E7gRNA-1, E7gRNA-2) y Cas9 con células HeLa tratadas con gRNA específico 16E6 o 16E7 (Ctrl-2). Barra de escala 100 ÿm. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos
independientes.

la proteína E6 endógena activaría las vías de señalización de p53. Para probar esto,
se prepararon lisados de proteínas de células enteras de células knockout para E6
de HPV18 y se analizaron las proteínas p53 y p21 endógenas. Como se esperaba,
los niveles endógenos de proteína p53 y p21 se restauraron en células expresadas
con ARNg E6 de HPV18 (Fig. 4A-C). La expresión de la proteína Cas9 en las células
seleccionadas con puromicina se verificó mediante el uso de un anticuerpo anti-
Flag, que detecta la proteína Flag-Cas9. En las células de control, las señales de
las proteínas p53 y p21 permanecieron más bajas, lo que confirma la presencia de
la proteína E6 de HPV18 endógena activa (Fig. 4A-C). La inactivación de HPV18 E6
restauró los niveles de proteína p53 dando como resultado la expresión activada de p21 de HPV18 E6 por CRISPR/Cas9 en células HeLa podría a su vez disminuir la expresión de
señalización aguas abajo que podría conducir a la senescencia celular.
Dado que HPV18 E6 y E7 se expresan a partir de un ARNm bicistrónico con un
promotor común, la interrupción de E6 puede afectar la expresión de E7 (Tang et
al., 2006). Para investigar el efecto de la desactivación de HPV18 E6 CRISPR/Cas9
en HPV18 E7, analizamos los lisados de desactivación de E6 mediante transferencia
de Western y sondeamos el anticuerpo HPV18 E7. Observamos la inactivación
completa de la proteína E7 de HPV18 en las células inactivadas de E6 de HPV18
en comparación con las células de control en las que los niveles de proteína E6 y
E7 permanecieron inalterados (Fig. 4D). Este resultado muestra que la interrupción

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Fig. 3. Las células HPV18 E6 o E7 inactivadas son positivas para marcadores de senescencia. (A) y (B) Microscopía de inmunofluorescencia indirecta de células HeLa que expresan
Cas9 (Ctrl-1), Cas9 con gRNA específicos de 18E6 (E6gRNA-1, E6gRNA-2) o gRNA específicos de 18E7 (E7gRNA-1, E7gRNA-2), y Cas9 con ARNg de HPV16E6 o E7 no específicos
(Ctrl-2). Se muestran de izquierda a derecha el núcleo teñido con DAPI, el citoplasma teñido con tubulina junto con la lámina B1 y la combinación de imágenes. Se muestra una imagen
representativa de tres experimentos independientes. Barra de escala 20 ÿm. (C) Las medidas del área de la superficie celular de las células teñidas con tubulina del panel B y C trazadas
para el experimento respectivo. Se mostraron los valores medios de tres experimentos independientes. El eje Y está en escala log2. (D) Mediciones cuantitativas del área de superficie
del núcleo celular de células teñidas con DAPI del panel B. Se mostraron los valores medios de tres experimentos independientes. El eje Y está en escala log2. (E) La señal de lamin
B1 de las células HeLa en el panel B y C se cuantificó a partir de tres experimentos independientes y se muestran los valores medios de cada experimento. Las barras de error indican
valores medios con desviación estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, se utilizó un análisis de varianza anidado (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple
de Turquía para evaluar la significación estadística.

