PROTOCOLO DE DISECCIÓN

 Poner mosquito en ETOH 70% por 5 minutos

 Hacer 3 lavados con PBS (medio isotónico) y dejar en el 4to con PBS
 Hacer la disección

EXTRACCIÓN DE MIDGUT PARA CULTIVO DE BACTERIAS (MIX DE BACTERIAS)

 Tomar el midgut y dentro del PCM, pongo en 100ul de LB en ependorf para microbiología
 Triturar con el pistón y la pistola
 Dejar el pistón en sulfanios con dilución
 Tomo 45-50ul y pongo en LB sólido

* Si es agua del algodón

 Tomo directamente 100ul en LB sólido
 Incubar x 16 horas a 30°C
 Refrigerar

AISLAMIENTO DE BACTERIAS INDIVIDUALES EN LB SÓLIDO

 En 100ul de LB líquido, poner un poco de bacterias con el palillo (una colonia)
 Tomar 10ul del líquido y colocar en un lado de la placa de LB sólido
 Esparcir con la paletita en las 3 direcciones diferentes
 Dejar incubar por 24 hrs
 Refrigerar

AISLAMIENTO EN GLICEROL
 En un falcon de 15ml, colocar 3-5ml de LB líquido.
 Agregar una colonia del cultivo sólido (bacterias individuales)
 Dejar una noche incubando a 30°C
 Tomar 1ml y poner en glicerol
 Poner en -80°C

RECULTIVO DE BACTERIAS DESDE EL GLICEROL

 Tomar tubo de muestra en cubeta de hielo
 Con un asa pequeñita, esparcir en LB sólido en las 3 direcciones diferentes
 Incubar por 16 hrs a 30°C
 Al día siguiente, colocar 15ml de LB líquido en un falcon de 50ml
 Colocar una colonia de la bacteria en el LB líquido
 Incubar por 16hrs a 30°C

ESTERILIZACIÓN DE HUEVOS
(Preparación de cloro: 1 pastilla por cada 150ml)
 En la cubeta con filtro, colocar los huevos y agregar alcohol 70% por 5 minutos y extraer
 Colocar cloro (bleach) por 5 minutos más y extraer
 Colocar alcohol 70% por 5 minutos y extraer
 Lavar con agua estéril por 3 veces y dejar en el 4to de agua
 Sacar los huevos y colocar en frasquito estéril con esa misma agua.
 Dejar en incubadora de crianza hasta ver eclosión

ECLOSIÓN DE HUEVOS EN BOMBA DE AIRE

 Colocar los huevos en agua y dejar en bomba de aire por 20 – 60 minutos

RE INFECTAR CON BACTERIAS A LARVAS PARA CRECIMIENTO

  Utilizar las bacterias obtenidas en el último paso del recultivo desde glicerol
 Centrifugar los tubos falcon a 3900 rpm x 30 minutos
 Deshacerse del LB dejando las bacterias sedimentadas.
 Agregar 50ml de agua estéril, mezclar con vortex.
 En una placa de distintos pocillos, agregar una larva por cada pocillo, estéril obtenida a partir
de la esterilización de huevos.
 Agregar 2ml de agua con bacterias y un par de gotitas de comida de pez estéril en cada
pocillo.

CONCENTRACIONES DE E. coli (AUX) PARA CRECIMIENTO DE LARVAS

Stock LB (liquid for isol.) Larval Water

d-Alanine 100 mg/ml 200ug/ ml 50ug /ml
Agregar: 2ul/ml 0.5ul/ml
m-DAP 10 mg/ml 50 ug/ml 12.5 ug/ml
Agregar: 5ul/ml 1.25 ul/ml
Kanamycin 50 mg/ml 50 mg/ml X
(antibiotic) Agregar: 1 ul/ml X

BACTERIAS PARA COMIDA CON ADULTOS

 Incubar una colonia de bacterias en 3ml de LB por una noche
 Centrifugar, eliminar el LB, y agregar 9 ml de agua estéril
 Mezclar en vórtex
 Añadir los 9ml en el algodón para adultos
* En este protocolo, no se provee de E. coli (AUX) a los adultos
* No se añade sucrosa como fuente de alimento

LAVADO DE SANGRE
(50% / 50%) (40% / 60%) (sangre / suero)
 Calentar el FBS (suero – fetal bovine serum) a 37°C. Preferible no congelar y descongelar
múltiples veces (usar la alícuota adecuada).
 Tomar el volumen de la sangre que voy a usar y poner en tubo(s) falcon 15ml.
 Centrifugar 1500rpm x 5 mins.
 Sacar supernatante
 Añadir 1 vol. de PBS estéril (mismo vol. que la sangre). MEZCLAR.
 Centrifugar 1500rpm x 5 mins.
 Sacar supernatante
 Añadir 1 vol. de FBS (suero) -- (mismo vol. que la sangre o el porcentaje que sea)
 Sangre lista! 🩸