HPV18 E7 (Fig. 4D). Para confirmar el efecto de la desactivación de E7 en las células
de desactivación de E6, analizamos los niveles de pRb y phospo-Rb mediante
transferencia Western. Como se esperaba, los niveles endógenos de Rb aumentaron y
los niveles de fosfo-Rb disminuyeron en las células inactivadas E6 y E7 (Fig. 4D-F).
Las células tratadas con el control mostraron niveles reducidos de Rb y niveles
aumentados de fosfo-Rb debido a las proteínas HPV18 E6 y E7 funcionales (Fig. 4D-
F). Tomados en conjunto, mostramos que la orientación individual de HPV18 E6 por
dos GuideRNA diferentes resultó en la eliminación combinada de las proteínas E6 y E7
con la activación de las vías de señalización p53 y pRb que conducen
a la senescencia.
3.3. La señalización pRb/ p21 se activa en las células knockout HPV18 E7
La proteína HPV18 E7 se une a la proteína supresora de tumores pRb y
por lo tanto interrumpe la represión transcripcional Rb/E2F. Además, se ha demostrado
que la proteína HPV16 E7 desestabiliza y degrada las proteínas de la familia Rb (Boyer
et al., 1996; Gonzalez et al., 2001). En combinación con la interrupción del complejo
Rb/E2F, las proteínas E7 del VPH de alto riesgo pueden interactuar directamente e
inactivar las proteínas p21 y p27 para mantener la proliferación celular (Funk et al.,
1997; Jones et al., 1999). Por lo tanto, la desactivación de la proteína HPV18 E7 podría
desestabilizar el pRb y, por lo tanto, disminuir los niveles de pRb fosforilados en las
células. El análisis de transferencia Western de los lisados de células HeLa inactivadas
con E7 de HPV18 demostró que los niveles de proteína pRb endógena aumentan en
comparación con las células HeLa tratadas con control (Fig. 5A y B). Además, las
proteínas pRb mostraron una fosforilación drásticamente reducida en las células
knockout E7 de HPV18 en comparación con las células de control (Fig. 5A y C). La
inactivación de la proteína E7 se correlaciona con la disminución de la pRb inactiva, lo
que podría relacionarse con la Rb hipofosforilada.

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Fig. 4. La inactivación de E6 de HPV18 restaura las vías supresoras de tumores p53 y pRb. (A) Las células HeLa que expresan solo Cas9 (Ctrl-1), Cas9 con 18 ARNg específicos de E6
(E6gRNA 1 y E6gRNA-2) y Cas9 con ARNg no específico (Ctrl-2) se analizaron mediante transferencia Western. La transferencia se sondeó para detectar la proteína Cas9 etiquetada con
Flag, p53, p21, HPV18 E6 y GAPDH. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. Se realizó la cuantificación de los niveles endógenos de p53 y p21 y se
trazaron las intensidades relativas para el experimento respectivo en el panel (B) y (C). (D) Análisis de transferencia Western de lisados de proteínas de células tratadas de manera similar
como se explica en el panel (A). La transferencia se sondeó para detectar HPV18 E6, HPV18 E7, pRb y actina. Los lisados se volvieron a procesar para detectar fosfo-Rb y actina. Se
trazaron las intensidades relativas de (B) p53, (C) p21 (E) pRb y (F) fosfo-Rb. Las barras de error representan valores medios con desviación estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001,
****P < 0,0001, se usó la prueba t de Student de dos colas para evaluar la significación estadística.

disponible para unirse a E2F, lo que resulta en la detención del ciclo celular. Los niveles
endógenos de proteína p53 en células knockout E7 de HPV18 permanecieron
relativamente sin cambios (Fig. 5D y E), pero los niveles de p21 fueron elevados en
comparación con las células de control (Fig. 5D y F). El aumento independiente de p53
en la expresión de p21 podría deberse al efecto directo de la proteína E7 sobre la
expresión de la proteína p21. Los niveles alterados de pRb en combinación con el
aumento de la expresión de p21 pueden dar como resultado la senescencia celular en
las células HeLa inactivadas para E7 (Fang et al., 1999). Dada la traducción de HPV18
E6 y E7 de las transcripciones bicistrónicas, investigamos el efecto de la inactivación
de E7 mediada por CRISPR/Cas9 en la expresión de E6 mediante la prueba de los
niveles de proteína E6 en las células inactivadas de E7. Como se muestra en la Fig.
5A, los niveles de proteína E6 se redujeron en las células knockout para E7 en
comparación con las células tratadas con control, pero aparentemente no lo suficiente
como para afectar los niveles de p53. En conjunto, pudimos demostrar que la
desactivación de los niveles de proteína HPV18 E6 o HPV18 E7 en las células HeLa
puede afectar la expresión combinada de HPV18 E6 y HPV18 E7, restaurar la señalización endógena
y Münger,
de2002).
p53/p21
senectud.
resultado. Por lo tanto, probamos si las células HPV18 E6 o E7 inactivadas con CRISPR/
Cas9 que mostraban senescencia (Figs. 2 y 3) también mostraban firmas de apoptosis.
Como control positivo para los marcadores apoptóticos, tratamos las células HeLa con
estaurosporina a concentraciones crecientes y recolectamos los lisados de proteínas.
Los lisados de proteínas se sometieron a análisis de transferencia Western y se
probaron marcadores apoptóticos usando anticuerpos contra PARP1 y caspasa-3, que
se escinden para activar la apoptosis (Kaufmann et al., 1993; Nicholson et al., 1995).
Los lisados celulares tratados con estaurosporina mostraron niveles aumentados de
fragmentos de PARP y niveles reducidos de PARP de longitud completa (Fig. 6A y C).
No observamos ningún producto de escisión de PARP o caspasa-3 en los lisados de
células knockout HPV18 E6 o HPV18 E7 (Fig. 6A-D). En el caso de las células
inactivadas para E6 de HPV18, notamos una disminución total en los niveles de PARP
y caspasa-3 en comparación con las células inactivadas para E7 de HPV18 y las células
de control (Fig. 6A y C). Se ha informado previamente que la expresión de proteínas E6
y E7 de HPV16 en células de prepucio neonatal mejora la expresión de PARP (Duensing
Deyacuerdo
pRb/p21con
para
este
inducir
informe, la eliminación de las proteínas HPV18
E6 o E7 podría resultar en una disminución de PARP. Se ha informado que los
fibroblastos senescentes resisten la apoptosis al regular a la baja la caspasa-3 (Marcotte

3.4. Los marcadores apoptóticos están ausentes en las células senescentes HPV18 E6 o E7
et al., 2004). De manera similar, notamos que las células senescentes de HPV18 E6 o
knockout E7 tienen niveles reducidos de caspasa-3 en comparación con las células de control.
Cuando se sondearon los niveles de proteína E7 de HPV18, observamos una

Estudios previos sobre la aplicación CRISPR/Cas9 para la inactivación de HPV18 disminución de los niveles de proteína E7 endógena en los lisados tratados con

E6 o E7 informaron apoptosis en lugar de senescencia aguas abajo

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Fig. 5. La eliminación de HPV18 E7 restaura la vía supresora de tumores pRb. (A) Las células HeLa que expresan solo Cas9 (Ctrl-1), Cas9 con 18 ARNg específicos de E7 (E7gRNA-1 y
E7gRNA-2) y Cas9 con ARNg no específico (Ctrl-2) se analizaron mediante transferencia Western. La transferencia se sondeó para detectar HPV18 E7, HPV18 E6, pRb y actina. Los
lisados se volvieron a procesar para detectar Rb fosforilado (fospo-Rb) y GAPDH. Se realizó la cuantificación de los niveles endógenos de pRb y fospo-Rb y se trazaron las intensidades
relativas para el experimento respectivo en el panel (B) y (C). (D) Análisis de transferencia Western de lisados de proteínas de células tratadas de manera similar como se explica en el
panel (A) la transferencia se evaluó en busca de anticuerpos contra Flag-Cas9, p53, p21, HPV18 E7 y GAPDH. Se trazaron las intensidades relativas de (B) pRb, (C) fosfo-Rb (E) p53 y (F) p21.
Las barras de error representan valores medios con desviación estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, se usó la prueba t de Student de dos colas para evaluar la
significación estadística, ns indica que no es significativa.

estaurosporina mientras que las células de control conservaron niveles normales de proteína E7 4. Discusión

(Fig. 6C). Los niveles endógenos de E6 de HPV18 permanecieron inalterados con el tratamiento
con estaurosporina (Fig. 6A). En conclusión, las células knockout E6 o E7 de HPV18 fueron La expresión continua de los oncogenes E6 y E7 del VPH de alto riesgo es esencial para el
negativas para los marcadores característicos de apoptosis. mantenimiento y la supervivencia de las células de cáncer de cuello uterino (McLaughlin-Drubin

y Münger, 2009; Vande Pol y Klingelhutz, 2013). Las células de cáncer de cuello uterino son
"adictas a los oncogenes virales", lo que significa que cualquier interrupción de estos oncogenes
3.5. La reintroducción de la proteína HPV18 E6 en células senescentes disminuye los niveles
de p53 es perjudicial para las células. En la actualidad, las opciones de tratamiento como la cirugía, la
radioterapia, la quimioterapia, la terapia dirigida y la inmunoterapia están disponibles para los
cánceres inducidos por el VPH. A pesar de estas opciones de tratamiento, el riesgo de
Para confirmar el efecto específico de la eliminación de HPV18 E6 por CRISPR/Cas9,
recurrencia debido a una infección persistente compromete las posibilidades de curación. Por lo
volvimos a introducir la proteína HPV18 E6 en células senescentes de HPV18 E6 knockout. La
tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar opciones de tratamiento para tratar los
represión de los niveles de proteína E6 endógena dio como resultado niveles de p53 endógenos
cánceres relacionados con el VPH y las infecciones persistentes. Con los avances recientes en
mejorados (Fig. 7). Al mismo tiempo, la introducción de HPV18 E6 exógeno en células
la tecnología de edición de ADN, CRISPR/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta
senescentes inducidas por ARNg E6 redujo los niveles endógenos totales de p53 (Fig. 7). La
de edición del genoma con precisión y especificidad (Pal y Kundu, 2020).
alteración de la expresión de p53 endógena con la inactivación y reintroducción de la proteína
E6 de HPV18 se correlacionó con la expresión de la proteína p21 endógena en estas células.
Usando el sistema de expresión CRISPR/Cas9, eliminamos específicamente las regiones E6 o
Las células senescentes HPV18 E6 no reanudaron el crecimiento después de la expresión de
E7 integradas de las células cancerosas HeLa inducidas por HPV18, lo que resultó en la
HPV18 E6 exógeno, sino que sufrieron muerte celular. El cambio de los niveles de p53 con
senescencia celular y detuvo la proliferación celular.
respecto a los niveles de proteína E6 confirma la solidez del sistema CRISPR/Cas9 para la
La integración de las regiones E6 y E7 dentro de la célula huésped en combinación con
inactivación específica de HPV18 E6.
factores de riesgo no virales facilitan la progresión de las infecciones por VPH a

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Fig. 6. Las células HeLa senescentes no sufren apoptosis. (A) Los lisados de células HeLa senescentes eliminados para la proteína E6 de HPV18 se analizaron mediante transferencia Western.
La transferencia se sondeó en busca de marcadores apoptóticos para detectar proteínas PARP, PARP escindida, caspasa-3 y caspasa-3 escindida. Las células HeLa tratadas con estaurosporina
(Sts) a concentraciones finales de 0,4 ÿM y 0,8 ÿM se usaron como control positivo para la apoptosis. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. (B) La PARP1
escindida y la intensidad de la banda de caspasa-3 escindida de las células inactivadas E6 de HPV18 se normalizaron frente a GAPDH y las intensidades de banda medias se trazaron para el
experimento respectivo. (C) Los lisados de células HeLa senescentes eliminados para la proteína E7 de HPV18 se analizaron mediante transferencia Western. La transferencia se probó de la
misma manera que se explica en el panel A. (D) La intensidad de la banda de PARP1 escindida y de la caspasa-3 escindida de las células knockout E7 de HPV18 se normalizó con GAPDH y las
intensidades de banda medias se trazaron para el experimento respectivo.

cáncer invasivo (Moody y Laimins, 2010). Un trabajo reciente ha demostrado que
la inactivación de los genes E6 o E7 del VPH de alto riesgo mediante sistemas
CRISPR/Cas9 restauró las redes p53 y pRb, lo que resultó en la inducción de la
detención del ciclo celular y la apoptosis como resultado final (Hu et al., 2014;
Jubair et al. ., 2019; Kennedy et al., 2014). Los estudios de Jubair et al. indicaron
que la administración sistémica de Cas9/ARNg en liposomas contra tumores de
células HPV16 E7 Caski y células HeLa en ratones eliminó los tumores por
apoptosis (Jubair et al., 2019). De manera similar, la transducción lentiviral de Cas9/
gRNA contra los genes E6 o E7 del VPH 18 durante un período de 10 días indujo
la muerte celular en células HeLa (Kennedy et al., 2014). De acuerdo con estos dos
estudios, transfectamos el plásmido que expresa Cas9/gRNA para apuntar a los
genes HPV18 E6 o HPV18 E7 y seleccionamos positivamente las células
transfectadas usando pu romicina. Dentro de los 4 a 6 días de la selección, notamos
células senescentes con morfología agrandada en lugar de colonias compactas
como en las células tratadas de control (Figs. 2 y 3). Dado que los estudios CRISPR/
Cas9 anteriores sobre los oncogenes del VPH18 no informaron la senescencia ni
analizaron los marcadores de senescencia, es difícil excluir la senescencia como
resultado potencial. Aunque se desconocen los mecanismos exactos que determinan
los destinos celulares, como la apoptosis o la senescencia, las diferencias en los
resultados alternativos podrían atribuirse a la extensión del daño celular y al modo
de administración. En el caso de la administración sistémica de Cas9/gRNA en
liposomas, los injertos xe de células HeLa requirieron siete tratamientos para la
eliminación en comparación con tres tratamientos en células CasKi (Jubair et al.,
2019). En el estudio de transducción lentiviral, las células HeLa se transdujeron a
un MOI de ~37 para inducir la muerte celular (Kennedy et al., 2014). En nuestro
presente estudio, empleamos transfección transitoria para la expresión de CRISPR/
Cas9 y puromicina para la selección positiva. En base a esto, planteamos la
hipótesis de que la escisión del ADN mediada por Cas9 por transfección y selección
de puromicina podría no ser un insulto suficiente para que la célula induzca la
apoptosis y, por lo tanto, dé como resultado la senescencia. Nuestra hipótesis se
basa en informes anteriores que confirman que los agentes que dañan el ADN, como la doxorrubicina, pueden inducir la senescencia a niveles bajos.
dosis y apoptosis a dosis altas (Soto-Gamez et al., 2019; Spallarossa et al., 2009).
Los niveles de expresión de Cas9 también juegan un papel importante en la
determinación del fenotipo celular (Fu et al., 2013). Por ejemplo, una mayor
expresión de Cas9 podría dar como resultado efectos fuera del objetivo y una
escisión de ADN no específica. La extensión del daño inducido en el ADN podría
resultar potencialmente en apoptosis o senescencia (Fu et al., 2013; Pattanayak et
al., 2013).
Antes de la llegada de la tecnología CRISPR/Cas9, la inactivación del oncogén
del VPH se lograba mediante la expresión de la proteína E2 del virus del papiloma
humano o bovino, un regulador negativo de E6 y E7 codificado por el virus, o
mediante la interferencia de ARN (ARNi). La inhibición de la expresión de E6 y E7
en células de cáncer de cuello uterino por la proteína E2 o RNAi resultó en la
detención del ciclo celular con senescencia (Goodwin et al., 2000; Hall y Alexander,
2003; Wells, 2000) o apoptosis como punto final (DeFilippis et al. ., 2003). Se
informó que la inducción de la senescencia se debe a la activación de vías
supresoras de tumores latentes, como las vías p53 y pRb reprimidas por E6 y E7,
respectivamente (Goodwin et al., 2000; Goodwin y DiMaio, 2000). De acuerdo con
los estudios mencionados anteriormente, pudimos demostrar con éxito que la
eliminación de CRISPR/Cas9 de los genes E6 o E7 de HPV18 puede inducir la
senescencia celular en las células HeLa (Figs. 2 y 3). E6 y E7 se traducen de la
transcripción bicistrónica y pudimos demostrar que la interrupción de HPV18 E6 en
las células HeLa podría afectar la expresión de HPV18 E7 y viceversa (Figs. 4 y 5).
Por lo tanto, la orientación CRISPR/Cas9 de HPV18 E6 dio como resultado la
desactivación combinada de las proteínas E6 y E7 de las células HeLa, activando
así las vías p53 y pRb respectivamente. La proteína p21 es uno de los mediadores
clave de la senescencia inducida por la terapia y la alta expresión de la proteína
p21 a menudo se asocia con la senescencia (Fang et al., 1999; Georgakilas et al.,
2017). Con la eliminación de las proteínas HPV18 E6 o E7, observamos el aumento
en los niveles de p21 tanto en entornos dependientes de p53 como independientes
de p53 que conducen a la senescencia (Figs. 4 y 5).

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Fig. 7. Reintroducción de HPV18 E6 en células HeLa senescentes. Las células
senescentes HPV18 E6 knock out se transfectaron con plásmido que expresa 18E6
modificado por codón o plásmido vacío seguido de análisis de transferencia Western.
La transferencia se sondeó en busca de anticuerpos contra p53, p21, proteína E6 de
HPV18 y actina. Se muestra una imagen representativa de dos experimentos
independientes. (B) La señal media de p53 de dos experimentos independientes se
normalizó con actina de control de carga y se trazó la intensidad relativa de p53 con
Ctrl-1 para el experimento respectivo.
La senescencia celular, al igual que la apoptosis, parece actuar como un mecanismo de
defensa contra los virus. La expresión de las proteínas HPV18 E6 y E7 previene la senescencia
en células diferenciadas terminalmente como los queratinocitos, que si no se transforman
experimentan senescencia replicativa. Por lo tanto, es razonable que la inactivación de los genes
HPV18 E6 o HPV18 E7 pueda resultar en senescencia. Otra explicación para la inducción de la
senescencia en las células cancerosas VPH positivas tras la represión de E6 y/o E7 podría ser
la activación de la vía de señalización de mTOR. Este modelo sugiere que la activación continua
de la señalización de mTOR media la conversión del crecimiento celular reversible que ocurre
debido a la represión de los oncogenes E6 o E7 en una detención del crecimiento irreversible o
senescencia (Blagosklonny, 2014; Hoppe-Seyler et al., 2017).
Desde un punto de importancia funcional y prueba de concepto, nuestros resultados
destacan un resultado alternativo que señala la senescencia como un bloqueo permanente del
crecimiento de células cancerosas. Estos resultados podrían extenderse para desarrollar vectores
virales clínicamente aplicables o sistemas de entrega con potencial para
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Virología 562 (2021) 92–102
tratar los cánceres relacionados con el VPH. Además, las células HeLa senescentes generadas
por la inactivación de los oncogenes E6 o E7 de HPV18 pueden actuar como un sistema de
modelo celular robusto para comprender los detalles de los mecanismos de senescencia y para
la detección de agentes senolíticos para detener el envejecimiento.
Declaración de contribución de autoría CRediT
Raviteja Inturi: Conceptualización, Metodología, Investigación, Validación, Redacción –
borrador original. Por Jemth: Conceptualización, Metodología, Supervisión, Recursos, Redacción
– revisión y edición, Adquisición de fondos.
Declaración de competencia de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones
personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo informado en este documento.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Sueca del Cáncer. Agradecemos al Dr.
Tanel Punga y al Prof. Stefan Schwartz por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito.
Apéndice A. Datos complementarios
Los datos complementarios de este artículo se pueden encontrar en línea en https://doi.
org/10.1016/j.virol.2021.07.005.
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